JP2020503887A - 治療用の細胞および組成物の調製における決定論的横置換 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2016年10月24日に出願された米国仮特許出願第62/412,180号、2017年9月1日に出願された米国仮特許出願第62/553,723号、および2017年10月3日に出願された米国仮特許出願第62/567,553号の恩典を主張し、それらの米国仮特許出願は全て、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
この発明は、National Institutes of Health;National Cancer Instituteにより授与された認可番号CA174121、およびNational Institutes of Health;Heart,Lung,and Blood Instituteにより授与された認可番号HL110574による政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
それの第1の態様において、本発明は、標的細胞集団を遺伝子操作する方法に向けられる。これは、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換(DLD)を実施することにより、標的細胞を粗流体組成物から単離することにより行われる。そのデバイスは、試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延び、かつ第1の壁およびその第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、少なくとも1つのチャネルの存在により特徴づけられる。障害物のアレイは、チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列され、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしている。その障害物は、粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、チャネルを通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、混入細胞または粒子は、収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている。いったん標的細胞が、デバイスを用いて精製されたならば、それらは、その細胞に所望の表現型を付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、治療上の価値のある細胞にするタンパク質)を発現するように設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入される。その後、細胞集団は、インビトロ(in vitro)での培養により増殖され得る。培養および増殖された時、所望の表現型を示す組換え的に操作された標的細胞の収率は、DLDに供されていない同一の細胞(特に、Ficoll遠心分離に曝されたが、DLDには曝されなかった細胞)より、好ましくは、少なくとも10%高く、より好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、または50%高い。
本発明は、T細胞(特に、ナチュラルキラーT細胞およびメモリーT細胞)を含む粗流体組成物を取得し、マイクロ流体デバイスを用いて、前記組成物にDLDを実施することにより、CAR T細胞を作製する方法を含む。一般的に、T細胞を含む粗流体組成物は、患者の血液に由来し、かつ白血球を含有するアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物である。
別の態様において、本発明は、癌細胞抗原、または自己免疫疾患もしくは感染性疾患の原因であり、またはそれに寄与する細胞上の抗原を認識するキメラ抗原受容体を発現するように操作されたCAR T細胞を投与することにより、患者を癌、自己免疫疾患、または感染性疾患について処置する方法に向けられる。CAR T細胞は、上記のセクションで論じられた方法を用いて、すなわち、T細胞を含む粗流体組成物(好ましくは、患者から引き出された白血球含有アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物)を取得し、その後、マイクロ流体デバイスを用いてその組成物にDLDを実施することにより、作製され得る。その後、この様式で回収されたCAR T細胞(好ましくは、ナチュラルキラーT細胞およびメモリーT細胞)は、その細胞をインビトロで成長させることにより、増殖される。最後に、その細胞は、患者に投与され、その患者は、一般的に、そのT細胞が単離された血液を提供した同じ患者であるべきである。
本発明はまた、細胞を迅速に処理するように設計され、かつ一般的に、その細胞が収集される現地で実施することができる、患者由来の細胞を収集および処理するためのプロトコールに向けられる。プロトコールは、上記の標的細胞およびCAR T細胞を調製するための方法の一部分として用いられ得る。これらのプロトコールの一部の態様は、図13および図14に図示され、図12に示されたプロトコールと対比され得る。図示された特定の手順において、全血のアフェレーシスにより取得された組成物が得られ、その後、その組成物におけるT細胞が選択される。この関連における用語「選択される」は、T細胞が、T細胞を特異性(上記で定義されているような)を以て認識する作用物質により結合されることを意味する。その後、DLDを用いて、選択されたT細胞を単離し、これらの細胞を、選ばれた流体培地へ移す。
DLDの一つの利点は、それが、相対的に大量の材料だけでなく、少量の材料も、ほとんど容量を増加せずに処理するために用いられ得ることである。その手順は、大容量の材料を処理することにおいてだけでなく、遠心分離による白血球の濃縮により小容量である白血球アフェレーシス産物にも用いられ得る。
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、生存細胞を非生存細胞から分離する方法に向けられる:(a)生存細胞および非生存細胞を含む試料を取得する工程であって、前記生存細胞が第1の既定のサイズを有し得、かつ前記非生存細胞が第2の既定サイズを有し得、および前記第1の既定サイズが臨界サイズ以上であり得、かつ前記第2の既定サイズが前記臨界サイズより小さくてもよい、工程;(b)前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み得、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ得、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズより小さい粒子を第2の方向へ偏向させるように構成され得る、工程;ならびに(c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記生存細胞が前記障害物により前記第1の方向に偏向され得、前記非生存細胞が前記第2の方向に偏向され得、それにより、前記生存細胞を前記非生存細胞から分離する、工程。臨界サイズは、第2の既定サイズの約1.1倍であり得、いくつかの実施形態において、生存細胞は、活発に分裂する細胞であり得る。いくつかの実施形態において、デバイスは、徐々により小さい障害物および間隙を有する少なくとも3つのゾーンを含み得る。
本発明はまた、以下により、接着性標的細胞、好ましくは治療上価値のある細胞、例えば、接着性幹細胞を取得する方法を含む:a)接着性標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程、およびb)決定論的横置換(DLD)を実施して、接着性標的細胞が濃縮された組成物を得る工程。このプロセスの間、接着性標的細胞に、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させ得る。例えば、担体は、接着性標的細胞と特異性(上記で定義されているような)を以て結合する親和性物質(例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマー)を表面上に有し得、所望の表現型をその細胞に付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、より高い治療上の価値がある細胞にするタンパク質)を発現するように、設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入され得る。
本発明はまた、上記の手順を用いて、活性化の能力がある細胞を精製する方法を含む。好ましい実施形態において、本発明は、以下により、活性化細胞を複数の他の細胞から分離する方法に向けられる:a)活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、前記担体の1つまたは複数が、細胞アクチベーターを含み、1つまたは複数の担体が、接触により、または接触後、細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞に少なくとも部分的に会合して、担体会合化細胞を生成し、少なくとも部分的な、前記細胞アクチベーターの前記活性化の能力がある細胞との会合が、前記活性化の能力がある細胞を活性化し、前記担体会合化細胞複合体が、他の細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化細胞複合体のサイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が、前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;b)前記粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記活性化細胞を前記複数の他の細胞から分離する、工程。その後、分離された担体会合化細胞複合体を含む流体組成物が収集され得る。このプロセスの間、その細胞は、適宜、その細胞に所望の表現型を付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、より高い治療上の価値がある細胞にするタンパク質)を発現するように、設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入され得る。
別の実施形態において、本発明は、以下を含む、化合物を細胞から除去する方法を含む:(a)細胞および化合物を含む流体組成物を取得する工程であって、前記細胞が、前記化合物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、および前記細胞の既定サイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記化合物の既定サイズが前記臨界サイズ未満である、工程;(b)前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに(c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、その間、前記細胞が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、前記化合物が前記第2の方向に偏向され得、それにより、前記細胞から前記化合物を除去する、工程。いくつかの実施形態において、方法はさらに、工程(c)後に細胞を培養すること、または工程(a)の流体組成物が取得された培養物へ前記細胞をリサイクルすることを含み得る。
本発明はまた、以下を含む、細胞から分泌性産物を連続的に精製する方法を含む:(a)細胞を含む流体組成物(細胞培養組成物であり得る)を取得する工程であって、前記細胞が、前記流体組成物中に懸濁しており(または前記細胞に、DLD分離を促進し、かつ担体−細胞の複合体を形成するように、1つまたは複数の担体を結合させ)、前記細胞が、分泌性産物を前記流体組成物へ分泌し、前記細胞(または前記担体−細胞複合体)が、前記分泌性産物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、前記細胞(または前記担体−細胞複合体)の既定サイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが前記臨界サイズ未満である、工程;(b)前記細胞(または前記担体−細胞複合体)を含む流体組成物を、DLD用デバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに(c)前記細胞または前記担体−細胞複合体を含む流体組成物を前記デバイスに流す工程であって、前記細胞または担体−細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、前記分泌性産物が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記分泌性産物を前記細胞から分離する、工程;(d)前記分泌性産物を収集する工程であって、それにより、精製されている前記分泌性産物の流体組成物を生じる、工程;(e)分離された細胞または担体−細胞複合体を含む回収された流体組成物を収集する工程;(f)前記細胞(または前記担体−細胞複合体)を前記流体組成物に再びアプライする工程;ならびに工程(a)〜(e)を繰り返す工程であって、それにより、分泌性産物を細胞から連続的に精製する、工程。
アフェレーシス:本明細書で用いられる場合、この用語は、患者またはドナー由来の血液がそれの成分、例えば、血漿、白血球、および赤血球へ分離される手順を指す。より具体的な用語は、「血小板アフェレーシス」(血小板の分離を指す)および「白血球アフェレーシス」(白血球の分離を指す)である。この関連において、用語「分離」は、全血と比較して、特定の成分が濃縮されている産物の取得を指し、絶対的純粋が達成されていることを意味しない。
細胞、特に、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスにより調製された組成物における細胞は、流体が、デバイスの1つの端における注入口から反対側の端の出口へ流れるチャネルを含有するマイクロ流体デバイスを用いてDLDを実施することにより単離され得る。サイズに基づいたマイクロ流体分離の基本原理、および細胞を分離するための障害物アレイの設計は、他の所(US 2014/0342375;US 2016/0139012;7,318,902、およびUS 7,150,812参照。それらは、全体として参照により本明細書に組み入れられている)で提供されており、また、下記のセクションで要約されている。
サイズに基づいて細胞を分離する能力があるマイクロ流体デバイスを作製および使用するための一般的な手順は、当技術分野において周知されている。そのようなデバイスには、US 5,837,115;US 7,150,812;US 6,685,841;US 7,318,902;7,472,794;およびUS 7,735,652(それらの全ては、全体として参照により本明細書に組み入れられている)に記載されたものが挙げられる。本発明のためのデバイスの作製および使用に役立ち得るガイダンスを提供する他の参考文献には以下が挙げられる:US 5,427,663;US 7,276,170;US 6,913,697;US 7,988,840;US 8,021,614;US 8,282,799;US8,304,230;US 8,579,117;US 2006/0134599;US 2007/0160503;US 20050282293;US 2006/0121624;US 2005/0266433;US 2007/0026381;US 2007/0026414;US 2007/0026417;US 2007/0026415;US 2007/0026413;US 2007/0099207;US 2007/0196820;US 2007/0059680;US 2007/0059718;US 2007/005916;US 2007/0059774;US 2007/0059781;US 2007/0059719;US 2006/0223178;US 2008/0124721;US 2008/0090239;US 2008/0113358;およびWO2012094642(それらの全ては全体として参照により本明細書に組み入れられている)。デバイスの作製および使用を記載する様々な参考文献のうちで、US 7,150,812は、特に良いガイダンスを提供し、7,735,652は、血液中に見出される細胞を含む試料に実施される分離のためのマイクロ流体デバイス(この点において、US 2007/0160503も参照されたい)に関して、特に興味深い。
CAR T細胞を作製および使用するための方法は、当技術分野において周知されている。手順は、例えば、US 9,629,877;US 9,328,156;US 8,906,682;US 2017/0224789;US 2017/0166866;US 2017/0137515;US 2016/0361360;US 2016/0081314;US 2015/0299317;およびUS 2015/0024482(それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている)に記載されている。
本明細書に記載されたDLDデバイスは、細胞、細胞断片、細胞付加体、または核酸を精製するために用いることができる。本明細書で論じられているように、これらのデバイスはまた、目的の細胞集団を複数の他の細胞から分離するために用いることができる。デバイスを用いる血液成分の分離および精製は、例えば、米国特許出願公開第2016/0139012号に見出すことができ、それの教示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。少数の実例となる分離の簡単な議論は下記に提供されている。
一実施形態において、デバイスは、生存細胞を非生存細胞から分離するように設計された手順に用いられる。用語「生存細胞」は、成長の能力があり、活発に分裂しており、再生の能力があるなどの細胞を指す。生存細胞が、非生存細胞より大きいサイズを有する場合、DLDデバイスは、非生存細胞の既定サイズより大きく、かつ生存細胞の既定サイズより小さい臨界サイズを含むように設計することができる。臨界サイズは、非生存細胞の既定サイズの1.1倍大きい(または小さい)などの小規模であり得るが、一般的に、より大きい(またはより小さい)程度が好ましく、例えば、約1.2倍〜2倍、好ましくは3〜10倍である。
別の実施形態において、DLDデバイスは、接着細胞を分離するための手順に用いることができる。本明細書で用いられる場合、用語「接着細胞」は、表面に接着する能力がある細胞を指す。接着細胞には、細胞培養に用いられる不死化細胞が挙げられ、哺乳類宿主に由来し得る。場合によっては、接着細胞は、精製の前にトリプシン処理され得る。接着細胞の例には、MRC−5細胞;HeLa細胞;Vero細胞;NIH 3T3細胞;L929細胞;Sf21細胞;Sf9細胞;A549細胞;A9細胞;AtT−20細胞;BALB/3T3細胞;BHK−21細胞;BHL−100細胞;BT細胞;Caco−2細胞;Chang細胞;Clone 9細胞;Clone M−3細胞;COS−1細胞;COS−3細胞;COS−7細胞;CRFK細胞;CV−1細胞;D−17細胞;Daudi細胞;GH1細胞;GH3細胞;HaK細胞;HCT−15細胞;HL−60細胞;HT−1080細胞;HT−29細胞;HUVEC細胞;I−10細胞;IM−9細胞;JEG−2細胞;Jensen細胞;Jurkat細胞;K−562細胞;KB細胞;KG−1細胞;L2細胞;LLC−WRC 256細胞;McCoy細胞;MCF7細胞;WI−38細胞;WISH細胞;XC細胞;Y−1細胞; CHO細胞;Raw 264.7;BHK−21細胞;293A、293Tなどを含むHEK 293細胞;HEP G2細胞;BAE−1細胞;SH−SY5Y細胞;ならびに、操作された株および組換え株を含む、それらの任意の誘導体が挙げられる。
DLDデバイスはまた、活性化細胞または活性化の能力がある細胞を、複数の他の細胞から分離するための手順に用いることができる。活性化を受けた細胞は、ラージスケールで成長し得るが、好ましい実施形態において、その細胞は、単一の患者に由来し、DLDが、収集から少なくとも数時間以内に実施される。用語「活性化細胞」または「活性化の能力がある細胞」は、細胞アクチベーターとの会合、インキュベーション、または接触を通して、それぞれ、活性化されている、または活性化され得る細胞を指す。活性化の能力がある細胞の例には、免疫または炎症応答において役割を果たす細胞、例えば、T細胞、B細胞;制御性T細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞など;代謝において役割を果たす細胞、例えば、β細胞、肝臓細胞、および膵臓細胞;ならびに誘導性タンパク質発現の能力がある組換え細胞、例えば、DE3溶原化E.コリ(E. coli)細胞、酵母細胞、植物細胞などが挙げられ得る。
DLDはまた、細胞にとって毒性であり得る化合物を除去するように、または細胞を毒性化合物による汚染を含まないようにしておくように設計された精製に用いることができる。例には、抗生物質、凍結保存剤、抗真菌剤、毒性代謝産物、アジ化ナトリウム、金属イオン、金属イオンキレート化剤、内毒素、可塑剤、殺虫剤、およびそれらの組合せが挙げられる。デバイスは、細胞から毒性化合物を除去して、細胞から材料の一貫した生産を保証するために用いることができる。場合によっては、細胞は、対数期細胞であり得る。用語「対数期細胞」は、指数関数的対数成長により特徴づけられる成長の時期における活発に分裂する細胞を指す。対数期において、細胞集団は、時間に対して細胞数の自然対数をプロットすることにより直線が生じるような、一定速度で倍増することができる。
DLD分離はまた、細胞から分泌された材料の精製に用いられ得る。そのような分泌性材料の例には、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、燃料、藻類に由来したものなどのバイオ燃料、ポリマー、単純な有機分子などの小分子、複雑な有機分子、薬物およびプロドラッグ、糖質、ならびにそれらの組合せが挙げられる。分泌性産物には、インスリン、イマチニブ、T細胞、T細胞受容体、Fc融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質スキャフォールド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解剤などの治療上有用なタンパク質が挙げられ得る。
本明細書で論じられたDLD方法により産生された細胞の純度、収率、および生存率は、出発材料の性質、使用される厳密な手順、およびDLDデバイスの特徴を含むいくつかの因子に基づいて変動する。好ましくは、少なくとも60%の精製、収率、および生存率が、得られるべきであり、より高いパーセンテージの、少なくとも70%、80%、または90%がより好ましい。好ましい実施形態において、方法は、全血、アフェレーシス産物、または白血球アフェレーシス産物から白血球を少なくとも70%の純度、収率、および生存率で単離するために用いられ得、より高いパーセンテージ(少なくとも80%、85%、または90%)が好ましい。
いかなる特定の理論にも捕らわれずに、マイクロ流体のいくつかの技術的側面の一般的な議論は、この分野において行われる分離に影響する因子を理解することにおいて助けとなり得る。様々な微細加工ふるいマトリックスが、粒子を分離するために開示されている(Chou, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:13762 (1999); Han, et al., Science 288:1026 (2000); Huang, et al., Nat. Biotechnol. 20:1048 (2002); Turner et al., Phys. Rev. Lett. 88(12):128103 (2002); Huang, et al., Phys. Rev. Lett. 89:178301 (2002); 米国特許第5,427,663号;米国特許第7,150,812号;米国特許第6,881,317号)。バンプアレイ(別名「障害物アレイ」)デバイスが記載されており、それらの基本的な動作は、例えば、米国特許第7,150,812号(全体として参照により本明細書に組み入れられている)に説明されている。バンプアレイは、本質的に、障害物のアレイ(一般的に、周期的に順序づけられたアレイ)を通過する粒子を分離する(segregate)ことにより、動作し、分離は、バルク流体フローの方向から、または印加電場の方向から斜めである「アレイ方向」に従う粒子間で起こる(U.S. 7,150,812)。
いくつかのアレイにおいて、隣接障害物の幾何学的配置は、間隙を定義する障害物の部分が、バルク流体フローの方向に延びる間隙の軸に関して対称であるような配置である。そのような間隙を通る流体フローの速度または容量プロフィールは、間隙に渡って、およそ放物線であり、流体速度および流量は、間隙を定義する各障害物の表面においてゼロであり(すべり流なしの状態を仮定した場合)、間隙の中心点で最大値に達する。プロフィールが放物線である場合、間隙を定義する障害物の1つに隣接する所定の幅の流体層が、間隙を定義するその他の障害物に隣接した同じ幅の流体層と等しい割合の流体流量を含有し、間隙の通過中に「バンピング」される粒子の臨界サイズが、粒子がどの障害物の近くを移動するかに関わらず、等しいことを意味する。
マイクロ流体デバイスにおいてサイズにより分離される物体には、細胞、生体分子、無機ビーズ、および他の物体が挙げられる。分画される典型的なサイズは、100ナノメートルから50マイクロメートルまでの範囲である。しかしながら、より大きい、およびより小さい粒子もまた、分画され得る場合もあり得る。
デザインに依存して、デバイス、またはデバイスの組合せは、試料の約10μlから少なくとも500μlの間、試料の約500μlから約40mLの間、試料の約500μlから約20mLの間、試料の約20mLから約200mLの間、試料の約40mLから約200mLの間、または少なくとも試料の200mLを処理するために用いられ得る。
デバイスは、1つまたは複数の注入口および1つまたは複数の出口を有する1つまたは複数のチャネルを含み得る。注入口は、試料または粗(すなわち、非精製)流体組成物用に、バッファー用に、または試薬を導入するために、用いられ得る。出口は、産物を収集するために用いられ得、または廃棄物用の出口として用いられ得る。チャネルは、幅が約0.5〜100mm、長さが約2〜200mmであり得るが、異なる幅および長さもまた可能である。深さは、1〜1000μmであり得、1個から100個までの範囲、またはそれ以上のチャネルが存在し得る。容量は、数μlから何mlまでもの非常に幅広い範囲に渡って変動し得、デバイスは、障害物の異なる立体配置での複数のゾーン(ステージまたはセクション)を有し得る。
障害物のアレイにおける間隙サイズ(ポスト間または障害物間のエッジからエッジまでの距離)は、約数(例えば、1〜500)マイクロメートルから変動し得、または1ミリメートルより大きくてもよい。いくつかの実施形態において、障害物は、1〜3000マイクロメートルの直径を有し、様々な形(球形、三角形、涙滴形、菱形、四角形、長方形など)を有し得る。ポストの第1行は、注入口の近くに(例えば、5μm以内に)位置し得、または1mmより遠く離れてあり得る。
デバイスは、複数の積み重ね可能なチップを含み得る。デバイスは、約1〜50個のチップを含み得る。場合によっては、デバイスは、直列に、または並列に、または両方で置かれた複数のチップを有し得る。
マイクロチップデザインおよび製作:この研究に用いられるDLDアレイは、単一ゾーンの鏡映型菱形ポストのデザインからなった(D'Silva, J., 「Throughout Microfluidic Capture of Rare Cells from Large Volumes of Blood」; A Dissertation Presented to the Faculty of Princeton University in Candidacy for the Degree of Doctor of Philosophy (2016)参照)。14レーンのDLDデバイスを生じる、チップあたり14個の並列アレイがあった(図1D)。デバイスは、ポスト間の16μmの間隙、および1/42傾斜を有するようにデザインされ、結果として、約4μmの臨界直径を生じた。プラスチックDLDデバイスを、ソフトエンボス加工と呼ばれるプロセスを用いて作製した。まず、プラスチックDLDマイクロチップについてのシリコン(Si)マスターを、標準フォトリソグラフィの深掘り反応性イオンエッチング技術を用いて作製した(Princeton University、PRISM)。その後、シリコンマスター上のフィーチャーを、Siフィーチャーの上にエラストマーを流し込み、硬化させることにより、ソフト弾性鋳型(Edge Embossing、Medford、MA)へ転写した。エラストマーを剥がして、シリコンマスターの再利用可能なネガティブインプリントが生じた。プラスチックブランクシートをエラストマー鋳型の間に置き、その後、圧力と温度の組合せを用いて、そのプラスチックを、ソフトエラストマーネガティブ鋳型のフィーチャー(ウェル)へ押し出し成形して、オリジナルのシリコンマスターのポジティブフィーチャーおよび深さを複製した。その後、そのソフトツールを、プラスチックデバイスから剥がして、マイクロポストのアレイの周りのフローチャネルおよび溝のパターンを有する、深さ約100μmまで表面エンボス加工されたプラスチックの平らな一片を生成した(図1D、挿入図)。マイクロチップの注入口末端および出口末端への流体アクセスのためにポートを作製した。超音波処理によるクリーニング後、デバイスを、感熱性で親水性の接着材(ARFlow Adhesives Research、Glen Rock、PA)で覆った。チップ全体は40×75mm、厚さ1mmであり、クレジットカードのサイズより小さかった。
アフェレーシス産物のDLDマイクロチップおよびFicoll処理
DLDおよびFicoll分離方法を用いて、12人の異なる正常なドナーから得られた12個のLRS試料を処理した。受け取られ、かつ処理されたそれらの12個の試料のうち、11個の試料は、それぞれ、およそ148.7×103個/μLのWBCカウント数および2.52×106個/μLの血小板カウント数の平均値に密集した(図2A、2B)。313.3×103個/μLのWBCカウント数および4.87×106個/μLの血小板カウント数を有する12番目の試料は、散布図において赤色三角形として見ることができる(図2A)。この試料は、処理の時点で、十分凝集しており、急速に20μmプレフィルターを詰まらせ、したがって、DLDに十分には流入しなかった。入力試料の顕微鏡検査により、この試料が、25〜50μmのサイズの範囲である血小板−WBC凝集体が充満していることが示され、250μm直径の規模の大きさの多数の凝集体が観察された(図2C、2D)。さらに、WBCカウント数と血小板カウント数の両方は、平均WBCカウント数および平均血小板カウント数より3標準偏差、高かった。四分位方法を用いて、この試料を、軽度の異常値として分類した;異常値についてのGrubbs検定および0.05のαレベルを用いて、この試料をまた、異常値として分類した20。結果として、このドナーを、極めて高いWBCカウント数および血小板カウント数、ならびに凝集が過度にひどく、かつ損傷していることに基づいて、本研究から排除した。
DLDまたはFicoll濃縮後、細胞を、CD3/CD28磁気ビーズを用いて、CD3+細胞あたり3.2個のビーズの目安で、60分間、活性化し、分離し、その後、プレーティングの前にカウントした。フローサイトメーターへのアクセスの制限および産物細胞カウント数における潜在的ビーズ干渉に関する懸念により、本発明者らは、入力物画分と非磁気画分の両方をカウントし、90%の効率での磁気分離(製造会社が報告した効率に基づいた)の仮定を用いて、引き算により磁石に結合したT細胞の数を得ることにより、T細胞カウント数を推定した。正確なT細胞カウント数を、培養へのプレーティング後に、フローサイトメトリにより、およびコールターカウンターによる絶対カウント数×%CD3陽性細胞を用いて、決定した;これらのカウント数は、最初の磁気CD3+細胞デプレションプロセスがたった44%効率であったことを確立した(表2)。これは、CD3+細胞あたり3.2個のビーズという目安に関係する最初の計算が、実際、DLD画分とFicoll画分の両方について平均して2.3個であり(目安とされた数よりT細胞あたり少ないビーズ)、直接的磁石画分においては5:1比(目安とされた数よりT細胞あたり有意に多いビーズ)であることを意味し、DLDアームとFicollアームの両方と比較して、直接的磁石画分に、さらにより高い増殖倍率を生じさせた可能性がある。
この出願は、国際出願日2017年10月23日を有する国際出願PCT/US2017/057876の米国国内段階であり、2016年10月24日に出願された米国仮特許出願第62/412,180号、2017年9月1日に出願された米国仮特許出願第62/553,723号、および2017年10月3日に出願された米国仮特許出願第62/567,553号の恩典を主張し、それらの米国仮特許出願は全て、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
それの第1の態様において、本発明は、標的細胞集団を遺伝子操作する方法に向けられる。これは、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換(DLD)を実施することにより、標的細胞を粗流体組成物から単離することにより行われる。そのデバイスは、試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延び、かつ第1の壁およびその第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、少なくとも1つのチャネルの存在により特徴づけられる。障害物のアレイは、チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列され、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしている。その障害物は、粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、チャネルを通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、混入細胞または粒子は、収集出口から切り離されている1つまたは複数の廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている。いったん標的細胞が、デバイスを用いて精製されたならば、それらは、その細胞に所望の表現型を付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、治療上の価値のある細胞にするタンパク質)を発現するように設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入される。その後、細胞集団は、インビトロ(in vitro)での培養により増殖され得る。培養および増殖された時、所望の表現型を示す組換え的に操作された標的細胞の収率は、DLDに供されていない同一の細胞(特に、Ficoll遠心分離に曝されたが、DLDには曝されなかった細胞)より、好ましくは、少なくとも10%高く、より好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、または50%高い。
本発明はまた、上記の手順を用いて、活性化の能力がある細胞を精製する方法を含む。好ましい実施形態において、本発明は、以下により、活性化細胞を複数の他の細胞から分離する方法に向けられる:a)活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、前記担体の1つまたは複数が、細胞アクチベーターを含み、1つまたは複数の担体が、接触により、または接触後、細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞に少なくとも部分的に会合して、担体会合化細胞複合体を生成し、少なくとも部分的な、前記細胞アクチベーターの前記活性化の能力がある細胞との会合が、前記活性化の能力がある細胞を活性化し、前記担体会合化細胞複合体が、他の細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化細胞複合体のサイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が、前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;b)前記粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記活性化細胞を前記複数の他の細胞から分離する、工程。その後、分離された担体会合化細胞複合体を含む流体組成物が収集され得る。このプロセスの間、その細胞は、適宜、その細胞に所望の表現型を付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、より高い治療上の価値がある細胞にするタンパク質)を発現するように、設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入され得る。
デバイスは、複数の積み重ね可能なチップを含み得る。デバイスは、約1〜50個のチップを含み得る。場合によっては、デバイスは、直列に、または並列に、または両方で置かれた複数のチップを有し得る。
アフェレーシス産物のDLDマイクロチップおよびFicoll処理
DLDおよびFicoll分離方法を用いて、12人の異なる正常なドナーから得られた12個のLRS試料を処理した。受け取られ、かつ処理されたそれらの12個の試料のうち、11個の試料は、それぞれ、およそ148.7×103個/μLのWBCカウント数および2.52×106個/μLの血小板カウント数の平均値に密集した(図2A、2B)。313.3×103個/μLのWBCカウント数および4.87×106個/μLの血小板カウント数を有する12番目の試料は、散布図において三角形として見ることができる(図2A)。この試料は、処理の時点で、十分凝集しており、急速に20μmプレフィルターを詰まらせ、したがって、DLDに十分には流入しなかった。入力試料の顕微鏡検査により、この試料が、25〜50μmのサイズの範囲である血小板−WBC凝集体が充満していることが示され、250μm直径の規模の大きさの多数の凝集体が観察された(図2C、2D)。さらに、WBCカウント数と血小板カウント数の両方は、平均WBCカウント数および平均血小板カウント数より3標準偏差、高かった。四分位方法を用いて、この試料を、軽度の異常値として分類した;異常値についてのGrubbs検定および0.05のαレベルを用いて、この試料をまた、異常値として分類した20。結果として、このドナーを、極めて高いWBCカウント数および血小板カウント数、ならびに凝集が過度にひどく、かつ損傷していることに基づいて、本研究から排除した。
Claims (155)
- 以下の工程を含む、標的細胞の集団を操作する方法:
a)標的細胞を粗流体組成物から単離する工程であって、単離手順が、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含み、前記デバイスが、
i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含む、工程;
b)前記収集出口から得られた標的細胞を、所望の表現型を有するように遺伝子操作する工程。 - 前記遺伝子操作する工程が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、遺伝子操作された標的細胞が、それらをインビトロで(in vitro)培養することにより増殖される、請求項1に記載の方法。
- 前記所望の表現型を示す標的細胞の収率が、Ficoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていない同一の細胞より少なくとも10%高い、請求項2に記載の方法。
- 前記粗流体組成物が、血液、または血液にアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスを実施することにより取得されている組成物である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的細胞が白血球である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が、B細胞、T細胞、NK細胞、単球、または前駆細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が樹状細胞である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 前記粗流体組成物が患者から取得される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 前記粗流体組成物における標的細胞が、形質導入またはトランスフェクションされる前に担体と結合していない、請求項8に記載の方法。
- 標的細胞に、DLDを実施する前に、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項8に記載の方法。
- 標的細胞に、DLDを実施した後で、かつそれらを形質導入またはトランスフェクションする前かまたは後のいずれかで、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項9に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する親和性物質を表面上に含む、請求項10または11に記載の方法。
- 前記物質が、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマーである、請求項12に記載の方法。
- 前記担体の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の50%以下の長さである、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の25%以下の長さである、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 担体の1つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 担体の1つの群が、標的細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項10〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項10〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、標的細胞に初めて担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項10〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から標的細胞に初めて担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項10〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項24または25に記載の方法。
- 以下の工程を含む、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を作製する方法:
a)T細胞を含む粗流体組成物を取得する工程;
b)i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記T細胞とは異なるサイズである細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイスを用いて、前記粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施する工程;
c)工程b)において取得された濃縮産物中のT細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を産生するように遺伝子操作する工程。 - 前記粗流体組成物が、患者由来の血液から取得されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であり、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ異なるサイズである赤血球、血小板、または他の粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる、請求項27に記載の方法。
- 前記遺伝子操作が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、遺伝子操作された標的細胞が、インビトロで前記細胞を成長させることにより、さらに増殖される、請求項27または28に記載の方法。
- 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも10%高い、請求項27〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも20%高い、請求項30に記載の方法。
- 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも50%高い、請求項30に記載の方法。
- 前記CARが、a)抗原結合ドメインを含む細胞外領域;b)膜貫通領域;c)細胞内領域を含み、前記CAR T細胞が、トリガーされた時、CAR T細胞の数または活性を低下させる分子スイッチを前記細胞に提供する1つまたは複数の組換え配列を含んでもよい、請求項27〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の、一本鎖可変断片(scFv)である、請求項33に記載の方法。
- 前記CARが、細胞外領域と膜貫通領域を接続する2〜20個のアミノ酸のヒンジ領域を含む、請求項33または34に記載の方法。
- 前記膜貫通領域が、CD8またはCD28タンパク質配列を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記細胞内領域が、CD3ζ、CD137、またはCD28細胞内ドメインに由来したシグナル伝達ドメインを含む、請求項33〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞を含む粗流体組成物が、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患を有する患者から取得される、請求項27〜37のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物を取得した後、前記流体組成物中のT細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項38に記載の方法。
- T細胞に、DLDを実施する前に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項39に記載の方法。
- T細胞に、DLDを実施した後で、かつそれらが遺伝子操作される前かまたは後のいずれかで、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項39に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の担体が、前記T細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の50%以下の長さである、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の25%以下の長さである、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 担体の1つの群が、T細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項39〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項39〜49のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記T細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項39〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項39〜50のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項27〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項27〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項53または54に記載の方法。
- CAR T細胞を作製することにおける全工程が、T細胞を含む粗流体組成物が取得される同じ施設で実施され、全工程が、合計4時間以内に完了する、請求項27〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項27〜55のいずれか一項に記載の方法により作製されたCAR T細胞。
- 癌、自己免疫疾患、または感染性疾患について患者を処置する方法であって、前記患者由来の癌細胞、自己免疫細胞、または感染細胞上の抗原を認識するキメラ抗原受容体を発現するように操作されたCAR T細胞を前記患者に投与することを含み、前記CAR T細胞が、以下の工程を含むプロセスにより作製されている、方法:
a)T細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程;
b)i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記T細胞とは異なるサイズである細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイスを用いて、前記粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施する工程;
c)工程b)において取得された前記T細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子操作する工程;
d)操作されたT細胞の数を、前記細胞をインビトロで成長させることにより増加させる工程;ならびに
e)前記粗流体組成物が取得された患者へ前記操作されたT細胞を投与する工程。 - 前記粗流体組成物が、前記患者由来の血液から取得されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であり、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ異なるサイズである赤血球、血小板、または他の粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる、請求項58に記載の方法。
- 遺伝子操作が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含む、請求項58または59に記載の方法。
- 表面上にキメラ受容体を発現する細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも10%高い、請求項60に記載の方法。
- 表面上にキメラ受容体を発現する標的細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも50%高い、請求項60に記載の方法。
- 前記CARが、a)抗原結合ドメインを含む細胞外領域;b)膜貫通領域;およびc)細胞内領域を含み、前記CAR T細胞が、トリガーされた時、CAR T細胞の数または活性を低下させる分子スイッチを前記細胞に提供する1つまたは複数の組換え配列を含んでもよい、請求項58〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の、一本鎖可変断片(scFv)である、請求項63に記載の方法。
- 前記CARが、細胞外領域と膜貫通領域を接続する2〜20個のアミノ酸のヒンジ領域を含む、請求項63または64に記載の方法。
- 前記膜貫通領域が、CD8またはCD28タンパク質配列を含む、請求項63〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞内領域が、CD3ζ、CD137、またはCD28細胞内ドメインに由来したシグナル伝達ドメインを含む、請求項63〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者が白血病を有する、請求項58〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記白血病が急性リンパ芽球性白血病である、請求項68に記載の方法。
- 前記CARが抗原CD19またはCD20を認識する、請求項68または69に記載の方法。
- 前記患者が固形腫瘍を有する、請求項58〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CARが、CD22;RORI;メゾテリン;CD33/IL3Ra;c−Met;PSMA;糖脂質F77;EGFRvIII;GD−2;NY−ESO−l TCR;MAGE A3 TCR;およびそれらの組合せからなる群から選択される抗原を認識する、請求項71に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物を取得した後に、前記流体中のT細胞に、DLD分離を促進するように、担体を結合させる、請求項58〜72のいずれか一項に記載の方法。
- DLDを実施する前に、T細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項73に記載の方法。
- DLDを実施した後で、かつT細胞が、キメラ受容体を発現するように遺伝子操作される前かまたは後のいずれかで、T細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項73に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の担体が、前記T細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項73〜75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項73〜76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の50%以下の長さである、請求項73〜76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項73〜76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の25%以下の長さである、請求項73〜76のいずれか一項に記載の方法。
- 担体の1つの群が、T細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項80に記載の方法。
- 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項73〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項73〜82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項73〜83のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記T細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項73〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項73〜84のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項73〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項73〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項87または88に記載の方法。
- T細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも1日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも3日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58〜89のいずれか一項に記載の方法。
- a)標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程;
b)マイクロ流体デバイスを用いて、前記標的細胞を含む粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施して、標的細胞が濃縮された組成物を得る工程;
を含み、DLDの前かまたは後のいずれかに、標的細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させ、前記標的細胞を含む粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、5時間より長く経過していない、患者から標的細胞を収集する方法。 - 前記1つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項92に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項92または93に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の50%以下の長さである、請求項92または93に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項92または93に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の25%以下の長さである、請求項92または93に記載の方法。
- 担体の1つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項92または93に記載の方法。
- 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項92または93に記載の方法。
- 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項92〜99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項92〜100のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92〜101のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項92〜101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞を含む粗流体組成物が、患者由来の血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施することにより、取得される、請求項92〜103のいずれか一項に記載の方法。
- DLDにより標的細胞が濃縮された組成物中の標的細胞が、ウイルスベクターを用いて形質導入される、請求項92〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞が、電気的に、化学的に、またはナノ粒子を用いて、トランスフェクションされる、請求項105に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスが
a)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
b)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記標的細胞を含む粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含む、請求項92〜106のいずれか一項に記載の方法。 - 前記標的細胞がT細胞である、請求項92〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞が、ナチュラルキラーT細胞、セントラルメモリーT細胞、ヘルパーT細胞、および制御性T細胞からなる群から選択される、請求項108に記載の方法。
- 前記標的細胞が幹細胞である、請求項92〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、または顆粒球である、請求項92〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞を含む粗流体組成物が、抗凝固剤として働き、または血小板の活性化を防ぐ1つまたは複数の添加物を含む、請求項92〜111のいずれか一項に記載の方法。
- 前記添加物が、チクロピジン、イノシン、プロトカテキュ酸、アセチルサリチル酸、およびチロフィバンからなる群から選択される、請求項112に記載の方法。
- 工程a)およびb)がどちらも、標的細胞を含む粗流体組成物が患者から取得される現地で行われる、請求項92〜113のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞を含む粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92〜114のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92〜114のいずれか一項に記載の方法。
- c)細胞を遺伝子操作し、および/もしくは数を増加させる工程;ならびに/または
d)前記標的細胞が取得された同じ患者を、収集された標的細胞で処置する工程
をさらに含む、請求項92〜116のいずれか一項に記載の方法。 - 工程e)後に、前記標的細胞が凍結保存される、請求項117に記載の方法。
- 工程c)において培養される標的細胞が、アクチベーターの存在下で培養されるT細胞である、請求項117または118に記載の方法。
- 前記アクチベーターが担体に結合している、請求項119に記載の方法。
- 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも1日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも3日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項92〜122のいずれか一項に記載の方法により作製された標的細胞。
- 請求項123に記載の標的細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または状態について患者を処置する方法。
- 以下の工程を含む、接着細胞を複数の他の細胞から分離する方法:
a)複数の他の細胞および接着細胞を含む粗流体組成物を、DLD分離を促進するように結合する1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、前記接着細胞が、接触により、または接触後に担体と少なくとも部分的に会合して、担体会合化接着細胞複合体を生成し、前記担体会合化接着細胞複合体が、前記複数の他の細胞における細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化接着細胞複合体のサイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;
b)前記粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに
c)前記担体会合化接着細胞複合体を含む前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化接着細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記担体会合化接着細胞複合体を前記複数の他の細胞から分離する、工程;
d)分離された担体会合化接着細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。 - 前記接着細胞が、前記接着細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、2時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、1時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞または前記担体接着細胞複合体が初めて前記デバイスから収集されるまで、4時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞または前記担体接着細胞複合体が初めて前記デバイスから収集されるまで、4時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
- 前記担体が、前記接着細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項125〜130のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の直径が、前記接着細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項125〜131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、前記接着細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項125〜131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、前記接着細胞の直径の少なくとも10倍の長さである、請求項125〜131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、10〜600μmである、請求項125〜131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接着細胞が、MRC−5細胞;HeLa細胞;Vero細胞;NIH 3T3細胞;L929細胞;Sf21細胞;Sf9細胞;A549細胞;A9細胞;AtT−20細胞;BALB/3T3細胞;BHK−21細胞;BHL−100細胞;BT細胞;Caco−2細胞;Chang細胞;Clone 9細胞;Clone M−3細胞;COS−1細胞;COS−3細胞;COS−7細胞;CRFK細胞;CV−1細胞;D−17細胞;Daudi細胞;GH1細胞;GH3細胞;HaK細胞;HCT−15細胞;HL−60細胞;HT−1080細胞;HEK細胞、HT−29細胞;HUVEC細胞;I−10細胞;IM−9細胞;JEG−2細胞;Jensen細胞;Jurkat細胞;K−562細胞;KB細胞;KG−1細胞;L2細胞;LLC−WRC 256細胞;McCoy細胞;MCF7細胞;WI−38細胞;WISH細胞;XC細胞;Y−1細胞;CHO細胞;Raw 264.7細胞;HEP G2細胞;BAE−1細胞;SH−SY5Y細胞、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項125〜135のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接着細胞が幹細胞である、請求項125〜135のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、活性化細胞を複数の他の細胞から分離する方法:
a)活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を、1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、少なくとも1つの担体が細胞アクチベーターを含み、前記細胞アクチベーターが、接触により、または接触後に、前記細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞と少なくとも部分的に会合して、担体会合化細胞複合体を生成し、前記細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞との前記細胞アクチベーターの会合が、前記活性化の能力がある細胞を少なくとも部分的に活性化し、前記担体会合化細胞複合体が、前記複数の他の細胞における細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化細胞複合体のサイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;
b)前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに
c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記活性化細胞を前記複数の他の細胞から分離する、工程;
d)分離された担体会合化細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。 - 前記活性化の能力がある細胞が、T細胞、B細胞、制御性T細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞、β細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、DE3溶原化細胞、酵母細胞、植物細胞、および幹細胞からなる群から選択される、請求項0に記載の方法。
- 細胞アクチベーターがタンパク質である、請求項138または139に記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体である、請求項140に記載の方法。
- 前記タンパク質が、CD3、CD28、抗原、ヘルパーT細胞、受容体、サイトカイン、糖タンパク質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項140に記載の方法。
- 前記細胞アクチベーターが、インスリン、IPTG、ラクトース、アロラクトース、脂質、グリコシド、テルペン、ステロイド、アルカロイド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項138に記載の方法。
- 前記活性化の能力がある細胞が、前記活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項138〜143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項138〜143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、2時間より長く経過していない、請求項138〜143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、工程c)が完了するまで、4時間より長く経過していない、請求項138〜143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、工程c)が完了するまで、3時間より長く経過していない、請求項138〜143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞と少なくとも同じ長さである、請求項138〜148のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項138〜148のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、138〜148の直径の少なくとも10倍の長さである、請求項138〜148のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の直径が、10〜600μmである、請求項138〜148のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、細胞から分泌性産物を連続的に精製する方法:
a)細胞を含む流体組成物を取得する工程であって、前記細胞が、前記流体組成物中に懸濁しており、前記細胞が分泌性産物を前記懸濁液へ分泌し、前記細胞が前記分泌性産物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、前記細胞の既定サイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが、前記臨界サイズ未満である、工程;
b)前記細胞を含む流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;
b)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記細胞が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記分泌性産物が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記分泌性産物を前記細胞から分離する、工程;
c)前記分泌性産物を収集する工程であって、それにより、実質的に純粋である前記分泌性産物の試料を生じる、工程;
d)分離された細胞を含む回収された流体組成物を収集する工程;ならびに
e)分離された細胞を含む回収された流体組成物を、前記デバイスに再アプライし、工程(a)〜(e)を繰り返す工程であって、それにより、分泌性産物を細胞から連続的に精製する、工程。 - 前記分泌性産物が、タンパク質、抗体、バイオ燃料、ポリマー、小分子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項153に記載の方法。
- 前記細胞が、細菌細胞、藻類細胞、哺乳類細胞、および腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項153に記載の方法。
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