CN116783283A - 产生具有增加的核酸摄取的细胞群体的方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了在不使用毒性密度梯度介质的情况下基于尺寸产生富集的靶细胞群体的方法，其中富集的靶细胞群体具有改善的被内源核酸(包括具有治疗潜力的核酸)基因工程化的能力。

Description

产生具有增加的核酸摄取的细胞群体的方法

交叉引用

本申请要求2020年11月13日提交的美国临时专利申请号63/113,471；和2021年3月19日提交的美国临时专利申请号63/163,585的权益；其各自通过引用整体并入本文。

背景技术

对于许多患有癌症、自身免疫性疾病和遗传疾病的患者，细胞疗法是重要且日益增长的治疗选择。然而，这些疗法需要能够产生大量的赋予治疗益处的核酸转基因细胞。

发明内容

目前，需要用于从患者和/或个体中富集原代细胞的方法，使其具有高活力和用外源治疗性核酸进行转基因的高能力。许多基于细胞的疗法如嵌合抗原受体T细胞(CART-细胞)或表达重组T细胞受体的T细胞通过表达这些重组分子的病毒转导。

本文描述了具有改善的用外源核酸(包括具有治疗潜力的核酸)基因工程化的能力的细胞的方法和组合物。核酸可通过病毒如慢病毒、腺病毒或腺相关病毒递送。这样的方法和细胞组合物允许改善治疗上有用的细胞的生产，允许产生更大量的基因工程化细胞，更短的用于孵育基因工程化细胞的时间框架，或两者。在某些实施方案中，本文所述的方法允许基于尺寸的富集，而不使用毒性密度梯度介质，并且所得的细胞群体显示出更大的用表达治疗相关多肽的治疗相关基因转染或转导的能力。

在一个方面，本文描述了用于获得基因工程化细胞组合物的方法，其包括：(a)提供包括一种或多种靶细胞的生物样品；(b)从包括一种或多种靶细胞的生物样品中除去预定直径的细胞组分以获得富集的靶细胞群体，其中预定直径为7微米或更小；和(c)使富集的靶细胞群体与外源核酸接触，从而提供基因工程化的靶细胞群体。在一些实施方案中，预定直径为4微米或更小。在某些实施方案中，预定直径为约5微米或更小。在某些实施方案中，预定直径为约4微米或更小。在某些实施方案中，生物样品是包括一种或多种细胞的流体。在某些实施方案中，一种或多种细胞是人细胞。在某些实施方案中，生物样品选自血液相关样品、骨髓样品和脂肪样品及其组合。在某些实施方案中，生物样品是人生物样品。在某些实施方案中，生物样品是血液相关样品。在某些实施方案中，血液相关样品包括大于约2％的血细胞比容。在某些实施方案中，血液相关样品包括大于约4％的血细胞比容。在某些实施方案中，血液相关样品包括小于约30％的血细胞比容。在某些实施方案中，血液相关样品是白细胞去除术产物。在某些实施方案中，外源核酸是病毒的组分。在某些实施方案中，病毒选自慢病毒、腺病毒或腺相关病毒及其组合。在某些实施方案中，病毒是慢病毒。在某些实施方案中，病毒是腺病毒。在某些实施方案中，病毒是腺相关病毒。在某些实施方案中，腺相关病毒是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9。在某些实施方案中，病毒是假型病毒。在某些实施方案中，病毒包含非病毒核酸。在某些实施方案中，非病毒核酸包含用于基因编辑的指导RNA。在某些实施方案中，非病毒核酸包含编码基因编辑系统的多肽组分的序列。本领域已知的此类系统包括TALEN、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12等。在某些实施方案中，非病毒核酸是包含靶链和指导链的CRISPR构建体。在某些实施方案中，非病毒核酸编码多肽。在某些实施方案中，多肽包括免疫球蛋白、嵌合抗原受体、T细胞受体、细胞因子或趋化因子。在某些实施方案中，非病毒核酸包含嵌合抗原受体。在某些实施方案中，以10:1或更大的感染复数使病毒与富集的靶细胞群体接触。在某些实施方案中，以25:1或更大的感染复数使病毒与富集的靶细胞群体接触。在某些实施方案中，以50:1或更大的感染复数使病毒与富集的靶细胞群体接触。在某些实施方案中，通过电穿孔使富集的靶细胞群体与外源核酸接触。在某些实施方案中，通过细胞压缩使富集的靶细胞群体与外源核酸接触。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括造血干细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞包括CD45+免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞包括B淋巴细胞或T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+、CD4+T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+、CD8+T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+、CD8+T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+、CD8+、CD4+T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+、CD8-、CD4-T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括包含至少约35％ CD3+T淋巴细胞的细胞群体。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括包含至少约40％ CD3+T淋巴细胞的细胞群体。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括自然杀伤细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括脂肪来源的干细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括骨髓来源的干细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括间充质干细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板，血小板与靶细胞的比率为约500:1或更小。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板，血小板与靶细胞的比率为约100:1或更小。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板，血小板与靶细胞的比率为约10:1或更小。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板，血小板与靶细胞的比率为约5:1或更小。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞，红细胞与靶细胞的比率为约100:1或更高。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞，红细胞与靶细胞的比率为约250:1或更高。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞，红细胞与靶细胞的比率为约500:1或更高。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞，红细胞与靶细胞的比率为约1000:1或更小。在某些实施方案中，方法还包括使富集的靶细胞群体与活化剂接触。在某些实施方案中，方法包括在从包括一种或多种靶细胞的生物样品中除去预定直径或预定密度的细胞组分之后，但在使一种或多种靶细胞与外源核酸接触之前，使富集的靶细胞群体与活化剂接触。在某些实施方案中，活化剂包括抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、抗-CD137抗体、抗-CD2抗体、抗-CD35抗体、白介素-2、白介素-7或白介素-15、白介素-21、白介素-6、TGFβ、CD40配体、PMA/离子霉素、伴刀豆球蛋白A、美洲商陆有丝分裂原或植物凝集素中的一种或多种。在某些实施方案中，活化剂包括抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、白介素-2、白介素-7或白介素-15中的一种或多种。在某些实施方案中，基因工程化的靶细胞在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后3天表现出比密度梯度分离方法更大的转导效率。在某些实施方案中，基因工程化的富集靶细胞群体在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后3天表现出至少约50％的转导效率。在某些实施方案中，基因工程化的富集靶细胞群体在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后3天表现出至少约60％的转导效率。在某些实施方案中，基因工程化的靶细胞在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后6天表现出比密度梯度分离方法更大的转导效率。在某些实施方案中，基因工程化的富集靶细胞群体在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后6天表现出至少约60％的转导效率。在某些实施方案中，基因工程化的富集靶细胞群体在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后6天表现出至少约70％的转导效率。在某些实施方案中，方法还包括在富集的靶细胞群体与外源核酸接触后第4天或更早时收获基因工程化的富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，方法还包括在富集的靶细胞群体与外源核酸接触后第5天或更早时收获基因工程化的富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，方法还包括在富集的靶细胞群体与外源核酸接触后第6天或更早时收获基因工程化的富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，方法还包括在富集的靶细胞群体与外源核酸接触后第7天或更早时收获基因工程化的富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，方法还包括在富集的靶细胞群体与外源核酸接触后第8天或更早时收获基因工程化的富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，在富集的靶细胞群体接触外源核酸后的第3天至第8天收获细胞。在某些实施方案中，在富集的靶细胞群体接触外源核酸后的第3天至第7天收获细胞。在某些实施方案中，在富集的靶细胞群体接触外源核酸后的第3天至第6天收获细胞。在某些实施方案中，在富集的靶细胞群体接触外源核酸后的第3天至第5天收获细胞。在某些实施方案中，收获至少1×10⁸个基因工程化的靶细胞。在某些实施方案中，收获至少1×10⁷个基因工程化的靶细胞。在某些实施方案中，从生物样品中除去预定直径的细胞组分不使用密度梯度介质。在某些实施方案中，从生物样品中除去预定直径的细胞组分采用确定性侧向位移。

在另一个方面，本文描述了用于获得基因工程化细胞组合物的方法，其包括：(a)提供包括一种或多种靶细胞的生物样品；(b)从包括一种或多种靶细胞的生物样品中除去预定直径的细胞组分，其中预定密度为1.1克/毫升或更低；以获得富集的靶细胞群体；和(c)使富集的靶细胞群体与外源核酸接触，从而提供基因工程化的富集的靶细胞。在某些实施方案中，预定密度为约1.09克/毫升或更低。在某些实施方案中，预定密度为约1.08克/毫升或更低。在某些实施方案中，生物样品是包括一种或多种细胞的流体。在某些实施方案中，一种或多种细胞是人细胞。在某些实施方案中，生物样品选自血液相关样品、骨髓样品和脂肪样品及其组合。在某些实施方案中，生物样品是人生物样品。在某些实施方案中，生物样品是血液相关样品。在某些实施方案中，血液相关样品包括大于约2％的血细胞比容。在某些实施方案中，血液相关样品包括大于约4％的血细胞比容。在某些实施方案中，血液相关样品包括小于约30％的血细胞比容。在某些实施方案中，血液相关样品是白细胞去除术产物。在某些实施方案中，外源核酸是病毒的组分。在某些实施方案中，病毒选自慢病毒、腺病毒或腺相关病毒及其组合。在某些实施方案中，病毒是慢病毒。在某些实施方案中，病毒是腺病毒。在某些实施方案中，病毒是腺相关病毒。在某些实施方案中，病毒包含非病毒核酸。在某些实施方案中，非病毒核酸是包含靶链和指导链的CRISPR构建体。在某些实施方案中，非病毒核酸编码多肽。在某些实施方案中，多肽包括免疫球蛋白、嵌合抗原受体、T细胞受体、细胞因子或趋化因子。在某些实施方案中，非病毒核酸包含嵌合抗原受体。在某些实施方案中，以10:1或更大的感染复数使病毒与富集的靶细胞群体接触。在某些实施方案中，以25:1或更大的感染复数使病毒与富集的靶细胞群体接触。在某些实施方案中，以50:1或更大的感染复数使病毒与富集的靶细胞群体接触。在某些实施方案中，通过电穿孔使富集的靶细胞群体与外源核酸接触。在某些实施方案中，通过细胞压缩使富集的靶细胞群体与外源核酸接触。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括造血干细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞包括CD45+免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞包括B淋巴细胞或T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+、CD4+T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+、CD8+T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+、CD8+T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+、CD8+、CD4+T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+、CD8-、CD4-T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括包含至少约35％ CD3+T淋巴细胞的细胞群体。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括包含至少约40％ CD3+T淋巴细胞的细胞群体。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括自然杀伤细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括脂肪来源的干细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括骨髓来源的干细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括间充质干细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板，血小板与靶细胞的比率为约500:1或更小。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板，血小板与靶细胞的比率为约100:1或更小。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板，血小板与靶细胞的比率为约10:1或更小。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板，血小板与靶细胞的比率为约5:1或更小。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞，红细胞与靶细胞的比率为约100:1或更高。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞，红细胞与靶细胞的比率为约250:1或更高。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞，红细胞与靶细胞的比率为约500:1或更高。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞，红细胞与靶细胞的比率为约1000:1或更小。在某些实施方案中，方法还包括使富集的靶细胞群体与活化剂接触。在某些实施方案中，方法包括在从包括一种或多种靶细胞的生物样品中除去预定直径或预定密度的细胞组分之后，但在使一种或多种靶细胞与外源核酸接触之前，使富集的靶细胞群体与活化剂接触。在某些实施方案中，活化剂包括抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、抗-CD137抗体、抗-CD2抗体、抗-CD35抗体、白介素-2、白介素-7或白介素-15、白介素-21、白介素-6、TGFβ、CD40配体、PMA/离子霉素、伴刀豆球蛋白A、美洲商陆有丝分裂原或植物凝集素中的一种或多种。在某些实施方案中，活化剂包括抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、白介素-2、白介素-7或白介素-15中的一种或多种。在某些实施方案中，基因工程化的靶细胞在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后3天表现出比密度梯度分离方法更大的转导效率。在某些实施方案中，基因工程化的富集靶细胞群体在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后3天表现出至少约50％的转导效率。在某些实施方案中，基因工程化的富集靶细胞群体在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后3天表现出至少约60％的转导效率。在某些实施方案中，基因工程化的靶细胞在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后6天表现出比密度梯度分离方法更大的转导效率。在某些实施方案中，基因工程化的富集靶细胞群体在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后6天表现出至少约60％的转导效率。在某些实施方案中，基因工程化的富集靶细胞群体在一种或多种靶细胞与外源核酸接触后6天表现出至少约70％的转导效率。在某些实施方案中，方法还包括在富集的靶细胞群体与外源核酸接触后第4天或更早时收获基因工程化的富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，方法还包括在富集的靶细胞群体与外源核酸接触后第5天或更早时收获基因工程化的富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，方法还包括在富集的靶细胞群体与外源核酸接触后第6天或更早时收获基因工程化的富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，方法还包括在富集的靶细胞群体与外源核酸接触后第7天或更早时收获基因工程化的富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，方法还包括在富集的靶细胞群体与外源核酸接触后第8天或更早时收获基因工程化的富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，在富集的靶细胞群体接触外源核酸后的第3天至第8天收获细胞。在某些实施方案中，在富集的靶细胞群体接触外源核酸后的第3天至第7天收获细胞。在某些实施方案中，在富集的靶细胞群体接触外源核酸后的第3天至第6天收获细胞。在某些实施方案中，在富集的靶细胞群体接触外源核酸后的第3天至第5天收获细胞。在某些实施方案中，收获至少1×10⁸个基因工程化的靶细胞。在某些实施方案中，收获至少1×10⁷个基因工程化的靶细胞。在某些实施方案中，从生物样品中除去预定直径的细胞组分不使用密度梯度介质。在某些实施方案中，从生物样品中除去预定直径的细胞组分采用确定性侧向位移。

本文还描述了包括一种或多种富集的靶细胞、血小板细胞和红细胞的细胞群体，其中血小板与富集的靶细胞的比率小于约500:1，并且红细胞与富集的靶细胞的比率大于约50:1，其中大于约60％的富集的靶细胞包含外源核酸。在某些实施方案中，外源核酸编码多肽。在某些实施方案中，细胞群体表达多肽。在某些实施方案中，外源多肽包括免疫球蛋白、嵌合抗原受体、T细胞受体、细胞因子或趋化因子。在某些实施方案中，外源多肽包括嵌合抗原受体。在某些实施方案中，富集的靶细胞包括人细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞、血小板细胞和红细胞包括人细胞。在某些实施方案中，血小板与富集的靶细胞的比率小于约100:1。在某些实施方案中，血小板与富集的靶细胞的比率小于约10:1。在某些实施方案中，血小板与富集的靶细胞的比率小于约5:1。在某些实施方案中，红细胞与富集的靶细胞的比率大于约100:1。在某些实施方案中，红细胞与富集的靶细胞的比率大于约250:1。在某些实施方案中，红细胞与富集的靶细胞的比率大于约500:1。在某些实施方案中，红细胞与富集的靶细胞的比率大于约1,000:1。在某些实施方案中，一种或多种富集的靶细胞包括免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞包括CD45+免疫细胞。在某些实施方案中，CD45+免疫细胞至少约35％ CD3+T淋巴细胞。在某些实施方案中，CD45+免疫细胞至少约40％ CD3+T淋巴细胞。在某些实施方案中，免疫细胞包括B淋巴细胞或T淋巴细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括CD3+T淋巴细胞。在某些实施方案中，一个或多个靶细胞具有在耗竭前分裂至少3次的能力。在某些实施方案中，细胞群体还包括白介素7。在某些实施方案中，白介素-7以至少25ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，细胞群体还包括白介素-15。在某些实施方案中，白介素-15以至少25ng/mL的浓度存在。

在本文所述的另一个方面，是从对象的样品分离的细胞群体，细胞群体包括包含异源DNA的细胞，其中与通过密度梯度离心从样品分离的血沉棕黄层细胞群体相比：(a)细胞群体中白细胞的数目比血沉棕黄层细胞群体中白细胞的数目多至少2倍；(b)细胞群体中T细胞的数目比血沉棕黄层细胞群体中T细胞的数目多至少2倍；(c)细胞群体中红细胞与T细胞的比率比血沉棕黄层细胞群体中红细胞与T细胞的比率小至少5倍；(d)细胞群体中血小板与T细胞的比率比血沉棕黄层细胞群体中血小板与T细胞的比率小至少5倍；(e)细胞群体中衰老细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中衰老细胞的百分比低至少10％；(f)细胞群体中耗竭细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中耗竭细胞的百分比低至少10％；(g)细胞群体中表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比低至少10％；(h)细胞群体中T中央记忆细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中T中央记忆细胞的百分比高至少10％；(i)细胞群体中为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞的百分比高至少10％；(j)细胞群体中包含异源DNA的细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中包含异源DNA的细胞的百分比高至少20％；并且用包含异源DNA的病毒载体转导细胞群体和血沉棕黄层细胞群体；(k)细胞群体能够在比血沉棕黄层细胞群体少至少30％的时间内扩增成包括至少2×10e9个包含异源DNA的T细胞；并且用包括异源DNA的病毒载体转导细胞群体和血沉棕黄层细胞群体；(l)细胞群体比血沉棕黄层细胞群体表达更多的干扰素γ；(m)细胞群体比血沉棕黄层细胞群体表达更多的GM-CSF；(n)细胞群体比血沉棕黄层细胞群体分泌更少的IL-6；(o)细胞群体比血沉棕黄层细胞群体分泌更少的MCP-1；(p)细胞群体比血沉棕黄层细胞群体分泌更少的IL-1Ra；(q)细胞群体比血沉棕黄层细胞群体包含更高的平均绝对端粒长度；或(r)细胞群体包括比从血沉棕黄层细胞群体中纯化的T细胞包含更高的平均绝对端粒长度的T细胞。

在某些实施方案中，细胞群体中白细胞的数目比血沉棕黄层细胞群体中白细胞的数目多至少2倍。在某些实施方案中，细胞群体中T细胞的数目比血沉棕黄层细胞群体中T细胞的数目多至少2倍。在某些实施方案中，细胞群体中红细胞与T细胞的比率比血沉棕黄层细胞群体中红细胞与T细胞的比率小至少5倍。在某些实施方案中，细胞群体中血小板与T细胞的比率比血沉棕黄层细胞群体中血小板与T细胞的比率小至少5倍。在某些实施方案中，细胞群体中衰老细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中衰老细胞的百分比低至少10％。在某些实施方案中，细胞群体中的耗竭细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中的耗竭细胞的百分比低至少10％。在某些实施方案中，细胞群体中表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比低至少10％。在某些实施方案中，细胞群体中T中央记忆细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中T中央记忆细胞的百分比高至少10％。在某些实施方案中，细胞群体中为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞百分比比血沉棕黄层细胞群体中为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞百分比高至少10％。

在某些实施方案中，细胞群体中包含异源DNA的细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中包含异源DNA的细胞的百分比高至少20％；并且用包含异源DNA的病毒载体转导细胞群体和血沉棕黄层细胞群体。在某些实施方案中，细胞能够在比血沉棕黄层细胞群体少至少30％的时间内扩增成包括至少2×10⁹个包含异源DNA的T细胞；并且用包含异源DNA的病毒载体转导细胞群体和血沉棕黄层细胞群体。在某些实施方案中，细胞群体比血沉棕黄层细胞群体表达更多的干扰素γ。在某些实施方案中，细胞群体比血沉棕黄层细胞群体表达更多的GM-CSF。在某些实施方案中，细胞群体比血沉棕黄层细胞群体分泌更少的IL-6。在某些实施方案中，细胞群体比血沉棕黄层细胞群体分泌更少的MCP-1。在某些实施方案中，细胞群体比血沉棕黄层细胞群体分泌更少的IL-1Ra。在某些实施方案中，细胞群体比血沉棕黄层细胞群体包含更高的平均绝对端粒长度。在某些实施方案中，细胞群体包括比从血沉棕黄层细胞群体中纯化的T细胞包含更高的平均绝对端粒长度的T细胞。

在某些实施方案中，异源DNA包含反向末端重复序列或长末端重复序列。在某些实施方案中，密度梯度离心包括将样品铺在包含泛影酸钠、EDTA二钠钙和密度约为1.078g/ml的中性、高度支化、高质量亲水性多糖[例如Ficoll]的水溶液上。在某些实施方案中，样品是leukopak。在某些实施方案中，样品是来自血小板捐献的残留白细胞。在某些实施方案中，样品是血液样品。在某些实施方案中，血液样品的血细胞比容＞2％。在某些实施方案中，血液样品的血细胞比容＞4％。在某些实施方案中，血液样品的血细胞比容＜30％。在某些实施方案中，样品是白细胞电泳(leukophoresis)或单采血液成分术样品。在某些实施方案中，样品是脂肪样品或骨髓样品。

在某些实施方案中，对象是人。在某些实施方案中，对象是健康个体。在某些实施方案中，对象患有癌症。在某些实施方案中，癌症是白血病。在某些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在某些实施方案中，病毒载体是腺病毒载体。在某些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒载体。在某些实施方案中，异源DNA编码CRISPR指导RNA。在某些实施方案中，异源DNA编码siRNA或miRNA。在某些实施方案中，异源DNA编码多肽。在某些实施方案中，多肽是嵌合抗原受体。在某些实施方案中，嵌合抗原受体选自替沙仑赛(tisagenlecleucel)、阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)、brexucabtagene autoleucel、利基迈仑赛(lisocabtagene maraleucel)、艾基维仑赛(idecabtagene vicleucel)及其组合。在某些实施方案中，多肽是免疫球蛋白、T细胞受体、细胞因子或趋化因子。在某些实施方案中，细胞群体中至少90％的细胞是有存活的。

在本文所述的另一个方面，是一种用于获得基因工程化的白细胞组合物的方法，其包括：(a)在不进行密度梯度离心的情况下从包括白细胞的生物样品中富集大细胞群体；(b)使所述大细胞群体与活化剂接触；以及(c)用包含多核苷酸的病毒载体转导大细胞群体。在某些实施方案中，大细胞具有至少4μm的直径。在某些实施方案中，大细胞具有至少5μm的直径。在某些实施方案中，大细胞具有至少7μm的直径。

在本文所述的另一个方面，是一种用于获得基因工程化的白细胞组合物的方法，其包括：(a)在不进行密度梯度离心的情况下从来自对象的包括白细胞的生物样品中去除低于预定尺寸的组分以产生大细胞群体；(b)使所述大细胞群体与活化剂接触；以及(c)用包含多核苷酸的病毒载体转导大细胞群体。在某些实施方案中，预定尺寸为4μm。在某些实施方案中，预定尺寸为5μm。在某些实施方案中，预定尺寸为7μm。在某些实施方案中，生物样品包括人细胞。在某些实施方案中，生物样品是leukopak。在某些实施方案中，其中生物样品是来自血小板捐献的残留白细胞。在某些实施方案中，生物样品是血液样品。在某些实施方案中，血液样品具有＞2％的血细胞比容。在某些实施方案中，血液样品具有＞4％的血细胞比容。在某些实施方案中，血液样品具有＜30％的血细胞比容。在某些实施方案中，其中生物样品是白细胞电泳或单采血液成分术样品。在某些实施方案中，生物样品是脂肪样品或骨髓样品。在某些实施方案中，对象是人。在某些实施方案中，对象是健康个体。在某些实施方案中，对象患有癌症。在某些实施方案中，癌症是白血病。

在某些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在某些实施方案中，病毒载体是腺病毒载体。在某些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒载体。在某些实施方案中，多核苷酸是异源DNA或异源RNA。在某些实施方案中，多核苷酸编码CRISPR指导RNA。在某些实施方案中，多核苷酸编码siRNA或miRNA。在某些实施方案中，多核苷酸编码多肽。在某些实施方案中，多肽是嵌合抗原受体。在某些实施方案中，嵌合抗原受体选自替沙仑赛、阿基仑赛、brexucabtagene autoleucel、利基迈仑赛、艾基维仑赛及其组合。在某些实施方案中，多肽是免疫球蛋白、T细胞受体、细胞因子或趋化因子。在某些实施方案中，基因工程化的白细胞组合物的至少90％的细胞是存活的。

在某些实施方案中，富集包括基于阵列的分离、声泳分离(acoustophoreticisolation)或亲和分离。在某些实施方案中，基于阵列的分离包括配置用于确定性侧向位移的微流体装置。在某些实施方案中，微流体装置包括多个阵列，阵列包括多个障碍物，障碍物布置成大致垂直于流体流动方向延伸的行和大致平行于流体流动方向延伸的列，其中列与流体流动方向偏移一倾斜角。在某些实施方案中，装置包括至少50个障碍物阵列。在某些实施方案中，装置包括至少50个平行布置的障碍物阵列。在某些实施方案中，多个障碍物包括至少50行障碍物。在某些实施方案中，多个障碍物包括至少50列障碍物。

在某些实施方案中，微流体装置包括直径为约20μm的柱阵列。在某些实施方案中，缓冲液连续流过微流体装置。在某些实施方案中，微流体装置在振荡流动条件下操作。在某些实施方案中，通过微流体装置的流速为至少约500mL/小时。在某些实施方案中，通过微流体装置的流速为至少约1000mL/小时。在某些实施方案中，微流体装置包括非对称六边形障碍物阵列。在某些实施方案中，微流体装置包括多个具有菱形形状的障碍物。在某些实施方案中，微流体装置包括多个具有圆形或椭圆形形状的障碍物。在某些实施方案中，多个障碍物中的每个障碍物具有菱形、圆形、椭圆形或六边形形状。在某些实施方案中，多个障碍物中的每个障碍物具有大致平行于流体流动方向的水平P1长度，该水平P1长度比大致垂直于流体流动方向的P2长度长。在某些实施方案中，多个障碍物中的每个障碍物具有细长的六边形形状。

在某些实施方案中，P1为约10μm至约60μm且P2为约10μm至约30μm。在某些实施方案中，P1为约40μm且P2为约20μm。在某些实施方案中，P1比P2长50％至150％。在某些实施方案中，列中的障碍物被约22μm的G1间隙隔开，并且障碍物行中的障碍物被约17μm的G2间隙隔开。在某些实施方案中，微流体装置包括多个障碍物，所述多个障碍物具有延伸到平行间隙中的顶点，使得间隙在任一侧上侧接指向彼此但彼此不直接相对的一个或多个顶点。在某些实施方案中，微流体装置包括多个障碍物，所述多个障碍物具有延伸到垂直间隙中的顶点，使得间隙在任一侧上侧接指向彼此并且彼此直接相对的顶点。在某些实施方案中，微流体装置包括多个障碍物，这些障碍物布置成使得倾斜角为1/100，这表明障碍物在每第100行中完全对齐。在某些实施方案中，微流体装置包括布置成至少50列的多个障碍物。在某些实施方案中，微流体装置包括布置成至少约50行的多个障碍物。在某些实施方案中，微流体装置包括第一和/或第二平面支持物，其包括至少20个嵌入的通道。

在某些实施方案中，活化剂包括抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、白介素-2、白介素-7或白介素-15中的一种或多种。在某些实施方案中，抗-CD3抗体或抗-CD28抗体与固体支持物缀合。在某些实施方案中，固体支持物是磁珠。在某些实施方案中，使大细胞群体与缀合至固体支持物的抗-CD3抗体或抗-CD28抗体接触还包括亲和富集表达CD3或CD28的白细胞。在某些实施方案中，转导包括使大细胞群体与包含多核苷酸的病毒载体以至少5的感染复数接触。在某些实施方案中，方法还包括在(a)之前用核酸酶处理生物样品。在某些实施方案中，方法还包括冷冻大细胞群体和解冻大细胞群体。在某些实施方案中，该方法还包括：(a)培养大细胞群体。在某些实施方案中，培养至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在某些实施方案中，培养不超过15、10、9、8、7、6、5、4或3天。

在某些实施方案中，至少70％的T细胞表达多核苷酸/多肽。在某些实施方案中，通过流式细胞术测定表达多肽的细胞的百分比。在某些实施方案中，基因工程化的白细胞组合物包括至少1×10⁹个T细胞。在某些实施方案中，在培养6天后，基因工程化的白细胞组合物的至少75％的T细胞是T中央记忆细胞或T效应记忆细胞。在某些实施方案中，在培养9天后，基因工程化的白细胞组合物的至少85％的T细胞是T中央记忆细胞或T效应记忆细胞。在某些实施方案中，方法还包括冷冻基因工程化的白细胞群体和解冻基因工程化的白细胞群体。在某些实施方案中，方法还包括向患有肿瘤或癌症的个体施用基因工程化的白细胞群体。

附图说明

本文所述的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下阐述说明性实例的详细描述以及附图，将获得对本文所述的特征和特征的优点的更好理解，在说明性实例中利用了本文所述特征的原理，在附图中：

图1A说明了通过确定性侧向位移(DLD)或密度梯度离心(Ficoll)回收外周血单核细胞。

图1B说明了通过DLD或密度梯度离心(Ficoll)富集后总CD45+细胞中CD3细胞的％。

图1C说明了在第3天和第6天通过DLD或密度梯度离心(Ficoll)富集后较高的病毒转导。

图2显示了对于通过DLD或密度梯度离心富集的细胞，病毒转导后第3天GFP阳性细胞的荧光显微术。

图3说明与密度梯度离心相比，对于DLD，在病毒转导后3和6天病毒转导的T细胞的总数增加。

图4说明与Ficoll相比，根据本文的系统和方法富集的leukopak中所有白细胞(WBC)/CD45+细胞的回收改善。

图5说明与Ficoll相比，根据本文的系统和方法在第0天的细胞疗法制造开始时从leukopaks中回收更多的CD4较少分化的初始和中央记忆亚群。

图6说明与Ficoll相比，从根据本文的系统和方法富集的较低WBC计数患者leukopak中回收所有白细胞(WBC)/CD45+细胞和CD3+T细胞的改善。

图7说明与Ficoll相比，根据本文的系统和方法从癌症患者leukopak富集的细胞具有较少的血小板和红细胞。

图8说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集的细胞更容易整合慢病毒。

图9说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集的细胞更容易整合慢病毒并在更早的时间点表达报告基因。

图10说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集的细胞更能接受病毒转导。

图11说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集的慢病毒转导和扩增的细胞在较早的时间点产生更多剂量当量的治疗性白细胞。

图12说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集并用高整合慢病毒处理的细胞群体具有较少的终末分化细胞。

图13说明与Ficoll制备物相比，本文的系统和方法从正常供体leukopak中回收更多的较少分化的初始和中央记忆亚群，并产生更少的终末分化细胞。

图14说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集并用高整合慢病毒处理的存活CD3+记忆细胞群体保留了T记忆细胞的相对群体。

图15说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集的细胞群体显示出衰老和耗竭减少两倍，在培养第13天PD1/Tim3共表达显著更少，进入TEMRA状态(表达CD45Ra的T效应记忆细胞)的细胞更少。

图16说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集的细胞群体具有正常或增加的杀伤能力。

图17说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集的细胞群体在扩增过程中具有更有利的细胞因子表达，因此具有更有利的安全特性。

图18说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集的细胞群体在扩增过程中具有更有利的细胞因子表达，因此具有更有利的安全特性，如用CD19 CAR-T构建体(+/-功能性CD28信号转导结构域)的细胞因子释放所证明。

图19说明与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集的细胞群体在扩增过程中具有更有利的细胞因子表达，因此具有更有利的安全特性，如用TCR-T构建体和慢病毒-GFP对照的细胞因子释放所证明。

图20总结了与Ficoll制备物相比，根据本文的系统和方法富集的细胞群体的各种优点。

图21A和图21B说明与Ficoll相比，根据本文的系统和方法富集的细胞具有更长的端粒长度，表明更大的扩增能力。图21C说明与Ficoll相比，根据本文的系统和方法富集的T细胞具有更长的端粒长度。使用qPCR分析进行绝对端粒长度(aTL)的测定。

图22说明了可用于富集细胞群体的DLD分离装置的实施方案。

图23说明了对称障碍布置和非对称障碍布置，例如障碍形状。

图24说明与由Ficoll分离的T细胞相比，由DLD分离的冷冻并且解冻的T细胞的病毒转导效率提高。

具体实施方式

在一个方面，本文描述了用于获得基因工程化细胞组合物的方法，其包括：(a)提供包括一种或多种靶细胞的生物样品；(b)从包括一种或多种靶细胞的生物样品中除去预定直径的细胞组分以获得富集的靶细胞群体，其中预定直径为7微米或更小；和(c)使富集的靶细胞群体与外源核酸接触，从而提供基因工程化的靶细胞群体。在一些实施方案中，预定尺寸为4微米或更小。

在另一个方面，本文描述了用于获得基因工程化细胞组合物的方法，其包括：(a)提供包括一种或多种靶细胞的生物样品；(b)从包括一种或多种靶细胞的生物样品中除去预定直径的细胞组分，其中预定密度为1.1克/毫升或更低；以获得富集的靶细胞群体；和(c)使富集的靶细胞群体与外源核酸接触，从而提供基因工程化的富集的靶细胞。

本文还描述了包括一种或多种富集的靶细胞、血小板细胞和红细胞的细胞群体，其中血小板与富集的靶细胞的比率小于约500:1，并且红细胞与富集的靶细胞的比率大于约50:1，其中大于约50％、55％、60％、65％、70％或75％的富集的靶细胞包含外源核酸。

某些术语

在以下描述中，阐述某些特定细节以便提供对各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践所提供的实施方案。除非上下文另有要求，否则在整个说明书和随后的权利要求书中，词语“包含”及其变体，例如“包括”和“含有”应以开放的、包括的意义来解释，即“包括但不限于”。如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非内容另外清楚地指明。还应当注意，术语“或”通常以其包括“和/或”的意义使用，除非内容另外清楚地指明。此外，本文提供的标题仅是为了方便，并不解释所要求保护的实施方案的范围或含义。

“基本上由……组成”当用于定义组合物和方法时，应意在排除对所述目的的组合具有任何实质意义的其它要素。因此，基本上由本文定义的要素组成的组合物不排除不会实质上影响所要求保护的发明的基本和有利特性的其它材料或步骤。用于治疗或预防给定疾病的组合物可以基本上由记载的活性成分组成，不包括另外的活性成分，但包括其它非活性组分，例如赋形剂、载体或稀释剂。“由……组成”应意在排除多于痕量元素的其它成分和实质方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案在本公开的范围内。

如本文所用，术语“约”是指接近指定量的10％或更少的量。

如本文所用，术语“个体”、“患者”或“对象”是指被诊断患有所述组合物和方法可用于治疗的至少一种疾病、疑似患有该疾病或处于发展该疾病的风险中的个体。在某些实施方案中，个体是哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、美洲驼、羊驼或牦牛。在某些实施方案中，个体是人。

术语“靶细胞”是指一种类型的细胞、细胞群体或细胞的组合物，它们是本发明要收集、富集、分离或分开的期望细胞。靶细胞表示本文所述的各种方法需要或设计用于纯化、收集、工程化等的细胞。具体细胞是什么将取决于使用该术语的上下文。例如，如果程序的目的是分离特定种类的干细胞，则该细胞将是该程序的靶细胞。术语“靶细胞”和“期望细胞”是可互换的，并在本发明中具有相同的含义。靶细胞可以以属-种关系存在。例如，如果靶细胞包括白细胞，则靶细胞将包括T细胞。

术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中以最广泛的含义使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体及其功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab’)₂片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段，单链抗体片段，包括单链可变片段(sFv或scFv)和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语包括免疫球蛋白的基因工程化和/或其它修饰形式，如内抗体、肽抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异源缀合抗体、多特异性(例如双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联双scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语还包括完整或全长抗体，包括任何类型或亚类的抗体，包括IgG及其亚类，IgM、IgE、IgA和IgD。抗体可包括人IgG1恒定区。抗体可包括人IgG4恒定区。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽，包括提供的抗体和抗体链和其它肽，例如接头和结合肽，可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，多肽可含有对自然或天然序列的修饰，只要蛋白保持期望活性。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可以是偶然的，如通过产生蛋白的宿主的突变或由于PCR扩增的错误。

相对于参考多肽序列的“百分比(％)序列同一性”为在序列对齐和引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性之后，并且在不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的对齐可通过已知的各种方法实现，例如使用公众可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。能够确定用于对齐序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大对齐所需的算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(华盛顿特区，20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可以从加利福尼亚州南旧金山的Genentech，Inc.公开获得，也可以从源代码中编译。ALIGN-2程序应该编译为在包括数字UNIX V4.0D在内的UNIX操作系统上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不改变。

在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、和或相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可替代地表述为给定氨基酸序列A与、和或相对于给定氨基酸序列具有或包含一定％的氨基酸序列同一性)计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是在A和B的程序比对中通过序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另有特别说明，否则本文所用的所有％氨基酸序列同一性值如前一段使用ALIGN-2计算机程序获得。

术语“血液相关样品”是指血液样品，包括全血样品以及通过添加或去除一种或多种细胞类型或化学或生物分子而来源于全血的样品。

术语“单采血液成分术”是指其中来自患者或供体的血液至少部分与其一些组分分离的程序。更具体的术语是“血小板去除术”(指血小板的分离)和“白细胞去除术”(指白细胞的分离)。在本文中，术语“分离”是指获得与全血相比富含特定组分的产物，并不意味着已经达到绝对纯度。

术语“T细胞”是指存在于PBMC中并表达“CD3”(T细胞受体)表面标记的淋巴细胞亚群。除非另有说明，T细胞包括CD4⁺(即辅助T细胞)和CD8⁺(即细胞毒性杀伤细胞)。

如本文所用，“基因工程化的”和语法等同物是指用一种或多种外源核酸对细胞进行修饰并赋予细胞经修饰的、额外的或不同的功能。例如，基因工程化细胞可以从用于治疗或研究目的的外源核酸来源表达多肽。或者，基因工程化细胞可包括改变细胞的核DNA的一种或多种修饰，例如可通过基因编辑系统(例如TALEN或CRISPR系统)实现，此类修饰涵盖现有核DNA序列的缺失、插入或改变。

术语“外源”是指源自或产生于生物体或细胞外部的物质或分子。“外源”还可以指细胞中分子的存在(例如蛋白、mRNA、转基因等)，其中细胞通常不包括分子的存在。如本文所用，术语“外源基因”或“外源核酸分子”是指编码已被引入(例如转化或转染)细胞中的RNA和/或蛋白质的表达的核酸。相对于被转化的细胞，外源基因可以来自不同物种(“异源”基因)或来自相同物种(“同源”基因)。“外源多肽”或“外源蛋白质”是指由细胞的外源核酸或包括通常不由细胞表达的外源核酸的细胞产生的多肽链。

本文所述的多肽可由外源核酸编码。核酸是包含两个或更多个核苷酸碱基的多核苷酸类型。在某些实施方案中，核酸是可用于将编码多肽的多核苷酸转移到细胞中的载体的组分。本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合载体或“整合载体”，其可以整合到宿主细胞的染色体DNA中。另一种类型的载体是“游离型”载体，例如能够染色体外复制的核酸。能够指导与其有效连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。合适的载体包括质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒载体等。在表达载体中，用于控制转录的调控元件如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号可以来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。还可以掺入通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力和促进转化体识别的选择基因。可以使用来源于病毒如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等的载体。质粒载体可以线性化以整合到染色体位置。载体可包括指导位点特异性整合到基因组中的限定位置或限制性位点组中的序列(例如AttP-AttB重组)。另外，载体可包括来源于转座因子的序列。多肽也可以由外源RNA分子编码。

如本文所用，术语“同源的”、“同源性”或“百分比同源性”当在本文中用于描述氨基酸序列或核酸序列时，相对于参考序列，可使用Karlin和Altschul描述的公式确定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268,1990,于Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877,1993中修改)。这种公式被结合到Altschul等人(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中。在本申请的申请日之前，可以使用最近版本的BLAST确定序列的同源性百分比。

除非另有说明，术语“富集”、“分离”和“纯化”是同义的，并且是指相对于不需要的物质富集期望产物。该术语不一定意味着产物是完全分离的或完全纯的。例如，如果起始样品具有构成样品中2％细胞的靶细胞，并且进行程序得到了其中靶细胞是存在的细胞的60％的组合物，则该程序将成功地富集、分离或纯化靶细胞。

术语“障碍物阵列”、“DLD阵列”和“阵列”在本文中同义使用，并且描述了设置在含细胞或颗粒的流体可通过的流动通道中的障碍物的有序阵列。障碍物阵列包括布置成列(沿着流体流动的路径)的多个障碍物。障碍物之间的间隙(沿着流体流动的路径)允许细胞或其它颗粒通过。这样的障碍物或列可以布置成一个或多个重复的行(垂直于流体流动的路径)。

如本文所述，“通道”或“泳道”是指具有多个障碍物的离散分离单元，障碍物可在任一侧由壁界定，使得离散泳道被分离。通道可以从一个或多个共用入口到一个或多个共用入口平行运行。通道可以流体串联连接。

如本文所述，如本文结合DLD使用的术语“流体流”和“主体流体流”是指流体在穿过障碍物阵列的大体方向上的宏观运动。这些术语没有考虑流体绕障碍物移动以使流体继续沿大体方向移动的流体流的临时位移。

如本文所述，术语“倾斜角”或“ε”：是主体流体流的方向和由障碍物阵列中的连续障碍物的行的对齐限定的方向之间的角度。

如本文所述，术语“阵列方向”是由障碍物阵列中的连续障碍物的行的对齐限定的方向。如果在穿过间隙并遇到下游障碍物时，颗粒的总体轨迹遵循障碍物阵列的列的方向(即，以相对于主体流体流的倾斜角ε行进)，则颗粒在障碍物阵列中“偏转”或“碰撞”。在这种情况下，如果颗粒的总体轨迹遵循主体流体流的方向，则颗粒不会碰撞。

术语“确定性侧向位移”或“DLD”是指颗粒在穿过阵列的路径上基于其尺寸相对于一些阵列参数而确定性地偏转的过程。该过程可用于分离细胞，这通常是本文讨论的上下文。然而，重要的是认识到DLD也可用于浓缩细胞和用于缓冲液交换。本文一般就连续流(DC条件；即，主体流体流仅沿单一方向流动)描述程序。然而，DLD也可以在振荡流(AC条件：即，主体流体流在两个方向之间交替流动)条件下工作。

通过障碍物阵列的颗粒的“临界尺寸”或“预定尺寸”、“临界直径”或“预定直径”描述了能够跟随流体的层流的颗粒的尺寸限制。大于临界尺寸的颗粒可从流体的流动路径“碰撞”，而尺寸小于临界尺寸(或预定尺寸)的颗粒将不一定如此移动。当通过间隙的流体流的轮廓关于在主体流体流的方向上平分间隙的平面对称时，对于间隙的两侧，临界尺寸可以相同；然而，当轮廓不对称时，间隙两侧的临界尺寸可以不同。

关于富集方法的术语“密度梯度”是指对悬浮在预定密度的流体或介质中的细胞施加力的过程，使得细胞基于其密度穿过流体或介质。通常通过离心来施加力，但也可通过压力或导致向细胞施加定向力的其它方式来施加力。密度梯度法通常应用于存在异种细胞群体并且细胞基于其密度而不同的情况，使得可以分离至少两种细胞群体。由于不同的活化状态、活力(例如，活的/死的、坏死的、凋亡的)或不同的谱系(例如，红细胞对淋巴细胞、血小板对红细胞、无核细胞对有核细胞等)，细胞密度可以不同。“密度梯度介质或介体”和语法等同物是指预定密度的流体介质，包括但不限于或Ficoll。应用于细胞的密度梯度介质通常是等渗的并且具有大于水(1.0克/毫升)的密度。密度梯度介质可包括1.05、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5克/毫升或更大的密度。密度梯度介质不包括水或与水密度基本相同的水基缓冲液或生长培养基。密度梯度介质的密度可以是到处相同的，分成不同密度的层，或者包括真正的梯度，其中密度在远离所施加的力的方向上均匀地增加或减小。

在某些实施方案中，本文描述的是主细胞库，其包括：(a)富集的靶细胞群体，所述靶细胞包含整合在基因组位置或附加型维持的本文所述的外源核酸；和(b)冷冻保护剂。在某些实施方案中，冷冻保护剂包括甘油或DMSO。在某些实施方案中，主细胞库包括在能够耐受液氮冷冻的合适小瓶或容器中。

生物样品

本文所述的方法和组合物以从生物样品富集特定的靶细胞开始。这样的生物样品可以来自哺乳动物来源。在某些实施方案中，生物样品来自人来源。来源可以来自单个个体或来自几个个体的集合。在某些实施方案中，生物样品的来源是单个人个体。在某些实施方案中，生物样品的来源是健康个体。在某些实施方案中，生物样品的来源是患有癌症的个体。在某些实施方案中，生物样品的来源是患有白血病的个体。

在某些实施方案中，生物样品是血液相关产物。这样的血液相关产物可包括全血或富集或去除一种或多种细胞或血清成分的全血。在某些实施方案中，生物样品是血液样品。在某些实施方案中，生物样品是单采血液成分术产物。在某些实施方案中，生物样品是白细胞去除术产物。白细胞去除术产物是富集淋巴细胞和/或骨髓来源的白细胞的产物。另外，白细胞去除术产物可具有减少数量的红细胞和/或血小板。在某些实施方案中，生物样品是leukopak。在某些实施方案中，生物样品是来自血小板捐献的残留白细胞。

样品可包括至少约50mL、100mL、200mL、300mL、400ml或500mL的体积。白细胞去除术样品可包括至少约50mL、100mL、200mL、300mL、400ml或500mL的体积。

在一些实施方案中，方法以包括一定血细胞比容的生物样品开始。血细胞比容是样品(如包含靶细胞和红细胞(RBC)的血液样品)中红细胞(RBC)的体积百分比。血细胞比容可为约0.5％至约50％。在一些实施方案中，方法从生物样品开始，所述样品在包含靶细胞和红细胞(RBC)的样品中红细胞(RBC)的血细胞比容百分比为约0.5％至约1％、约0.5％至约5％、约0.5％至约10％、约0.5％至约15％、约0.5％至约20％、约0.5％至约25％、约0.5％至约30％、约0.5％至约35％、约0.5％至约40％、约0.5％至约45％、约0.5％至约50％、约1％至约5％、约1％至约10％、约1％至约15％、约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至约30％、约1％至约35％、约1％至约40％、约1％至约45％、约1％至约50％、约5％至约10％、约5％至约15％、约5％至约20％、约5％至约25％、约5％至约30％、约5％至约35％、约5％至约40％、约5％至约45％、约5％至约50％、约10％至约15％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约30％、约10％至约35％、约10％至约40％、约10％至约45％、约10％至约50％、约15％至约20％、约15％至约25％、约15％至约30％、约15％至约35％、约15％至约40％、约15％至约45％、约15％至约50％、约20％至约25％、约20％至约30％、约20％至约35％、约20％至约40％、约20％至约45％、约20％至约50％、约25％至约30％、约25％至约35％、约25％至约40％、约25％至约45％、约25％至约50％、约30％至约35％、约30％至约40％、约30％至约45％、约30％至约50％、约35％至约40％、约35％至约45％、约35％至约50％、约40％至约45％、约40％至约50％或约45％至约50％。在一些实施方案中，方法在由靶细胞和红细胞(RBC)组成的样品中产生约0.5％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的红细胞(RBC)的血细胞比容百分比。在一些实施方案中，方法在包含靶细胞和红细胞(RBC)的样品中产生至少约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％或约45％的红细胞(RBC)的血细胞比容百分比。在一些实施方案中，可通过将红细胞加入靶细胞组合物中以达到或产生有效比率来实现保持有效血细胞比容。

用于本文所述的方法和组合物的生物样品还可包含从哺乳动物来源获得的骨髓或脂肪组织。在某些实施方案中，哺乳动物来源是人来源。

例如，一些治疗应用如CAR细胞疗法或过继性T细胞疗法，样品可以是待治疗个体的自体样品。还考虑来自最终用干细胞移植或治疗性细胞治疗的个体的血液相关样品。还考虑了来自家族成员、同卵双胞胎或以其他方式HLA匹配的供体的样品，提供用于另一个体的治疗性治疗的细胞(例如，异源样品)。

可以对用于处理的样品进行一个或多个步骤以制备用于处理的样品或促进样品的收集或使其适于分离，包括加入抗凝剂或耗尽一种或多种非靶细胞。合适的抗凝剂包括柠檬酸、柠檬酸钠、右旋糖、肝素和螯合剂如EDTA或EGTA。在某些实施方案中，样品可以用抗凝血剂柠檬酸盐右旋糖溶液(ACD-A、柠檬酸一水合物、右旋糖一水合物和柠檬酸三钠二水合物)处理。收集样品的个体可在收集前施用血液稀释剂、抗凝剂或抗炎药物。

基于尺寸的富集

本文所述的方法涉及基于预定尺寸富集细胞群体，产生富集细胞群体，其中富集的靶细胞群体包含超过一定大小的细胞。当处理血液相关样品时，小于红细胞(例如，小于约7微米或小于约4微米)的细胞组分可与血清生物分子一起从样品中特异性去除。当处理血液相关样品时，小于静息或活化白细胞的细胞组分可与血清生物分子一起从样品中特异性去除。在某些实施方案中，从样品中去除小于约11微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约10微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约9微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约8微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约7微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约6微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约5微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约4微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约3微米的细胞。

在某些实施方案中，小于约11微米的细胞被去除，而大于约11微米的细胞被保留。在某些实施方案中，小于约10微米的细胞被去除，而大于约10微米的细胞被保留。在某些实施方案中，小于约9微米的细胞被去除，而大于9微米的细胞被保留。在某些实施方案中，小于约8微米的细胞被去除，而大于8微米的细胞被保留。在某些实施方案中，小于约7微米的细胞被去除，而大于7微米的细胞被保留。在某些实施方案中，小于约6微米的细胞被去除，而大于6微米的细胞被保留。在某些实施方案中，小于约5微米的细胞被去除，而大于5微米的细胞被保留。在某些实施方案中，小于约4微米的细胞被去除，而大于4微米的细胞被保留。在某些实施方案中，小于约3微米的细胞被去除，而大于3微米的细胞被保留。

基于密度的富集

本文所述的方法涉及基于密度截断富集细胞群体，产生富集的靶细胞群体，其中富集的靶细胞群体包含高于一定密度的细胞。当处理血液相关样品时，小于红细胞(例如，小于约1.11克/毫升)的细胞组分可与血清生物分子一起从样品中特异性地去除。在某些实施方案中，从样品中去除小于约1.11g/mL的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约1.10g/mL微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约1.09g/mL微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约1.08g/mL微米的细胞。在某些实施方案中，从样品中去除小于约1.07g/mL微米的细胞。

在某些实施方案中，小于约1.11g/mL的细胞被去除，而大于1.11g/mL的细胞被保留。在某些实施方案中，小于1.10g/mL的细胞被去除，而大于1.10g/mL的细胞被保留。在某些实施方案中，小于1.09g/mL的细胞被去除，而大于1.09g/mL的细胞被保留。在某些实施方案中，小于1.08g/mL的细胞被去除，而大于1.08g/mL的细胞被保留。在某些实施方案中，小于1.07g/mL的细胞被去除，而保留大于1.07g/mL的细胞被保留。

富集细胞群体

本文所述的方法产生富集的靶细胞的组合物。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含靶细胞和红细胞的群体，其中靶细胞和血细胞占富集的靶细胞群体的大于约75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含淋巴细胞和红细胞的群体，其中淋巴细胞和血细胞占富集的靶细胞群体的大于约75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含T细胞和红细胞的群体，其中T细胞和血细胞占富集的靶细胞群体的大于约75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体基本上不含血小板。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含少于约10％、5％、4％、3％、2％或1％的血小板。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体基本上不含红细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含少于约10％、5％、4％、3％、2％或1％的红细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含活化的T细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含初始T细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含静息或未活化的T细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含中央记忆(CD62L+)T细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含人细胞或由人细胞组成。

在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含靶细胞和红细胞的群体，其中靶细胞占富集的靶细胞群体的大于约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％或99％。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含淋巴细胞和红细胞的群体，其中淋巴细胞占富集的靶细胞群体的大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含T细胞和红细胞的群体，其中T细胞占富集的靶细胞群体的大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体基本上不含血小板。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含少于约10％、5％、4％、3％、2％或1％的血小板。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含活化的T细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含初始T细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含中央记忆(CD62L+)T细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包含人细胞或由人细胞组成。

富集的靶细胞群体可包含外源核酸。外源核酸可以包含多肽(任选地非病毒多肽)的编码区。在某些实施方案中，富集的靶细胞的大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含外源核酸。在某些实施方案中，大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的淋巴细胞包含外源核酸。在某些实施方案中，大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞包含外源核酸。在某些实施方案中，由外源核酸编码的多肽包括免疫球蛋白、嵌合抗原受体、T细胞受体、细胞因子或趋化因子。在某些实施方案中，由外源核酸编码的多肽包括嵌合抗原受体。

富集的靶细胞群体还可包含支持细胞生长和分裂的细胞因子、趋化因子或生长因子。在某些实施方案中，细胞群体包含IL-15、IL-7、抗-CD28抗体或抗-CD3抗体中的任一种或多种。在某些实施方案中，细胞群体包含至少约5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL的IL-15。在某些实施方案中，细胞群体包含至少约5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL的IL-17。IL-15或IL-7可以是重组人IL-15或IL-7。

富集方法

密度梯度分离

包括基于密度从细胞组分中分离血浆的离心单采血液成分术的方法可用于从血液相关样品中获得一种或多种靶细胞。密度梯度分离单采血液成分术装置被设计用于从全血中分离血浆或血液组分，用于耗尽或交换这些组分或血浆。密度梯度分离包括从患者抽取全血并利用离心力作为操作的基础将血液分离成其组分。离心流动装置通常将来自患者的连续流输送到离心机。在离心前加入抗凝剂，通常是柠檬酸盐，然后用适当的置换液(通常是白蛋白或血浆)使剩余的血液组分返回，从而形成连续流动的体外回路。

因此，密度梯度分离可用于从样品产生富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约500:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约100:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约10:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约5:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约100:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约250:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约500:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率不大于约1,000:1。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离淋巴细胞。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离造血干细胞。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离间充质干细胞。在某些实施方案中，外周血单核细胞(PBMC)的分离用于分离T细胞以产生嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。

基于阵列的分离

利用包括微结构(例如微柱或柱)的阵列的方法，构造基于临界尺寸分离细胞的孔隙。例如，这样的方法通常利用尺寸排阻通过物理阻塞来防止或限制进入或通过。尺寸排阻的实施方案包括使用小孔隙以防止大的不可变形颗粒进入孔隙。可以工程化孔径以允许分离不同尺寸(临界尺寸)的颗粒。这样的方法还可以利用层流、切向流或交叉流动动力学来促进样品处理。因此，密度梯度分离可用于产生本文公开的靶细胞组合物。

例如，包括用于分离不同细胞类型的确定性侧向位移(DLD)的方法可用于在不进行密度梯度离心的情况下从血液相关样品获取一个或多个靶细胞。参见Campos-Gonzalez等人(2018).Deterministic Lateral Displacement:The Next-Generation CAR T-CellProcessing？,SLAS Technology,23(4),338—351.DOI:10.1177/2472630317751214，其全部内容通过引用整体并入本文。DLD是这样的过程，其中颗粒在穿过微流体装置中的阵列的路径上基于其尺寸相对于一些阵列参数而确定性地偏转。用于DLD的微流体装置包括具有直径为约20微米的柱的阵列的通道。该装置可包括至少10、15、20、25或50个通道。DLD也可用于浓缩细胞和用于缓冲液交换。本文一般就连续流(DC条件；即，主体流体流仅沿单一方向流动)描述程序。然而，DLD也可以在振荡流(AC条件：即，主体流体流在两个方向之间交替流动)下工作。DLD通常用于基于通过障碍物阵列的颗粒的临界尺寸或预定尺寸来分离细胞或其组分，描述了能够跟随流体的层流的颗粒的尺寸限制。大于临界尺寸的颗粒可从流体的流动路径“碰撞”，而尺寸小于临界尺寸(或预定尺寸)的颗粒将不一定如此移动。当通过间隙的流体流的轮廓关于在主体流体流的方向上平分间隙的平面对称时，对于间隙的两侧，临界尺寸可以相同；然而，当轮廓不对称时，间隙两侧的临界尺寸可以不同。

如本文所述，应用于分离用于转染的细胞的方法的临界尺寸可包括约2微米、约3微米、约3.4微米、约3.5微米、约3.6微米、约3.7微米、约3.8微米、约4微米、约5微米、约6微米、约7微米、约8微米或更大。临界尺寸可以不同于被分离的细胞的实际尺寸，因为通过微流体装置的流动可以使细胞看起来更大或更小，这取决于变量，例如分离介质的张力、流速和可能影响被分离的细胞的表观或流体动力学尺寸的其它因素。

基于尺寸的微流体分离的基本原理和用于分离细胞的障碍物阵列的设计已经在别处提供(参见，US 2014/0342375；US 2016/0139012；7,318,902和US 7,150,812，其通过引用整体并入本文)，并且也总结于以下部分中。

制备和使用能够根据尺寸分离细胞的微流体装置的方法也已在本领域中描述。此类装置包括在US 5,837,115；US 7,150,812；US 6,685,841；US 7,318,902；7,472,794；以及US 7,735,652中描述的那些；所有这些文献通过引用整体并入本文。提供了可能有助于制造和使用本发明装置的指南的其他参考文献包括：US 5,427,663；US 7,276,170；US 6,913,697；US 7,988,840；US 8,021,614；US 8,282,799；US 8,304,230；US 8,579,117；US2006/0134599；US 2007/0160503；US 20050282293；US 2006/0121624；US 2005/0266433；US 2007/0026381；US 2007/0026414；US 2007/0026417；US 2007/0026415；US 2007/0026413；US 2007/0099207；US 2007/0196820；US 2007/0059680；US 2007/0059718；US2007/005916；US 2007/0059774；US 2007/0059781；US 2007/0059719；US 2006/0223178；US 2008/0124721；US 2008/0090239；US 2008/0113358；和W02012094642，其全部也通过引用整体并入本文。

本文描述了用于将预定尺寸的靶颗粒或靶细胞与样品的其它成分分离的微流体装置的实例。该装置可以具有平面支持物，其通常为矩形，并且可以由与分离方法相容的任何材料制成，包括硅、玻璃、混合材料或(优选)聚合物。支持物可具有顶表面和底表面，其中一个或两个表面具有至少一个从一个或多个样品入口和一个或多个不同的流体入口延伸到一个或多个产物出口和一个或多个不同的废物出口的嵌入通道。流体入口(与样品入口相对)有时可称为“缓冲液”或“洗涤”入口，并且取决于分离的目的，可用于将多种流体输送到通道中。除非通过使用或上下文另有说明，否则应理解“流体”可以是包含构成细胞的生长培养基的试剂的缓冲液，或通常是任何液体，并且包含与装置的操作和使用者的目的相容的任何组分。

当流体通过样品或流体入口施加到装置时，其通过通道流向出口，从而限定主体流体流的方向。为了分离不同尺寸的细胞或颗粒，通道包括障碍物的阵列，障碍物被组织成沿通道纵向延伸(从入口到出口)的列和横向延伸穿过通道的行。每个随后的障碍物行相对于前一行横向移动，从而以倾斜角(ε)限定偏离主体流体流方向的阵列方向。障碍物被定位成限定临界尺寸，使得当样品被施加到装置的入口并流到出口时，样品中大于临界尺寸的颗粒或细胞沿阵列方向流动，而小于临界尺寸的颗粒沿主体流体流的方向流动，从而导致分离。

阵列的行中的相邻障碍物由间隙G1隔开，其垂直于主体流体流的方向，而列中的相邻障碍物由间隙G2隔开，其平行于主体流体流的方向(见图23A和23B)。本装置的一个特征是间隙G2的尺寸与间隙G1的尺寸的比率不等于1，G1通常比G2宽(例如，宽10-100％)。阵列中的障碍物各自具有至少两个顶点，并且被定位成使得每个间隙在任一侧上由至少一个顶点侧接。在优选实施方案中，顶点延伸到平行间隙中，使得间隙在任一侧上侧接指向彼此但彼此不直接相对的一个或多个顶点，和/或障碍物具有延伸到垂直间隙中的顶点，使得间隙在任一侧上侧接指向彼此且彼此直接相对的顶点(见图23A和23B)。

在一些实施方案中，G1和G2可各自独立地为约9μm至约30μm。在一些实施方案中，G1和G2可各自独立地为约9μm至约11μm、约9μm至约13μm、约9μm至约15μm、约9μm至约17μm、约9μm至约19μm、约9μm至约21μm、约9μm至约22μm、约9μm至约24μm、约9μm至约26μm、约9μm至约28μm、约9μm至约30μm、约11μm至约13μm、约11μm至约15μm、约11μm至约17μm、约11μm至约19μm、约11μm至约21μm、约11μm至约22μm、约11μm至约24μm、约11μm至约26μm、约11μm至约28μm、约11μm至约30μm、约13μm至约15μm、约13μm至约17μm、约13μm至约19μm、约13μm至约21μm、约13μm至约22μm、约13μm至约24μm、约13μm至约26μm、约13μm至约28μm、约13μm至约30μm、约15μm至约17μm、约15μm至约19μm、约15μm至约21μm、约15μm至约22μm、约15μm至约24μm、约15μm至约26μm、约15μm至约28μm、约15μm至约30μm、约17μm至约19μm、约17μm至约21μm、约17μm至约22μm、约17μm至约24μm、约17μm至约26μm、约17μm至约28μm、约17μm至约30μm、约19μm至约21μm、约19μm至约22μm、约19μm至约24μm、约19μm至约26μm、约19μm至约28μm、约19μm至约30μm、约21μm至约22μm、约21μm至约24μm、约21μm至约26μm、约21μm至约28μm、约21μm至约30μm、约22μm至约24μm、约22μm至约26μm、约22μm至约28μm、约22μm至约30μm、约24μm至约26μm、约24μm至约28μm、约24μm至约30μm、约26μm至约28μm、约26μm至约30μm或约28μm至约30μm。在一些实施方案中，G1和G2可各自独立地为约9μm、约11μm、约13μm、约15μm、约17μm、约19μm、约21μm、约22μm、约24μm、约26μm、约28μm或约30μm。在一些实施方案中，G1和G2可各自独立地为至少约9μm、约11μm、约13μm、约15μm、约17μm、约19μm、约21μm、约22μm、约24μm、约26μm或约28μm。在一些实施方案中，G1和G2可各自独立地为至多约11μm、约13μm、约15μm、约17μm、约19μm、约21μm、约22μm、约24μm、约26μm、约28μm或约30μm。

微流体装置通常还具有障碍物粘合层，其粘合到平面支持物的表面并粘合到通道中的障碍物，以防止流体或样品在装置的操作期间流过障碍物。该障碍物粘合层可包括一个或多个流体连接到通道的入口和通道的出口的通路，其允许流体流动。

通常，微流体装置将用于将尺寸大于装置临界尺寸的靶颗粒或靶细胞与尺寸小于临界尺寸的污染物、流体、非靶颗粒或非靶细胞分离。当通过样品入口将含有靶细胞或颗粒的样品施加到装置上并使其流体通过通道时，靶细胞或靶颗粒将流到一个或多个产物出口，在那里获得富集靶细胞或靶颗粒的产物。本文中使用的术语“富集”是指产物中靶细胞或颗粒与污染物的比率高于样品中的比率。尺寸小于临界尺寸的污染物、流体、非靶颗粒和非靶细胞将主要流到一个或多个废物出口，在那里它们可以被收集或丢弃。

尽管分离的目的通常是将靶细胞或颗粒与较小的污染物分离，但有时使用者可能希望将靶细胞或颗粒与较大的污染物分离。在这些情况下，可以使用临界尺寸大于靶细胞或颗粒但小于污染物的微流体装置。在单个装置或多个装置上的具有不同临界尺寸的两个或更多个障碍物阵列的组合也可用于分离。例如，装置可以具有通道，所述通道具有临界尺寸大于T细胞但小于粒细胞和单核细胞的障碍物的第一阵列和临界尺寸小于T细胞但大于血小板和红细胞的第二阵列。在这种装置上处理血液样品允许收集其中T细胞已经与粒细胞、单核细胞、血小板和红细胞分离的产物。障碍物阵列的顺序对于结果不应该是重要的，即，具有较小临界尺寸的阵列可以出现在具有较大临界尺寸的阵列之前或之后。具有不同临界尺寸的阵列也可以在细胞通过的分离的装置上。

可以使用宽阵列和多个出口来收集多种产物，例如，可以在一个出口获得单核细胞，而在不同的出口获得T细胞。因此，使用多个阵列和多个出口可以允许同时收集比使用单个阵列更纯化的若干产物。如下面进一步讨论的，可以通过平行使用许多DLD阵列来维持高通量。

优选地，微流体装置中使用的障碍物具有多边形形状，优选菱形或六边形形状的障碍物。障碍物通常也是细长的，使得它们垂直于主体流体流的长度(P1)与它们平行于主体流体流的宽度(P2)相差(通常长)例如10-100％(见图23B)。通常，P1比P2长至少15％、30％、50％、100％或150％。以范围表示，P1可以比P2长10-150％(15-100％；或20-70％)。

微流体装置还可包括从装置的样品入口延伸的分离壁，其中它将样品入口与流体入口分开并防止混合到通道中的障碍物阵列中。分离壁平行于主体流体流的方向取向，并向样品和流体出口延伸。壁在到达通道的末端之前终止，从而允许样品和流体流在此后彼此接触。其通常应延伸障碍物阵列的长度的至少10％的距离，但可延伸阵列的至少20％、40％、60％或70％。以范围表示，壁通常延伸障碍物阵列长度的10-70％。在装置中还可以存在多于一个分离壁，并且根据分离的目的，可以以不同的方式定位。

为了增加可以处理体积的速率，可以通过用一个或多个堆叠的障碍物阵列覆盖第一障碍物阵列来制造堆叠的分离组件，其中每个堆叠的底表面与第一障碍物阵列的顶表面或顶表面上的障碍物粘合层接触，或者与另一阵列的顶表面或顶表面上的障碍物粘合层接触。通过第一共用歧管向所有装置的样品入口提供样品，并通过与第一歧管可以相同或可以不同的第二歧管向流体入口提供流体。产物通过一个或多个产物管道从产物出口排出，废物通过一个或多个不同于产物管道的废物管道从废物出口排出。通常，堆叠分离组件将具有2至9个堆叠阵列以及第一微流体障碍物阵列。然而，也可以使用更多的装置。此外，支持物的顶表面和/或底表面可具有多个(例如2-40或2-30个)嵌入通道并用于纯化靶颗粒或靶细胞。

堆叠的分离组件可具有连接到第一微流体装置的底表面和/或堆叠的微流体装置的顶表面的储器粘合层。储器粘合层应包括具有一个或多个通路的第一端，其允许流体流动到通道上的入口，以及任选地包括在与第一端相对并且由流体不可渗透的材料隔开的第二端处的一个或多个通道，其允许流体流动到通道的产物出口和废物出口或从通道的产物出口和废物出口流出。

装置的堆叠组件可以被支撑在盒中，所述盒的特征在于存在具有端口的外壳，该端口允许将样品和流体传送到盒中以及将产物和废物传送出盒。该图示出了具有两个入口端口和两个出口端口的盒。然而，可以使用进入和离开盒的多个端口，并且可以基本上同时收集几种产物。还将认识到，盒可以是系统的一部分，在该系统中有本领域公知和常用的部件。这些常见部件包括用于控制流体流动的泵、阀和处理器；用于监测系统参数如流速和压力的传感器；用于监测流体特性如pH或盐度的传感器；用于确定细胞或颗粒浓度的传感器；以及用于确定存在于盒中或从盒收集的材料中的细胞或颗粒的类型的分析器。更一般地，可以使用本领域已知的并且与盒、被处理的材料和处理目标兼容的任何设备。

在另一方面，本发明涉及一种用于从污染物中纯化预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的方法，其通过获得包括靶颗粒或靶细胞和污染物的样品并使用本文所述的任何微流体装置或堆叠分离组件进行纯化来实现。通过将样品施加到上述任何微流体装置上的一个或多个样品入口或施加到装置组件中的第一微流体装置或堆叠装置上的样品入口来实现纯化。歧管可用于将样品施加到入口，特别是当使用堆叠装置时。然后样品通过通道流向装置的出口。通常，靶颗粒或靶细胞的尺寸大于装置上障碍物阵列的临界尺寸，并且至少一些污染物的尺寸小于临界尺寸。结果，靶细胞或靶颗粒将流到一个或多个产物出口，在那里获得富集的靶细胞或靶颗粒的产物，并且尺寸小于临界尺寸的污染物将流到一个或多个废物出口。然而，如前所述，可能存在靶细胞或靶颗粒小于污染物的情况，并且选择临界尺寸大于靶细胞或颗粒且小于污染物的装置。在这些情况下，装置的一般操作将基本上相同，但是污染物将沿阵列方向流动，并且靶细胞或颗粒将沿主体流体流的方向前进。

设计微流体匣

本公开提供了用于纯化颗粒或细胞的微流体匣(即，装置、芯片、盒、板、微流体装置、匣、DLD装置等)。本公开的微流体匣可使用DLD方法操作。本公开的微流体匣可以由聚合物材料(例如热塑性)形成，并且可以包括具有顶表面和底表面的第一平面支持物和具有顶表面和底表面的第二平面支持物中的一个或多个，其中第一和第二平面支持物的顶表面包括从一个或多个入口延伸到一个或多个出口的至少一个嵌入通道；该至少一个嵌入通道包括障碍物阵列，其中该第一和第二平面支持物的底表面包括空隙空间，该空隙空间被配置成当该第一平面支持物的底部被按压到该第二平面支持物的底部时变形。本公开的微流体匣可以是单次使用或一次性装置。作为替代方案，微流体匣可以是多用途装置。使用聚合物(例如，热塑性)形成微流体结构可允许使用廉价且高度可缩放的软模压工艺，而空隙空间可提供快速制造的改进的能力且避免在制造工艺期间对障碍物(即，柱、DLD阵列等)的损坏。

本文所述的匣可通过确定性侧向位移或DLD操作。DLD可以包括三种不同的操作模式。操作模式包括：i)分离，ii)缓冲液交换和iii)浓缩。在每种模式中，高于临界直径的颗粒在阵列方向上从进入点偏转，导致作为阵列几何形状的函数的尺寸选择、缓冲液交换或浓缩。在所有情况下，低于临界直径的颗粒在层流条件下直接通过装置并随后离开装置。微流体匣的分离区的整个长度可以为约75mm，宽度可以为约40mm，每个单独的通道的宽度为约1.8mm。

本文所述的匣可以以多种取向布置以实现不同的DLD模式或产物结果。例如，可以使用具有侧壁和障碍物阵列的四个通道。含有血液、细胞或颗粒的样品可以通过顶部的样品入口进入通道，缓冲液、试剂或介质可以在单独的流体入口进入通道。当它们流向通道的底部时，尺寸大于阵列的临界直径(＞Dc)的细胞或颗粒以由障碍物阵列方向确定的角度流动，并与尺寸小于阵列的临界直径(＜Dc)的细胞和颗粒分离。

参考图22A-22D，匣的实施方案可包括可用于微流体装置或匣中的14个平行通道的布置。图22B-22D示出了匣的截面的放大视图。在该图示中，通道具有三个具有逐渐变小的间隙的区域(部分)。匣具有共用样品入口，例如用于血液，该入口将样品供给到每个通道上的入口。存在用于缓冲液进入通道的单独入口，但根据处理目的，其可用于将具有试剂、生长培养基或其它流体的流体引入通道中。在每个通道的底部具有产物出口，其通常用于回收尺寸大于通道中障碍物阵列的临界直径的靶细胞或颗粒。各个通道的出口供给到共同产物出口，从该共同产物出口可以回收靶细胞或颗粒。还示出了废物出口，尺寸低于通道中障碍物阵列的临界直径的细胞和颗粒在其中离开。

匣的实施方案可包括2个通道。这些通道可以具有三个段，这些段被设计成具有逐渐更小直径的障碍物和间隙。一些匣可以具有“凸块阵列(bump array)”，其具有设置在微流体通道中的等边三角形形状的障碍物。等边三角形柱可设置成相对于流体流方向倾斜的平行四边形晶格布置。也可以使用其它晶格布置(例如，正方形、矩形、梯形、六边形等晶格)。选择倾斜角ε(epsilon)，使得装置是周期性的。在一些实施方案中，18.4度(1/3弧度)的倾斜角使得装置在三行之后是周期性的。倾斜角ε还表示阵列方向偏离流体流方向的角度。柱之间的间隙用G表示，等边三角形边长为S。流线在柱之间延伸，将柱之间的流体流分成相等体积流的三个区域(“流管”)。当流体流沿所示方向流动时，相对较大的颗粒(尺寸大于阵列的临界尺寸)遵循阵列倾斜角。相对较小的颗粒(尺寸小于阵列的临界尺寸)遵循流体流的方向。

本文提供的匣可包括菱形柱的阵列，如图23A-23B所示。图23A示出了障碍物的对称阵列，其中垂直于流体流方向的间隙(例如间隙1(G1))和平行于流体流方向的间隙(例如间隙2(G2))都具有大致相同的长度。菱形障碍物可以具有两个直径，一个垂直于流体流方向(P1)，另一个平行于流体流方向(P2)。该图的右侧示出了非对称阵列，其中平行间隙比垂直间隙短。尽管与对称阵列相比，非对称阵列中的G1已经加宽，但是间隙G2的减小导致该阵列的临界直径与对称阵列的临界直径相同。结果，这两个阵列在分离样品中给定直径的颗粒或细胞时应该大致相等地有效。然而，G1的加宽允许更高的样品通量并减少通道堵塞。图23B在左侧示出了菱形障碍物阵列，该菱形障碍物阵列被拉长，使得它们的垂直直径长于它们的水平直径。图23的中间截面示出了菱形柱，该菱形柱已经被拉长，使得它们的水平直径长于它们的垂直直径，并且该图的最远截面示出了已经被水平拉长的六边形形状的障碍物。

本文所述的匣可包括堆叠的分离组件，其中两个微流体装置或匣组合成单个单元。最上面的装置可以包括平面支持物，该平面支持物可以使用多种材料制成，但最优选是聚合物的并且具有顶表面和底表面。支持物的顶表面可以包括在支持物的一端提供样品入口和缓冲液或其它流体的入口以及在另一端提供产物出口和废物出口的储器。每个储器可以使用将顶表面连接到底表面上的通道的小过孔通过支持物流体地连接。支持物的底表面可具有多个嵌入的微流体通道，其中每一个可具有通过通道连接的障碍物阵列(见图22B-22D、图23B和图23B)。嵌入的微流体层可以粘合到障碍物粘合层，该障碍物粘合层密封第一装置并防止流体在操作期间流过障碍物。叠层中的第二微流体装置可以在最顶部表面上包括嵌入的微流体通道，并且可以由与最顶部装置相同的障碍物粘合层密封。储器粘合层可具有允许液体通过而到达通道入口和来自通道出口的液体通过的椭圆形开口。储器粘合层可类似于障碍物粘合层，不同之处在于其连接到装置的表面而不是障碍物，并且可连接到供给装置叠层的一个或多个储器或连接到歧管。孔可用于对准堆叠的装置。如上所述，两个嵌入的微流体表面可以面向相同的障碍物粘合层。另一种配置是在两个装置的顶表面上具有嵌入的通道，在装置之间具有中间层，该中间层用作下面的嵌入通道的障碍物粘合层和上面的储器的分配层。多个微流体装置可以堆叠在一起以形成单个组装单元。在该叠层的顶部(并且任选地在顶部和底部)可以是具有用于歧管入口分配器的进料的歧管和从歧管产物出口引出的导管。也可以存在通向流体入口的进料和用于从废物出口除去流体的导管。

在某些实例中，装置可具有两个通道，其中每一通道具有不对称间隔的菱形障碍物阵列，其中G1大于G2。菱形可以偏移，使得每个连续行相对于前一行横向偏移。

本公开在本文中提供了在外壳内的微流体装置的堆叠组件，其一起可被称为“盒”。端口可用作将样品供给通过外壳并到达歧管的进料口。端口可以连接到通过歧管样品入口将样品分配到通道样品入口的歧管进料口。一旦施加，样品流过包含障碍物阵列的通道(参见图22和图23)，并且具有大于临界尺寸的颗粒或细胞的产物在歧管产物出口处离开装置叠层。然后，产物通过产物管道从歧管出口流出，并通过产物出口端口被输送出盒。流体流入盒中并通过连接到歧管流体进料口的端口到达歧管。其可以通过歧管流体入口分配到通道流体入口。流体流过通道，并且小于临界尺寸的颗粒或细胞主要通过歧管废物出口离开装置叠层。这些颗粒或细胞然后流过废物导管，该废物导管通过出口端口将废物输送出盒。

本文提供的匣或装置的实施方案可以包括由具有样品入口和流体入口的两个壁界定的通道。可以存在防止样品流与流体流动流混合的分离壁。分离壁可延伸到障碍物阵列中并在向下约一半处终止。最初，在进入障碍物阵列之后，靶细胞可以偏离流体流的方向，直到它们到达分离壁。然后它们可以沿着壁行进直到其结束。此后，它们可以继续被转移，直到它们在产物出口处离开通道。尺寸小于障碍物阵列的临界尺寸的颗粒不被转移并且在废物出口处离开通道。通道可以由具有用于样品的入口、用于试剂的入口和用于缓冲液或其它流体的入口的壁界定。样品可以在入口处进入并流到障碍物阵列上。在那里，大于阵列临界直径的颗粒或细胞被转移到试剂流中，在那里它们进行反应。分离壁可以从试剂入口部分地沿障碍物阵列向下延伸，并且可以将试剂流与缓冲液或其它流体流分离。壁将细胞或颗粒在试剂流中保持较长的时间，从而为反应提供更多的时间。在分离壁的末端，颗粒或细胞继续被转移到产物出口，在那里它们可以被被收集。在该过程中，细胞或颗粒与未反应的试剂分离。第二分离壁可以从第一分离壁的端部延伸到废物出口，在那里，缓冲剂液或其它流体、试剂和小颗粒或细胞离开装置并可以被收集或丢弃。第二废物出口可用于除去试剂、样品中的颗粒或细胞悬浮于其中的流体以及小于障碍物阵列的临界直径的颗粒或细胞。这些材料可以回收或丢弃。

G_T指三角形柱之间的间隙长度，G_C指圆形柱之间的间隙长度。当阵列倾斜增加时，三角形柱与圆形柱之间的阵列的特定临界尺寸(D_C)所需的间隙长度的差异减小。

障碍物边缘圆度(表示为r/S)可对由边缘界定的间隙的侧面上表现的临界尺寸具有影响。对于给定的间隙长度，增加柱的圆度增加了柱的临界尺寸值。

除了临界尺寸之外，在给定恒定施加压力的情况下，不同形状的柱也可能影响颗粒速度。给定施加压力，具有三角形柱的阵列将导致比具有圆形柱的阵列更大的颗粒速度。此外，三角形柱阵列中颗粒速度随压力增加而增加的速率也大于圆形柱阵列。

本文描述的匣可以包括在顶部和/或底部上的密封/盖以及分离层，该分离层包括促进分离的多个障碍物、流体层、以及允许在不使多个障碍物变形的情况下制造匣的空隙空间或缓冲区域(crumple zone)。多个障碍物可以排列成行和列，从而形成被配置成允许流体和细胞通过的间隙。障碍物可以这样排列，使得它们在重复行之间没有偏移或偏移最小的情况下堆叠。两个或更多个匣可以堆叠或串联或并联连接以实现更大的分离或更高的通量。

当类似的装置或微流体匣在亚毫米级上操作并处理微升、纳升或更少量的流体时，制造中的主要障碍是避免模压或组装期间障碍物的损坏或变形。例如，芯片的处理可导致对平面支持物的压力，尤其是当平面支持物被压在一起时，这可导致平面支持物、障碍物(即障碍物阵列)和各种分离泳道的变形或破坏。这种变形或破坏可能导致纯化颗粒或细胞的性能的显著损失，或者可能完全损害微流体匣的功能。为了避免在制造和组装期间的潜在变形和缺陷，其它微流体系统需要较慢的制造运行或接受降低的性能。

在一个方面，本公开提供了用于纯化细胞或颗粒的微流体匣。微流体匣可以包括第一平面支持物。第一平面支持物可包括顶表面和底表面。装置可以包括第二平面支持物。第二平面支持物可包括顶表面和底表面。顶表面可以包括从一个或多个入口延伸到一个或多个出口的至少一个嵌入通道。至少一个嵌入通道可以包括障碍物阵列。第一和第二平面支持物的底表面可以包括空隙空间。空隙空间可以被配置成当第一平面支持物的底部被压到第二平面支持物的底部时变形。

根据描述的分离沿着嵌入在平面支持物中的通道发生，通道包括多个障碍物。对于本说明书的匣，可以使用第一和第二平面表面。第一和第二平面表面可堆叠(例如，具有间隔物的底部到底部或顶部到底部)，使通量和分离能力加倍，同时维持小占地面积。第一和/或第二平面表面的顶表面可以包括至少1个嵌入通道至约500个嵌入通道。顶表面可包括至少1个嵌入通道至约2个嵌入通道、1个嵌入通道至约5个嵌入通道、1个嵌入通道至约20个嵌入通道、1个嵌入通道至约50个嵌入通道、1个嵌入通道至约100个嵌入通道、1个嵌入通道至约500个嵌入通道、约2个嵌入通道至约5个嵌入通道、约2个嵌入通道至约20个嵌入通道、约2个嵌入通道至约50个嵌入通道、约2个嵌入通道至约100个嵌入通道、约2个嵌入通道至约500个嵌入通道、约5个嵌入通道至约20个嵌入通道、约5个嵌入通道至约50个嵌入通道、约5个嵌入通道至约100个嵌入通道、约5个嵌入通道至约500个嵌入通道、约20个嵌入通道至约50个嵌入通道、约20个嵌入通道至约100个嵌入通道、约20个嵌入通道至约500个嵌入通道、约50个嵌入通道至约100个嵌入通道、约50个嵌入通道至约500个嵌入通道、或约100个嵌入通道至约500个嵌入通道。顶表面可包括至少1个嵌入通道、约2个嵌入通道、约5个嵌入通道、约20个嵌入通道、约50个嵌入通道、约100个嵌入通道或约500个嵌入通道。顶表面可包括至少1个嵌入通道、约2个嵌入通道、约5个嵌入通道、约20个嵌入通道、约50个嵌入通道或约100个嵌入通道。顶表面可包括至少至多约2个嵌入通道、约5个嵌入通道、约20个嵌入通道、约50个嵌入通道、约100个嵌入通道或约500个嵌入通道。顶表面或第一或第二平面表面可包括约28个通道(当堆叠时是56个)。另外的第三、第四、第五或第六平面表面也可以包括与第一或第二平面表面类似量的嵌入通道。

微流体匣可包括至少1个入口至约50个入口。微流体匣可包括至少1个入口至约2个入口、1个入口至约5个入口、1个入口至约10个入口、1个入口至约20个入口、1个入口至约50个入口、约2个入口至约5个入口、约2个入口至约10个入口、约2个入口至约20个入口、约2个入口至约50个入口、约5个入口至约10个入口、约5个入口至约20个入口、约5个入口至约50个入口、约10个入口至约20个入口、约10个入口至约50个入口、或约20个入口至约50个入口。微流体匣可包括至少1个入口、约2个入口、约5个入口、约10个入口、约20个入口或约50个入口。微流体匣可包括至少1个入口、约2个入口、约5个入口、约10个入口或约20个入口。微流体匣可包括至少至多约2个入口、约5个入口、约10个入口、约20个入口或约50个入口。入口可以由共用射流系统或双射流系统(一个用于缓冲剂/稀释剂，一个用于样品)供给。

微流体匣可包括至少1个出口至约50个出口。微流体匣可包括至少1个出口至约2个出口、1个出口至约5个出口、1个出口至约10个出口、1个出口至约20个出口、1个出口至约50个出口、约2个出口至约5个出口、约2个出口至约10个出口、约2个出口至约20个出口、约2个出口至约50个出口、约5个出口至约10个出口、约5个出口至约20个出口、约5个出口至约50个出口、约10个出口至约20个出口、约10个出口至约50个出口、或约20个出口至约50个出口。微流体匣可包括至少1个出口、约2个出口、约5个出口、约10个出口、约20个出口或约50个出口。微流体匣可包括至少1个出口、约2个出口、约5个出口、约10个出口或约20个出口。微流体匣可包括至少至多约2个出口、约5个出口、约10个出口、约20个出口或约50个出口。出口可以供给共用射流系统或双射流系统(一个用于废物，一个用于富集的靶细胞或颗粒)。

包括两个或更多个平面表面的匣可以包括空隙空间以保护泳道中的障碍物阵列，因为它们的小尺寸导致它们易于变形，从而导致故障。

微流体匣的空隙空间可以被配置成变形、弯曲、膨胀、塌陷或扭曲。空隙空间可以被配置成保护障碍物、通道、入口、出口、平面表面或其任何组合免受损坏、移位、变形或故障。空隙空间可以包括缓冲区域，其被配置成保护这些障碍物、通道、入口、出口、平面表面或其任何组合免受损坏、移位、变形或故障。空隙空间可具有约1立方微米至约10,000立方微米的体积。空隙空间可具有约1立方微米至约5立方微米、约1立方微米至约10立方微米、约1立方微米至约30立方微米、约1立方微米至约50立方微米、约1立方微米至约100立方微米、约1立方微米至约300立方微米、约1立方微米至约1,000立方微米、约1立方微米至约3,000立方微米、约1立方微米至约10,000立方微米、约5立方微米至约10立方微米、约5立方微米至约30立方微米、约5立方微米至约50立方微米、约5立方微米至约100立方微米、约5立方微米至约300立方微米、约5立方微米至约1,000立方微米、约5立方微米至约3,000立方微米、约5立方微米至约10,000立方微米、约10立方微米至约30立方微米、约10立方微米至约50立方微米、约10立方微米至约100立方微米、约10立方微米至约300立方微米、约10立方微米至约1,000立方微米、约10立方微米至约3,000立方微米、约10立方微米至约10,000立方微米、约30立方微米至约50立方微米、约30立方微米至约100立方微米、约30立方微米至约300立方微米、约30立方微米至约1,000立方微米、约30立方微米至约3,000立方微米、约30立方微米至约10,000立方微米、约50立方微米至约100立方微米、约50立方微米至约300立方微米、约50立方微米至约1,000立方微米、约50立方微米至约3,000立方微米、约50立方微米至约10,000立方微米、约100立方微米至约300立方微米、约100立方微米至约1,000立方微米、约100立方微米至约3,000立方微米、约100立方微米至约10,000立方微米、约300立方微米至约1,000立方微米、约300立方微米至约3,000立方微米、约300立方微米至约10,000立方微米、约1,000立方微米至约3,000立方微米、约1,000立方微米至约10,000立方微米或约3,000立方微米至约10,000立方微米的体积。空隙空间可具有约1立方微米、约5立方微米、约10立方微米、约30立方微米、约50立方微米、约100立方微米、约300立方微米、约1,000立方微米、约3,000立方微米或约10,000立方微米的体积。空隙空间可具有至少约1立方微米、约5立方微米、约10立方微米、约30立方微米、约50立方微米、约100立方微米、约300立方微米、约1,000立方微米或约3,000立方微米的体积。空隙空间可具有至多约5立方微米、约10立方微米、约30立方微米、约50立方微米、约100立方微米、约300立方微米、约1,000立方微米、约3,000立方微米或约10,000立方微米的体积。

匣的底表面可包括多个空隙空间，这些空隙空间在此示出为布置成平行于平面支持物的长度延伸的条带。空隙空间可在平面支持物的顶表面上制造的障碍物的阵列或列或由障碍物的列形成的泳道下方延伸。平面支持物的顶表面可以包括形成为阵列或列的多个单独的障碍物，阵列或列产生允许流体、细胞和/或颗粒流动的间隙。嵌入在平面支持物的底表面中的障碍物下方可以是空隙空间。与泳道相对的空隙空间的面积(长度×宽度)可以是泳道面积(长度×宽度)的至少约80％。在某些实施方案中，与泳道相对的空隙空间的面积(长度×宽度)可以为泳道面积(长度×宽度)的至少约90％、100％、110％或120％直至并包括约150％。

在一种配置中，两个平面支持物的空隙空间可以是对称的或近似对称的并且被背靠背压紧。然而，替代布置也是可能的，例如以空隙空间在障碍物层上方或下方堆叠。

空隙空间可分成两个或更多个空隙空间。空隙空间可分成至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个空隙空间。空隙空间可被精确地分成两个空隙空间。对于包括障碍物的每个平面支持物，通道或泳道和空隙空间之间的比率可以为1:1。

平面支持物可以由结合在一起的两层材料制成。这些层可以通过粘合剂、聚合物或热塑性粘合在一起。这些层可以包含聚合物或热塑性。聚合物或热塑性层或粘合材料可包含高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PT)、聚碳酸酯(PC)或环烯烃共聚物(COC)。

匣的顶层可包括在至少一个嵌入通道中的障碍物阵列、空隙空间、至少一个入口、至少一个出口或其组合。匣的底层可包括在至少一个嵌入通道中的障碍物阵列、空隙空间、至少一个入口、至少一个出口或其组合。这些层可以定位在平面支持物在其侧表面、底表面或顶表面上结合在一起的位置。空隙空间可以在结合在一起的平面支持物的界面内部，或者在界面外部。

微流体匣还可包括障碍物粘合层，其粘合到平面支持物的表面和嵌入通道中的障碍物阵列的顶表面，以防止流体或样品在匣的操作期间流过障碍物阵列。障碍物粘合层可以是金属的、聚合物的或热塑性的。障碍物粘合层可以是覆盖层或膜。聚合物或热塑性层或粘合材料可包含高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PT)、聚碳酸酯(PC)或环烯烃共聚物(COC)。微流体匣可以包括在顶部平面支持物外侧上的两个障碍物粘合层。微流体匣可以在匣的中间包括单个障碍物粘合层作为平面支持物的粘合剂。障碍物粘合层可以包括流体连接到嵌入通道的一个或多个入口(允许样品流入通道)的一个或多个通路，以及流体连接到通道的一个或多个出口(允许流体从一个或多个出口流出)的一个或多个通道。这样的障碍层可以包括至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约10个、至少约20个、至少约30个、至少约50个、或至少约100个流体地连接到嵌入通道的一个或多个入口或一个或多个出口的通路。

微流体匣可具有定位成限定匣的临界尺寸的障碍物，使得当样品施加到匣的入口并流到出口时，样品中大于临界尺寸的颗粒或细胞与样品中小于临界尺寸的颗粒或细胞分离。每个障碍物可以具有其自己的单独的亚临界尺寸，单独的障碍物的总和限定匣的临界尺寸。匣的一个或多个出口可包括至少一个产物出口，其中尺寸大于匣的临界尺寸的靶颗粒或细胞被引导到至少一个产物出口。匣的一个或多个出口可包括至少一个产物出口，其中尺寸大于匣的临界尺寸的靶颗粒或细胞被引导到至少一个产物出口。匣可具有至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约5个、至少约10个、或至少约50个产物出口。尺寸大于临界尺寸的颗粒或细胞可流向至少一个产物出口。匣可以具有至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约5个、至少约10个、或至少约50个废物出口。

在匣中使用的障碍物可以采取柱形、或者三角形、正方形、矩形、菱形、梯形、六边形、泪滴形、圆形、半圆形、具有顶侧水平形状的三角形、以及具有底侧水平形状的三角形的形状。此外，相邻的障碍物可以具有这样的几何形状，使得限定间隙的障碍物的部分关于间隙的轴线是对称的或非对称的，间隙的轴线在主体流体流的方向上延伸。障碍物可具有延伸到平行间隙中的顶点，使得间隙在任一侧侧接一个或多个指向彼此但彼此不直接相对的顶点。障碍物可具有延伸到垂直间隙中的顶点，使得间隙在任一侧侧接指向彼此且彼此直接相对的顶点。障碍物位置和形状可以在单个芯片中变化。对于任何特定的要求，附加的障碍物可以被添加到装置的任何位置。另外，在装置中障碍物的形状可以不同。柱形状、尺寸和位置的任何组合可用于特定的要求。匣可仅包含菱形或六边形障碍物。

障碍物形状可以垂直于流体流方向伸长，使得它们具有不同于它们的垂直长度(P2)的水平长度(P1)。P1可具有约1μm至约160μm的长度。P1可具有约1μm至约10μm、约1μm至约15μm、约1μm至约30μm、约1μm至约40μm、约1μm至约80μm、约1μm至约160μm、约10μm至约15μm、约10μm至约30μm、约10μm至约40μm、约10μm至约80μm、约10μm至约160μm、约15μm至约30μm、约15μm至约40μm、约15μm至约80μm、约15μm至约160μm、约30μm至约40μm、约30μm至约80μm、约30μm至约160μm、约40μm至约80μm、约40μm至约160μm或约80μm至约160μm。P1可具有约1μm、约10μm、约15μm、约30μm、约40μm、约80μm或约160μm的长度。P1可具有至少约1μm、约10μm、约15μm、约30μm、约40μm或约80μm的长度。P1可具有至多约10μm、约15μm、约30μm、约40μm、约80μm或约160μm的长度。P2可具有约1μm至约160μm的长度。P2可具有约1μm至约10μm、约1μm至约15μm、约1μm至约30μm、约1μm至约40μm、约1μm至约80μm、约1μm至约160μm、约10μm至约15μm、约10μm至约30μm、约10μm至约40μm、约10μm至约80μm、约10μm至约160μm、约15μm至约30μm、约15μm至约40μm、约15μm至约80μm、约15μm至约160μm、约30μm至约40μm、约30μm至约80μm、约30μm至约160μm、约40μm至约80μm、约40μm至约160μm或约80μm至约160μm。P2可具有约1μm、约10μm、约15μm、约30μm、约40μm、约80μm或约160μm的长度。P2可具有至少约1μm、约10μm、约15μm、约30μm、约40μm或约80μm的长度。P2可具有至多约10μm、约15μm、约30μm、约40μm、约80μm或约160μm的长度。P1可比P2长约25％到约200％。P1可比P2长约25％至约50％、约25％至约75％、约25％至约100％、约25％至约150％、约25％至约200％、约50％至约75％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约75％至约100％、约75％至约150％、约75％至约200％、约100％至约150％、约100％至约200％、或约150％至约200％。P1可比P2长约25％、约50％、约75％、约100％、约150％或约200％。P1可比P2长至少约25％、约50％、约75％、约100％或约150％。P1可比P2长至多约50％、约75％、约100％、约150％或约200％。

微流体匣可以包括作为障碍物阵列的障碍物。障碍物可以布置成形成离散阵列的列和行。障碍物阵列包括至少约5列至约50列。障碍物阵列可包括至少约5列至约10列、约5列至约28列、约5列至约29列、约5列至约30列、约5列至约50列、约10列至约28列、约10列至约29列、约10列至约30列、约10列至约50列、约28列至约29列、约28列至约30列、约28列至约50列、约29列至约30列、约29列至约50列或约30列至约50列。障碍物阵列包括至少约5列、约10列、约28列、约29列、约30列或约50列。障碍物阵列包括至少约5列、约10列、约28列、约29列或约30列。障碍物阵列可包括至少至多约10列、约28列、约29列、约30列或约50列。障碍物阵列包括至少约20行到约500行。障碍物阵列可以包括至少约20行至约30行、约20行至约60行、约20行至约100行、约20行至约200行、约20行至约500行、约30行至约60行、约30行至约100行、约30行至约200行、约30行至约500行、约60行至约100行、约60行至约200行、约60行至约500行、约100行至约200行、约100行至约500行或约200行至约500行。障碍物阵列可包括至少约20行、约30行、约60行、约100行、约200行或约500行。障碍物阵列可包括至少约20行、约30行、约60行、约100行或约200行。障碍物阵列可包括至少至多约30行、约60行、约100行、约200行或约500行。多个障碍物阵列可以布置在离散泳道中。第一或第二平面支持物的障碍物阵列形成约10个泳道至约50个泳道。第一或第二平面支持物的障碍物阵列形成约10个泳道至约20个泳道、约10个泳道至约28个泳道、约10个泳道至约30个泳道、约10个泳道至约50个泳道、约20个泳道至约28个泳道、约20个泳道至约30个泳道、约20个泳道至约50个泳道、约28个泳道至约30个泳道、约28个泳道至约50个泳道、或约30个泳道至约50个泳道。第一或第二平面支持物的障碍物阵列形成约10个泳道、约20个泳道、约28个泳道、约30个泳道或约50个泳道。第一或第二平面支持物的障碍物阵列形成至少约10个泳道、约20个泳道、约28个泳道或约30个泳道。第一或第二平面支持物的障碍物阵列形成至多约20个泳道、约28个泳道、约30个泳道或约50个泳道。

每个匣可以包括至少一组、至少两组、至少三组或至少四组障碍物阵列。每个平面顶表面可以包括至少一个或至少两个阵列。匣可包括总共约20个泳道至约100个泳道。匣可包括总共约20个泳道至约40个泳道、约20个泳道至约56个泳道、约20个泳道至约60个泳道、约20个泳道至约100个泳道、约40个泳道至约56个泳道、约40个泳道至约60个泳道、约40个泳道至约100个泳道、约56个泳道至约60个泳道、约56个泳道至约100个泳道、或约60个泳道至约100个泳道。匣可包括总共约20个泳道、约40个泳道、约56个泳道、约60个泳道或约100个泳道。匣可包括总共至少约20个泳道、约40个泳道、约56个泳道或约60个泳道。匣可包括总共至多约40个泳道、约56个泳道、约60个泳道或约100个泳道。

微流体匣的入口、出口或两者可与泵或马达流体连接以驱动流体在匣内和匣外流动。入口、出口或两者可流体连接到至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个泵。泵可以是蠕动泵。泵可以彼此流体连接或分离。匣的入口和出口可以与彼此并联连接的两个蠕动泵流体连接。匣的入口和出口可以与彼此串联连接的两个蠕动泵流体连接。

微流体匣可由金属、聚合物或热塑性制成。聚合物或热塑性层可包含高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PT)、聚碳酸酯(PC)或环烯烃共聚物(COC)。在一个实例中，微流体匣包含环状烯烃共聚物。

本公开还提供了一种微流体组件，其包括流体连接的多个微流体匣。组件中的匣可以堆叠或分层。多个微流体匣可包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30个匣。多个匣可以串联或并联地流体连接。

在DLD期间，包含细胞的流体样品在入口处被引入装置中，并与流过装置的流体一起被运送到出口。当样品中的细胞穿过装置时，它们遇到已被定位以形成细胞必须通过的间隙或孔隙的柱或其它障碍物。每个连续的障碍物行相对于前一行移位，以便形成与流动通道中的流体流方向不同的阵列方向。由这两个方向定义的“倾斜角”，连同障碍物之间的间隙的宽度、障碍物的形状和形成间隙的障碍物的取向是确定阵列的“临界尺寸”的主要因素。尺寸大于临界尺寸的细胞沿阵列方向而不是沿主体流体流方向行进，尺寸小于临界尺寸的颗粒沿主体流体流方向行进。在用于白细胞去除术来源的组合物的装置中，可以选择阵列特征，使得白细胞在阵列方向上转向，而红细胞和血小板在主体流体流的方向上继续。为了从具有相似尺寸的其它白细胞中分离选定类型的白细胞，然后可以使用载体，该载体以促进DLD分离的方式与细胞结合，从而产生比未复合的白细胞大的复合物。然后可以在临界尺寸小于复合物但大于未复合细胞的装置上进行分离。

可以使用通常制造微米级和纳米级流体处理装置的任何材料制造装置，包括硅、玻璃、塑料和混合材料。适用于微流体制造的不同范围的热塑性材料是可获得的，提供了机械和化学性质的广泛选择，可针对特定应用进行利用和进一步定制。在一个方面，微流体匣可以通过软模压和紫外光固化来制造。

微流体匣(或装置、盒、芯片等)可通过包括复制模制、具有PDMS的软平版印刷、热固性聚酯、模压、软模压、热模压、卷对卷模压、注塑、激光烧蚀、紫外光固化及其组合的技术制造。进一步的细节可以在Fiorini等人的“Disposable microfluidic devices:fabrication,function and application”(BioTechniques 38:429-446(March 2005))中找到，其通过引用整体并入本文。由Keith E.Herold和Avraham Rasooly编辑的书“Lab ona Chip Technology”，Caister Academic Press Norfolk UK(2009)是另一种制造方法的资源，并且通过引用整体并入本。

高通量模压方法如热塑性塑料的卷到卷加工是工业微流体芯片生产的有吸引力的方法。使用单片热模压可以是在原型制作阶段实现高质量微流体装置的成本有效的技术。在Yang等人的“Microfluidic device fabrication by thermoplastic hot-embossing”(Methods Mol.Biol.949:115-23(2013))中描述了在两种热塑性塑料聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和/或聚碳酸酯(PC)中复制微观特征的方法，其通过引用整体并入本。

流动通道可以使用两件或更多件来构造，这些件在组装时形成封闭的空腔(优选地具有用于添加或抽出流体的孔口的空腔)，障碍物被布置在空腔内。障碍物可以被制造在被组装以形成流动通道的一件或两件上，或者它们可以被制造成夹在限定流动通道的边界的两件或更多个件之间的插入件的形式。

障碍物可以是以阵列形式横向延伸穿过流动通道并沿通道从入口纵向延伸到出口的固体。在障碍物在障碍物的一端处与流动通道的一个面(或其延伸)成一体的情况下，障碍物的另一端可以密封到或压靠在流动通道的相对面上。在障碍物的一端与流动通道的面之间可容许有小的空间(优选地太小而不能容纳用于预期用途的任何目的颗粒)，只要空间不会不利地影响障碍物的结构稳定性或装置的相关流动特性即可。

可以涂覆表面以改变它们的性质，并且可以以许多方式修饰用于制造装置的聚合物材料。在一些情况下，在天然聚合物中或通过湿化学或等离子体处理添加的官能团如胺或羧酸用于交联蛋白或其它分子。使用表面胺基将DNA连接至COC和PMMA基底。通过向PDMS制剂中加入表面活性剂如/>可用于使表面亲水和蛋白排斥。在一些情况下，PMMA层旋涂在装置例如微流体芯片上，并且用羟丙基纤维素“掺杂”PMMA以改变其接触角。

为了减少细胞或化合物(例如由裂解的细胞释放的或在生物样品中发现的)在通道壁上的非特异性吸附，可以将一个或多个壁化学修饰为非粘附的或排斥的。壁可以涂有市售不粘试剂的薄膜(例如单层)，例如用于形成水凝胶的那些。可用于修饰通道壁的化学物质的其它实例包括低聚乙二醇、氟化聚合物、有机硅烷、硫醇、聚乙二醇、透明质酸、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、粘蛋白、聚HEMA、甲基丙烯酸酯化PEG和琼脂糖。带电聚合物也可用于排斥带相反电荷的物质。用于排斥的化学物质的类型和附着于通道壁的方法可以取决于被排斥的物质的性质以及壁和被附着的物质的性质。这种表面修饰技术是本领域公知的。壁可以在装置组装之前或之后官能化。

IV.使用DLD的分离过程

本文所述的DLD装置可用于纯化细胞、细胞碎片、细胞加合物或核酸。使用装置分离和纯化血液组分可以在例如美国公开号US 2016/0139012中找到，其教导通过引用整体并入本文。

通过DLD方法产生的细胞的纯度、产率和活力将基于许多因素而变化，包括起始材料的性质、所采用的确切程序和DLD装置的特征。优选地，应获得至少60％的纯化、产率和活力，至少70％、80％或90％的更高百分比是更优选的。

在一个方面，本公开提供了用于从样品中的污染物中富集预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的方法。富集靶颗粒或靶细胞的方法使用本文别处描述的任何匣、微流体匣、盒、芯片、装置、流体装置或微流体装置。方法可以包括获得包含靶颗粒或靶细胞和污染物的样品。方法还可包括通过将样品施加到本文所述的任何匣、盒或装置上的一个或多个样品入口而将靶颗粒或靶细胞与污染物分离。方法还可包括使样品流向本文所述的任何匣、盒或装置上的出口。方法还可包括从一个或多个出口获得富含靶颗粒或靶细胞的产物，同时除去污染物。方法可以产生从污染物中纯化或分离细胞或颗粒的优异能力，产生更大的细胞产量，提高的体外扩增产物的能力，以及更适于转导或其它基因工程的富集细胞产物。

方法可能需要使用确定性侧向位移，由此该装置具有如本文所述的临界尺寸，并且污染物和靶颗粒或靶细胞基于具有不同的临界尺寸而被分离。方法可包括使包含靶颗粒或靶细胞和污染物的样品流向本文所述的任何匣、盒或装置，其中靶颗粒或靶细胞具有大于障碍物阵列的临界尺寸的尺寸，并且至少一些污染物具有小于障碍物阵列的临界尺寸的尺寸，并且其中靶细胞或靶颗粒流向一个或多个产物出口，在那里获得富集了靶细胞或靶颗粒的产物，并且尺寸小于障碍物阵列的临界尺寸的污染物流向一个或多个废物出口。方法可包括使包含靶颗粒或靶细胞和污染物的样品流向本文所述的任何匣、盒或装置，其中靶颗粒或靶细胞具有小于障碍物阵列的临界尺寸的尺寸，并且至少一些污染物具有大于障碍物阵列的临界尺寸的尺寸，并且其中靶细胞或靶颗粒流向一个或多个产物出口，在那里获得富集了靶细胞或靶颗粒的产物，并且尺寸大于障碍物阵列的临界尺寸的污染物流向一个或多个废物出口。

方法可包括使包含靶颗粒或靶细胞和污染物的样品以恒定流速或可变流速流向本文所述的任何匣、盒或装置。该方法的匣流速可以是约400mL/小时。该方法的匣流速可以为约100mL/小时至约1,000mL/小时。该方法的匣流速可以为约100mL/小时至约200mL/小时、约100mL/小时至约400mL/小时、约100mL/小时至约800mL/小时、约100mL/小时至约1,000mL/小时、约200mL/小时至约400mL/小时、约200mL/小时至约800mL/小时、约200mL/小时至约1,000mL/小时、约400mL/小时至约800mL/小时、约400mL/小时至约1,000mL/小时、或约800mL/小时至约1,000mL/小时。该方法的匣流速可以为约100mL/小时、约200mL/小时、约400mL/小时、约800mL/小时或约1,000mL/小时。该方法的匣流速可以为至少约100mL/小时、约200mL/小时、约400mL/小时或约800mL/小时。该方法的匣流速可以为至多约200mL/小时、约400mL/小时、约800mL/小时或约1,000mL/小时。

方法可包括在匣内的内部压力。匣的内部压力可以为至少约15磅/平方英寸。匣的内部压力可以为至少约1.5磅/平方英寸至约50磅/平方英寸。匣的内部压力可以为至少约1.5磅/平方英寸至约5磅/平方英寸、约1.5磅/平方英寸至约10磅/平方英寸、约1.5磅/平方英寸至约15磅/平方英寸、约1.5磅/平方英寸至约20磅/平方英寸、约1.5磅/平方英寸至约50磅/平方英寸、约5磅/平方英寸至约10磅/平方英寸、约5磅/平方英寸至约15磅/平方英寸、约5磅/平方英寸至约20磅/平方英寸、约5磅/平方英寸至约50磅/平方英寸、约10磅/平方英寸至约15磅/平方英寸、约10磅/平方英寸至约20磅/平方英寸、约10磅/平方英寸至约50磅/平方英寸、约15磅/平方英寸至约20磅/平方英寸、约15磅/平方英寸至约50磅/平方英寸或约20磅/平方英寸至约50磅/平方英寸。匣的内部压力可以为至少约1.5磅/平方英寸、约5磅/平方英寸、约10磅/平方英寸、约15磅/平方英寸、约20磅/平方英寸或约50磅/平方英寸。匣的内部压力可以为至少约1.5磅/平方英寸、约5磅/平方英寸、约10磅/平方英寸、约15磅/平方英寸或约20磅/平方英寸。匣的内部压力可以为至少至多约5磅/平方英寸、约10磅/平方英寸、约15磅/平方英寸、约20磅/平方英寸或约50磅/平方英寸。

样品中细胞的分离可以通过使用DLD对细胞类型进行正选择或负选择来进行，并收集在输出管中。因此，DLD可用于产生血小板减少的血液相关样品。在某些实施方案中，血小板减少的血液相关样品包括血小板与靶细胞的比率小于约500:1。在某些实施方案中，血小板减少的血液相关样品包括血小板与靶细胞的比率小于约100:1。在某些实施方案中，血小板减少的血液相关样品包括血小板与靶细胞的比率小于约10:1。在某些实施方案中，血小板减少的血液相关样品包括血小板与靶细胞的比率小于约5:1。在某些实施方案中，红细胞维持在红细胞与靶细胞的比率大于约100:1。在某些实施方案中，红细胞维持在红细胞与靶细胞的比率大于约250:1。在某些实施方案中，红细胞维持在红细胞与靶细胞的比率大于约500:1。在某些实施方案中，红细胞维持在红细胞与靶细胞的比率不大于约1,000:1。

因此，DLD可用于从样品产生富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约500:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约100:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约10:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约5:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约100:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约250:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约500:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率不大于约1,000:1。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离淋巴细胞。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离造血干细胞。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离间充质干细胞。在某些实施方案中，外周血单核细胞(PBMC)的分离用于分离T细胞以产生嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。

在某些实施方案中，富集的靶细胞包含PBMC并表现出从起始样品中除去大于约75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的红细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞包含PBMC并表现出从起始样品中除去大于约75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的血小板细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞包含PBMC并表现出从起始样品中除去大于约75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的红细胞和血小板细胞。

介电电泳

包括用于分离不同细胞类型的介电电泳(DEP)的方法可用于从血液相关样品获得一种或多种靶细胞。介电电泳(DEP)是暴露于电场梯度的颗粒或细胞根据细胞和包围它们的介质的特性而被极化的现象。参见美国专利号10,078,066；还参见Douglas TA等人，“Separation of Macrophages and Fibroblasts Using ContactlessDielectrophoresis and a Novel ImageJ Macro.”Bioelectricity.2019；1(1):49-55.doi:10.1089/bioe.2018.0004。这种极化诱导细胞沿电场梯度的运动。因此，介电电泳(DEP)可用于捕获细胞或将它们从正常流线转移。例如，介电电泳(DEP)可用于从细胞群体中正选择或负选择靶细胞。采用包含细胞流动腔室的聚二甲硅氧烷(PDMS)微流体装置的非接触式介电电泳(DEP)可用于促进细胞类型的介电电泳(DEP)分离。聚二甲硅氧烷(PDMS)微流体装置通常包括含有20微米(μm)柱的阵列的腔室，其中细胞基于所施加电场的梯度而被捕获。装置通常还包括填充有导电流体并通过薄聚二甲硅氧烷(PDMS)膜与主通道分离的非接触流体电极。使用填充有浓缩缓冲液(例如10×浓缩磷酸盐缓冲盐水(PBS))的非接触电极施加电压通过防止微流体装置中的电解和气泡形成以及避免高电场区域与细胞之间的接触而消除了如在传统介电电泳中所看到的细胞死亡的问题。

除了改善细胞活力之外，利用小的柱结构通过防止珠链化和细胞-细胞相互作用允许更好地控制细胞选择性。具有不同生物电表型的细胞在不同的施加电场频率下被捕获在主通道中。通过调节所施加的频率，装置可以选择性地捕获一些细胞，同时允许其它细胞通过装置。这种选择性允许以无标记的方式分离高度相似的细胞类型，同时保持高细胞活力，使得它们可以在下游培养或进一步表征。方法提供了更具选择性和更高活力的细胞分离，其允许分离更紧密相关和物理上相似的细胞，同时允许以更高的效率分离不太相似的细胞。

分批分离可以通过捕获一些细胞同时允许其它细胞流过并收集在输出管中来进行。在关闭电压之后，被捕获的细胞可以从它们的柱释放并且可以被收集在另一个输出管中。因此，介电电泳方法可用于从样品产生富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约500:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约100:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约10:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约5:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约100:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约250:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约500:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率不大于约1,000:1。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离淋巴细胞。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离造血干细胞。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离间充质干细胞。在某些实施方案中，外周血单核细胞(PBMC)的分离用于分离T细胞以产生嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。

声泳分离

包括用于分离不同细胞类型的声泳的方法可用于从血液相关样品获得一种或多种靶细胞。声泳是这样一种现象，其中暴露于声压场的细胞基于细胞的特性而被分离。参见美国专利号10,640,760；还参见Dutra，Brian等人“A Novel Macroscale Acoustic Devicefor Blood Filtration.”Journal of medical devices vol.12,1(2018):0110081-110087.doi:10.1115/1.4038498。声学分离的基本原理是基于由声学驻波建立的流体中的非均匀声压场。在该声压场中引入颗粒导致声压的散射。作用在颗粒表面上的声压于是由入射声学驻波和散射波的总和组成。通过对颗粒表面上的声压(即声辐射力)进行积分来确定颗粒上的净时间平均力。除了轴向声辐射力分量之外，三维声波还在悬浮颗粒上施加垂直于轴的侧向力。声辐射力分量的轴向分量引导颗粒每半个波长在压力节点或波腹处的平面中聚集，分别由正或负声反差因子确定。声辐射力分量的侧向分量将平面内的细胞聚集成局部簇，其中细胞以聚集尺寸生长，直到它们达到临界质量，并且重力/浮力使细胞下沉或上升出悬浮液，从而分离细胞。

样品中细胞的分离可以通过使用声泳对细胞类型进行正选择或负选择来进行，并收集在输出管中。因此，声泳分离可用于从样品产生富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约500:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约100:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约10:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约5:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约100:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约250:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约500:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率不大于约1,000:1。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离淋巴细胞。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离造血干细胞。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离间充质干细胞。在某些实施方案中，外周血单核细胞(PBMC)的分离用于分离T细胞以产生嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。

亲和分离

利用基于亲和力的分离技术分离样品或生物材料的组分的各种技术是已知的。免疫亲和方法可包括选择性标记样品的某些组分(例如，抗体标记)以及分离标记的和未标记的组分。为了从预先富集或未富集的生物样品中分离细胞，使用利用亲和分子(例如抗体、结合蛋白、适体等)的免疫亲和捕获。因此，本文使用的免疫亲和捕获是指使用亲和分子(例如抗体、结合蛋白、适体等)从样品捕获或分离细胞。结合特异性细胞标记蛋白的亲和分子(例如抗体、结合蛋白、适体等)作为靶细胞的配体起作用，从而提供捕获细胞(直接或间接)并允许它们从样品中分离的手段。免疫亲和捕获技术的实例包括但不限于免疫沉淀、柱亲和层析、磁激活细胞分选、荧光激活细胞分选、基于粘附的分选和基于微流体的分选，直接或使用载体。在均质或异质混合物中的亲和分子(例如抗体、结合蛋白、适体等)可以一起使用，在单一溶液中使用，或者可以在同时或连续使用的两种或多种溶液中使用。

磁分离方法通常包括使样品通过分离柱或与基于珠的溶液孵育。磁分离是用于选择性地将磁性材料保持在置于磁场中的腔室或柱中的程序。靶物质，包括生物材料，可以通过借助与颗粒缀合的特异性结合配偶体附着于磁性颗粒而被磁性标记。然后将标记的靶物质的悬浮液施加到腔室中。靶物质在磁场的存在下保持在腔室中。然后可以通过改变磁场的强度或消除磁场来洗脱保留的靶物质。具有合适磁化率的材料的基体可以放置在腔室中，使得当磁场施加到腔室时，在靠近基体表面处局部地感应高磁场梯度。这允许弱磁化颗粒的保留，并且该方法被称为高梯度磁分离(HGMS)。

因此，磁分离可用于从样品产生富集的靶细胞群体。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约500:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约100:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约10:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括血小板与靶细胞的比率小于约5:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约100:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约250:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率大于约500:1。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体包括红细胞与靶细胞的比率不大于约1,000:1。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离淋巴细胞。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离造血干细胞。在一些实施方案中，密度梯度分离用于分离间充质干细胞。在某些实施方案中，外周血单核细胞(PBMC)的分离用于分离T细胞以产生嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。

因此，结合血小板表面上的生物标记的亲和分子(例如抗体、结合蛋白、适体等)是有用的。已知的血小板表面生物标记包括但不限于CD36、CD41(GP IIb/IIIa)、CD42a(GPIX)、CD42b(GPIb)和CD61(avb3，玻连蛋白受体)。已知的血小板活化生物标记在活化期间出现在血小板表面上并且可以被靶向。血小板活化生物标记包括但不限于PAC-1(活化的IIb/IIIa)、CD62P(P-选择蛋白)、CD31(PECAM)和CD63。红细胞表面生物标记可用于靶向亲和分子(例如抗体、结合蛋白、适体等)。已知的红细胞生物标记包括但不限于表面抗原A、表面抗原B、Rh因子和CD235a。

在某些实施方案中，富集的靶细胞群体不是通过基于亲和力的分离富集的。在某些实施方案中，富集的靶细胞群体不是通过基于磁性的分离富集的。

本文所述的方法产生具有减少的血小板量和/或增加的红细胞量或一定数量的红细胞的富集的靶细胞群体。在一些实施方案中，富集的靶细胞包括少于10％、5％、2％或1％的血小板。在一些实施方案中，红细胞维持在1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶个红细胞/微升(uL)的水平。另外，可以将红细胞加入到从声泳收集的细胞靶产物中。在一些实施方案中，样品是血液样品。在一些实施方案中，声泳用于分离外周血单核细胞(PBMC)。在某些实施方案中，外周血单核细胞(PBMC)的分离用于分离T细胞以产生嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。在一些实施方案中，声泳用于分离淋巴细胞。在一些实施方案中，声泳用于分离造血干细胞。在一些实施方案中，声泳用于分离间充质干细胞。

靶细胞

本文所述的方法允许富集、分离或纯化某些靶细胞和亚群，使得靶细胞可随后与活化剂接触并用包含多核苷酸的病毒载体转导。靶细胞可以是治疗相关的靶细胞。分离的靶细胞然后可以经历一个或多个步骤，包括使靶细胞与核酸或包含核酸的病毒接触。

靶细胞包括一种类型的细胞、细胞群体或细胞组合物，它们是要通过本发明富集、收集、分离或分离的期望细胞。通常，如本文所公开的，靶细胞可以是旨在用于立即或下游治疗用途的任何细胞。本文公开的靶细胞是真核细胞并且通常由免疫细胞组成。免疫细胞包括源自骨髓或淋巴细胞谱系的细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞是白细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞是淋巴细胞。淋巴细胞可以通过细胞表面标记CD45(淋巴细胞共同抗原)的阳性鉴定。在某些实施方案中，淋巴细胞包括自然杀伤细胞、T细胞和/或B细胞。在某些实施方案中，靶细胞是T细胞(例如CD3+)。在某些实施方案中，靶细胞是自然杀伤细胞(例如CD56+或CD16+)。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是中央记忆T细胞(例如CCR7+CD45RA-CD45RO+CD62L+CD27+)。在一些实施方案中，T细胞是CCR7+。在一些实施方案中，T细胞是CD62L+。在一些实施方案中，T细胞是CD45RO+。与同种型对照或已知对特异性标记呈阴性的细胞群体相比，这种阳性可例如通过流式细胞术测定。在一些实施方案中，靶细胞是骨髓细胞。骨髓细胞系包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、树突细胞和巨噬细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞是嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、枯否细胞或肺泡巨噬细胞。

本文所述的治疗性细胞可以是已经分离和富集的内源性细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞来源于对象。在一些实施方案中，治疗性细胞是异源的。另外，治疗性细胞可来源于内源细胞，包括来自成人的多能干细胞、造血干细胞、胎盘或胎儿细胞。治疗性细胞也可以从已建立的细胞系或培养物中获得。在一些实施方案中，治疗性细胞包括来源于细胞系或已建立的培养物的细胞，其中细胞系或已建立的培养物来源于内源细胞，包括来自成人的多能干细胞、造血干细胞、胎盘或胎儿细胞。

在某些实施方案中，靶细胞包括脂肪来源的干细胞。在某些实施方案中，靶细胞包括骨髓来源的干细胞。在某些实施方案中，干细胞。在某些实施方案中，靶细胞群体包括间充质干细胞。

使用治疗活性细胞的现有方法的一个限制是来自可随后进行基因工程化的主要来源(例如，单采血液成分术、个体供体)的合适细胞的低产率。本文所述的方法增加了用于制备和生产治疗性细胞群体的某些T细胞群体的绝对数和百分比。本文产生的细胞群体适于基因工程化并且可以包括高水平的CD3 T细胞。群体可包含CD45+淋巴细胞群体，其大于约50％ CD3+T细胞，大于约55％ CD3+T细胞，大于约60％ CD3+T细胞，大于约65％ CD3+T细胞，大于约70％CD3+T细胞，大于约75％ CD3+T细胞，大于约80％ CD3+T细胞或大于约85％CD3+T细胞。

本文所述的方法可产生超过约1×10⁶、约2×10⁶、约5×10⁶、约1×10⁶、约1×10⁷、约2×10⁷、约5×10⁷、约1×10⁸、约2×10⁸、约5×10⁸、约1×10⁹、约2×10⁹、约1×10¹⁰、约2×10¹⁰或约5×10¹⁰或更多的用于基因工程的富集的靶细胞群体。本文所述的方法可产生超过约1×10⁶、约2×10⁶、约5×10⁶、约1×10⁶、约1×10⁷、约2×10⁷、约5×10⁷、约1×10⁸、约2×10⁸、约5×10⁸、约1×10⁹、约2×10⁹、约1×10¹⁰、约2×10¹⁰或约5×10¹⁰或更多的CD45+淋巴细胞群体。本文所述的方法可产生超过约1×10⁶、约2×10⁶、约5×10⁶、约1×10⁶、约1×10⁷、约2×10⁷、约5×10⁷、约1×10⁸、约2×10⁸、约5×10⁸、约1×10⁹、约2×10⁹、约1×10¹⁰、约2×10¹⁰或约5×10¹⁰或更多的CD3+T淋巴细胞群体。

在一些情况下，本文所述的方法可产生富集细胞群体，当与通过密度梯度离心从样品分离的血沉棕黄层细胞群体相比时，富集细胞群体在细胞群体中包含增加数量的白细胞。在一些情况下，富集细胞群体可以在细胞群体中包含比血沉棕黄层细胞群体中的白细胞数量至少多2倍、多2.5倍、多3倍、多4倍或多5倍的白细胞数量。在一些情况下，富集细胞群体可在细胞群体中包含比血沉棕黄层细胞群体中的白细胞数量至少少2倍、少2.5倍、少3倍、少4倍或少5倍的白细胞数量。

在一些情况下，本文所述的方法产生富集细胞群体，当与通过密度梯度离心从样品分离的血沉棕黄层细胞群体相比时，富集细胞群体包含增加数量的T细胞。在一些情况下，富集细胞群体可包含比血沉棕黄层细胞群体中的T细胞数量至少多2倍、多2.5倍、多3倍、多4倍或多5倍的T细胞数量。在一些情况下，富集细胞群体可包含比血沉棕黄层细胞群体中T细胞数量少2倍、少2.5倍、少3倍、少4倍或少5倍的T细胞数量。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心产生的血沉棕黄层细胞群体相比时，本文所述的方法产生包括红细胞与T细胞的较小比率的富集细胞群体。在一些情况下，细胞群体包括比血沉棕黄层细胞群体中的红细胞与T细胞的比率至少少5倍、少4倍、少3倍、少2.5倍或少2倍的血沉棕黄层细胞群体中的红细胞与T细胞的比率。在一些情况下，富集细胞群体包括比血沉棕黄层细胞群体至少多2倍、多2.5倍、多3倍、多4倍或多5倍的血沉棕黄层细胞群体中的红细胞与T细胞的比率。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心产生的血沉棕黄层细胞群体相比时，本文所述的方法产生包括血小板与T细胞的较小比率的富集细胞群体。在一些情况下，富集细胞群体包括比血沉棕黄层细胞群体中血小板与T细胞的比率至少少5倍、少4倍、少3倍、少2.5倍或少2倍的细胞群体中血小板与T细胞的比率。在一些情况下，富集细胞群体包括比血沉棕黄层细胞群体中血小板与T细胞的比率至少多5倍、多4倍、多3倍、多2.5倍或多2倍的细胞群体中血小板与T细胞的比率。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心产生的血沉棕黄层细胞群体相比时，本文所述的方法产生包含较少百分比的衰老细胞的富集细胞群体。在一些情况下，富集细胞群体包含比血沉棕黄层细胞群体中衰老细胞的百分比至少少10％、少9％、少8％、少7％、少6％、少5％、少4％、少3％、少2.5％或少2％的衰老细胞的百分比。在一些情况下，富集细胞群体包含比细胞群体中衰老细胞的百分比至少多10％、多9％、多8％、多7％、多6％、多5％、多4％、多3％、多2.5％或多2％的衰老细胞的百分比。

在一些情况下，当与通过梯度密度离心产生的血沉棕黄层细胞群体相比时，本文所述的方法产生包含较少百分比的耗竭细胞的富集细胞群体。在一些情况下，富集细胞群体在细胞群体中包含比血沉棕黄层细胞群体中的耗竭细胞的百分比至少少10％、少9％、少8％、少7％、少6％、少5％、少4％、少3％、少2.5％或少2％的耗竭细胞的百分比。在一些情况下，富集细胞群体在细胞群体中包含比血沉棕黄层细胞群体中的耗竭细胞的百分比至少多10％、多9％、多8％、多7％、多6％、多5％、多4％、多3％、多2.5％或多2％的耗竭细胞的百分比。

在一些情况下，当与通过梯度密度离心产生的血沉棕黄层细胞群体相比时，本文所述的方法产生在细胞群体中包含较少百分比的表达CD45Ra的T效应记忆细胞的富集细胞群体。在一些情况下，富集细胞群体在细胞群体中包含比血沉棕黄层细胞群体中表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比至少少10％、少9％、少8％、少7％、少6％、少5％、少4％、少3％、少2.5％或少2％的表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比。在一些情况下，本文所述的方法产生富集细胞群体，其在细胞群体中包含比血沉棕黄层细胞群体中表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比至少多10％、多9％、多8％、多7％、多6％、多5％、多4％、多3％、多2.5％或多2％的表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比。

在一些情况下，当与通过梯度密度离心产生的血沉棕黄层细胞群体相比时，本文的方法产生包含更高百分比的T中央记忆细胞的富集细胞群体。在一些情况下，富集细胞群体包含比血沉棕黄层细胞群体中至少多6％、多7％、多8％、多9％、多10％、多15％、多20％、多30％或多40％的T中央记忆细胞的百分比。在一些情况下，富集细胞群体包含比血沉棕黄层细胞群体中至少少6％、少7％、少8％、少9％或少10％的T中央记忆细胞的百分比。

在一些情况下，与血沉棕黄层细胞群体中为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞的百分比相比，本文所述的方法可在细胞群体中产生更大百分比的为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞。在一些情况下，细胞群体在细胞群体中包含的为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞的百分比比血沉棕黄层细胞群体中为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞的百分比高至少10％、高15％、高20％、高25％、高30％或高40％。

通过本文的方法富集的细胞在基因工程之前可以包括超过60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的高水平的活力。

靶细胞也可以在富集过程中进行缓冲液交换，得到的群体可以重新悬浮在用于细胞培养或下游处理的各种缓冲液和/或培养基中。这样的缓冲液和/或培养基可以是等渗的和/或pH缓冲的，以反映生理重量渗透摩尔浓度或pH。这样的缓冲液和/或培养基可还包含一种或多种能源，诸如葡萄糖或右旋糖，和/或维生素和/或矿物质补充剂。具体的缓冲液或培养基包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、Hank's缓冲盐溶液、林格氏缓冲液(含或不含葡萄糖)、RPMI、DMEM、包含5％、10％、15％或20％动物血清(人或其它动物)的缓冲液或培养基，包含适当血清替代物或被配制为不含血清的缓冲液或培养基(例如X-VIVO 10^TM、X-VIVO15^TM、X-VIVO 20^TM)。

富集后，可将靶细胞在合适的培养基或缓冲液中培养至少1小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更长时间。在某些实施方案中，富集的靶细胞的培养不超过15天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。这种培养可以在37摄氏度下在富含CO₂的环境(例如，1％、2％、5％、10％或更多的CO₂)下进行。在某些实施方案中，通过本文的方法富集的细胞在无菌和/或GMP设备中富集。

本文所述的方法可包括在基因工程化之前活化细胞的额外步骤。例如，可以诱导原代细胞进入细胞周期以使基因整合到靶细胞的基因组中。方法可包括富集后的额外活化步骤。在某些实施方案中，活化步骤包括使富集的靶细胞与IL-15和/或IL-7接触。在某些实施方案中，活化步骤包括使富集的靶细胞与活化剂接触。在某些实施方案中，活化剂包括抗-CD3抗体和/或CD28抗体。在某些实施方案中，活化剂包括缀合至固体支持物的抗-CD3抗体和/或抗-CD28抗体。在某些实施方案中，固体支持物是磁珠。在某些实施方案中，使大细胞群体与缀合至固体支持物的抗-CD3抗体或抗-CD28抗体接触还包括亲和富集表达CD3或CD28的白细胞。在某些实施方案中，活化步骤包括使富集的靶细胞与IL-2、IL-15、IL-7、抗-CD3抗体和/或CD28抗体接触。IL-15和IL-17是支持T细胞活化和扩增的细胞因子。IL-15可以以约或至少约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、75ng/mL或100ng/mL或更多施用。IL-15可以以约1ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约25ng/mL至约100ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约75ng/mL、约5ng/mL至约75ng/mL、约10ng/mL至约75ng/mL、约25ng/mL至约75ng/mL、或约40ng/mL至约60ng/mL施用。IL-7可以以约或至少约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、75ng/mL或100ng/mL或更多施用。IL-15可以以约1ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约25ng/mL至约100ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约75ng/mL、约5ng/mL至约75ng/mL、约10ng/mL至约75ng/mL、约25ng/mL至约75ng/mL、或约40ng/mL至约60ng/mL施用。在某些实施方案中，活化剂包括抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、抗-CD137抗体、抗-CD2抗体、抗-CD35抗体、白介素-2、白介素-7或白介素-15、白介素-21、白介素-6、TGFβ、CD40配体、PMA/离子霉素、伴刀豆球蛋白A、美洲商陆有丝分裂原或植物凝集素中的一种或多种，这样的活化剂可根据本文所述的方法适当地用于活化NK细胞、B细胞或T细胞。

富集的靶细胞可以在基因工程之前与活化剂接触至少1、2、3、4、5、6、7天或更多天。

基因工程

通过本文所述的方法产生的细胞群体适于基因工程。这种基因工程产生包含外源核酸的富集的靶细胞。在某些实施方案中，核酸包含与目的基因的编码区有效偶联的启动子，其允许在合适的情况下转录和翻译目的基因。启动子可以是诱导型启动子、组织特异性启动子或通用启动子。目的基因还可以与其它调控元件偶联，例如聚腺苷酸化信号或一种或多种增强子。目的基因可以编码免疫球蛋白、嵌合抗原受体、T细胞受体、细胞因子或趋化因子中的任何一种或多种。在某些实施方案中，目的基因编码免疫球蛋白。在某些实施方案中，目的基因编码嵌合抗原受体。在某些实施方案中，目的基因编码T细胞受体。在某些实施方案中，目的基因编码细胞因子或趋化因子。在某些实施方案中，目的基因是包含靶链和引导链的CRISPR构建体。

所公开的组合物、方法和系统提供了促进嵌合抗原受体(CAR)T细胞产生的收集的靶细胞产物(例如细胞群体)。嵌合抗原受体(CAR)T细胞免疫疗法是过继性细胞疗法的高度有效形式，如支持FDA批准的患有B细胞急性成淋巴细胞性白血病或大B细胞淋巴瘤的患者中的缓解率所证明。

制备和使用CAR T细胞的方法是本领域已知的。程序已描述于例如以下中：US 9,629,877；US 9,328,156；US 8,906,682；US 2017/0224789；US 2017/0166866；US 2017/0137515；US 2016/0361360；US 2016/0081314；US 2015/0299317；和US 2015/0024482；其各自通过引用整体并入本文。

使用本文讨论的方法制备的CAR T细胞可用于使用临床医学领域中充分确立的程序治疗患者的白血病，例如急性成淋巴细胞性白血病，并且在这些情况下，CAR可将CD19或CD20识别为肿瘤抗原。该方法也可用于实体瘤，在这种情况下，识别的抗原可包括CD22；RORI；间皮素；CD33/IL3Ra；c-Met；PSMA；Her2/Neu；CD38、糖脂F77；EGFRvIII；GD-2；NY-ESO-l；MAGE A3；及其组合。关于自身免疫疾病，CAR T细胞可用于治疗类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、强直性脊柱炎、1型糖尿病或血管炎。

在某些实施方案中，本文所述的方法可用于产生表达用于治疗血液癌症或实体瘤的异源基因的淋巴细胞。在一些实施方案中，癌症是膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌。

在某些实施方案中，本文所述的方法可用于产生包括嵌合抗原受体的T细胞。在某些实施方案中，本文所述的方法可用于产生阿基仑赛。在某些实施方案中，本文所述的方法可用于产生brexucabtagene autoleucel。在某些实施方案中，本文所述的方法可用于生产替沙仑赛。在某些实施方案中，本文所述的方法可用于产生利基迈仑赛或艾基维仑赛。

本文所述的方法适用于使用活化剂如包含目的基因的病毒对富集的靶细胞群体进行基因工程化。富集的靶细胞群体可以与包含目的基因的病毒接触。在某些实施方案中，病毒是慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。在某些实施方案中，病毒是慢病毒。在某些实施方案中，病毒是腺病毒。在某些实施方案中，病毒是腺相关病毒。

本文产生的靶细胞产生具有被病毒载体以高水平效率转导的能力的细胞群体。通过本文所述的方法产生的靶细胞的转导效率在转导后三天可以为至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。通过本文所述的方法产生的靶细胞的转导效率在转导后六天可以为至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。

对于病毒基因工程，细胞群体可以以预定的感染复数(MOI)与病毒接触。在一些实施方案中，MOI为约5至约200。在一些实施方案中，MOI为约5至约10、约5至约20、约5至约25、约5至约30、约5至约40、约5至约50、约5至约75、约5至约100、约5至约200、约10至约20、约10至约25、约10至约30、约10至约40、约10至约50、约10至约75、约10至约100、约10至约200、约20至约25、约20至约30、约20至约40、约20至约50、约20至约75、约20至约100、约20至约200、约25至约30、约25至约40、约25至约50、约25至约75、约25至约100、约25至约200、约30至约40、约30至约50、约30至约75、约30至约100、约30至约200、约40至约50、约40至约75、约40至约100、约40至约200、约50至约75、约50至约100、约50至约200、约75至约100、约75至约200或约100至约200。在一些实施方案中，MOI为约5、约10、约20、约25、约30、约40、约50、约75、约100或约200。在一些实施方案中，MOI为至少约5、约10、约20、约25、约30、约40、约50、约75或约100。在一些实施方案中，MOI为至多约10、约20、约25、约30、约40、约50、约75、约100或约200。

在一些实施方案中，包含外源非病毒核酸的慢病毒的MOI为约5至约200。在一些实施方案中，包含外源非病毒核酸的慢病毒的MOI为约5至约10、约5至约20、约5至约25、约5至约30、约5至约40、约5至约50、约5至约75、约5至约100、约5至约200、约10至约20、约10至约25、约10至约30、约10至约40、约10至约50、约10至约75、约10至约100、约10至约200、约20至约25、约20至约30、约20至约40、约20至约50、约20至约75、约20至约100、约20至约200、约25至约30、约25至约40、约25至约50、约25至约75、约25至约100、约25至约200、约30至约40、约30至约50、约30至约75、约30至约100、约30至约200、约40至约50、约40至约75、约40至约100、约40至约200、约50至约75、约50至约100、约50至约200、约75至约100、约75至约200或约100至约200。在一些实施方案中，包含外源非病毒核酸的慢病毒的MOI为约5、约10、约20、约25、约30、约40、约50、约75、约100或约200。在一些实施方案中，包含外源非病毒核酸的慢病毒的MOI为至少约5、约10、约20、约25、约30、约40、约50、约75或约100。在一些实施方案中，包含外源非病毒核酸的慢病毒的MOI为至多约10、约20、约25、约30、约40、约50、约75、约100或约200。

在某些实施方案中，病毒载体(例如腺病毒、慢病毒、AAV)包含异源核酸。异源核酸可以包含编码目的多肽的序列。目的多肽可以是嵌合抗原受体、T细胞受体、包括免疫球蛋白结构域的多肽、细胞因子、趋化因子或任何其它多肽如受体。在其它实施方案中，异源核酸包含siRNA或miRNA的序列。

本文所述的细胞也适于通过其它方法如电穿孔进行基因工程化。细胞还可适于通过压缩进行基因工程化，例如通过WO 2020/117856A1中描述的方法和装置。

本文所述方法的一个优点是在较早的时间点提供转基因细胞，允许更有效地产生用于研究或治疗用途的基因工程化细胞。在某些实施方案中，可以在工程化后1、2、3、4、5或更多天收获富集的靶细胞用于治疗或研究目的。在某些实施方案中，可以在工程化后约5天至工程化后约17天收获富集的靶细胞用于治疗或研究。在某些实施方案中,在工程化后约5天至工程化后约7天、工程化后约5天至工程化后约8天、工程化后约5天至工程化后约9天、工程化后约5天至工程化后约10天、工程化后约5天至工程化后约11天、工程化后约5天至工程化后约12天、工程化后约5天至工程化后约13天、工程化后约5天至工程化后约14天、工程化后约5天至工程化后约15天、工程化后约5天至工程化后约16天、工程化后约5天至工程化后约17天、工程化后约7天至工程化后约8天、工程化后约7天至工程化后约9天、工程化后约7天至工程化后约10天、工程化后约7天至工程化后约11天、工程化后约7天至工程化后约12天、工程化后约7天至工程化后约13天、工程化后约7天至工程化后约14天、工程化后约7天至工程化后约15天、工程化后约7天至工程化后约16天、工程化后约7天至工程化后约17天、工程化后约8天至工程化后约9天、工程化后约8天至工程化后约10天、工程化后约8天至工程化后约11天、工程化后约8天至工程化后约12天、工程化后约8天至工程化后约13天、工程化后约8天至工程化后约14天、工程化后约8天至工程化后约15天、工程化后约8天至工程化后约16天、工程化后约8天至工程化后约17天、工程化后约9天至工程化后约10天、工程化后约9天至工程化后约11天、工程化后约9天至工程化后约12天、工程化后约9天至工程化后约13天、工程化后约9天至工程化后约14天、工程化后约9天至工程化后约15天、工程化后约9天至工程化后约16天、工程化后约9天至工程化后约17天、工程化后约10天至工程化后约11天、工程化后约10天至工程化后约12天、工程化后约10天至工程化后约13天、工程化后约10天至工程化后约14天、工程化后约10天至工程化后约15天、工程化后约10天至工程化后约16天、工程化后约10天至工程化后约17天、工程化后约11天至工程化后约12天、工程化后约11天至工程化后约13天、工程化后约11天至工程化后约14天、工程化后约11天至工程化后约15天、工程化后约11天至工程化后约16天、工程化后约11天至工程化后约17天、工程化后约12天至工程化后约13天、工程化后约12天至工程化后约14天、工程化后约12天至工程化后约15天、工程化后约12天至工程化后约16天、工程化后约12天至工程化后约17天、工程化后约13天至工程化后约14天、工程化后约13天至工程化后约15天、工程化后约13天至工程化后约16天、工程化后约13天至工程化后约17天、工程化后约14天至工程化后约15天、工程化后约14天至工程化后约16天、工程化后约14天至工程化后约17天、工程化后约15天至工程化后约16天、工程化后约15天至工程化后约17或工程化后约16天至工程化后约17天收获富集的靶细胞。在某些实施方案中，可以在工程改造后约5天、工程改造后约7天、工程改造后约8天、工程改造后约9天、工程改造后约10天、工程改造后约11天、工程改造后约12天、工程改造后约13天、工程改造后约14天、工程改造后约15天、工程改造后约16天或工程改造后约17天收获富集的靶细胞。在某些实施方案中，可以在工程改造后至少约5天、工程改造后约7天、工程改造后约8天、工程改造后约9天、工程改造后约10天、工程改造后约11天、工程改造后约12天、工程改造后约13天、工程改造后约14天、工程改造后约15天或工程改造后约16天收获富集的靶细胞。在某些实施方案中，可以在工程改造后至多约7天、工程改造后约8天、工程改造后约9天、工程改造后约10天、工程改造后约11天、工程改造后约12天、工程改造后约13天、工程改造后约14天、工程改造后约15天、工程改造后约16天或工程改造后约17天收获富集的靶细胞。收获后细胞可进行额外的富集步骤，包括洗涤、浓缩、缓冲液交换或运输以适当促进施用。

本文产生的细胞包括许多有益特性，这些特性对于用治疗性载体转染，产生治疗剂量和转染或扩增后下游避免某些不期望的细胞表型是期望的。这些有益特性在图20中示出。

在一些情况下，本文所述的方法产生在培养物中表现出增加的扩增能力的细胞群体，其中当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，细胞在基因修饰之前或之后扩增。在一些情况下，细胞群体表现出在培养物中扩增的能力增加至少约1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍，其中当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，细胞在基因修饰之前或之后扩增。在一些情况下，与通过梯度密度离心产生的血沉棕黄层细胞群体相比，该细胞群体能够在至少少5％、少10％、少15％、少20％、少25％或少30％的时间内扩增到包括至少2×10e9个包含异源DNA的T细胞。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出容易地整合慢病毒载体(即慢病毒的核酸的至少一些部分插入细胞基因组或外泌体中)的能力增加的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现出容易地整合慢病毒载体的能力增加至少约5％、10％、15％、25％、30％、50％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些实例中，已显示本文所述的方法产生具有30％增加的容易地整合慢病毒的能力的细胞群体。参见图8。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出在细胞培养中保留T细胞记忆组成的能力增加的细胞群体。在一些情况下，与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比，该细胞群体保留其相对T细胞记忆组成长至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。例如，已经证明，DLD方法产生的细胞群体比包括Ficoll在内的其他方法保持其相对记忆T细胞群体的时间更长。参见图14。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出对病毒转导的接受度增加的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现对病毒转导接受度增加至少约5％、10％、15％、25％、30％、50％、100％、200％、300％、400％或500％。例如，已经显示DLD方法产生的细胞群体比使用Ficoll或其它方法产生的细胞对病毒转导的接受度高约20-40％。参见图10。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出平均绝对端粒长度增加的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现出平均绝对端粒长度增加至少约5％、10％、15％、25％、30％、50％、100％、200％、300％、400％或500％。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生在细胞培养中表现出保持较少分化的初始和中央记忆细胞的相对群体的能力的增加的细胞群体。在某些情况下，与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比，该细胞群体在细胞培养中保持其较少分化的初始和中央记忆细胞的相对群体长至少多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出功能杀伤能力增加的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现出功能杀伤能力增加至少约5％、10％、15％、25％、30％、50％、100％、200％、300％、400％或500％。例如，已经显示，当以2个细胞/靶细胞进行接种用于杀伤时，DLD方法产生的细胞与使用Ficoll方法产生的细胞相比具有至少大30％的杀伤能力。参见图16。

流式细胞术可用于确定群体中表达多肽的靶细胞的百分比。在一些情况下，本文所述的方法产生T细胞群体，其中如通过流式细胞术所测定，至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的T细胞表达多核苷酸/多肽。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出IFNγ表达增加的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现IFNγ表达增加至少约1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现出IFNγ表达增加至少约1％、5％、10％、15％、20％或50％。在一些情况下，IFNγ表达的增加在通过本文所述的方法和系统产生后0、3、6、9、13或16天明显。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出GM-CSF表达增加的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现GM-CSF表达增加至少约1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些情况下，GM-CSF表达的增加在通过本文所述的方法和系统产生后0、3、6、9、13或16天明显。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出TNFa表达增加的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，细胞群体表现出TNFa表达增加至少约5％、10％、15％、25％、30％、50％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些情况下，TNFa表达的增加在通过本文所述的方法和系统产生后0、3、6、9、13或16天明显。

在一些情况下，本文所述的方法产生细胞群体，其中细胞群体的大部分细胞是活的。在一些情况下，细胞群体包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的活细胞。在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出存活率增加的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现出存活率增加至少约5％、10％、15％、25％、30％、50％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些情况下，本文的方法产生由至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的活的经基因修饰的白细胞组成的经基因修饰的白细胞群体。

在一些情况下，本文所述的方法产生包含至少1×10e9个T细胞、2×10e9个T细胞、3×10e9个T细胞、5×10e9个T细胞、7×10e9个T细胞或9×10e9个T细胞的基因工程化白细胞的组合物。在一些情况下，本文所述的方法产生基因工程化的白细胞组合物，其中在培养9天后，组合物中至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的T细胞是T中央记忆细胞或T效应T细胞。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出容易地整合慢病毒载体的能力增加的细胞群体。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出在培养物中扩增以产生单一治疗剂量当量的细胞所需的时间减少的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体在培养物中扩增以产生单一治疗剂量当量的细胞所需的时间少约1、2、3、4、5、6、7或8天。在一些情况下，当用包含异源DNA的病毒载体转导该细胞群体和血沉棕黄层细胞群体时，与通过密度梯度离心法产生的血沉棕黄层细胞群体相比，该细胞群体在培养物中扩增至包含至少2×10e9个包含异源DNA的T细胞所需的时间约少5％、少10％、少15％、少20％、少25％或少30％。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出表达由载体递送的基因所需的时间减少的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表达由载体递送的基因所需的时间少约1、2、3、4、5、6、7或8天。例如，已经显示DLD方法比Ficoll或其它方法更快地产生表达由载体递送的基因的细胞群体。参见图9。

治疗剂量当量可根据治疗剂的确切类型而变化，但在一些情况下可为至少约1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹或5×10⁹个总细胞。治疗剂量可为约1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹或5×10⁹个转染的细胞。

治疗剂量当量可根据治疗剂的确切类型而变化，但在一些情况下可为至少约1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹或5×10⁹个总细胞。治疗剂量可为约1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹或5×10⁹个转染的细胞。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出效应或Temra细胞的相对群体减少的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现出效应或Temra细胞的相对群体减少至少约5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、75％或90％。例如，已经显示，在用高整合性慢病毒处理后，DLD方法产生的细胞群体的Temra细胞比使用Ficoll或其它方法产生的细胞少约40％。参见图12。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出IL-1Ra表达降低的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现出IL-1Ra表达降低至少约5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、60％、75％或90％。在一些情况下，IL-1Ra表达的降低在通过本文所述的方法和系统产生后0、3、6、9、13或16天明显。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出IL-6表达降低的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，改细胞群体表现出IL-6表达降低至少约5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、60％、75％或90％。在一些情况下，IL-6表达的降低在通过本文所述的方法和系统产生后0、3、6、9、13或16天明显。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出IL-13表达降低的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，表现出细胞群体表现出IL-13表达降低至少约5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、60％、75％或90％。在一些情况下，IL-13表达的降低在通过本文所述的方法和系统产生后0、3、6、9、13或16天明显。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出MCP-1表达降低的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，表现出细胞群体表现出MCP-1表达降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％或90％。在一些情况下，MCP-1表达的降低在通过本文所述的方法和系统产生后0、3、6、9、13或16天明显。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出PD1和Tim3表达降低的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，表现出细胞群体表现出PD1和Tim3表达降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％或90％。在一些情况下，PD1和Tim3表达的降低在通过本文所述的方法和系统产生后0、3、6、9、13或16天明显。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出细胞衰老或耗竭减少的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现出细胞衰老或耗竭减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％或90％。例如，已经显示，与从Ficoll产生的细胞相比，DLD方法产生的细胞显示低约50％的PD1和Tim3共表达，表明它们比使用Ficoll产生的细胞具有更低的衰老和耗竭。参见图15。

在一些情况下，与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出引发细胞因子释放综合征的倾向降低的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，该细胞群体表现出触发细胞因子释放综合征的细胞倾向降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％或90％。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出在递送至患者之前所需的培养时间减少的细胞群体。在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，该细胞群体在递送至患者之前需要少约1、2、3、4、5、6、7或8天的培养。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心方法产生的细胞群体相比时，表现的一种或多种生物学特性的增加或降低在通过本文所述的方法和系统产生后0、3、6、9、13或16天明显。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出在培养物中扩增以产生单一治疗剂量当量的细胞所需的时间减少的细胞群体。

在一些情况下，当与通过密度梯度离心法产生的细胞群体相比时，本文所述的方法产生表现出在培养物中扩增以产生单一治疗剂量当量的细胞所需的时间减少的细胞群体。

在一些情况下，本文所述的方法还包括冷冻和解冻基因工程化的白细胞群体。在一些情况下，本文所述的方法还包括向患有肿瘤或癌症的个体施用基因工程化的白细胞群体。

实施例

以下说明性实施例是本文所述的组合物和方法的实施方案的代表，并不意味着以任何方式进行限制。

实施例1——确定性侧向位移产生具有更高的病毒摄取和表达潜力的细胞群体

方法

在前一天收集Leukopack(白细胞去除术产物)并在室温或4℃下摇动储存。当在4℃下储存时，在处理之前使样品达到室温。

在第0天，将单采血液成分术与Benzonase(Millipore-Sigma货号E1014)以50U/ml或100U/ml孵育并保持摇动1h直至使用。取出等分试样以测量7-AAD的活力和总细胞计数。用Ficoll(GE货号17-440-02)对单采血液成分术的级分进行基于密度的离心，而剩余的Leukopack用DLD处理并收集到含有4％ BSA的Plasmalyte-A缓冲液中。Ficoll是中性、高度支化、高质量的亲水性多糖，密度为约1.078g/ml。

使用具有六边形障碍物的障碍物匣阵列进行DLD分离，障碍物被配置成使得每个障碍物的P1为约40μm并且P2为约20μm。G1为22μm，G2为17μm。障碍物布置成使得每个六边形的面垂直于主体流体流的轴线。使用蠕动泵使样品流过装置。

在DLD和Ficoll处理结束时，取样以使用以下抗体混合物CD3-BV421、CD4-PERCP、CD45-FITC和CD8-PE确定CD45+(PBMC)级分中的CD3+(T细胞)的％。

来自DLD产物和Ficoll产物的10×10^6/ml的T细胞通过与缀合至磁珠(Dynabeads，Thermo-Fisher货号11131D)的CD3/CD28抗体以3:1珠/细胞的比率在37℃下孵育1h来活化。此后，使用磁体将磁珠:细胞与非T细胞分离，并在6孔G-Rex板(Wilson-Wolf货号P/N80240M)中以1×10^6/ml在补充有10％ FBS和Pen/Strep以及50ng/ml的IL-7和IL-15(Biolegend货号581908，570308)的TexMACS(Miltenyi货号130-097-196)培养基中铺板。

在第1天，用MOI为5的GFP-慢病毒在1:500X的TransPlus病毒转导增强剂(ALSTEM货号V050)存在下转导铺板的细胞，并将细胞再培养6或7天。

在第3天，取出培养细胞的等分试样并通过移液去珠，然后使用Cell DYN库尔特计数器(Abbott)计数。使用以下混合物CD11b-BV570、CD69-BV510、CD3-BV421、CD4-BV650、CD45RA-BV605、CD62L-PECY7、CCR7-PE、DRAQ7、CD8-APCCY7通过流动检查细胞，或通过用CD45-A647抗体复染的免疫荧光显微镜检查细胞，其全部来自Biolegend。剩余的细胞根据需要用完全培养基供给。在第6天或第7天重复该过程以确定GFP-慢病毒阳性的T细胞的％。

结果

通过DLD富集leukopack导致总外周血单核细胞的更大回收率，如图1A所示，以及回收的总CD45+细胞的CD3+％增加(约20％)，如图1B所示。病毒转导后，与Ficoll相比，DLD富集的靶细胞在第3天和第6天显示更高水平的转染，如图1C所示。图2显示了对于通过DLD或密度梯度离心富集的细胞，病毒转导后第3天GFP阳性细胞的荧光显微术。因为与Ficoll相比，DLD增加了总PBMC的产量、来自PBMC的CD3+细胞的百分比和转导效率，所以DLD导致在转染后3天和6天转染的T细胞的数量更多，如图3所示。该差异在第6天的转染细胞中为增加10倍。

实施例2——与密度梯度分离相比，在DLD分离后第0天回收更多数量的CD45+细胞CD3+细胞

研究了DLD系统与密度梯度离心分离(例如，GE Healthcare)相比在白细胞和T细胞总数方面的性能。与Ficoll相比，使用DLD系统富集的leukopak显示出增加的总活(DARQ7-)CD45+细胞(泛白细胞标记)的量，如通过流式细胞术测定的。如图13所示，当标准化为1200mL输入时，将从白细胞中分离平均5×10⁹个CD45+细胞，相比之下使用Ficoll分离的细胞为2×10⁹个，增加了2.5倍。如图15所示，当处理较低WBC计数的患者样品时，与Ficoll相比，使用DLD系统获得的存活的总CD45+和CD3+细胞(泛T细胞标记)也增加。该优点对于从NHL、淋巴瘤、AML、乳腺癌、结直肠癌或其它癌症患者获得淋巴细胞至关重要。同样地，DLD的增加的淋巴细胞和T细胞回收成果可以用WBC与期望从输入样品中耗竭的细胞的比率来表示，作为减积效率的量度。如图16所示，DLD产物导致RBC/WBC和PLT/WBC两者的较低比率。使用CD41作为血小板标记，CD235a作为红细胞标记，CD45作为白细胞标记，通过流式细胞术进行确定。DLD方案导致具有显著较少RBC(红细胞)和PLT(血小板)的白细胞群体。

实施例3——与密度梯度分离相比，在分离后第0天回收更多数量的有益T细胞亚型和更少数量的不需要的或有害的T细胞亚型

T细胞疗法的功效和安全性取决于用于制造疗法的T细胞亚型。因此，将使用DLD系统分离的T细胞亚型与Ficoll纯化进行比较，后者是从血液和白细胞去除术样品中分离T细胞的常用方法。与Ficoll相比，使用DLD系统富集的leukopak显示出较高百分比的T中央记忆细胞组成和较少完全分化的T效应细胞。如图5所示，使用DLD和Ficoll方法分离CD4+和CD8+T细胞群体。平均而言，DLD方法分离的群体包含30％ T初始细胞(CD3+/CD45RA+/CCR7+)、25％ T中央记忆细胞(CD3+/CD45RA-/CCR7+)、29％ T效应记忆细胞(CD3+/CD45RA+/CCR7-)和17％ T emra细胞(效应记忆分化的)(CD3+/CD45+/CCR7-)。平均而言，Ficoll分离的群体包含32％ T初始细胞(CD3+/CD45RA+/CCR7+)、19％ T中央记忆细胞(CD3+/CD45RA-/CCR7+)、28％ T效应记忆细胞(CD3+/CD45RA+/CCR7-)和21％ T emra细胞(效应记忆分化的)(CD3+/CD45+/CCR7-)。

实施例4——与密度梯度分离相比，通过DLD分离的T细胞群体更能接受慢病毒转导，更有效地被慢病毒转导，更快地表达慢病毒递送的基因，并保留更有益的T细胞亚型。

T细胞疗法的及时施用、功效和安全性取决于分离的T细胞如何适合于基因工程化和随后的扩增，以及它们可以如何快速和有效地表达异源遗传物质。因此，将使用DLD系统分离的T细胞对慢病毒转导的T细胞应答与从Ficoll纯化获得的那些进行比较。处理来自三个不同供体的leukopack，用CD3/CD28珠分离/活化T细胞，并用GFP-慢病毒转导。然后在具有IL-7/IL-15在细胞培养中扩增细胞9天。如图8所示，在相应的天数通过流式细胞术分析细胞，以监测GFP-慢病毒的摄取和整合，并在第0、3、6、9和12天与未转导的细胞比较，显示DLD制备的细胞群体更容易整合慢病毒，包括在第6天，其显示与Ficoll制备的细胞相比，整合的细胞数量增加30％。图10显示了在DLD和Ficoll制备的细胞群体中转导细胞的平均％，表明DLD群体更适合慢病毒转导，在某些情况下，提高20-100％。

使用9天时间过程的免疫荧光显微镜证实了这些发现。将来自相同供体的DLD和Ficoll程序的T细胞分离/活化并用GFP-慢病毒转导并在细胞培养中扩增。在所示的时间，通过显微镜检查细胞以监测GFP-慢病毒的摄取和GFP的表达，显示DLD细胞比Ficoll细胞更容易转导，如图9中的DLD来源的细胞群体中更大的GFP信号所示。因此，与其它系统方法相比，通过DLD系统制备的细胞能够更容易地转导。(见图17-19)。DLD产生的细胞始终更易于转导，相对于Ficoll，约87.5％显示出显著的改善。在第3天的平均改善为约2倍，在第6、9天保持30％的优势。在所有时间，DLD系统产生的细胞平均具有较高的转导水平。

这些发现在将这些分离过程转化为临床应用中尤其显著。更高的慢病毒转导效率导致了达到给药(即获得用于一个剂量或多个剂量的治疗性细胞的足够数量的细胞)的时间缩短。如图11所示，DLD方法可产生足够的慢病毒转导细胞，在培养3天后相当于10个剂量的治疗性细胞，标准化为最初输入200mL的leukopack材料时，在9天期间比Ficoll产生更多的总剂量。在一些情况下，DLD制备的细胞群体在9天内产生两倍的转导细胞。

除了分离和慢病毒转导后产生的总细胞数之外，关键的是治疗性细胞剂量包括有效活化的T细胞类型，例如T中央记忆细胞和T效应记忆细胞。在DLD和Ficoll制备的细胞群体之间比较活化后第3天和第6天的GFP-Lv+细胞的T细胞亚群组成。如图12所示，通过流式细胞术在GFP-Lv+T细胞中确定T细胞亚型。在第6天，DLD方法产生包括4％ T初始(CD3+/CD45RA+/CCR7+)、19％ T中央记忆(CD3+/CD45RA-/CCR7+)、74％ T效应记忆(CD3+/CD45RA+/CCR7-)和3％ T emra(CD3+/CD45+/CCR7-)的T细胞群体。在第6天，Ficoll方法产生包括28％ T初始(CD3+/CD45RA+/CCR7+)、16％ T中央记忆(CD3+/CD45RA-/CCR7+)、51％ T效应记忆(CD3+/CD45RA+/CCR7-)和5％ T emra(CD3+/CD45+/CCR7-)的T细胞群体。因此，与Ficoll GFP＝Lv+T细胞相比，DLD细胞具有更大的T cm库，导致更稳健的转化为T em细胞。

这些发现通过比较慢病毒转导前(图13)和转导后3、6和9天培养物中来自DLD和Ficoll制备的组合物(来自健康供体)的细胞群体T细胞组成的额外实验得到证实(图14)。第0天(转导前)DLD细胞显示比Ficoll细胞更多的CD4+细胞和较少分化的T cm细胞，如通过流式细胞术测定的。图14显示了GFP-Lv对T细胞亚型的进展。与来自Ficoll方案的细胞相比，来自DLD方案的存活CD3+细胞随时间显示出朝向Tcm的偏向。通过流式细胞术测定GFP-Lv+和T细胞亚群。例如，在第9天，DLD方法产生包括5％ T初始(CD3+/CD45RA+/CCR7+)、29％T中央记忆(CD3+/CD45RA-/CCR7+)、59％ T效应记忆(CD3+/CD45RA+/CCR7-)和7％ T emra(CD3+/CD45+/CCR7-)的T细胞群体。在第9天，Ficoll方法产生包括9％ T初始(CD3+/CD45RA+/CCR7+)、20％ T中央记忆(CD3+/CD45RA-/CCR7+)、59％ T效应记忆(CD3+/CD45RA+/CCR7-)和12％ T emra(CD3+/CD45+/CCR7-)的T细胞群体。

实施例5——与用Ficoll方法制备的T细胞群体相比，通过DLD分离的T细胞群体在活化、慢病毒转导和扩增后具有较低的细胞衰老和耗竭标记物表达。

治疗性细胞的效力和制备部分依赖于具有活的和扩增的细胞的群体，即不是衰老的或耗竭的T细胞。在第13天检测活化的、转导的和扩增的T细胞的衰老(CD57+/KLRG1+)和耗竭(CD57/KLRG1+/PD1+/Tim3+)，并表示为Ficoll/DLD的比率。如图15所示，用完整CAR19信号转导结构域转导的Ficoll细胞具有比DLD细胞更显著的表达衰老和耗竭标记(CD57+/KLRG1+和CD57-/KLRG1+与PD1和Tim3共表达)，而在用NO CAR或无活性CAR(CAR19-Sig结构域)的对照转导的细胞中存在非常小的差异。

实施例5——通过DLD分离的T细胞群体与使用Ficoll方法制备的那些相比具有相当的或增加的杀伤能力。

治疗性T细胞制剂的效力依赖于有效杀伤包含靶向肽序列的细胞的那些细胞。分离来自DLD或Ficoll的T细胞，活化并用特异于MART-1抗原的TCRT慢病毒转导。在第6天，收集细胞并在不同比率下与携带MART-1肽的T2靶细胞(Luc+)共培养。孵育后，通过共培养物中化学发光的损失检测T2细胞死亡率。DLD和Ficoll细胞都能够以剂量依赖的方式杀伤其靶细胞。如图16所示，使用DLD方法制备的细胞在2:1、1:1和0.5:1的T细胞与靶细胞比率下比使用Ficoll制备的细胞表现出更高的杀伤能力，在一些情况下杀伤增加30％。

实施例6——与通过Ficoll分离的T细胞群体相比，通过DLD分离的T细胞群体具有更高的期望细胞因子表达和更低的不期望细胞因子表达。

治疗性T细胞制剂的安全性部分依赖于分离出能产生更多细胞杀伤活性而非炎症反应的细胞，以避免对患者产生不利影响。因此，希望使用各种分离方法制备的T细胞群体表达更多的细胞杀伤性细胞因子并具有低的炎症应答细胞因子表达。因此，在使用DLD和Ficoll方法分离的T细胞群体之间比较细胞因子表达。

在T细胞分离/活化、扩增(IL7/IL-15)和慢病毒转导(CAR-T-CD19或TCRT-MART-1)后第0、6和13天收集DLD和Ficoll细胞的上清液。通过Luminex多重测定分析所有上清液的15种不同细胞因子。结果表示为Ficoll/DLD的比率(pg/ml)，如图17所示。图18说明了CAR-T-CD19转导细胞中IFNg、GM-CSF、IL-1Ra和IL-6的时间过程细胞因子表达。图19说明了TCRT-MART-1转导细胞中IFNg、GM-CSF、IL-1Ra和IL-6的时间过程细胞因子表达。Ficoll细胞分泌更多的参与炎症反应的IL-6、MCP-1和IL-1Ra，而DLD细胞表达更多的IFNg和GM-CSF，这是细胞杀伤活性的典型标记。因此，DLD制备的T细胞群体表现出更有利的细胞因子表达谱。

实施例7——通过本文所述的方法分离的T细胞群体具有更长的端粒

如图21A所示，与Ficoll相比，通过本文所述方法分离的细胞具有更长的端粒长度，表明更大的扩增能力。使用qPCR分析进行绝对端粒长度(aTL)的测定。

亚序列分析证实DLD细胞具有比Ficoll细胞更长的aTL。图21B当从DLD富集的群体而不是Ficol富集的群体纯化时，T细胞也具有更长的aTL。图21C。

实施例8——通过DLD分离产生的细胞群体的T储存和回收。

对通过DLD分离的细胞进行计数并以400xg离心5min。将细胞再悬浮于冷CS-10中并稀释至150×10⁶细胞/mL的最终浓度。将冷冻管用1mL悬浮液填充并逐渐冷却至-80℃。然后将冷冻管储存在液氮的气相中。或者，可以将50×10⁶/ml的细胞冷冻在90％ FBS+10％DMSO中。

将冷冻细胞运送到远程实验室并在培养基中解冻。对T细胞进行选择并使用CD3/CD28两用珠激活。或者，可用非T细胞受体靶标(即CD4、CD8)选择T细胞，随后用CD3/CD28活化。激活的T细胞使用聚凝胺转导增强剂与重组病毒进行转导，以实现CAR的表达。然后将CAR T细胞冷冻，运回主实验室，并通过流式细胞术分析，这证实了两次冷冻的细胞是功能性杀伤细胞，如图24所示。

实施例9——使用DLD分离产生的CAR-T治疗剂。

通过DLD分离新鲜样品。将所得细胞冷冻并运送到将生产治疗剂的地点。在该地点，将细胞解冻并在培养基中复苏。活化并选择细胞以加入病毒以及任选的转导增强剂。整合病毒并再次冷冻细胞。然后将细胞转运到治疗地点，在那里将它们解冻，并在使用前确认CAR的表达。

虽然在此已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，这些实施方案仅作为实例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其它文献通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其它文献被具体地和单独地指明通过引用以其整体并入。包括在通过引用并入的文本中的定义在它们与本公开中的定义相矛盾时被排除。

Claims (110)

1.一种从来自对象的样品分离的细胞群体，其包括包含异源DNA的细胞，其中与通过密度梯度离心从所述样品分离的血沉棕黄层细胞群体相比：

a)所述细胞群体中白细胞的数目比所述血沉棕黄层细胞群体中白细胞的数目多至少2倍；

b)所述细胞群体中T细胞的数目比所述血沉棕黄层细胞群体中T细胞的数目多至少2倍；

c)所述细胞群体中红细胞与T细胞的比率比所述血沉棕黄层细胞群体中红细胞与T细胞的比率小至少5倍；

d)所述细胞群体中血小板与T细胞的比率比所述血沉棕黄层细胞群体中血小板与T细胞的比率小至少5倍；

e)所述细胞群体中衰老细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中衰老细胞的百分比低至少10％；

f)所述细胞群体中耗竭细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中耗竭细胞的百分比低至少10％；

g)所述细胞群体中表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比低至少10％；

h)所述细胞群体中T中央记忆细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中T中央记忆细胞的百分比高至少10％；

i)所述细胞群体中为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞的百分比高至少10％；

j)所述细胞群体中包含所述异源DNA的细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中包含所述异源DNA的细胞的百分比高至少20％；并且用包含所述异源DNA的病毒载体转导所述细胞群体和所述血沉棕黄层细胞群体；

k)所述细胞群体能够在比所述血沉棕黄层细胞群体少至少30％的时间内扩增成包括至少2×10e9个包含所述异源DNA的T细胞；并且用包含所述异源DNA的病毒载体转导所述细胞群体和所述血沉棕黄层细胞群体；

l)所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体表达更多的干扰素γ；

m)所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体表达更多的GM-CSF；

n)所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体分泌更少的IL-6；

o)所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体分泌更少的MCP-1；

p)所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体分泌更少的IL-1Ra；

q)所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体包含更高的平均绝对端粒长度；或

r)所述细胞群体包括比从血沉棕黄层细胞群体中纯化的T细胞包含更高的平均绝对端粒长度的T细胞。

2.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中白细胞的数目比所述血沉棕黄层细胞群体中白细胞的数目多至少2倍。

3.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中T细胞的数目比所述血沉棕黄层细胞群体中T细胞的数目多至少2倍。

4.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中红细胞与T细胞的比率比所述血沉棕黄层细胞群体中红细胞与T细胞的比率小至少5倍。

5.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中血小板与T细胞的比率比所述血沉棕黄层细胞群体中血小板与T细胞的比率小至少5倍。

6.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中衰老细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中衰老细胞的百分比低至少10％。

7.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中耗竭细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中耗竭细胞的百分比低至少10％。

8.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中表达CD45Ra的T效应记忆细胞的百分比低至少10％。

9.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中为T中央记忆细胞的细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中为T中央记忆细胞的细胞的百分比高至少10％。

10.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中为T中央记忆细胞或T效应记忆细胞的细胞的百分比高至少10％。

11.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中包含所述异源DNA的细胞的百分比比所述血沉棕黄层细胞群体中包含所述异源DNA的细胞的百分比高至少20％；并且用包含所述异源DNA的病毒载体转导所述细胞群体和所述血沉棕黄层细胞群体。

12.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体能够在比所述血沉棕黄层细胞群体少至少30％的时间内扩增成包括至少2×10⁹个包含所述异源DNA的T细胞；并且用包含所述异源DNA的病毒载体转导所述细胞群体和所述血沉棕黄层细胞群体。

13.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体表达更多的干扰素γ。

14.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体表达更多的GM-CSF。

15.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体分泌更少的IL-6。

16.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体分泌更少的MCP-1。

17.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体分泌更少的IL-1Ra。

18.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体比所述血沉棕黄层细胞群体包含更高的平均绝对端粒长度。

19.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，所述细胞群体包括比从所述血沉棕黄层细胞群体中纯化的T细胞包含更高的平均绝对端粒长度的T细胞。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的细胞群体，其中，所述异源DNA包含反向末端重复序列或长末端重复序列。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的细胞群体，其中，所述密度梯度离心包括将所述样品铺在包含泛影酸钠、EDTA二钠钙和密度约为1.078g/ml的中性、高度支化、高质量亲水性多糖[例如Ficoll]的水溶液上。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的细胞群体，其中，所述样品是leukopak。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的细胞群体，其中，所述样品是来自血小板捐献的残留白细胞。

24.根据权利要求1至21中任一项所述的细胞群体，其中，所述样品是血液样品。

25.根据权利要求24所述的细胞群体，其中，所述血液样品的血细胞比容＞2％。

26.根据权利要求24所述的细胞群体，其中，所述血液样品的血细胞比容＞4％。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的细胞群体，其中，所述血液样品的血细胞比容＜30％。

28.根据权利要求1至21中任一项所述的细胞群体，其中，所述样品是白细胞电泳或单采血液成分术样品。

29.根据权利要求1至21中任一项所述的细胞群体，其中，所述样品是脂肪样品或骨髓样品。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的细胞群体，其中，所述对象是人。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的细胞群体，其中，所述对象是健康个体。

32.根据权利要求1至30中任一项所述的细胞群体，其中，所述对象患有癌症。

33.根据权利要求32所述的细胞群体，其中，所述癌症是白血病。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的细胞群体，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。

35.根据权利要求1至33中任一项所述的细胞群体，其中，所述病毒载体是腺病毒载体。

36.根据权利要求1至33中任一项所述的细胞群体，其中，所述病毒载体是腺相关病毒载体。

37.根据权利要求1至36中任一项所述的细胞群体，其中，所述异源DNA编码CRISPR指导RNA。

38.根据权利要求1至36中任一项所述的细胞群体，其中，所述异源DNA编码siRNA或miRNA。

39.根据权利要求1至36中任一项所述的细胞群体，其中，所述异源DNA编码多肽。

40.根据权利要求39所述的细胞群体，其中，所述多肽是嵌合抗原受体。

41.根据权利要求40所述的细胞群体，其中，所述嵌合抗原受体选自替沙仑赛、阿基仑赛、brexucabtagene autoleucel、利基迈仑赛、艾基维仑赛及其组合。

42.根据权利要求39所述的细胞群体，其中，所述多肽是免疫球蛋白、T细胞受体、细胞因子或趋化因子。

43.根据权利要求1至42中任一项所述的细胞群体，其中，所述细胞群体中至少90％的细胞是存活的。

44.一种用于获得基因工程化的白细胞组合物的方法，其包括：

(a)在不进行密度梯度离心的情况下从包括白细胞的生物样品中富集大细胞群体；

(b)使所述大细胞群体与活化剂接触；以及

(c)用包含多核苷酸的病毒载体转导所述大细胞群体。

45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述大细胞具有至少4μm的直径。

46.根据权利要求44所述的方法，其中，所述大细胞具有至少5μm的直径。

47.根据权利要求44所述的方法，其中，所述大细胞具有至少7μm的直径。

48.一种用于获得基因工程化的白细胞组合物的方法，其包括：

(a)在不进行密度梯度离心的情况下从来自对象的包括白细胞的生物样品中去除低于预定尺寸的组分以产生大细胞群体；

(b)使所述大细胞群体与活化剂接触；以及

(c)用包含多核苷酸的病毒载体转导所述大细胞群体。

49.根据权利要求48所述的方法，其中，所述预定尺寸为4μm。

50.根据权利要求48所述的方法，其中，所述预定尺寸为5μm。

51.根据权利要求48所述的方法，其中，所述预定尺寸为7μm。

52.根据权利要求44至51中任一项所述的方法，其中，所述生物样品包括人细胞。

53.根据权利要求44至52中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是leukopak。

54.根据权利要求44至52中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是来自血小板捐献的残留白细胞。

55.根据权利要求44至52中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是血液样品。

56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述血液样品具有＞2％的血细胞比容。

57.根据权利要求55所述的方法，其中，所述血液样品具有＞4％的血细胞比容。

58.根据权利要求55所述的方法，其中，所述血液样品具有＜30％的血细胞比容。

59.根据权利要求44至52中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是白细胞电泳或单采血液成分术样品。

60.根据权利要求44至52中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是脂肪样品或骨髓样品。

61.根据权利要求44至60中任一项所述的方法，其中，所述对象是人。

62.根据权利要求44至61中任一项所述的方法，其中，所述对象是健康个体。

63.根据权利要求44至61中任一项所述的方法，其中，所述对象患有癌症。

64.根据权利要求63所述的方法，其中，所述癌症是白血病。

65.根据权利要求44至64中任一项所述的方法，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。

66.根据权利要求44至64中任一项所述的方法，其中，所述病毒载体是腺病毒载体。

67.根据权利要求44至64中任一项所述的方法，其中，所述病毒载体是腺相关病毒载体。

68.根据权利要求44至67中任一项所述的方法，其中，所述多核苷酸是异源DNA或异源RNA。

69.根据权利要求44至67中任一项所述的方法，其中，所述多核苷酸编码CRISPR指导RNA。

70.根据权利要求44至67中任一项所述的方法，其中，所述多核苷酸编码siRNA或miRNA。

71.根据权利要求44至67中任一项所述的方法，其中，所述多核苷酸编码多肽。

72.根据权利要求71所述的方法，其中，所述多肽是嵌合抗原受体。

73.根据权利要求72所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体选自替沙仑赛、阿基仑赛、brexucabtagene autoleucel、利基迈仑赛、艾基维仑赛及其组合。

74.根据权利要求71所述的方法，其中，所述多肽是免疫球蛋白、T细胞受体、细胞因子或趋化因子。

75.根据权利要求44至74中任一项所述的方法，其中，所述基因工程化的白细胞组合物的至少90％的细胞是存活的。

76.根据权利要求44至75中任一项所述的方法，其中，所述富集包括基于阵列的分离、声泳分离或亲和分离。

77.根据权利要求76所述的方法，其中，所述基于阵列的分离包括被配置用于确定性侧向位移的微流体装置。

78.根据权利要求77所述的方法，其中，所述微流体装置包括多个阵列，所述阵列包括多个障碍物，所述障碍物布置成大致垂直于流体流动方向延伸的行和大致平行于所述流体流动方向延伸的列，其中所述列与所述流体流动方向偏移一倾斜角。

79.根据权利要求78所述的方法，其中，所述装置包括至少50个障碍物阵列。

80.根据权利要求79所述的方法，其中，所述装置包括至少50个平行布置的障碍物阵列。

81.根据权利要求78所述的方法，其中，所述多个障碍物包括至少50行障碍物。

82.根据权利要求78或79所述的方法，其中，所述多个障碍包括至少50列障碍物。

83.根据权利要求78所述的方法，其中，所述倾斜角为约1/100。

84.根据权利要求77至83中任一项所述的方法，其中，所述多个障碍物中的每个障碍物具有菱形、圆形、椭圆形或六边形形状。

85.根据权利要求77至84中任一项所述的方法，其中，所述多个障碍物中的每个障碍物具有大致平行于所述流体流动方向的P1长度，所述P1长度比大致垂直于所述流体流动方向的P2长度长。

86.根据权利要求85所述的方法，其中，所述多个障碍物中的每个障碍物具有细长的六边形形状。

87.根据权利要求77至86中任一项所述的方法，其中，P1为约10μm至约60μm，且P2为约10μm至约30μm。

88.根据权利要求77至86中任一项所述的方法，其中，P1为约40μm且P2为约20μm。

89.根据权利要求77至86中任一项所述的方法，其中，P1比P2长50％至150％。

90.根据权利要求77至88中任一项所述的方法，其中，障碍物列中的所述障碍物被约22μm的G1间隙隔开，并且障碍物行中的所述障碍物被约17μm的G2间隙隔开。

91.根据权利要求77至90中任一项所述的方法，其中，缓冲液连续流过所述微流体装置。

92.根据权利要求77至91中任一项所述的方法，其中，通过所述微流体装置的流速为至少约1000mL/小时。

93.根据权利要求77至92中任一项所述的方法，其中，所述微流体装置在振荡流动条件下操作。

94.根据权利要求44至93中任一项所述的方法，其中，所述活化剂包括抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、白介素-2、白介素-7或白介素-15中的一种或多种。

95.根据权利要求94所述的方法，其中，所述抗-CD3抗体或抗-CD28抗体与固体支持物缀合。

96.根据权利要求95所述的方法，其中，所述固体支持物是磁珠。

97.根据权利要求95至96中任一项所述的方法，其中，使所述大细胞群体与缀合至固体支持物的所述抗-CD3抗体或所述抗-CD28抗体接触还包括亲和富集表达CD3或CD28的白细胞。

98.根据权利要求44至97中任一项所述的方法，其中，所述转导包括使所述大细胞群体与包含多核苷酸的所述病毒载体以至少为5的感染复数接触。

99.根据权利要求44至98任一项的方法，还包括在(a)之前用核酸酶处理所述生物样品。

100.根据权利要求44至99中任一项所述的方法，还包括冷冻所述大细胞群体和解冻所述大细胞群体。

101.根据权利要求44至100中任一项所述的方法，还包括：

(a)培养所述大细胞群体。

102.根据权利要求101所述的方法，其中，所述培养持续至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天。

103.根据权利要求101至102中任一项所述的方法，其中，所述培养不超过15、10、9、8、7、6、5、4或3天。

104.根据权利要求101至103中任一项所述的方法，其中，至少70％的T细胞表达所述多核苷酸/多肽。

105.根据权利要求104的方法，其中，通过流式细胞术测定表达所述多肽的细胞的百分比。

106.根据权利要求101至105中任一项所述的方法，其中，所述基因工程化的白细胞组合物包括至少1×10⁹个T细胞。

107.根据权利要求101至106中任一项所述的方法，其中，在培养6天后，所述基因工程化的白细胞组合物的至少75％的T细胞是T中央记忆细胞或T效应记忆细胞。

108.根据权利要求101至106中任一项所述的方法，其中，在培养9天后，所述基因工程化的白细胞组合物的至少85％的T细胞是T中央记忆细胞或T效应记忆细胞。

109.根据权利要求44至108中任一项所述的方法，还包括冷冻所述基因工程化的白细胞群体和解冻所述基因工程化的白细胞群体。

110.根据权利要求44至109中任一项所述的方法，还包括向患有肿瘤或癌症的个体施用所述基因工程化的白细胞群体。