JP2017500062A - マイクロ流体装置 - Google Patents

Abstract

生物学的流体サンプル中の生物学的細胞を受け入れる少なくとも１つのサンプル流入口と、シース流体を受け入れる少なくとも１つのシースフロー流入口と、前記生物学的流体サンプルを実質的に安定した外側層流として提供し、かつ、前記シース流体を実質的に安定した別個の内側層流として提供するよう構成された少なくとも１つの曲線状流路と、それぞれが、前記外側層流から目標範囲内の寸法を有する単一細胞を受け入れるよう構成された、前記曲線状流路の周囲に配された複数の細胞捕捉部とを備えるマイクロ流体装置をここに開示される。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、マイクロ流体装置に関する。

個々の細胞はそれぞれ固有であり、寸法や状態、タンパク質発現が異なったり、同じ組織内であってもまったく別のゲノムプロファイルを示すことがある。母集団平均測定では隠れていることが多い奇病や細胞事象を理解するためにはこれらの相違点は特に重要である。たとえば血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出には、非侵襲性ガン診断法としての可能性がある。腫瘍量と相関する絶対数測定よりも、ＣＴＣの特性評価は患者一人一人に合わせた治療法選択の指標となることが期待される。単一細胞の解析は、これら変化の特定に役立つ決定的な情報をもたらす可能性がある。ピペッティングやプロセシングによる従来の細胞抽出法は作業が退屈で、特に標的の細胞が少量および／または低純度の場合はミスが生じやすい。自動の蛍光細胞分取器は数百万個の細胞を必要とし、多くの細胞消失を伴うため、この用途には不向きである。

細胞異質性に取り組む潜在的利点から、単一細胞解析に関心が寄せられている。少数の細胞内に存在する重要な変異も、細胞母集団に対する解析では発見されない可能性がある。したがって、腫瘍学や再生医療における現在の研究では、個々の細胞を回収し特性評価することが重要部分を占めることが多い。医療は個別化治療、標的治療へと向かっており、細胞集団の多様性および遺伝的体質を理解することは、医師がより良い臨床判断を下すのに役立つ。また、病気に関連する主要な突然変異を特定することができれば、医薬品設計や集団検診の迅速化にもつながる。単一細胞を高スループットで正確に選択、操作、処理することができれば、細胞異質性の理解のために充分なサンプル数を得るのに有用である。

従来のベンチトップ型の単一細胞分取・調製法として、段階希釈と、顕微鏡下での手動での細胞ピペッティングがある。段階希釈を用いて単一細胞解像度を得ようとすると大量のエラーが発生し、これらのエラーはランダムで見分けがつきにくい。手動での細胞ピペッティングはスループットがかなり低い技術で、その作業は退屈なため、細胞亜集団の多様性パターンを解明するために充分なデータを得るのに必要な数百の細胞処理には向かない。マイクロピペット選択やマイクロマニピュレータまたはレーザキャプチャダイセクションを使った分離法で現在半自動化されている工程もスループットは低く、分離工程を行うにはユーザが操作して興味対象の細胞までたどりつく必要がある。

蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）であれば、光学的観察により単一細胞の分離が可能である。しかし、これらシステムは始動時に相当量の材料を必要とし、細胞消失が多いために希少な細胞事象にはあまり向かない。また、ＦＡＣＳシステムは非常に高額なツールであり、ユーザ間で共有するのが普通のため、サンプル間での汚染リスクがあり、後続の遺伝子解析において誤った陽性結果につながる可能性がある。このため希少試料の場合はＦＡＣＳシステムの有用性も限られる。

その他の形式の細胞分取器では、特にマイクロシステムを用いたものが提案されている。この種のシステムは、必要とされるサンプルインプット量が少なく、スループットもそこそこ高いため好まれている。これら装置はまた安価でもあり、相互汚染を防ぐための単一使用も可能である。連続流中での磁気分離を利用する装置は、異なる細胞亜集団から区別するための濃縮率が５０００倍と非常に効率がよいことが示されている。このようなシステムの主な制約は、単一細胞の回収ができないことであり、遺伝子変異の大規模調査に有用なツールである次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などの下流の解析に制約が生じる。細胞に優しいと考えられるその他の分取技術に、決定論的横置換法による分離、または、マイクロ流中の層流特性を変化させて行う分離がある。しかし、サンプルがマイクロ流路を横断する速度が速すぎるため、精密機器なしでは蛍光強度を正確に測定できず、このために単一細胞の回収が困難である。

単一細胞レベルでの分取・回収を目指すシステムとして、単一細胞捕集用基板のマイクロパターニング、マイクロ流体を用いた物理的捕捉、細胞のインクジェット印刷、アクティブプローブ領域にて細胞を操作する誘電泳動法（ＤＥＰ）がある。たとえば、分子解析用のＤＮＡ注出を行うために、付着している隣の細胞に影響を与えることなく特定の細胞を回収するのにマイクロパターニングを用いるのは難しい。誘電泳動法（ＤＥＰ）や細胞インクジェット印刷を用いたシステムの精密制御も、かなりの追加コストとなる。たとえば、受動的物理的捕捉法を用いる単一細胞サンプル調製システムＦｌｕｉｄｉｇｍ（商標）の場合、システム内に９６個のウェルしかないために、標的細胞が１．１％より高い頻度を有する必要があるという大きな制約がある。所望の細胞の頻度が１．１％以下であると、１回のうちで標的細胞が１つも抽出されない可能性が高い。それでも、インプットの純度が比較的高くない限り、ほとんどが標的細胞ではないために、システム内のサンプルの大半が無駄になる。したがって、細胞を迅速に回収でき、かつ、細胞を保管できるような融通性が十分ある、または、このような細胞を下流の様々な用途で使用可能にするシステムが、依然として必要とされている。

本発明は概して、個々の細胞を高速流路から捕捉し、これらの細胞を単一細胞解析用に別々に放出するマイクロ流体装置を提案するものである。本装置により、高速処理および／または光学／蛍光分析が可能となり得る。再循環によって細胞を最大限回収することができ、特に、希少な標的細胞事象や、サンプル量が制限要因となってサンプルの細胞インプットが少ない場合を対象とすることができる。本装置は大量の単一細胞を供給可能な総合的サンプル調製ツールを提供することができ、免疫細胞化学を通じて形態学的情報やタンパク質発現レベルなどの細胞の基本特性を提供する。

本発明の第１の態様では、生物学的流体サンプル中の生物学的細胞を受け入れる少なくとも１つのサンプル流入口と、
シース流体を受け入れる少なくとも１つのシースフロー流入口と、
前記生物学的流体サンプルを実質的に外側流として提供し、かつ、前記シース流体を実質的に別個の内側層流として提供するよう構成された少なくとも１つの曲線状流路と、
それぞれが、前記外側流から目標範囲内の寸法を有する単一細胞を受け入れるよう構成された、前記曲線状流路周囲に配された複数の細胞捕捉部、とを備える
マイクロ流体装置を開示する。

周囲に配された前記複数の細胞捕捉部は、前記外側流と流体接触している。

本装置は、放出モード中に、各捕捉部から前記目標範囲内の寸法を有する各単一細胞を放出するよう構成されたエジェクタをさらに備えることができる。

前記細胞捕捉部は、前記外側流に近く前記目標範囲内の寸法を有する前記単一細胞を受け入れるよう構成された第１のポートと、前記外側流から遠い第２のポートとを有することができる。前記第２のポートは、捕捉モード中に、前記外側流に対して低圧力を加えるよう構成することができる。低圧力はたとえば周囲の大気圧である。

前記第２のポートはさらに、前記放出モード中に高圧力を加えるよう構成することができる。高圧力はたとえば、シース流体の流れによって加えることができる。

前記第２のポートは、堰、狭窄流路、光学的にオンオフされるゲート、誘電的にオンオフされるゲートからなる群から選択することができる。たとえば第２のポートが堰の場合、該堰の最狭部寸法はたとえば１〜３μｍなど５μｍ未満である。

前記第１のポートの幅は、１０μｍ〜３０μｍ、１５μｍ〜２５μｍ、１６μｍ〜２１μｍ、または１７μｍ〜２０μｍとすることができる。

本装置はさらに光学システムを備えることができる。たとえば該光学システムは標的とする細胞種類の選択に適したものとすることができ、随意で、明視野撮影または蛍光撮影用に構成される。前記標的とする細胞種類は循環腫瘍細胞でもよい。

前記少なくとも１つのサンプル流入口は、前記生物学的流体サンプルの体積および／または流量を制御するよう構成され、および／または、前記少なくとも１つのシース流入口は、前記シース流体の体積および／または流量を制御するよう構成することができる。たとえば生物学的流体サンプルおよび前記シース流体それぞれの体積および／または流量は、外側流幅が１５〜２５μｍとなるよう構成される。

前記捕捉モードおよび前記放出モードの間で、前記流路を洗浄してもよい。

前記装置はスライドガラス上に接着されたＰＤＭＳまたは硬質樹脂から成型することができる。

本装置はさらに、各捕捉部内の１個の細胞の存在および／または種類を判定、あるいは、各捕捉部内の細胞を同定するよう構成された光学検出器を備えることができる。

本装置はさらに、前記流体サンプルを前記流路を通じて再循環させるよう構成された再利用ポートを備えることができる。

本装置はさらに、放出された各単一細胞を所定の位置に提供するよう構成された流出口を備えることができる。

本発明の第２の態様では、流体供給システムが、
生物学的流体を受け入れるよう構成された流入口と、
請求項２３に記載のマイクロ流体装置と、
前記マイクロ流体装置のアウトプットからの、前記目標範囲内寸法を有する放出された各単一細胞を、診断または解析用に処理するよう構成された診断または解析モジュールと、
前記捕捉モード中に、すべての前記捕捉部が塞がるまで前記少なくとも１つの流入口に制御信号を送信し、放出モード中に、前記目標範囲内寸法を有する細胞を各捕捉部から順次放出するよう前記エジェクタに制御信号を送信するよう構成されたコントローラとを備え、
前記マイクロ流体装置の前記少なくとも１つのサンプル流入口は、前記システムの前記生物学的流体サンプル流入口に連結され、前記マイクロ流体装置の前記少なくとも１つのシースフロー流入口は前記システムのシース流体流入口に連結されている。

本流体供給システムはさらに、マイクロ流体装置のアウトプットに対して転換可能に構成されたアウトプットアレイを備えることができ、前記アウトプットからの前記目標範囲内寸法を有する放出された各単一細胞が前記アレイ内の分離位置に提供される。

前記診断または解析モジュールは、前記アウトプットアレイから前記目標範囲内寸法を有する放出された各単一細胞を、単一細胞解析用に抽出するよう構成することができる。

以下の図面を参照し、本発明をさらに詳しく説明する。

図１Ａは、細胞を分離・回収するシステムアーキテクチャの概略図である。 図１Ｂは、生物学的サンプル流体の流れとシース流体の流れとを区別するために有色色素が用いられた、装置の出口流路を示す図である。 （Ａ）は、コンピュータ支援設計（ＣＡＤ）によるマイクロ流体装置のレイアウトであり、（Ｂ）は液流およびセルチャンバの位置を示す細胞捕捉領域の概略図であり、（Ｃ）はセルチャンバに細胞が近づくときに細胞に働く力を示す概略図である。 （Ａ）は、スライドガラス上に接着したＰＤＭＳを用いて作製されたプロトタイプの装置を示す図であり、（Ｂ）は有色色素によって可視化した、稼働中の装置を示す図である。 （Ａ）の（ｉ）および（ｉｉ）は細胞流路を示す図であり、（Ｂ）は流量比と細胞の流路幅との相関を示すグラフである。 （Ａ）は細胞の分離・回収機構を示す概略図、（Ｂ）は光顕微鏡で撮影した、セルチャンバ内での細胞分離を示す図、（Ｃ）は光学撮像による細胞の回収および確認を示す図である。 図６は、光顕微鏡で撮影した、１０のチャンバすべてにおける細胞捕捉効率を示す図である。 図７は、細胞の分離・回収機構の代替例を示す概略図である。 図８は、光顕微鏡で撮影したセルチャンバ内での細胞分離を示す図である。

細胞の分取・分離システムを図１に示す。マイクロ流体装置１００は、細胞の低インプット処理および基板１０６上への制御分注の能力を有する。基板は、随意で、細胞回収時の位置決めを精密に行う自動試料台１１０と、撮像およびフィードバック用の（たとえばカメラ１２１と対物レンズ１２２を含む）光学機構１２０とであってもよい。本装置はさらに、コンピュータインターフェース１３０、サンプル投入部１０１、シースフロー投入部１０２、サンプル再利用ポート１０５、およびＸ‐Ｙステージ１１１上に載置されたサンプル回収トレイ１０７を備えることができる。

本システムは数千個程度の単一細胞を分取し、回収基板上に供給することができ、これら細胞は下流で後続の解析過程ですぐに使用することができる。回収基板は、ＰＣＲ法や細胞培養で用いられる細胞撮影や（様々なサイズの）ウェルプレート用に通常使用される一般的なスライドガラスなど、様々な種類の媒体を保持できる交換可能なプラットフォームである。たとえばユーザが、免疫細胞化学や蛍光ｉｎ‐ｓｉｔｕハイブリッド形成法により、インプットされたサンプルプール中の細胞亜集団を同定したい場合は、細胞の回収中は細胞をポリ―Ｌ―リジンコートスライドガラス上に固定化し、次いで、当該研究用に関心のある抗体とともに培養することができる。基板は、細胞にどのような処理を行うか（たとえば細胞に対して行う解析法の種類）によって、適切なものを選べばよい。また、本システム上の光学機構により蛍光スキャンを行って、存在している異種の細胞亜種を区別することもできる。さらに、各細胞の位置は本システムによって予め定義されるため、必要な場合、将来の解析用に基板を簡単に保管しておくことができる。

本単一細胞サンプル調製システムを非常に有効利用することができる下流の適用例として、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）がある。ＮＧＳは遺伝的変異の理解に深い影響を及ぼし、生物医学科学分野においてパラダイムシフトをもたらした成長中の重要な応用例であり、ＮＧＳにより臨床的評価は改善された。９６／３８４ウェルプレートなどの適切な回収基板を選ぶことで、既存のプラットフォームと直接互換可能であり、細胞溶解と後続のシーケンシングライブラリ調製を行うことができる。本サンプル調製システムを有効利用できる可能性のある下流の適用例は限りがなく、また、同システムによりスループットを高めることで現検出法の生産性が上がる。

マイクロ流体装置１００の構成を図２Ａおよび図２Ｂに示す。本装置は、単一細胞分離部２１０、再利用ポート２２０、回収ポートまたは流出口２３０、細胞流入口２４０、およびシースフロー流入口２５０を備えることができる。単一細胞分離部２１０は、流体力学的絞込み領域２６１と、この流体力学的絞込み領域２６１の周囲に間隔をおいて配される一連の細胞捕捉部２６０としての細胞保持チャンバとを有する。本装置はまた、細胞放出制御部２７０を有する。

このような装置は、ソフトリソグラフィ、熱エンボス加工、または射出成型により、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から成型することができる。

図示したシステムでは、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、流体力学的絞込み領域２６１は、１８０°に渡る円弧曲線形状である。外縁周りに１０個の保持チャンバ２６０が配されている。言うまでもなく、細胞保持チャンバの数は１０より多くても少なくてもよく、たとえば、２〜２００個のうちのいくつでもよい（たとえば５〜５０個の細胞保持チャンバなど、４〜１００個の細胞保持チャンバうちのいずれかなど）。細胞保持チャンバ２６０は、流体力学的絞込み領域２６１に向けて開口する第１のポート２６７と、遠位の第２のポート２６４とを有する。

言うまでもなく、流路の間隔や曲率はこれに限定されず、考慮すべき特定の構成もない。

損失を最小限としつつ高速細胞分離を行うために、インプットされた細胞２６２はシースフローにより流路壁（図２Ｂ）側に絞り込まれ、流動しつつ第１のポート２６７内へ押し込まれる。遠心力と、細胞にかかる僅かな負の差圧（図２Ｃ）が相まって、細胞保持チャンバ内に細胞が入りやすくなる効果が得られる。細胞保持チャンバ内は、細胞放出ポート２６３を通じて第２のポート２６４から細胞保持チャンバを大気に解放することにより負圧とすることができる一方、半円曲線に沿ってバルク流体を流動させるために正圧が加えられる。図示の実施形態では、高さ２μｍ（たとえば１．８〜２．２μｍ）の堰構造２６４によって、細胞放出ポート２６３への細胞の進入が妨げられる。これに代えて、細胞保持チャンバに、堰の代わりに、光学的または誘電的にオンオフされるゲートを設けてもよい。いったん細胞保持チャンバが塞がると、さらに細胞が入ろうとしても抵抗が高いため、次に来る細胞は後続の細胞保持チャンバへと転がっていき易い。この手法で、図示の装置では一度に１０個の細胞を保持することができ、このことは、撮像装置により確認することができる。これを図５Ｂの画像に示すが、各チャンバが単一細胞で塞がっていることが分かる。

本装置は血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の捕捉用に設計することができるが、同様にして、随意で赤血球や血小板を除外するなど、任意の種類の細胞の分離用に設計することができる。たとえば堰２６４とチャンバ２６０の寸法は、標的とする細胞のサイズに依存する。直径およそ１５μｍのＣＴＣであれば、チャンバ２６０は１６〜２１μｍ幅（たとえば１７〜２０μｍ）であり、堰の間隔は０．５μｍ〜約５μｍ（たとえば１．５μｍ〜２．５μｍなど、１μｍ〜３μｍの範囲、たとえば２μｍなど）であるとよい。

細胞が確実に細胞保持チャンバに捕捉されるように、シースフロー２６５と細胞流２６６とは、細胞流が、標的に定められた細胞の寸法と同様の幅を有するように最適化される。これによって、細胞流中の細胞を可能な限りチャンバに近づけることができる。たとえば、選択された細胞が１５μｍの大きさであるとき、細胞流の目標幅は１５〜２５μｍの範囲である。随意で、廃棄量を最小限とするために、粘度を高めたシースフローを用いることもできる（たとえばシースフローとして用いる液体の粘度を、細胞運搬流として用いる液体より、たとえば２〜４倍など、２〜１０倍の範囲、たとえば３倍にする）。細胞流およびシースフローの流路には適切なシリンジポンプを用いればよく、システムはコンピュータで動作する制御ソフトで制御することができる。

上述の条件によりほぼ確実に、２つの流れが各々の層流特性によって混じり合わないようにすることができる。また、流路長が比較的短いため、別個の流れ間での拡散も最小限となる。図１Ｂは出口流路１６０、１７０の９０°に曲がった部分を示すが、これは、流路の周壁にあるチャンバと外側流との間に見られる屈曲部と同様である。図１Ｂに示すようにこれらの流れは混じり合うことなく、１つの流れ（外側流１４０）がもう１つの流れ（内側流１５０）によって周壁に押しつけられている。

圧倒的多数の細胞は生物学的サンプル流体、すなわち外側流１４０中に残るが、例外もある。これらの例外は、生物学的サンプル流体の絞込み流寸法を越える質量中心を有する大きい細胞で、最終的にはシースフロー、すなわち内側流１５０の流れに追随する。

シースフロー液は、細胞互換性を有する適切なものであればいかなるバッファを含んでもよい。たとえばシースフロー液は、水／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を混合したグリセロールを様々な濃度で含むことができる。その他、適切なシースフローの例として、水／ＰＢＳと様々な濃度で混合したポリエチレングリコールまたはデキストランがある。言うまでもなく、シースフローは、水／ＰＢＳと混合した様々な濃度で、グリセロール、ポリエチレングリコール、およびデキストランを様々な組み合わせで含んでいてもよい。

たとえば、捕捉過程中の流量は、シースフローと細胞流の流体粘性比がおよそ３：１で、１００〜４００μＬ／ｍｉｎとすることができる。シースフロー流量（ｍＬ／秒）に対する細胞の体積比は約１：１から約１：５、サンプル濃度はｍＬ当たりの細胞数が１００個以上（たとえばｍＬ当たりの細胞数が約２０００〜約１００万個など、ｍＬ当たりの細胞数が約１０００〜２００万個の範囲）とすることができる。これらのパラメータから、すべての細胞保持チャンバが埋まるのは、ほぼ一瞬で埋まる場合から３０分までの範囲と予測される（たとえば０．１秒〜１２０秒など、たとえば０．０１秒〜１０分の範囲）。言うまでもなく、すべてのチャンバが埋まるのにかかる時間は、流体サンプル中の細胞濃度によって変動する。

ＣＴＣの場合、事前濃縮血液サンプル中の細胞濃度は通常、１０億個の血液細胞中に１つ程度と推定されている。しかし、濃縮サンプルの場合のＣＴＣ濃度は血液細胞１０００〜１０，０００個中に１つ程度の可能性がある。

細胞流とシースフローが流体力学的絞込み領域と細胞保持チャンバを通過すると、これらの流れは再利用ポートへ案内される。随意で、特にシースフローが細胞流より高い粘度を有する場合は、シースフローと細胞流との分離性を高めるために、再利用ポートを２つに分岐させる。

すべてのチャンバが一杯になった後は、（たとえば適切な細胞バッファまたはヌクレアーゼフリー水を用いて）流体力学的絞込み領域を洗浄してもよい。

次いで、放出過程を開始する。各細胞は、それぞれの細胞チャンバに正圧を加えることにより、回収基板上に１つずつ放出される（図２Ａの細胞放出制御）。回収基板は、たとえば可動回収トレイまたは９６／３８４ウェルプレートなど、適切なものであればどのような基板でもよい。細胞に加圧する正の圧力は、（適切な細胞バッファまたはヌクレアーゼフリー水などの）適切な液状として与えればよく、細胞放出ポートを通じて（たとえば適切なシリンジポンプから加圧して）細胞保持チャンバに流入させ、細胞を半円形の屈曲部に放出し、回収ポートへ案内する。捕捉過程中は、回収ポート２３０は閉じている。回収ポートの選択は、放出流体が放出ポートを通じて、適切な期間、適切な圧力で（たとえば３秒間に１μＬを１〜５Ｐｓｉの圧力範囲で）供給されたときに回収ポートが選択されるように装置を較正することにより行われる。随意で、細胞がそれぞれの細胞保持チャンバから放出される前に、流体力学的絞込み領域（すなわち半円形の屈曲部）を適切な液体で洗浄してもよい。

言うまでもなく、細胞保持チャンバ内に捕捉された細胞をすべて、１個ずつ別々に、またはその他の組み合わせで分注するかどうかはユーザが選択する。また、言うまでもなく、細胞放出の仕方はオペレータの要求に従って変えることができ、放出の各回ごとに変えてもよい。このように融通性のある分注システムにより、所定の研究で行われる滴定実験も可能となる。

本装置のまた別の重要な特徴は、最初の（または後続の）通過時に細胞チャンバに入り損ねた（失われたサンプル）を再利用できることである。本システムは、所望の細胞サンプル量が限られているまたは希少である用途を対象としており、インプットされる細胞材料を最大限回収することが必須である。これは、再利用ポート２２０からの絞込み細胞流を、細胞流入口２４０に戻るよう案内し、細胞が再び細胞保持チャンバに入り込むチャンスを得るようにする。この細胞分離サイクルを、細胞サンプルのインプットが無くなるまで繰り返す。本装置が自動化されている場合は、５分間に渡って１つの細胞も捕捉されない場合に装置がサンプルの再利用を止めるよう設定することによって、再利用サンプルが使い尽くされたと判断することができる。

すべてのチャンバが埋まったかどうか（分注前に）確認するのに光学系を用いる場合は、これら光学系を、関心のある細胞を選択するのに用いることもできる。たとえば明視野撮影や蛍光撮影を利用した光学システムであってもよい。この方法では、オペレータはノイズや対象外の細胞を除去することができる。たとえば図示した装置では、１０のチャンバがすべて埋まった後、５番目のチャンバにのみ関心のある細胞（標的細胞）がある場合はその細胞をプレート／スライドガラス上に分注する一方、その他の９個の細胞は同時に廃棄側へ注出することができる。この廃棄側は再利用ポートまたは別個の廃棄ポートとすることができる。このようにして得られたサンプルは、いかなる単一細胞解析プラットフォームにも簡単に供給することができる。これにより、スライドガラス／プレートを細胞ピッキングステーションに移動させ、平行に並べられた大量の単一細胞プレートから関心のある細胞を選択する必要がなくなる。

図示したシステムは、大規模な配列解析を行う研究所や、免疫細胞化学法、蛍光ｉｎ‐ｓｉｔｕハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）、その他の分子法を頻繁に行う中央の病理学研究所でのサンプル調製の一助として用いることができる。本システムはまた、細胞多様性に対応するため撮影能力を組み込んでおり、単一細胞の全面解析が可能であることから、細胞／分子生物学研究所でも役に立つ。図示したシステムはすでに用いられ、以下で説明するように、そのマイクロ流体構造による細胞分離・回収の概念が実証されている。

本システムは、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分離・検出に関する目下の研究努力からの大きな進歩であり、研究施設と臨床の場との架け橋となるものである。図示したシステムの、下流の解析用にサンプルを調製する能力により、今のところ大量の白血球細胞の存在によって隠されている突然変異や変種を高感度の尺度で検出できるようになる。たとえば従来のＰＣＲやサンガーシーケンスを用いた突然変異解析の至適基準では検出下限が１％であるが、ＣＴＣ数の少ないサンプルでは通常、これを越えることができない。図示したシステムでは確実に、下流で解析を行う前にサンプル純度を充分なものにすることができる。

実験の項

装置の製造

ソフトリソグラフィによりＰＤＭＳから製造した装置を用い、概念実証実験を行った（ソフトリソグラフィ法については、Ｑｉｎ，Ｄ．， Ｘｉａ，Ｙ． ＆ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｇ．Ｍ．“Ｓｏｆｔ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏ‐ ａｎｄ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５，４９１‐５０２（２０１０）、および、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｇ．Ｍ．， Ｏｓｔｕｎｉ， Ｅ．， Ｔａｋａｙａｍａ， Ｓ．， Ｊｉａｎｇ， Ｘ． ＆ Ｉｎｇｂｅｒ， Ｄ．Ｅ． “Ｓｏｆｔ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ” Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３， ３３５−３７３（２００１）を参照。同文献は参照によりここに援用する。）
概念実証

図３Ａは、単一細胞捕捉・回収概念の有効性を明らかにするために用いたプロトタイプの装置を示す。本装置では理想的なテストサンプルとして１５μｍのポリスチレン製ビーズを用いている。本装置は、既存の倒立または正立顕微鏡の大半と互換性があるので追加のコストは最小限ですみ、リアルタイムでの分離過程の視覚化が可能となる。しかし、顕微鏡を装置に一体化して組み込んでもよい。図示するように、装置は、図３Ｂに示すように配された接続チューブで接続したシリンジポンプを用いて検査した。

本システムでは、流体力学的に絞り込んだ細胞流が最適であれば高い分離率が得られ、また、損失細胞をシステムで再び利用することで全体の細胞回収率を上げられる可能性も示している。本システムはまた、所望の細胞チャンバに正圧で加圧することにより単一ビーズを積極的に回収することも可能とし、そしてこの回収の様子が、光学撮像により視覚的に確認された。
シースフローの最適化

図３Ａおよび図３Ｂの装置内でのフロー制御は、ビーズの細胞チャンバへの分離効率に直接影響するため重要である。最適な流れかどうかの基準は、細胞流が、細胞の寸法と同様の幅を有していることである。この場合、目標とする幅は、“細胞”として使用しているビーズのサイズに適合する１５〜２５μｍの範囲となる。これにより、細胞流中の“細胞”をチャンバになるべく近づけることができる。さらに、廃棄量を最小限とするため、より粘度の高いシースフローを選び、サンプル処理工程中の流体力学的拡散を変化させた。これにより、生成される廃棄量が最小限で保全が簡易となり、また、最終的な流路比率に大きな差が生じないことから、ポンプの選択も簡単となった。

本例では、細胞流およびシースフローの流れを双方とも供給する２つのシリンジポンプの制御に、ＮＩ Ｌａｂｖｉｅｗ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）のインターフェースを用いた。本ソフトウェアは、ポンプのパラメータを各回毎に手動で変更する必要なく各流路の流量を積極的に調節するものである。また、システムの過渡応答を最小限にするためにポンプの始動を同期化するのにも役立った。ここでは、本ソフトウェアは２つのシリンジポンプを制御する。これらシリンジポンプは、圧力制御用ソレノイド弁に代えてもよい。このようなソフトウェアを用いて、合計２４までのバルブ／シリンジポンプを実装することができる。

シースフローと細胞流との流体粘度比がおよそ３：１で、１００〜５００μＬ／ｍｉｎ間の流量を調べた。この流体粘度比は、数多くの試験の後に選択されたものである。脱イオン水を用いて細胞流を模し、これよりかなり粘度の高い食品着色染料を用いてシースフローを模した。着色染料は脱イオン水単独よりおよそ３倍粘度が高くなるよう脱イオン水で薄めた。粘度は血流計を用いて計測した。

図４Ａは、流量１００μＬ／ｍｉｎ、細胞流４１０とシースフロー４２０の流量比１：１（図４Ａ（ｉ））と１：５（図４Ａ（ｉｉ））とで行った典型的な特性評価実験を示す。図４Ａから分かるように、流量を変えるだけで、絞り込み細胞流の幅が、所望の寸法内に制御された。

図４Ｂから、流量が４００μＬ／ｍｉｎを越えると、流路内の流れがほぼすべてシースフローとなり、細胞流は拍動する不均一な流れとなることが分かる。したがって、本システムの最大処理限界は４００μＬ／ｍｉｎと規定される。このことから、典型的なサンプルインプット量１０００〜２０００μＬの場合、１回目の処理時間は、細胞流：シースフローの比を１：１として、５〜１０分の範囲となる。もし細胞流およびシースフローに同一粘度の流体を用いた場合シースフロー廃棄量は１０〜２０ｍＬとなるのに比べ、このようなサンプル処理中に生じる廃棄シースフロー量は１〜２ｍＬである。
分離効率とサンプル回収

細胞を模した１５μｍのポリスチレン製ビーズを用いて、システム内に様々な流入量で導入される粒子の濃縮効果を調べた。これにより、様々な初期条件のサンプルに必要な処理時間を測定することができ、装置への導入前にサンプルの事前調製（希釈またはサンプル濃縮）が必要かどうかを判断することができた。インプット濃度が最適範囲であれば、許容範囲の時間間隔で単一細胞を規則的に通過させることができる。逆に、濃度が高すぎれば、すべての細胞チャンバが埋まったとき、細胞流を停止させるまでにわずかな遅延時間があるために、インプットされる細胞の損失量が大きくなってしまう。しかし、濃度が低ければ、チャンバがすべて埋まるまでに長い待ち時間を要し、処理時間が長引いてしまう。

図５Ａは細胞分離・回収機構を示す。各細胞チャンバ５２０内の堰構造５１０により、細胞を、回収の準備が整うまで凹状のチャンバ内に保持することができる。これは、負圧と、屈曲部５３０周辺の遠心力との作用が相まって達成される。チャンバは主な流れに沿って配されており、分離された細胞は主流路内の流れに悪影響を受けることはない。このため、主流路は捕捉した細胞を回収する前に洗浄することができる。解放機構は簡単で、堰の段差の対向端に正圧５４０を加えることで言葉で表現される。図７は代替例を示し、図５Ａの堰構造５１０に代えて細胞保持チャンバ内に狭窄流路５７０が設けられている。図示例では、狭窄流路および堰構造は２μｍの空隙を形成するが、本明細書に開示のいかなるサイズであってもよい。

ここで図示した装置では、細胞流とシースフローの流量比が１：５という流動条件を用い、総流量を１００〜４００μＬ／ｍｉｎまで様々に変化させた。５回別々に行って、１０個の細胞チャンバすべてが塞がるのにかかった時間を記録し平均を出した。チャンバが一杯になるのが速ければ速いほどシステムのスループットは上がる。図５Ｂは典型的な回でのチャンバへのビーズ分離成功例を示す。本例では投入したビーズの濃度は脱イオン水１ｍＬ当たり２０００個から２０００万個まで変化させた。図６に、調査した様々な運転条件をまとめている。１ｍＬ当たり２０万個以上では、すべての異なる試験流量においてビーズ分離はほぼ瞬間的に行われた。１ｍＬ辺り２０００個の低濃度では、流量が１００μＬ／ｍｉｎのとき１０個の細胞捕捉部すべてが埋まるのに５３秒かかった。サンプル流量を増やすと、捕捉時間は１３秒まで減少した。すなわち、流量を４００μＬ／ｍｉｎに変更すると細胞捕捉部充填時間に７５％の改善が見られた。したがって本システムは、１ｍＬ当たり細胞が２０万個以上の濃度でインプットされるサンプルの処理に適しており、また、サンプル濃度がこれより低い場合は、流量を上げて稼働するよう本システムを調節し、スループットを最大化することができる。

図５Ｃは装置５６０の回収流出口におけるビーズ５５０回収の成功例を示す。細胞チャンバからの放出過程を視覚化するため、大径の生検用パンチ（５ｍｍ）を用いて、回収流体ポートに回収ウェルを設けた。放出されたビーズは手動でピペッティングにより取り出し、次のビーズチャンバを駆動して次のビーズを解放および回収した。すべてのビーズが順次回収されるまでこれを行った。本システムでは、１００回の試行中１００個のビーズすべてを個々に取り出し回収することに成功した。

本実験の項で述べたように、細胞を模するのにポリスチレン製ビーズを用いた。図５Ａ〜図５Ｃに、特定条件下でのビーズの分離・回収機構を示す。図８は、本発明による装置を用いて単一のＭＣＦ‐７腫瘍細胞の分離に成功した例を示す。図５に関して説明したものと同一の条件を用いた。図８から分かるように、半円形の屈曲部における各細胞保持部へ能動的放出制御を行うことにより、単一細胞の捕捉効率は１００％となっている。

Claims (26)

1. 生物学的流体サンプル中の生物学的細胞を受け入れる少なくとも１つのサンプル流入口と、
   シース流体を受け入れる少なくとも１つのシースフロー流入口と、
   前記生物学的流体サンプルを実質的に安定した外側層流として提供し、かつ、前記シース流体を実質的に安定した別個の内側層流として提供するよう構成された少なくとも１つの曲線状流路と、
   それぞれが、前記外側層流から目標範囲内の寸法を有する単一細胞を受け入れるよう構成された、前記曲線状流路の周囲に配された複数の細胞捕捉部と
   を備える
   マイクロ流体装置。
2. 放出モード中に、各捕捉部から前記目標範囲内の寸法を有する各単一細胞を放出するよう構成されたエジェクタをさらに備える請求項１に記載の装置。
3. 前記細胞捕捉部が、前記外側流に近く前記目標範囲内の寸法を有する前記単一細胞を受け入れるよう構成された第１のポートと、前記外側層流から遠い第２のポートとを有する請求項２に記載の装置。
4. 前記第２のポートが、捕捉モード中に、前記外側層流に対して低圧力を加えるよう構成された、請求項３に記載の装置。
5. 前記低圧力が周囲の大気圧である、請求項４に記載の装置。
6. 前記第２のポートがさらに、前記放出モード中に高圧力を加えるよう構成された、請求項３〜５のいずれか一項に記載の装置。
7. 前記高圧力は流体の流れにより加えられる、請求項６に記載の装置。
8. 前記第２のポートが、堰、狭窄流路、光学的にオンオフされるゲート、誘電的にオンオフされるゲートからなる群から選択される、請求項３〜７のいずれか一項に記載の装置。
9. 前記堰の最狭部寸法が、５μｍ未満である、請求項８に記載の装置。
10. 前記堰の最狭部寸法が、１〜３μｍである、請求項９に記載の装置。
11. 前記第１のポートの幅が、１０μｍ〜３０μｍ、１５μｍ〜２５μｍ、１６〜２１μｍ、または１７〜２０μｍである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の装置。
12. 前記少なくとも１つのサンプル流入口が、前記生物学的流体サンプルの体積および／または流量を制御するよう構成された、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の装置。
13. 前記少なくとも１つのシース流入口が、前記シース流体の体積および／または流量を制御するよう構成された、請求項１２に記載の装置。
14. 前記シース流体の粘度が、前記生物学的流体サンプルの粘度より、２〜１０倍、２〜４倍、またはおよそ３倍である、請求項１３に記載の装置。
15. 前記粘度、それぞれの体積および／または流量が、外側層流幅が１５〜２５μｍとなるよう構成される、請求項１４に記載の装置。
16. 前記捕捉モードおよび前記放出モードの間で、前記流路が洗浄されるよう構成された、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の装置。
17. 前記装置がスライドガラス上に接着された、ＰＤＭＳまたは硬質樹脂から成型される、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の装置。
18. 各捕捉部内の１個の細胞の存在および／または種類を判定、または、各捕捉部内の細胞を同定するよう構成された光学検出器をさらに備えた、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の装置。
19. 前記光学検出器が、標的とする細胞種類の選択に適した、請求項１８に記載の装置。
20. 前記標的とする細胞種類が循環腫瘍細胞および／または前記目標範囲の寸法が１０μｍ〜３０μｍである、請求項１９に記載の装置。
21. 前記光学検出器が明視野撮影または蛍光撮影用に構成された、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の装置。
22. 前記流体サンプルを前記流路を通じて再循環させるよう構成された再利用ポートをさらに備える、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の装置。
23. 放出された各単一細胞を所定の位置に提供するよう構成された流出口をさらに備える、請求項２〜２２のいずれか一項に記載の装置。
24. 生物学的流体を受け入れるよう構成された流入口と、
    請求項１〜２３のいずれか一項に記載のマイクロ流体装置と、
    前記マイクロ流体装置のアウトプットからの、前記目標範囲内寸法を有する放出された各単一細胞を、診断または解析用に処理するよう構成された診断または解析モジュールと、
    前記捕捉モード中に、すべての前記捕捉部が塞がるまで前記少なくとも１つの流入口に制御信号を送信し、放出モード中に、前記目標範囲内寸法を有する細胞を各捕捉部から順次放出するよう前記エジェクタに制御信号を送信するよう構成されたコントローラと
    を備える流体供給システムであって、
    前記マイクロ流体装置の前記少なくとも１つのサンプル流入口が、前記システムの前記生物学的流体サンプル流入口に連結され、前記マイクロ流体装置の前記少なくとも１つのシースフロー流入口が前記システムのシース流体流入口に連結された、
    流体供給システム。
25. 前記マイクロ流体装置のアウトプットに対して転換可能に構成されたアウトプットアレイをさらに備え、前記アウトプットから前記目標範囲内寸法を有する放出された各単一細胞が前記アレイ内の分離位置に提供される、請求項２４のシステム。
26. 前記診断または解析モジュールが、前記アウトプットアレイから前記目標範囲内寸法を有する放出された各単一細胞を、単一細胞解析用に抽出するよう構成された、請求項２５のシステム。