CN111065399B - 使用微流体制备治疗活性细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微流体在制备用于治疗用途的细胞和组合物中的用途。本发明在其第一方面涉及遗传工程化靶细胞群的方法。这通过在微流体设备上进行确定性侧向位移(DLD)而从粗流体组合物分离靶细胞完成。本发明包括通过获得包含T细胞的粗流体组合物和使用微流体设备对该组合物进行DLD来产生CAR T细胞的方法。本发明在另一方面涉及通过施用根据所述方法工程化的CAR T细胞来治疗患者的癌症、自身免疫疾病或传染病的方法。

Description

使用微流体制备治疗活性细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年9月1日提交的美国临时专利申请第62/553,723号的权益；于2017年10月3日提交的美国临时专利申请第62/567,553号的权益；于2018年2月26日提交的临时专利申请第62/635,304号的权益；以及于2018年4月12日提交的临时专利申请第62/656,939号的权益；并且，此外，本申请是于2017年10月23日提交的PCT/US2017/057876的部分继续申请。这些在先申请全部被通过引用以其整体并入本文。
关于联邦资助的研究的声明
本发明根据由美国国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的资助号CA174121和HL110574在政府支持下进行。政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
本发明主要涉及制备用于治疗用途的细胞和组合物的方法。这些方法使用基于尺寸分离细胞的微流体设备。
发明背景
细胞疗法，并且尤其是CAR-T细胞疗法，已经在治疗B-细胞疾病，诸如B-急性淋巴性白血病(B-ALL)和B-细胞淋巴瘤中表现出非凡的效力。因此，对自体疗法(autologoustherapy)的需求已经急剧增加，并且开发工作已经扩大到集中在以实体瘤为特征的癌症，诸如胶质母细胞瘤(Vonderheide等人,Immunol.Rev.257:7-13(2014)；Fousek等人,Clin.Cancer Res.21:3384-3392(2015)；Wang等人,Mol.Ther.Oncolytics 3:16015(2016)；Sadelain等人,Nature 545:423-431(2017))。用CRISPR/Cas-9在被关注的自体细胞(诸如干细胞)群中靶向基因编辑可以进一步供应需求(Johnson等人,Cancer CellRes.27:38-58(2017))。
用于个性化疗法的细胞制备通常是劳动密集的过程，该过程依靠从不太适合治疗应用的血液保存(blood banking)或蛋白质生物处理程序(protein bioprocessingprocedure)改良的程序。与处理步骤相关的细胞损失通常是极大的(Hokland等人,Scand.J.Immunol.11:353-356(1980)；Stroncek等人,J.Transl.Med.12:241(2014))，部分是因为方法使用了实现细胞特异性分离的制品(Powell等人,Cytotherapy 11:923-935(2009)；TerumoBCT.ELUTRA细胞分离系统。用于从单采血液成分术(apheresis)残留物富集淋巴细胞的制造商建议)，但这样做是以细胞存活率和产率为代价的(Chiche-Lapierre,Cytotherapy 18(6):S47(2016))。因此，存在对更高效的方法的需求。
发明概述
本发明尤其涉及收集和快速处理细胞，特别是具有治疗用途的细胞的方法。许多方法依赖于确定性侧向位移(DLD)，一种涉及使样品流过包含与流体流动的方向成小角度倾斜的微柱的特别设计的阵列的微流体设备的方法(Davis等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:14779-14784(2006)；Inglis等人,Lab Chip 6:655-658(2006)；Chen等人,Biomicrofluidics.9(5):054105(2015))。大于微柱阵列的靶尺寸的细胞可以被微柱轻微地偏转(“碰撞(bump)”)到洁净缓冲液的流中，有效地将它们与较小的、未被偏转的细胞和颗粒分离，而同时在无害(non-injurious)的方法中洗涤细胞。DLD相对于细胞处理的有益特征在表1中描述：
表1.DLD的固有性质及其对细胞处理的意义
用于工程化靶细胞的方法
本发明在其第一方面涉及遗传工程化靶细胞群的方法。所述方法通过在微流体设备上进行确定性侧向位移(DLD)从粗流体组合物中分离靶细胞完成。该设备的特征是存在从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，并且所述通道由第一壁和与第一壁相对的第二壁界定。障碍物阵列成行布置在通道中，障碍物的每一个后续的行相对于前一行侧向地偏移。障碍物以这样的方式布置，使得当粗流体组合物被施加至设备的入口并且通过通道时，靶细胞流向收集所富集的产物的一个或更多个收集出口，并且污染性细胞或颗粒流向与收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口。一旦靶细胞已经使用设备纯化后，就用核酸转染或转导靶细胞，所述核酸被设计成赋予细胞期望的表型，例如以表达嵌合分子(优选地使细胞具有治疗价值的蛋白质)。细胞群可以然后通过体外培养被扩增。当被培养和扩增时，表现出期望的表型的重组工程化靶细胞的产率优选地比未进行DLD的相同细胞(且特别是已经暴露于Ficoll离心而不进行DLD的细胞)大至少10％，并且更优选地大至少20％、30％、40％或50％。
在优选的实施方案中，粗流体组合物是血液，或者更优选地，已通过在患者的血液上进行单采血液成分术(apheresis)或白细胞单采术(leukapheresis)获得的白细胞的制备物。优选的靶细胞包括T细胞、B-细胞、NK-细胞、单核细胞和祖细胞，T细胞(尤其是自然杀伤T细胞)是最优选的。除白细胞外，其他类型的细胞，例如树突细胞或干细胞，也可以被用作靶细胞。
一般而言，包含靶细胞的粗流体组合物将在不冷冻(至少直到靶细胞被遗传工程化的时刻)的情况下并在收集的场所被处理。粗流体组合物将优选地是患者的血液，并且更优选地是包含作为在这样的血液上进行单采血液成分术或白细胞单采术的结果而获得的白细胞的组合物。然而，术语“粗流体组合物”还包括体液，诸如淋巴液或滑液以及从骨髓或其他组织制备的流体组合物。粗流体组合物也可以来源于肿瘤或其他异常组织。
尽管靶细胞与载体在被遗传工程化之前结合并非必不可少，但优选的是，靶细胞与一种或更多种载体在首次进行DLD之前或之后(优选地在首次进行DLD之前)结合。使结合发生的具体手段对本发明而言不是关键的，但是结合应该“以促进DLD分离的方式”完成。如在该背景中使用的，该术语意指该方法必须最终导致对特定靶细胞类型表现出特异性的结合，所述结合提供复合物的尺寸相对于未结合细胞增加至少2μm(并且可选地，当以百分比表示时至少20％、50％、100％、200％、500％或1000％)，并且在治疗或其他用途需要游离靶细胞的情况下，所述结合允许靶细胞通过化学裂解或酶裂解、化学溶解、消化、由于与其他结合剂的竞争、通过物理剪切(例如使用移液管以产生剪切应力)或通过其他手段从复合物中释放。
在优选的实施方案中，载体在其表面上具有允许载体特异性地直接结合靶细胞的亲和剂(例如，抗体、活化剂、半抗原、适体、核酸序列或其他化合物)。可选地，可以存在特异性地结合靶细胞和载体二者的中间蛋白质、细胞或其他剂。例如，可以使用识别靶细胞上的表面抗原并且还特异性地结合载体(例如，由于在载体表面上存在第二抗体、亲和素/生物素结合或一些其他类似的相互作用)的抗体。此外，靶细胞有时可以特异性地与其他细胞相互作用以形成复合物，并且当这样做时，所述其他细胞可以用作生物载体，即它们可以增加靶细胞的有效尺寸并且从而促进靶细胞与未形成复合物的细胞分离。例如，人类T细胞可以与绵羊红细胞或自体人类红细胞相互作用，以形成随后可以作为复合物被纯化的细胞玫瑰花结(a rosette of cells)。可选地，其他载体可以特异性地与这样的玫瑰花结中的细胞结合，以进一步促进基于尺寸的分离。
如在该背景中使用的，词语“特异性”意指相对于结合的每个非靶细胞，至少100个(并且优选地至少1000个)靶细胞将被粗流体组合物中的载体结合。在载体在DLD之后结合的情况中，结合可以发生在靶细胞被遗传工程化之前或之后。
载体的结合可以有助于稳定细胞、活化它们(例如以使其分裂)或有助于促进一种类型细胞与另一种类型的细胞的分离。如以上提出的，载体与细胞的结合可以发生在该方法的不同时间，包括在细胞正在被获得的时间期间发生。为了提高分离，可以选择载体，使得单个载体与细胞的结合引起实质上大于单独的细胞的尺寸的载体-细胞复合物。可选地，可以使用比靶细胞小的载体。在这种情况中，优选的是，数个载体(several carriers)特异性地结合细胞，从而形成具有一个细胞和多个载体的复合物。在DLD期间，复合的靶细胞可以与具有相似尺寸的未复合的细胞分离并提供原本不发生的纯化。
为了实现这样的分离，复合物的直径应该优选地比未复合的靶细胞大至少20％并且更优选地大至少50％、是未复合的靶细胞的至少两倍或至少十倍大。如上文所述，这种尺寸上的增加可能是由于单个大的载体与靶细胞的结合，或由于数个较小载体的结合。这可以使用以下实现：a)仅具有与靶细胞的直径至少一样大(或在其他实施方案中，靶细胞的直径的至少两倍大或至少十倍大)的直径的载体；b)仅具有不超过靶细胞的直径的50％(或在其他实施方案中，不超过25％或15％)大的直径的载体；或c)具有这些尺寸特征的大载体和小载体的混合物(例如，可以存在具有与靶细胞的直径至少一样大(或是靶细胞的直径的至少两倍或十倍大)的直径的一组载体，和具有不超过靶细胞的直径的50％(或不超过25％或15％)大的直径的第二组载体)。通常，载体将具有1-1000μm(并且通常在5μm-600μm或5μm-400μm的范围内)的直径。理想地，复合物将在具有障碍物阵列的微流体设备上通过DLD与其他细胞或污染物分离，所述障碍物具有低于复合物尺寸但高于未复合的非靶细胞或污染物的尺寸的临界尺寸。
此外，载体可以以“补充DLD分离(complement DLD separation)”的方式起作用，而不是直接通过这种技术促进分离。例如，载体(例如Janus或草莓样颗粒(Strawberry-like particle))可以包含两种或更多种分散的化学性质，所述两种或更多种分散的化学性质支持和向与载体结合的细胞赋予可操作的(actionable)、差异的、非尺寸相关的次要性质，诸如化学、电化学或磁性性质，并且这些性质可以在下游处理中被使用。因此，颗粒可以被使用以促进磁性分离、电穿孔或基因转移。颗粒还可以在与例如新陈代谢或繁殖相关的细胞性质方面赋予有益变化。
在特别重要的实施方案中，载体的结合可以被用作将特定白细胞(特别是T细胞，包括自然杀伤T细胞)与其他白细胞(例如粒细胞和单核细胞)和/或其他细胞分离的手段。这可以在例如两步方法中完成，其中DLD在未与载体结合的靶细胞上使用具有小于所述细胞的临界尺寸的障碍物阵列进行，并且也在包含靶细胞和载体的复合物上使用具有小于复合物但大于未复合的细胞的临界尺寸的障碍物阵列进行。DLD步骤可以以任一顺序进行，即，可以在未复合的靶细胞上进行DLD之前或之后在复合物上进行DLD。
从获得粗流体组合物完成的时间到靶细胞首次与载体结合，应历时不超过4小时(并且优选地不超过3、2或1小时)。此外，从获得粗流体组合物完成的时间到靶细胞首次被转染或转导，应历时不超过5小时(并且优选地不超过4、3或2小时)。
在特别地优选的实施方案中，上文描述的方法中的靶细胞是T细胞(特别是自然杀伤T细胞和记忆T细胞)，并且这些T细胞被工程化以在它们的表面表达嵌合抗原受体。用于制造这些CAR T细胞的程序将在下文更具体地描述。
用于制造CAR T细胞的方法
本发明包括通过获得包含T细胞(特别是自然杀伤T细胞和记忆T细胞)的粗流体组合物和使用微流体设备在组合物上进行DLD来产生CAR T细胞的方法。通常，包含T细胞的粗流体组合物将是来源于患者的血液并且含有白细胞的单采血液成分术或白细胞单采术的产物。
微流体设备必须具有从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中该通道由第一壁和与第一壁相对的第二壁界定。障碍物阵列成行布置在通道中，障碍物的每一个后续的行相对于前一行侧向地偏移。这些障碍物以这样的方式布置，使得当包含T细胞的粗流体组合物被施加至设备的入口并且流体流动地通过通道时，T细胞流向收集所富集的产物的一个或更多个收集出口，并且与T细胞具有不同(通常较小)尺寸的其他细胞(例如红细胞和血小板)或其他颗粒流向与收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口。一旦获得T细胞，就使用本领域良好建立的程序将T细胞遗传工程化以在其表面产生嵌合抗原受体(CAR)。这些受体通常应该结合与疾病或异常状况相关的细胞表面上的抗原。例如，受体可以结合在癌细胞表面上特有或过表达的抗原。在这个方面，CD19有时可以是这样的抗原。
表达CAR的T细胞的遗传工程化将通常包括用核酸转染或转导T细胞，并且CAR T细胞一旦产生，就可以通过使这些细胞在体外生长而扩大数量。在这个过程期间可以添加活化剂或其他因子以促进生长，IL-2和IL-15在可以被使用的剂之中。在一些实施方案中，在DLD、重组工程化和扩增后，在其表面上表达嵌合受体的T细胞的产率应该比以相同方式但不进行DLD制备的T细胞大至少10％，并且优选地大至少20％、30％、40％或50％。类似地，在一些实施方案中，在其表面上表达嵌合受体的T细胞的产率应该比通过Ficoll离心而不进行DLD分离的T细胞大至少10％，并且优选地大至少20％、30％、40％或50％。
嵌合受体将通常具有a)具有抗原结合结构域的胞外区；b)跨膜区和c)胞内区。细胞也可以用为细胞提供分子开关的序列重组工程化，该分子开关当被触发时降低CAR T细胞数目或活性。在优选的实施方案中，抗原结合结构域是来自单克隆抗体的重链和轻链二者的抗原结合区的单链可变片段(scFv)。还优选地存在连接胞外区和跨膜区的2-20个氨基酸的铰链区。跨膜区可以具有CD3 zeta、CD4、CD8或CD28蛋白序列，并且胞内区应该具有通常来源于CD3-zeta、CD137或CD28的信号传导结构域。也可以包括用于调控或刺激活性的其他信号传导序列。
在获得包含T细胞的粗流体组合物后，或在正在收集T细胞的时间期间，由于上文讨论的原因，T细胞可以以促进DLD分离的方式与一种或更多种载体结合。所述结合将优选地发生在进行DLD前。然而，所述结合也可以发生在进行DLD后和在细胞首次被转染或转导之前或之后。在优选的实施方案中，载体应该在其表面上包含与T细胞(优选地自然杀伤T细胞)特异性地结合的亲和剂(例如抗体、活化剂、半抗原或适体)。如在该背景中使用的术语“特异性”意指，与组合物中的任何其他细胞相比，载体优先地与期望的T细胞结合。例如，对于其中载体结合一种不同类型的细胞的每个实例，载体可与100个或1000个CD8+T细胞结合。
在一些实施方案中，载体可以具有球形形状，并且由生物材料或合成材料制造，所述生物材料或合成材料包括胶原蛋白、多糖、包括聚苯乙烯、丙烯酰胺、藻酸盐和磁性材料。此外，载体可以以补充DLD分离的方式起作用。
为了帮助实现分离，在T细胞和载体之间形成的复合物的直径应该优选地比未复合的T细胞大至少20％并且优选地大至少50％，是未复合细胞的至少两倍大或至少十倍大。这种尺寸上的增加可能是由于单个大的载体与细胞的结合，或由于数个较小载体的结合。结合可以涉及使用：a)仅具有与T细胞的直径至少一样大(或在其他实施方案中，是T细胞的直径的至少两倍大或至少十倍大)的直径的载体；b)仅具有不超过T细胞的直径的50％(或在其他实施方案中，不超过25％或15％)大的直径的载体；或c)具有这些尺寸特征的大载体和小载体的混合物(例如，可以存在具有与T细胞的直径至少一样大(或是T细胞的直径的至少两倍或十倍大)的直径的一组载体，和具有不超过T细胞的直径的50％(或不超过25％或15％)大的直径的第二组载体)。通常，载体将具有1μm-1000μm(并且通常在5μm-600μm或5μm-400μm的范围内)的直径。理想地，复合物将通过在具有障碍物阵列的微流体设备上的DLD与未复合的细胞或污染物分离，所述障碍物具有低于复合物的尺寸但高于未复合的非靶细胞或污染物的尺寸的临界尺寸。
如以上结合靶细胞讨论的，T细胞的纯化可以涉及两步骤方法。例如，DLD可以在未结合载体的T细胞上使用具有小于T细胞的临界尺寸的障碍物阵列进行。包含分离的T细胞以及其他细胞或颗粒的组合物然后可被回收，并与一种或更多种载体以促进DLD分离并且其中T细胞被特异性地结合的方式结合。由此形成的复合物然后可在具有小于复合物但大于未复合的细胞的临界尺寸的障碍物阵列上被分离。原则上，DLD步骤可以以任一顺序进行，即DLD可以先在复合物上进行，或者先在未复合的T细胞上进行。
优选地，从获得包含T细胞的粗流体组合物完成的时间(例如，从单采血液成分术或白细胞单采术完成的时间)到T细胞与载体结合，应历时不超过4小时(并且，更优选地，不超过3、2或1小时)。此外，从获得T细胞完成的时间到T细胞首次被转染或转导，应历时不超过5小时(并且优选地不超过4、3或2个小时)。理想地，产生CAR T细胞的所有步骤都在获得包含T细胞的粗流体组合物的同一设备中进行，并且所有步骤在不超过4小时(并且优选地不超过3小时)内完成，并且无需细胞冷冻。
使用CAR T细胞治疗癌症、自身免疫疾病或传染病
在另一方面，本发明涉及通过施用被工程化以表达识别癌细胞抗原、或负责或促成自身免疫疾病或传染病的细胞上的抗原的嵌合抗原受体的CAR T细胞治疗患者的癌症、自身免疫疾病或传染病的方法。CAR T细胞可以使用在以上部分中讨论的方法制造，即通过获得包含T细胞的粗流体组合物(优选地来源于患者的单采血液成分术产物或白细胞单采术的包含白细胞的产物)，并且然后使用微流体设备在组合物上进行DLD。以这种方式回收的CAR T细胞(优选地自然杀伤T细胞和记忆T细胞)然后通过使这些细胞在体外生长而被扩增。最后，细胞被施用至患者，该患者通常应该是提供从其分离T细胞的血液的同一患者。
优选地，在DLD、重组工程化和扩增后，在其表面上表达嵌合受体的T细胞的产率比以相同方式制备但不进行DLD的T细胞大至少10％，并且更优选地大至少20％、30％、40％或50％。例如，在其表面上表达嵌合受体的T细胞的产率可比通过Ficoll离心而不进行DLD分离的T细胞大至少10％，并且优选地大至少20％、30％、40％或50％。
嵌合受体将通常至少具有：a)具有抗原结合结构域的胞外区；b)跨膜区和c)胞内区。细胞也可以用为细胞提供分子开关的序列重组工程化，该分子开关当被触发时降低CART细胞数目或活性。在优选的实施方案中，抗原结合结构域是来自单克隆抗体的重链和轻链二者的抗原结合区的单链可变片段(scFv)。还优选地存在连接胞外区和跨膜区的2-20个氨基酸的铰链区。跨膜区本身可以具有CD3 zeta、CD4、CD8或CD28蛋白序列，并且胞内区将具有通常来源于CD3-zeta和/或CD28胞内结构域的信号传导结构域。还可以包括用于调控或刺激活性的其他信号传导序列。
在获得粗流体组合物之后或在粗流体组合物正在被收集的时间期间，在组合物中存在的T细胞与一种或更多种载体可以以促进或补充DLD分离的方式结合。结合将优选地在进行DLD之前发生。然而，结合也可以在进行DLD之后和在细胞被遗传工程化之前或之后发生。优选地，结合将促进DLD分离，并且载体将在其表面上包含特异性地结合T细胞(尤其是自然杀伤T细胞)的抗体、活化剂或与其他剂。如在该背景使用的术语“特异性”意指，与组合物中的任何其他细胞相比，载体将优先与期望的T细胞结合。例如，对于结合其他类型的细胞的每种载体，该载体可以结合100个或1000个CD8+T细胞。
在T细胞和载体之间形成的复合物的直径应该优选地比未复合的T细胞大至少20％，并且更优选地大至少50％，是未复合的T细胞的至少两倍大或至少十倍大。这种尺寸上的增加可能是由于单个大的载体与细胞的结合，或由于数个较小载体的结合。结合可以涉及使用：a)仅具有与T细胞的直径至少一样大(或在其他实施方案中，是T细胞的直径的至少两倍大或至少十倍大)的直径的载体；b)仅具有不超过T细胞的直径的50％(或在其他实施方案中，不超过25％或15％)大的直径的载体；或c)具有这些尺寸特征的大载体和小载体的混合物(例如，可以存在具有与T细胞的直径至少一样大(或是T细胞的直径的至少两倍或十倍大)的直径的一组载体，和具有不超过T细胞的直径的50％(或不超过25％或15％)大的直径的第二组载体)。通常，载体将具有1μm-1000μm(并且通常在5μm-600μm或5μm-400μm的范围内)的直径。理想地，复合物将通过在具有障碍物阵列的微流体设备上的DLD与未复合的细胞或污染物分离，所述障碍物具有低于复合物的尺寸但高于未复合的非靶细胞或污染物的尺寸的临界尺寸。
T细胞的纯化可以涉及两步骤方法。例如，DLD可以在未与载体结合的T细胞上使用具有小于T细胞的临界尺寸的障碍物阵列进行。包含分离的T细胞以及其他细胞或颗粒的组合物然后可被回收，并与一种或更多种载体以促进DLD分离且其中T细胞被特异性地结合的方式结合。由此形成的复合物可以然后在具有小于复合物但大于未复合的细胞的临界尺寸的障碍物阵列上被分离。原则上，DLD步骤可以以任一顺序进行，即DLD可以先在复合物上进行，或者先在未复合的T细胞上进行。
优选地，从获得T细胞完成(例如，直到单采血液成分术或白细胞单采术完成)的时间到T细胞与载体结合，应历时不超过4小时(并且更优选地，不超过3、2或1小时)。此外，从获得T细胞完成的时间到T细胞首次被转染或转导，应历时不超过5小时(并且优选地不超过4、3或2小时)。理想地，产生CAR T细胞的所有步骤都在获得包含T细胞的粗流体组合物的同一设备中进行，并且所有步骤都在不超过4小时(并且优选地不超过3小时)内完成。
以这种方式制造的CAR T细胞可以在使用临床医学领域中良好建立的方法治疗患者的白血病(例如急性淋巴母细胞性白血病)中使用，并且在这些情况中，CAR可以识别CD19或CD20为肿瘤抗原。该方法也可以用于实体瘤，在这种情况中，被识别的抗原可以包括CD22；RORI；间皮素；CD33/IL3Ra；c-Met；PSMA；糖脂F77；EGFRvIII；GD-2；NY-ESO-1；MAGEA3；及其组合。关于自身免疫疾病，CAR T细胞可以用于治疗类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化症、强直性脊柱炎、1型糖尿病或血管炎。
在一些实施方案中，通过以上描述的方法产生的靶细胞将比如果使用不包括DLD的方法生成的细胞更早地可用于向患者施用。这些细胞可以早1天或更多天，并且优选地早2、3、4、5天或更多天被施用。细胞可以在从获得粗流体组合物完成的时间后的8-10天内被施用。
细胞的收集和处理
本发明还涉及用于收集和处理来自患者的细胞的方案，所述方案被设计成快速处理细胞并且所述方案可以通常在收集细胞的场所进行。所述方案可以被用作上文描述的用于制备靶细胞和CAR T细胞的方法的一部分。这些方案中的一些方案的方面在图13和14中说明，并且可以与图12中示出的方案对比。在所示的具体程序中，通过全血的单采血液成分术获得的组合物被获得，并且然后组合物中的T细胞被选择。在该背景中的术语“被选择(selected)”意指，T细胞被特异性地(如上文定义的)识别T细胞的剂结合。然后使用DLD来分离被选择的T细胞，并且将这些细胞转移到挑选的液体培养基中。
更通常地，本发明涉及通过以下收集靶细胞的方法：a)从患者获得包含靶细胞的粗流体组合物；和b)在粗流体组合物上进行确定性侧向位移(DLD)，以获得富集靶细胞的组合物，其中在DLD之前或之后，靶细胞以促进DLD分离的方式与载体结合。例如，可以使用在其表面上具有特异性地(如上文定义的)结合靶细胞的亲和剂(例如抗体、活化剂、半抗原或适体)的载体。
如果期望的话，载体与靶细胞可以在正在从患者收集细胞的时间期间结合，并且从获得包含靶细胞的粗流体组合物完成的时间到靶细胞与载体结合，应当历时不超过5小时(并且优选地不超过4小时、3小时、2小时或1小时)。
在靶细胞和一种或更多种载体之间形成的复合物的直径应该优选地比未复合的细胞大至少20％，并且优选地大至少50％，是未复合的细胞的至少两倍大或至少十倍大。这种尺寸上的增加可能是由于单个大的载体与靶细胞的结合，或由于数个较小载体的结合。结合可以涉及使用：i)仅具有与靶细胞的直径至少一样大(或在其他实施方案中，是靶细胞的直径的至少两倍大或至少十倍大)的直径的载体；ii)仅具有不超过靶细胞的直径的50％(或在其他实施方案中，不超过25％或15％)大的直径的载体；或iii)具有这些尺寸特征的大载体和小载体的混合物(例如，可以存在具有与靶细胞的直径至少一样大(或是靶细胞的直径的至少两倍或十倍大)的直径的一组载体，和具有不超过靶细胞的直径的50％(或不超过25％或15％)大的直径的第二组载体)。通常，载体将具有1μm-1000μm(并且通常在5μm-600μm或5μm-400μm的范围内)的直径。理想地，复合物将通过在具有障碍物阵列的微流体设备上的DLD与其他细胞或污染物分离，所述障碍物具有低于复合物的尺寸但高于未复合的细胞或污染物的尺寸的临界尺寸。
在优选的实施方案中，包含靶细胞的粗流体组合物通过对来自患者的血液进行单采血液成分术或白细胞单采术获得。该组合物可以包含用作抗凝血剂或防止血小板活化的一种或更多种添加剂。这样的添加剂的实例包括单独或组合的噻氯匹定(ticlopidine)、肌苷、原儿茶酸(protoctechuic acid)、乙酰水杨酸和替罗非班(tirofiban)。
微流体设备必须具有从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中所述通道被第一壁和与第一壁相对的第二壁界定。在通道中还必须存在成行布置的障碍物的阵列，障碍物的每一个后续的行相对于前一行侧向地偏移，当包含靶细胞的所述粗流体组合物被施加至设备的入口并且流体流动地通过通道时，靶细胞流向收集所富集的产物的一个或更多个收集出口，并且在粗流体组合物中且具有与靶细胞不同的尺寸的污染性细胞或颗粒流向与收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口。
在特别优选的实施方案中，靶细胞是选自由以下组成的组的T细胞：自然杀伤T细胞；中央记忆T细胞；辅助性T细胞和调节T细胞，自然杀伤T细胞是最优选的。在可选的优选实施方案中，靶细胞是干细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞或祖细胞。
除了步骤a)和b)之外，本发明的方法可以包括：c)通过使用病毒载体转导来遗传工程化细胞。可选地，细胞可以被电转染、化学转染或通过纳米颗粒的手段转染和/或扩大细胞数量；和/或d)用收集的靶细胞治疗从其获得靶细胞的同一患者。此外，收集的细胞可以被培养和/或冻存。在靶细胞是T细胞的情况中，培养应该通常在活化剂(优选地与载体结合的活化剂)的存在下进行。IL-2和IL-15在可以被包含在T细胞培养物中的因子之中。
在一些实施方案中，通过上文描述的方法产生的靶细胞比如果使用不包括DLD的方法生成的细胞将更早地可用于向患者施用。这些细胞可以早1天或更多天，并且优选地早2、3、4、5天或更多天被施用。细胞可以在从获得粗流体组合物完成的时间后的8-10天内被施用。
除了上文讨论的方法之外，本发明包括通过这些方法产生的靶细胞和其中靶细胞被施用至患者的治疗方法。
使用DLD改变白细胞的特性
降低白细胞制备物中血小板的水平对于制造CAR T细胞和制备用于其他治疗用途的白细胞都具有优势。在这个方面，本发明部分地基于这样的观念，即DLD比通常使用的Ficoll分离更有效地降低单采血液成分术样品中血小板的总数目(参见图19-21)，尤其是在使用不促进血小板凝集的缓冲液时(参见图22-23)。当与基于特异性结合T细胞的磁珠的分离组合使用时，DLD得到可以比单独使用这样的磁珠或与Ficoll离心结合使用这样的磁珠时更快速地扩增的细胞的制备物(参见图24)。这种作用可能部分由于血小板数目的降低，并且部分由于与存在的血小板的数目无关的因素(参见图24)。此外，使用DLD/磁珠程序获得的结果更加一致(参见图25)，并且当与使用Ficoll/磁珠方法制备的群相比时，从该程序扩增的T细胞具有更高百分比的具有中央记忆表型的T细胞(参见图26)。来自DLD的较高的初始细胞回收率将a)T细胞的更快扩增和b)更高百分比的中央记忆细胞组合，意味着可以更快地使患者能够获得治疗有效水平的T细胞。
在一个方面，本发明涉及用于降低单采血液成分术样品中血小板与白细胞的比率的方法，该方法通过在不存在离心或淘析的情况下对样品进行确定性侧向位移以获得这样的产物，其中血小板与白细胞的比率比当使用离心(包括梯度离心或逆流离心)或淘析代替DLD进行相同程序时获得的比率低至少20％(并且优选地50％或70％)。优选地，该程序不包括在DLD之前对单采血液成分术样品进行的分离步骤，并且DLD在不包含改变血小板的尺寸且不促进血小板凝集的嵌入剂(intercalator)或其他手段的缓冲液中进行。应当被避免的剂包括右旋糖和其他高电荷聚合物。除了降低血小板与白细胞的比率之外，DLD获得的产物中的血小板的总数目应当比单采血液成分术样品中血小板的总数目低至少70％并且优选地低至少90％。
在另一方面，本发明涉及一种从单采血液成分术样品纯化T细胞的方法，该方法通过对样品进行DLD，随后是对T细胞进行亲和分离步骤并且通过在活化剂存在下培养来扩增T细胞。该过程应当得到的T细胞的数目是通过使用Ficoll离心代替DLD进行相同程序产生的数目的至少2倍。一种优选的亲和方法包括使用磁珠，所述磁珠通过识别至少CD3并且可以包括CD3以及CD28或其他共刺激分子的抗体与T细胞特异性结合。培养14天后获得的T细胞的数目应当是通过使用Ficoll离心代替DLD进行相同程序产生的数目的至少2倍(并且优选地至少4倍或6倍)。通过该方法产生的产物中的记忆T细胞的百分比应当比使用相同方法但用Ficoll离心代替DLD产生的百分比高至少10％(并且优选地高至少20％)。
该方法尤其非常适于产生用于CAR T细胞疗法的T细胞。使用DLD代替Ficoll离心产生足以治疗患者的数目的细胞所需的时间降低了至少5％(并且优选地至少10％或至少20％)，并且CAR T细胞可以在不需要冷冻的情况下制备。在优选的方法中，细胞从患者收集，通过DLD以及任选的亲和方法在相同的场所处理。遗传转化也可以在该场所发生，并且优选地，从单采血液成分术完成的时间到DLD开始，历时不超过1小时。
本发明还包括一种通过对样品进行确定性侧向位移(DLD)来降低单采血液成分术样品中血小板与白细胞的比率的方法。在不存在离心或淘析的情况下进行DLD，以获得其中血小板的总数目比单采血液成分术样品中低至少70％(并且优选地至少90％)的产物。DLD应当优选地在不包含嵌入剂且不促进血小板凝集的缓冲液中进行。优选地，缓冲液不包含右旋糖或其他高电荷聚合物。
本发明不限于白细胞，而是还包括其他有治疗价值的细胞，特别是可能存在于单采血液成分术制备物中的细胞，包括循环干细胞。DLD的益处，包括由于去除不期望的血小板的益处，应当适用于各种各样的方法。
将DLD用于大体积的白细胞单采术材料的方法
DLD的一个益处是，它可以用于处理少量材料而体积几乎没有增加，以及相对大量的材料。该程序可以在由于通过离心浓缩白细胞而具有小体积的白细胞单采术产物上以及在处理大体积材料中使用。
因此，在另一方面，本发明涉及用于从大体积白细胞单采术方法中纯化细胞的系统，其中至少一种微流体设备被用来通过DLD分离材料。目标是获得可以被治疗地使用的白细胞或分泌可以被治疗地使用的剂的白细胞。特别重要的是，本发明包括将特定类型的白细胞与一种或更多种载体以促进且任选地还补充DLD分离的方式结合，并然后在复合物上进行DLD。以这种方式，特定类型的白细胞可以与大约相同尺寸且在不存在复合物形成的情况下无法通过DLD分辨的细胞分离。在这个方面，如上文讨论的两步骤程序有时可能是有利的，其中一个DLD程序将未结合的白细胞与较小的材料分离，并且另一个DLD程序将载体-白细胞复合物与未复合的细胞分离。基本上相同的技术可以在其他环境中使用，例如在培养的细胞上，条件是细胞特异性载体是可获得的。在所有情况中，细胞可以被重组地遗传工程化，以改变它们的一个或更多个基因的表达。
关于白细胞单采术材料，微流体设备必须具有从样品入口延伸至“收集出口”和“废弃物出口”二者的至少一个通道，所述“收集出口”用于回收白细胞(WBC)或特定白细胞-载体复合物，具有与WBC不同的尺寸(通常更小)的材料或未复合的白细胞流动通过“废弃物出口”。通道由第一壁和与第一壁相对的第二壁界定，并且包含成行布置的障碍物阵列，每一个连续的行相对于前一行侧向地偏移。障碍物以这样的方式布置，使得当白细胞单采术材料被施加至设备的入口并且流体流动地通过通道时，细胞或细胞复合物被偏转到收集所富集的产物的收集出口(或多个出口)，并且具有不同(通常更小)尺寸的材料流向一个或更多个分隔的废弃物出口。
为了促进大体积的起始材料的快速处理，微流体设备中的障碍物可以被设计成菱形或三角形的形状，并且每个设备可以具有6-40个通道。此外，微流体设备可以是包含2-20个微流体设备的系统的一部分(见图7)。单个设备可以以14ml/hr的流速运行，但是流速至少为25ml/hr(优选地至少为40ml/小时、60ml/小时、80ml/小时或100ml/小时)是优选的，并且允许在1小时内处理大样品体积(至少200ml，并且优选地400ml-600ml)。
存活细胞的分离
在另一个方面，本发明涉及将存活细胞与非存活细胞分离的方法，所述方法包括：(a)获得包含存活细胞和非存活细胞的样品，其中存活细胞可以具有第一预定尺寸，并且非存活细胞可以具有第二预定尺寸；并且其中第一预定尺寸可以大于或等于临界尺寸，并且第二预定尺寸可以小于临界尺寸；(b)将样品施加至设备，其中设备可以包括成行布置的障碍物阵列，其中所述行可以相对于彼此侧向地偏移，其中所述行可以被配置成使大于或等于临界尺寸的颗粒在第一方向上偏转，并且使小于临界尺寸的颗粒在第二方向上偏转；和(c)使样品流过该设备，其中存活细胞可以被障碍物在第一方向上偏转，并且非存活细胞可以在第二方向上被偏转，从而将存活细胞与非存活细胞分离。临界尺寸可以比第二预定尺寸大大约1.1倍，并且在一些实施方案中，存活细胞可以是活跃地分裂的细胞。在一些实施方案中，设备可以包含具有逐渐变小的障碍物和间隙的至少三个区域。
黏附细胞的分离
本发明还包括通过以下获得黏附靶细胞(优选地具有治疗价值的细胞，例如黏附干细胞)的方法：a)从患者获得包含黏附靶细胞的粗流体组合物；和b)进行确定性侧向位移(DLD)以获得富集黏附靶细胞的组合物。在此过程中，黏附靶细胞与一种或更多种载体可以以促进或补充DLD分离的方式结合。例如，载体可以在其表面上具有特异性地(如上文定义的)结合黏附靶细胞的亲和剂(例如抗体、活化剂、半抗原或适体)，并且可以用核酸转染或转导，所述核酸被设计成赋予细胞期望的表型，例如以表达嵌合分子(优选使细胞具有更大治疗价值的蛋白质)。
载体可以在粗流体组合物正在被收集的时间，或可选地在收集完成后但在首次进行DLD前被添加。在第二种可选方案中，DLD可以在添加载体前进行第一次。例如，如果黏附细胞具有小于临界尺寸的尺寸，粗流体组合物可以在载体被添加前被施加至设备，黏附细胞可以被回收，然后细胞可以被附着到一种或更多种载体以形成大于设备的临界尺寸的复合物，然后可以进行第二个DLD步骤并且可以收集载体黏附细胞复合物。
优选地，从由患者获得粗流体组合物完成的时间到黏附细胞首次与载体结合，历时不超过3小时(并且更优选地不超过2小时或1小时)。在另一个优选的实施方案中，从由患者获得粗流体组合物完成的时间到首次从设备收集黏附细胞或载体黏附细胞复合物，历时不超过4小时(并且优选地不超过3小时或2小时)。
以上描述的方法学可以用于将黏附靶细胞(例如黏附干细胞)与多于一个其他细胞分离。该方法包括：a)使包含黏附靶细胞和多于一个其他细胞的粗流体组合物与一种或更多种载体接触，其中黏附靶细胞至少部分地与所述一种或更多种载体以促进DLD分离的方式缔合并形成载体缔合的黏附靶细胞复合物，其中复合物包括相对于多于一个其他细胞增加的尺寸，并且其中载体缔合的黏附细胞复合物的尺寸优选地比临界尺寸大至少50％，并且其他未复合的细胞包括小于临界尺寸的尺寸：b)将包含载体缔合的黏附细胞复合物的粗流体组合物施加至设备，其中设备包括成行布置的障碍物的阵列，其中所述行相对于彼此侧向地偏移，其中所述行被配置成将大于或等于临界尺寸的细胞或复合物在第一方向上偏转，并将小于临界尺寸的细胞或复合物在第二方向上偏转；c)使包含载体缔合的黏附靶细胞复合物的粗流体组合物流过设备，其中复合物被障碍物在第一方向上偏转，并且未复合的细胞在第二方向上被偏转，从而将载体缔合的黏附细胞复合物与其他未复合的细胞分离；d)收集包含分离的载体缔合的黏附靶细胞复合物的流体组合物。
黏附靶细胞和一种或更多种载体之间形成的复合物的直径应该优选地比未复合的细胞大至少20％，并且优选地大至少50％，是未复合的细胞的至少两倍大或至少十倍大。这种尺寸上的增加可以是由于单个大的载体与黏附靶细胞的结合，或由于数个较小载体的结合。结合可以涉及使用：a)仅具有与黏附靶细胞的直径至少一样大(或在其他实施方案中，是黏附靶细胞的直径的至少两倍大或至少十倍大)的直径的载体：b)仅具有不超过黏附靶细胞的直径的50％(或在其他实施方案中，不超过25％或15％)大的直径的载体；或c)具有这些尺寸特征的大载体和小载体的混合物(例如，可以存在具有与黏附靶细胞的直径至少一样大(或是黏附靶细胞的直径的至少两倍或十倍大)的直径的一组载体，和具有不超过黏附靶细胞的直径的50％(或不超过25％或15％)大的直径的第二组载体)。通常，载体将具有1μm-1000μm(并通常在5μm-600μm或5μm-400μm的范围内)的直径。
载体可以由本领域已知的用于培养黏附细胞的任何材料制造，所述材料包含聚丙烯、聚苯乙烯、玻璃、明胶、胶原蛋白、多糖、塑料、丙烯酰胺和藻酸盐。它们可以是未包被的或用促进黏附和生长的材料(例如血清、胶原蛋白、蛋白质或聚合物)包被，并且可以具有附着在它们表面的剂(例如抗体、抗体片段、底物、活化剂或其他材料)。在一些实施方案中，稀释剂可以是生长培养基，步骤可以顺序地进行，并且在步骤(d)之后，可以进行缓冲液交换。
可以用上文描述的方法分离的特定的黏附细胞的实例包括：MRC-5细胞；HeLa细胞；Vero细胞；NIH 3T3细胞；L929细胞；Sf21细胞；Sf9细胞；A549细胞；A9细胞；AtT-20细胞；BALB/3T3细胞；BHK-21细胞；BHL-100细胞；BT细胞；Caco-2细胞；Chang细胞；Clone 9细胞；Clone M-3细胞；COS-1细胞；COS-3细胞；COS-7细胞；CRFK细胞；CV-1细胞；D-17细胞；Daudi细胞；GH1细胞；GH3细胞；HaK细胞；HCT-15细胞；HL-60细胞；HT-1080细胞；HEK细胞，HT-29细胞；HUVEC细胞；I-10细胞；IM-9细胞；JEG-2细胞；Jensen细胞；Jurkat细胞；K-562细胞；KB细胞；KG-1细胞；L2细胞；LLC-WRC 256细胞；McCoy细胞；MCF7细胞；WI-38细胞；WISH细胞；XC细胞；Y-1细胞；CHO细胞；Raw 264.7细胞；HEP G2细胞；BAE-1细胞；SH-SY5Y细胞及其任何衍生物。
与活化剂结合的细胞的分离
本发明还包括使用上文描述的程序纯化能够被活化的细胞的方法。在优选的实施方案中，本发明涉及通过以下将活化的细胞与多于一个其他细胞分离的方法：a)使包含能够被活化的细胞和多于一个其他细胞的粗流体组合物与一种或更多种载体以促进DLD分离的方式接触，其中一种或更多种载体包含细胞活化剂，其中一种或更多种载体与能够被细胞活化剂活化的细胞在接触时或接触后至少部分地缔合以生成载体缔合的细胞，其中细胞活化剂与能够被活化的细胞的缔合至少部分地活化能够被活化的细胞，其中载体缔合的细胞复合物包括相对于其他细胞增加的尺寸，并且其中载体缔合的细胞复合物的尺寸大于或等于临界尺寸，并且多于一个其他细胞中的细胞包括小于临界尺寸的尺寸：b)将粗流体组合物施加至设备，其中设备包括成行布置的障碍物阵列；其中所述行相对于彼此侧向地偏移，其中所述行被配置成将大于或等于临界尺寸的颗粒在第一方向上偏转，并且将小于临界尺寸的颗粒在第二方向上偏转；c)使样品流过设备，其中载体缔合的细胞复合物被障碍物在第一方向上偏转，并且多于一个其他细胞中的细胞在第二方向上被偏转，从而将活化的细胞与多于一个其他细胞分离。包含分离的载体缔合的细胞复合物的流体组合物然后可被收集。在此过程中，细胞可以任选地用核酸转染或转导，所述核酸被设计成赋予细胞期望的表型，例如以表达嵌合分子(优选地使细胞具有更大治疗价值的蛋白质)。
能够被活化的细胞可以选自由以下组成的组：T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞、粒细胞、先天淋巴细胞、巨核细胞、自然杀伤细胞、凝血细胞、滑膜细胞、β细胞、肝细胞、胰腺细胞；DE3溶原化的细胞、酵母细胞、植物细胞和干细胞。
细胞活化剂可选自由以下组成的组：抗体或抗体片段、CD3、CD28、抗原、辅助性T细胞、受体、细胞因子、糖蛋白及其任何组合。在其他实施方案中，活化剂可以是小化合物并且可以选自由胰岛素、IPTG、乳糖、异乳糖、脂质、糖苷、萜烯、类固醇、生物碱及其任何组合组成的组。
在优选的实施方案中，从患者收集作为包含能够被活化的细胞和多于一个其他细胞的粗流体组合物的一部分的能够被活化的细胞，其中从由患者获得粗流体组合物完成的时间到能够被活化的细胞与载体结合，应历时不超过4小时(并且优选地不超过3小时、2小时或1小时)。还优选的是，从由患者获得粗流体组合物完成的时间到步骤c)完成，历时不超过4小时。可选地，在细胞收集开始之前，该方法可以通过结合活化剂被改变。
优选地，在能够被活化的细胞和一种或更多种载体之间形成的复合物的直径应该比未复合的细胞大至少20％，并且更优选地大至少50％，是未复合的细胞的至少两倍大或至少十倍大。这种尺寸上的增加可能是由于单个大的载体与能够被活化的细胞的结合，或由于数个较小载体的结合。结合可以涉及使用：a)仅具有与能够被活化的细胞的直径至少一样大(或在其他实施方案中，是能够被活化的细胞的直径的至少两倍大或至少十倍大)的直径的载体；b)仅具有不超过能够被活化的细胞的直径的50％(或在其他实施方案中，不超过25％或15％)大的直径的载体；或c)具有这些尺寸特征的大载体和小载体的混合物(例如，可以存在具有与能够被活化的细胞的直径至少一样大(或是能够被活化的细胞的直径的至少两倍或十倍大)的直径的一组载体，和具有不超过能够被活化的细胞的直径的50％(或不超过25％或15％)大的直径的第二组载体)。通常，载体将具有1μm-1000μm(并通常在5μm-600μm或5μm-400μm的范围内)的直径。
将化合物与细胞分离
在另一个实施方案中，本发明包括从细胞去除化合物的方法，所述方法包括：(a)获得包含细胞和化合物的流体组合物，其中细胞具有大于化合物的预定尺寸的预定尺寸，并且其中细胞的预定尺寸大于或等于临界尺寸，并且化合物的预定尺寸小于临界尺寸；(b)将样品施加至设备，其中设备包括成行布置的障碍物的阵列，其中所述行相对于彼此侧向地偏移，其中所述行被配置成使大于或等于临界尺寸的颗粒在第一方向上偏转，并且使小于临界尺寸的颗粒在第二方向上偏转；和(c)使样品流过设备，在此期间，细胞被障碍物在第一方向上偏转，并且化合物可以在第二方向上被偏转，从而从细胞去除化合物。在一些实施方案中，该方法还可以包括在步骤(c)之后培养细胞或将细胞再循环到从其获得步骤a)的流体组合物的培养物。
化合物可以是毒性化合物，并且可以选自由以下组成的组：抗生素、抗真菌剂、毒性代谢物、叠氮化钠、金属离子、内毒素、增塑剂、杀虫剂及其任何组合。在其他实施方案中，化合物可以是废弃的化学组分(spent chemical component)。
分泌的细胞产物的连续纯化
本发明还包括连续纯化来自细胞的分泌的产物的方法，所述方法包括：(a)获得包含细胞的流体组合物(其可以是细胞培养组合物)，其中细胞悬浮在流体组合物中(或细胞与一种或更多种载体以促进DLD分离和形成载体-细胞复合物的方式结合)，并且其中细胞将分泌的产物分泌到流体组合物中，其中细胞(或载体-细胞复合物)具有大于分泌的产物的预定尺寸的预定尺寸，并且其中细胞(或载体-细胞复合物)的预定尺寸大于或等于临界尺寸，并且分泌的产物的预定尺寸小于临界尺寸；(b)将包含细胞(或载体-细胞复合物)的流体组合物施加至用于DLD的设备，其中设备包括成行布置的障碍物阵列；其中所述行相对于彼此侧向地偏移，其中所述行被配置成使大于或等于临界尺寸的颗粒在第一方向上偏转，并且使小于临界尺寸的颗粒在第二方向上偏转；(c)使包含细胞或载体-细胞复合物的流体组合物流过设备，其中细胞或载体-细胞复合物被障碍物在第一方向上偏转，并且分泌的产物在第二方向上被偏转，从而将分泌的产物与细胞分离；(d)收集分泌的产物，从而产生经纯化的分泌的产物的流体组合物；(e)收集包含分离的细胞或载体-细胞复合物的回收的流体组合物；(f)将细胞(或载体-细胞复合物)重新施加至流体组合物；和重复步骤(a)至(e)；从而连续纯化来自细胞的分泌的产物。
分泌的产物可以是蛋白质、抗体、生物燃料、聚合物、小分子及其任何组合，并且细胞可以是细菌细胞、藻类细胞、哺乳动物细胞和肿瘤细胞。在一个优选的实施方案中，分泌的产物是治疗上有价值的蛋白质、抗体、聚合物或小分子。此外，步骤a)的流体组合物可以从其中细胞在载体上生长的培养物获得。
微流体尺寸分离设备(Microfluidic Sizing Device)的使用
更广泛地，本发明涉及对靶细胞群工程化的方法，所述靶细胞群通过任何基于尺寸的微流体分离方法制备。基于尺寸分选细胞的差异可能是使用如本文讨论的碰撞阵列的结果或通过在分离期间控制流速或通过微流体设备本身的设计产生的惯性力的结果(参见US 9,895,694和US 9,610,582，其被通过引用以其整体并入本文)。可以只有单一分离程序被使用或者可以有多于一种分离程序被使用。例如，靶细胞可以使用一种微流体程序与较小的颗粒和细胞分离，并且使用第二种程序与较大的颗粒和细胞分离。
在靶细胞被分离后，它们被遗传工程化以具备期望的表型。这可以使用用于转染或转化细胞的标准重组方法学完成。例如，可以用载体转染细胞以表达重组表型。通过在遗传工程化之前避免离心，具有期望的特征的细胞应当增加至少20％。
优选的靶细胞是白细胞(特别是T细胞)或干细胞，并且优选的粗液体组合物是从患者获得的血液或单采血液成分术制备物。中心目标是将这些制备物中血小板与靶细胞的比率降低至少50％并且优选地降低至少80％或90％。靶细胞的分离应当在以下这样的条件下进行，所述条件使得获得其中血小板的总数目比起始单采血液成分术制备物中低至少70％(并且优选地至少90％)的产物。
在遗传工程化期间或之后，细胞在细胞培养时被扩增。使用上文描述的程序，培养14天后获得的T细胞的数目应当是其中使用离心分离细胞的程序的至少2倍(并且优选地至少5倍或10倍)。此外，培养物中的记忆T细胞相对于T细胞的总数目的百分比应当比其中T细胞通过离心被分离的程序高至少10％(并且优选地20％或30％)。
从单采血液成分术收集完成的时间到进行DLD的时间，应历时不超过1小时，并且从获得单采血液成分术样品完成的时间到靶细胞被分离并被遗传工程化，应历时不超过4小时。
在特别优选的实施方案中，上文描述的方法被用于产生CAR T细胞。这包括先通过单采血液成分术获得包含T细胞的粗流体组合物并然后在微流体设备上使用基于尺寸差异将T细胞与血小板分离的一种或更多种程序分离这些细胞。因此，应当获得富集了T细胞并去除了血小板的产物。在下一个步骤中，分离的T细胞被遗传工程化以在其表面上表达嵌合抗原受体(CAR)。这些细胞被培养以扩大其数目并然后被收集。T细胞在被遗传工程化之前的任何步骤不应被离心或淘析，并且在优选的实施方案中，使用微流体设备通过尺寸将用于遗传工程化的试剂与细胞分离。在另外的优选的实施方案中，T细胞通过被转移到用于向患者施用的药物组合物中而被收集。
T细胞在被收集或转移到药物组合物中之前不应当被冷冻，并且优选地至少90％的血小板被去除。在培养之前或期间，细胞可以被暴露于T细胞活化剂或载体。这可以有助于稳定细胞并且还可以促进基于尺寸的微流体分离。然而，应当注意，活化剂与载体都不一定需要与磁珠或颗粒结合。
与其中细胞通过离心被分离或浓缩的程序相比，通过微流体分离获得的CAR T细胞应当提前至少1天(并且优选地至少3天、5天或10天)可用于被患者使用。总体上，产生足够用于治疗的数目的CAR T细胞所需的时间应当比使用Ficoll离心分离细胞进行相同方法时短至少10％(并且优选地至少20％或30％)。这部分地是因为，通过使用基于尺寸的微流体分离，培养14天后获得的CAR T细胞的数目将通常是使用通过Ficoll离心获得的细胞的培养物中的数目的至少2倍(并且优选地4倍或8倍)。此外，当通过本方法制备的细胞被施用到患者时，它们应当表现出比通过离心从单采血液成分术组合物分离的细胞的衰老少至少10％。
本发明还包括通过施用治疗有效量的通过上文讨论的方法制备的细胞来治疗患者的疾病或状况。这包括对经工程化的白细胞或干细胞响应的任何疾病或状况，并且，至少在CAR T细胞的情况下，癌症在可以被治疗的疾病中。
附图简述
图1A-图1G：图1A-图1C举例说明了DLD的不同操作模式。操作模式包括：i)分离(图1A)、ii)缓冲液交换(图1B)和iii)浓缩(图1C)。在每个模式下，基本上高于临界直径的所有颗粒从进入点(point of entry)偏转到阵列方向上，致使尺寸选择、缓冲液交换或浓度随设备几何形状变化。在所有情况中，低于临界直径的颗粒在层流条件下直接通过设备，并且随后离开设备。图1D示出了在分离模式中使用的14道DLD设计。描绘的阵列和微通道的全长是75mm并且宽度是40mm，每个单独的道宽1.8mm。图1E-图1F是塑料的菱形柱阵列和用于出口的加固收集端口的放大视图。图1G描绘了使用原型设备在10PSI处理白细胞单采术产物的照片。
图2A-图2H：图2A是示出了在本研究中使用的正常供体血小板和WBC细胞计数的范围的散点图。WBC和血小板的平均计数分别是：162.4×106/mL和2718×103/μL(+)。异常样品(▲)堵塞了20μm预过滤器，并且被排除在数据集之外。示出了输入样品(图2C和图2D)。在10PSI通过14-道菱形柱DLD(图2E)或Ficoll-Hypaque(图2F)处理的代表性的24小时的正常供体白细胞单采术输入(图2B)和PBMC产物。来自相同的白细胞单采术供体(#37)的代表性DLD产物(图2G)和Ficoll(图2H)。输入(图2B、图2C、图2D)和产物级分(图2E和图2F)被固定在载玻片上并用CD41-FITC(血小板)加CD45-Alexa647(WBC)染色并用DAPI(核DNA)复染。
图3：这幅图涉及细胞活化在DLD对比Ficoll和直接磁体方法(Direct Magnetapproaches)中的一致性(CD4、CD8对比CD25，第8天)。细胞活化和表型谱示出了扩增期间向典型中央记忆T细胞相关表型的转换(第8天)。如之前描述的，对细胞进行计数和脱珠(de-beaded)。在每个时间点，将约100,000个细胞用CD3-BV421、CD45RA-BV605、CD95-FITC、CD279-PE、CD25-APC、CD4-Alexa 700和CD8-APC-Cy7染色，在黑暗中于室温孵育持续30分钟，并且用10体积的PBS洗涤，然后离心并在PBS中的1.0％多聚甲醛(Paraformaldehyde)中固定。样品在BD FACSAria上采集，并使用FlowLogic软件使用CD3和前向角和侧向角散射门限分析。
图4：图4是描绘了与Ficoll&直接磁体相比，通过DLD的样品的记忆细胞表型的快速增加和一致性活化的图。示出了测量向T细胞活化态的转化和通过CD45 RO状态的转化的CD45RA-、CD25+细胞的百分比的图。只因为实验被设计成解决初始扩增能力，细胞在第3天且再次在第8天被供给200单位IL-2/mL培养物。
图5A-图5C：这些图涉及来自DLD、Ficoll和直接磁体的CD3细胞的扩增倍数(×106)。按照Thermo-Fisher CTS方案，将DLD产物和Ficoll细胞的等分试样用1×107个T细胞/mL的T细胞密度用CD3/CD28珠孵育。使用约2.5个珠/T细胞的比，而对于直接磁体使用约5.0个珠/T细胞，将细胞和珠在旋转混合仪中孵育持续60分钟，然后进行磁性分离。被刺激的细胞或未被刺激的(未分离的PMBC)细胞在完全培养基(RPMI-1640+10％FBS+抗生素，不含IL-2)中被稀释到0.5×106/mL，并且在时间点特异性反应中被铺板，以避免在中间时间点对培养物的任何干扰。在第3天，根据制造商的建议，将200IU的IL-2/mL添加到被刺激和分离的组中。细胞计数在使用制造商的方案(移液(pipetting))脱珠后的第3、8、15天通过Coulter计数(Scepter)确定，并且通过在BD FACSCalibur上使用流式细胞术的基于珠的绝对计数验证细胞计数，所述流式细胞术使用具有关于CD45的荧光阈值的免洗涤方法(non-washapproach)，并用CD3-FITC、CD45-PerCP染色，并使用DNA染料DRAQ5以确保有效区分双联体(doublet)和仍然附着珠的任何细胞。计数方法之间的相关性是可接受的，斜率为0.95，R2＝0.944。在第6天和第9天，向培养物中添加培养基以将细胞密度保持在可接受的范围内(<3.0×106/mL)。由于污染，损失了供体21第15天的数据点。平均值或％CV以所示水平条示出(图5A)。图5B示出了T中央记忆细胞的百分比(第15天)，并且图5C示出了T中央记忆细胞的数目(第15天)。
图6A-图6B：图6A-图6B涉及T中央记忆细胞的细胞术分析和产生的中央记忆细胞的数量。图6A：T中央记忆细胞：CD3+T细胞通过单重门限(singlet gate)门控，随后是CD3 v侧向角散射和使用CD45RO、CCR7、CD28和CD95的4参数门限的中央记忆表型分型(phenotyping)以界定中央记忆群。该群被再度门控(back gated)以显示作为T细胞的级分的中央记忆细胞，中央记忆细胞在彩图中为红色。彩图中非红色的细胞代表所有非中央记忆T细胞。图6B：表型转化和关键度量(Key Metrics)(第15天)：关键度量示出了中央记忆细胞数量>50％的供体的数目，以及平均值和与中央记忆扩增相关的％CV。
图7：图7是示出了通用的单个芯片(current individual chips)如何被设计成可堆叠为层，以实现使用已建立的制造方法的任何具体应用需要的通量的示意图。由于系统被发展，规划了注射成型的层。
图8A-图8C：这些是示出了通过DLD浓缩WBC的补充图。图8A：来源于全血的DLD产物：使全血通过第一个DLD以去除红细胞。被设计成实现浓缩系数12的第二个串联的浓缩DLD与分离DLD的产物输出连接。将等体积的产物和废弃物添加到具有相等数量的绝对计数的珠的管，并通过流式细胞术分析。计算与输入材料相比的关于废弃物(图8B)和关于浓缩物(图8C)的所得相对细胞:珠比，以确定浓缩倍数。将白细胞用CD45PerCP和1mM DRAQ5染色，这被用作荧光阈值以采集珠和白细胞二者。采集了5000个珠事件。(所有试剂来自eBioscience)。设计的浓缩系数：12.0×；观察的相对浓缩系数：15.714/1.302＝12.07×。
图9：图9是通过DLD或Ficoll方法纯化的未被刺激的CD3+T细胞上CD25和CD4的表达的补充图(第8天)。如在图3中描述的准备细胞并进行分析。平均CD4+25+：Ficoll：20.25％；DLD：8％。
图10：这是关于IL-2扩增的中央记忆T细胞按主要子集分配的补充图。在原始图中：CD8(绿色)、CD4(蓝色)、CD4+CD8+(红色)中央记忆细胞被顺序性门控：CD3+、CD45RO+CCR7+、CD28+CD95+。由IL2驱动的CD4子集的相对丰度是明显的。
图11：图11是描绘了估计用IL-2扩增后的中央记忆T细胞数目的补充图，假设在本研究中的产率和通常的白细胞单采术收获物来自具有50×106个WBC细胞/mL和在250mL中包含50％ CD3淋巴细胞的供体。
图12：图12举例说明了原则上可以用于产生CAR T细胞和将细胞施用至患者的方案。该方案被包括以对比本文讨论的其他程序，并且不代表实际进行的工作。
图13：图13举例说明了用于产生CAR T细胞的建议的方案，该方案在程序的初始步骤方面与图12的方案不同。出于比较的目的，包括了该图中央部分的步骤。该图意图举例说明创新性思想，并不代表实际进行的工作。
图14：图14举例说明了用于生产CAR T细胞的第二个建议的方案，该方案在程序的初始步骤方面与图12的方案不同。出于比较的目的，包括了该图中央部分的步骤。与图12和图13一样，该图意图举例说明创新性思想，并不代表实际进行的工作。
图15：图15示出了用于从废弃的(spent)细胞中取出分泌的产物的设备的示意图。
图16：图16示出了用于从活跃生长的细胞中连续取出毒性化合物的设备的示意图。
图17：图17示出了用于从活跃生长的细胞中连续取出毒性化合物的设备的示意图，添加载体的选择在每次迭代(iteration)之间。
图18A和18B：图18A示出了具有向下偏移(downshift)的障碍物镜像阵列的实例。中央通道位于在左侧和在右侧的障碍物阵列之间。中央通道可以是针对至少临界尺寸的颗粒的收集通道(即，至少临界尺寸的颗粒可以被阵列偏转到中央通道，而小于临界尺寸的颗粒可以与主体流(bulk flow)一起通过该通道)。通过将行向下偏移，可以实现通道相对于具有向下偏移的镜像阵列的宽度的变化。向下偏移的量可以基于障碍物的尺寸和/或横截面形状变化。图18B举例说明了无向下偏移的障碍物的镜像阵列。在左侧的阵列和在右侧的阵列可以将至少临界尺寸的颗粒偏转到中央通道。
图19A和图19B：这些图示出了使用DLD处理的单采血液成分术样品中剩余的血小板(图19A)和使用Ficoll离心处理的单采血液成分术样品中剩余的血小板(图19B)。血小板是更小、更亮的细胞(其中一些通过箭头示出)，而白细胞是更大、更暗的细胞。可以观察到，在通过DLD处理的细胞中，血小板的相对数目实质上更低。
图20：图20以图示方式示出了使用三种不同的缓冲液通过Ficoll离心处理的单采血液成分术样品中剩余的血小板的百分比(白色柱)和通过DLD处理的单采血液成分术样品中剩余的血小板的百分比(条纹柱)。X轴是剩余的血小板的百分比。该图的最左侧示出了对于1％ BSA/PBS缓冲液的结果；对于包含F127泊洛沙姆嵌入剂的缓冲液的百分比在中间，并且对于淘析缓冲液的百分比在最右侧。
图21：图21示出了图22的结果，不同之处是Y轴表示每个白细胞的血小板的数目，即血小板与白细胞的比率。具有三条纹的柱表示存在于初始单采血液成分术样品中的比率，白色柱是通过Ficoll离心处理后的比率，并且具有宽间隔的单条纹的柱是通过DLD处理后的比率。
图22：图22是柱状图，其示出了作为通过Ficoll离心(实心白色柱)和DLD(与白色柱相邻的具有单条纹的柱)处理单采血液成分术样品的结果发生的T细胞扩增。从左至右移动，这些柱示出了将10％(具有双条纹的柱)、50％(点状柱)和100％(与点状柱相邻的具有深色宽间隔柱的柱)的最初存在于单采血液成分术的起始材料中的血小板加回到扩增之前的DLD处理的细胞的效果。该图的左侧描绘了在不具有EDTA的情况下通过DLD处理并且然后在第0天用CD3/CD28刺激的细胞，在第3天、第7天和第14天对CD3阳性细胞进行计数。该图的右侧示出了用2mM EDTA处理并且然后在第0天用CD3/CD28刺激的细胞，在第3天、第7天和第14天对CD3阳性细胞进行计数。
图23：图23是对使用三种处理方法获得的T细胞进行扩增的可变性的比较：单独使用磁珠的分离(该图最左侧的柱)、使用Ficoll离心随后是磁珠的分离(中间的柱)和通过DLD随后磁珠的分离(最右侧的柱)。
图24：图24示出了存在于图23的扩增的T细胞群中的为中央记忆T细胞的细胞的百分比。
工作流程图的概述：图25-32全部被包括以举例说明构思而不考虑实际进行的任何实验。这些图图示了从患者获得细胞时通常涉及的基本工作流程，所述细胞然后被处理并且在治疗上使用，通常治疗从这些细胞被从其获得的同一患者。所述图在很大程度上具体涉及CAR T细胞的制造，但将理解的是，该方法通常可以适用于制造用于治疗目的的白细胞和其他细胞。在许多这样的方法，包括用于CAR T细胞的那些方法的情况下，从患者收集的细胞被重组工程化以表达治疗感兴趣的基因。任何类型的此类工程化可以是所图示的方法的一部分。这些图将步骤分为在诊所进行的那些步骤和在不同的场所进行的那些步骤，出于说明的目的所述不同的场所被称为“制造场所”。图25示出了可以被预期用于例如制造CAR T细胞的经典方法的工作流程。细胞的转化将通常在冻存的样品被解冻、洗涤、去除和富集后在制造场所发生。图26示出了原型CAR T细胞方法中可以使用DLD的若干处(点状框)，同时维持相同的基本工作流程。然后，图27-32展示了可以如何使用DLD修改工作流程和改进原型方法的一些说明性实例。主要目标是产生更好的总体质量的细胞，缩短获得足以治疗患者的数目的细胞所需的时间，并且使目前劳动强度更大的步骤自动化。
图25：图25图示了目前用于处理来自患者的用于治疗用途的细胞的方法中通常涉及的基本工作流程。如图示的，该方法从收集细胞(“单采血液成分术收集”)的诊所开始，行进到细胞被扩增并且可以被工程化的制造场所，并且回到将细胞施用到患者(“再输注”)的诊所结束。
图26：图26示出了CAR T工作流程中可以使用DLD的若干个步骤(点状框)。在该实例中，基本工作流保持基本不变。
图27：图27图示了可以在单采血液成分术后立即使用DLD以在冷冻之前清理细胞(点状框)。在该点使用DLD的优点为，它在运送前去除细胞中的血小板并且从而消除来自血小板活化、凝块形成、任何储存相关的脱粒和细胞的总体损失的有害影响。通过这种方式，DLD改善了被运送的细胞组合物的质量，并且用自动化的对应步骤替换了该方法中的一个人工步骤。
图28：在这种情况中，在细胞被清理、活化、DLD分离和转移到期望的培养基例如生长培养基的早期步骤(点状框)期间使用DLD。重要的是，避免了在诊所的冷冻和冻存以及随后在制造场所的解冻，这应当将完成该方法所需的时间减少了例如约2-3天。尽管不是优选的，但如果期望的话，仍然可以进行冻存步骤。可以避免的其他步骤通过划线的文字指示。
图29：在这种情况下，DLD与磁珠结合使用，所述磁珠与T细胞上的细胞表面CD3结合。这种情况具有上文描述的减少血小板的相同优点，但可以用于活化细胞并且使细胞比原型程序中早得多地开始生长。细胞还可以在与生长相适应的温暖温度运送。因此，消除了在制造场所进行的对应步骤并且相应地减少了总体处理时间。
图30：图30中示出的情况与图29中的情况相比最重要的区别是细胞在暴露于活化剂后立即用病毒遗传转化(参见点状框)。细胞在单采血液成分术收集完成后24小时内被纯化、活化、转化并且在培养基中生长，而不是在活化和转化前历时若干天。优选地，从单采血液成分术完成到暴露于载体的时间应当不超过12小时，并且更优选地，不超过6小时或3小时。最优选地，暴露将发生在单采血液成分术完成后两小时内，并且在所有情况中，发生在细胞冷冻之前。该图示出了可以被消除的在制造场所的许多处理步骤，并且预期获得足够用于治疗患者的细胞所需的时间将减少至少3天或4天。
图31：图31中示出的情况与图30中的情况相似，不同之处是在早期步骤中增加了通过亲和程序的分离(通过识别包含CD3的细胞的磁珠例示)以帮助分离T细胞。DLD还被用于纯化和/或浓缩细胞。
图32：在图32中示出的情况中，通过单采血液成分术收集的T细胞被纯化、工程化、扩增和浓缩以用于再输注，不曾进行其中细胞被冷冻的步骤。如果期望的话，所有步骤都可以在收集细胞的场所进行，而不需要运送。
定义
单采血液成分术：如本文使用的，该术语是指其中来自患者或供体的血液被分离为其组分，例如血浆、白细胞和红细胞的程序。更具体的术语是“血小板单采术(plateletpheresis)”(指血小板的分离)和“白细胞单采术”(指白细胞的分离)。在本文中，术语“分离”是指获得与全血相比富集特定组分的产物，并且不意指已经达到绝对纯度。
CAR T细胞：术语“CAR”是“嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor)”的首字母缩略词。因此，“CAR T细胞”是已经被遗传工程化以表达嵌合受体的T细胞。
CAR T细胞疗法：此术语是指其中用CAR T细胞治疗疾病的任何程序。可以被治疗的疾病包括血液和实体瘤癌症、自身免疫疾病和传染病。
载体：如本文使用的，术语“载体”是指由生物材料或合成材料制造的剂，例如珠或颗粒，所述剂为了直接或间接(即，通过一种或更多种中间细胞、颗粒或化合物)结合存在的一些或所有化合物或细胞的目的被添加到制备物中。载体可以由多种不同的材料制造，包括DEAE-葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、胶原蛋白和藻酸盐，并且将通常具有1μm-1000μm的尺寸。载体可以被包被或未包被，并且具有被修饰以包含识别细胞表面上的抗原或其他分子的亲和剂(例如，抗体、活化剂、半抗原、适体、颗粒或其他化合物)的表面。载体还可以被磁化，并且这可以提供补充DLD的另外的纯化手段，并且载体可以包含赋予细胞或细胞复合物非尺寸相关的次要性质的颗粒(例如，Janus或草莓样颗粒)。例如，颗粒可以引起可以在下游过程中使用的化学、电化学或磁性性质，诸如磁分离、电穿孔、基因转移和/或具体的分析化学过程。颗粒还可以引起细胞中的代谢变化、活化细胞或促进细胞分裂。
“以促进DLD分离的方式”结合的载体：该术语是指载体和结合载体的方法，根据上下文，所述载体影响细胞、蛋白质或颗粒在DLD期间的行为。具体地，“以促进DLD分离的方式结合”意指：a)结合必须表现出对特定靶细胞类型、蛋白质或颗粒的特异性；和b)必须产生这样的复合物，其提供了相对于未结合的细胞、蛋白质或颗粒的复合物尺寸增加。在结合靶细胞的情况中，必须存在至少2μm的增加(并且可选地当以百分比表示时，至少20％、50％、100％、200％、500％或1000％的增加)。在治疗或其他用途需要靶细胞、蛋白质或其他颗粒从复合物中被释放以实现其预期用途的情况中，那么术语“以促进DLD分离的方式”还需要复合物允许这样的释放，例如通过化学裂解或酶裂解、化学溶解、消化、由于与其他结合剂的竞争或通过物理剪切(例如使用移液管以产生剪切应力)，并且被释放的靶细胞、蛋白质或其他颗粒必须保持活性；例如，从复合物释放后的治疗细胞必须仍然保持使它们在治疗上有用的生物活性。
载体也可以“以补充DLD分离的方式”结合：该术语是指载体和结合载体的方法，所述载体改变细胞或细胞复合物的化学、电化学或磁性性质或改变细胞的一种或更多种生物活性，不管它们是否充分地增加尺寸来促进DLD分离。补充DLD分离的载体也不必然地特异性地结合靶细胞，即所述载体可能必须与使载体变得特异性的一些其他剂组合，或所述载体可以简单地被添加到细胞制备中并被允许非特异性地结合。术语“以补充DLD分离的方式”和“以促进DLD分离的方式”是不相互排斥的。结合可以既补充DLD分离又促进DLD分离。例如，多糖载体可以在其表面上具有增加细胞生长速率的活化剂，并且这些载体中的一个或更多个载体的结合也可以促进DLD分离。可选地，结合可以仅促进DLD分离，或者仅补充DLD分离。
靶细胞：如本文使用的，“靶细胞”是本文描述的各种程序需要或被设计以纯化、收集、工程化等的细胞。具体的细胞是什么将取决于使用该术语的上下文。例如，如果程序的目标是分离特定种类的干细胞，则该细胞将是该程序的靶细胞。
分离、纯化：除非另外指明，否则如本文使用的这些术语是同义的，并且是指相对于不期望的材料富集期望的产物。这些术语不一定意指产物是完全分离的或完全纯的。例如，如果起始样品具有的靶细胞构成样品中的细胞的2％，并且进行了产生其中靶细胞是存在的细胞的60％的组合物的程序，则该程序将已经成功地分离或纯化靶细胞。
碰撞阵列(bump array)：术语“碰撞阵列”和“障碍物阵列”在本文中被同义地使用，并且描述了布置在含细胞或颗粒的流体可以通过的流体通道(flow channel)中的障碍物的有序阵列。
确定性侧向位移：如本文使用的，术语“确定性侧向位移”或“DLD”是指，其中基于颗粒的尺寸(与一些阵列参数相关)，颗粒在通过阵列的路径上被确定性地偏转的方法。该方法可以用于分离细胞，这通常是本文讨论的背景(context)。然而，认识到DLD也可以用于浓缩细胞和用于缓冲液交换是重要的。通常，方法在本文关于连续流(DC条件；即，主体流体只在单一方向上流动)描述。然而，DLD也可以在振荡流(AC条件；即，主体流体在两个方向之间交替流动)下工作。
临界尺寸：通过障碍物阵列的颗粒的“临界尺寸”或“预定尺寸”描述了能够跟随流体的层流的颗粒的尺寸限值。大于临界尺寸的颗粒可以从流体的流动路径被“碰撞”出来，而具有低于临界尺寸(或预定尺寸)的尺寸的颗粒将不一定如此移位。当通过间隙的流体流的分布(profile)关于在主体流体流动方向上平分该间隙的平面对称时，该间隙两侧的临界尺寸可以是相同的；然而，当分布是非对称的时，该间隙两侧的临界尺寸可以不同。
流体流动：如本文结合DLD使用的，术语“流体流动”和“主体流体流动”是指流体在总体方向上跨障碍物阵列的宏观移动。这些术语不考虑流体的流体流在障碍物周围移动以便该流体继续在总体方向上移动的暂时性位移。
倾斜角ε：在碰撞阵列设备中，倾斜角是主体流体流动方向和由阵列中成行的顺序性障碍物(在主体流体流动方向上)的对准限定的方向之间的角度。
阵列方向：在碰撞阵列设备中，“阵列方向”是通过阵列中成行的顺序性障碍物的对准限定的方向。如果颗粒在通过间隙并且遇到下游障碍物时，颗粒的总体轨迹遵循碰撞阵列的阵列方向(即，相对于主体流体流动成倾斜角ε行进)，则颗粒在碰撞阵列中被“碰撞”。在这些情况下，如果颗粒的总体轨迹遵循主体流体流动方向，则颗粒不被碰撞。
发明详述
本发明主要涉及DLD在制备具有治疗价值的细胞中的用途。下面的文本提供了关于本文公开的方法的指导和可以帮助制造和使用在进行这些方法中涉及的设备的信息。
I.设计微流体板
细胞，特别是通过单采血液成分术或白细胞单采术制备的组合物中的细胞，可以通过使用微流体设备进行DLD来分离，所述微流体设备包括流体从设备的一端处的入口流到相对端处的出口的通道。基于尺寸的微流体分离的基本原理和用于分离细胞的障碍物阵列的设计已经在别处提供(参见US2014/0342375、US2016/0139012；7,318,902和US 7,150,812，这些文件以其整体并入本文)，并且也在下面的部分中进行了概述。
在DLD期间，将包含细胞的流体样品从入口引入到设备中，并且与流过设备的流体一起输送到出口。当样品中的细胞穿过设备时，它们遇到已经成行布置并且形成细胞必须通过的间隙或孔隙的柱或其他障碍物。障碍物的每一个连续的行相对于前一行移位，以便形成与流动通道中流体流动方向不同的阵列方向。由这两个方向限定的“倾斜角”，与障碍物之间的间隙的宽度、障碍物的形状和形成间隙的障碍物的朝向一起，是确定阵列的“临界尺寸”的主要因素。具有大于临界尺寸的尺寸的细胞在阵列方向上行进，而不在主体流体流动方向上行进，并且具有小于临界尺寸的尺寸的颗粒在主体流体流动方向上行进。在用于白细胞单采术来源的组合物的设备中，可以选择引起白细胞在阵列方向上转向，而红细胞和血小板继续处于主体流体流动方向的阵列特征。然后，为了将所选择类型的白细胞与具有相似尺寸的其他白细胞分离，可以使用以促进DLD分离和从而引起大于未复合的白细胞的复合物的方式与细胞结合的载体。然后可以在具有小于复合物但大于未复合的细胞的临界尺寸的设备上进行分离。
在设备中使用的障碍物可以采用圆柱形或是三角形、正方形、矩形、菱形、梯形、六边形或泪珠形的形状。此外，相邻的障碍物可以具有几何形状，使得限定间隙的障碍物的部分关于在主体流体流动方向上延伸的间隙的轴线是对称的或非对称的。
II.制造和操作微流体设备
用于制造和使用能够基于尺寸分离细胞的微流体设备的一般程序是本领域众所周知的。这样的设备包括US 5,837,115；US 7,150,812；US 6,685,841；US 7,318,902；7,472,794；和US 7,735,652中描述的那些设备；所有文献通过引用以其整体并入本文。提供可以有助于制造和使用本发明的设备的指导的其他参考文献包括：US 5,427,663；US 7,276,170；US 6,913,697；US 7,988,840；US 8,021,614；US 8,282,799；US 8,304,230；US8,579,117；US2006/0134599；US2007/0160503；US20050282293；US 2006/0121624；US2005/0266433；US2007/0026381；US2007/0026414；US 2007/0026417；US2007/0026415；US2007/0026413；US2007/0099207；US 2007/0196820；US2007/0059680；US2007/0059718；US2007/005916；US 2007/0059774；US2007/0059781；US2007/0059719；US2006/0223178；US 2008/0124721；US2008/0090239；US2008/0113358；以及WO2012094642，所有文献也通过引用以其整体并入本文。在描述制造和使用设备的各种参考文献中，US 7,150,812提供了特别好的指导，并且7,735,652关于用于在具有血液中发现的细胞的样品上进行分离的微流体设备特别令人感兴趣(关于这一点，也见US2007/0160503)。
设备可以使用来自通常地制造微米级和纳米级流体处理设备的任何材料制造，所述材料包括硅、玻璃、塑料和杂化材料(hybrid material)。适用于微流体制造的多种热塑性材料是可用的，提供了可以是杠杆式的(leveraged)并且针对具体应用定制的机械和化学性质的广泛选择。
制造设备的技术包括复制压模(Replica molding)、用PDMS的软光刻术、热固性聚酯、模压(embossing)、注塑成型、激光烧蚀及其组合。另外的细节可以在Fiorini等人的“Disposable microfluidic devices:fabrication,function and application”(BioTechniques 38:429-446(2005年3月))中找到，该文献在此通过引用以其整体并入本文。由Keith E.Herold和Avraham Rasooly编辑的书“Lab on a Chip Technology”，Caister Academic Press Norfolk UK(2009)是制造方法的另一个来源，并且在此通过引用以其整体并入本文。
热塑性塑料的高通量模压方法，诸如卷到卷(reel-to-reel)加工是用于工业微流体芯片生产的吸引人的方法。使用单芯片热模压可以是在原型设计阶段期间用于实现高质量微流体设备的费用低廉(cost-effective)的技术。在两种热塑性塑料，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和/或聚碳酸酯(PC)中复制微米级特征(microscale feature)的方法在Yang等人的“Microfluidic device fabrication by thermoplastic hot-embossing”(MethodsMol.Biol.949:115-23(2013))中描述，该文献在此通过引用以其整体并入本文。
流动通道可以使用两个或更多个部件(piece)来构造，当部件被组装后，形成具有布置在其中的障碍物的封闭腔室(优选地具有用于添加或排出流体的穴(orifice)的腔室)。障碍物可以在被组装以形成流动通道的一个或更多个部件上制造，或者障碍物可以被制造成以插入件的形式，该插入件被夹在限定流动通道的边界的两个或更多个部件之间。
障碍物可以是跨流动通道延伸的实心体，在一些情况中，从流动通道的一面延伸到流动通道的相对面。在障碍物在障碍物的一端与流动通道的一面成一体(或是流动通道的延伸)时，障碍物的另一端可以被密封到或按压在流动通道的相对面。在障碍物的一端和流动通道的面之间的小空间(优选地小到不能容纳对预期用途而言是感兴趣的任何颗粒)是可容许的，条件是该空间不会不利地影响障碍物的结构稳定性或设备的相关流动性质。
存在的障碍物的数目应该足以实现阵列的颗粒分离性质。通常，障碍物可以成行和成列地组织(注意：术语“行和列”的使用并不意指或暗示行和列彼此垂直)。在跨过(transverse)流动通道中流体流动的方向上大致对准的障碍物可以被称为成列的障碍物。在列中彼此相邻的障碍物可以限定流体流过的间隙。
相邻列中的障碍物可以以一定角度彼此偏移，该角度以被称为ε(epsilon)的倾斜角为特征。因此，对于彼此相邻的一些列(即，由大致跨过列的单一方向的流体流动连续通过的几个列的障碍物)，列中对应的障碍物可以彼此偏移，使得对应的障碍物形成相对于流过列的流体流动方向成角度ε延伸的一行障碍物。可以选择倾斜角并且可以使列彼此间隔开，使得1/ε(当以弧度表示时)是整数，并且障碍物的列周期性重复。在单一列中的障碍物也可以彼此偏移相同或不同的倾斜角。举例来说，行和列可以被布置成相对于彼此成90度的角度，行和列二者相对于流过流动通道的主体流体流动方向以相同的角度ε倾斜。
表面可以被包被以改变它们的性质，并且用于制造设备的聚合材料可以以多种方式改性。在一些情况中，天然聚合物中的或通过湿化学或等离子体处理(plasmatreatment)的手段添加的官能团(诸如胺或羧酸)被用于交联蛋白质或其他分子。DNA可以使用表面胺基团附接到COC和PMMA基底。表面活性剂诸如可以通过将/>添加到PDMS制剂中，用于使表面亲水和排斥蛋白质。在一些情况中，将PMMA层旋涂在设备例如微流体芯片上，并且用羟丙基纤维素“掺入”PMMA以改变其接触角。
为了降低细胞或化合物(例如通过裂解的细胞释放的或在生物样品中发现的)在通道壁上的非特异性吸附，一个或更多个壁可以被化学改性为非黏附性的或排斥性的。壁可以用商业的非粘试剂(诸如用于形成水凝胶的那些)的薄膜涂层(例如，单层)包被。可以用于改性通道壁的化学品种类的另外的实例包括寡聚乙二醇、氟化聚合物、有机硅烷、硫醇、聚乙二醇、透明质酸、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、粘蛋白、聚HEMA、甲基丙烯酸酯化的PEG和琼脂糖。也可以使用带电荷的聚合物以排斥带相反电荷的种类。用于排斥的化学品种类的类型和附着到通道壁的方法可以取决于被排斥种类的性质以及壁和被附着的种类的性质。这样的表面改性技术是本领域众所周知的。可以在设备组装之前或之后使壁官能化。
III.CAR T细胞
用于制造和使用CAR T细胞的方法是本领域周知的。程序已经在例如US 9,629,877；US 9,328,156；US 8,906,682；US2017/0224789；US 2017/0166866；US2017/0137515；US2016/0361360；US2016/0081314；US 2015/0299317；和US2015/0024482中描述，这些文献中的每一篇通过引用以其整体并入本文。
IV.使用DLD的分离方法
本文描述的DLD设备可以用于纯化细胞、细胞片段、细胞加合物或核酸。如本文讨论的，这些设备还可以用于将感兴趣的细胞群与多于一个其他细胞分离。使用设备分离和纯化血液组分可以在例如美国公布第US2016/0139012号中找到，该文献的教导通过引用以其整体并入本文。下面提供几个说明性的分离的简要讨论。
A.存活细胞
在一个实施方案中，设备在被设计成将存活细胞与非存活细胞分离的程序中使用。术语“存活细胞”是指能够生长、活跃地分裂、能够增殖等的细胞。在存活细胞具有大于非存活细胞的尺寸的实例中，DLD设备可以被设计成包括大于非存活细胞的预定尺寸且小于存活细胞的预定尺寸的临界尺寸。临界尺寸可以小至比非存活细胞的预定尺寸大(或小)1.1倍，但通常更大的程度(或更小)是优选的，例如约1.2倍-2倍，并且优选地3倍-10倍。
B.黏附细胞
在另一个实施方案中，DLD设备可以在分离黏附细胞的程序中使用。如本文使用的，术语“黏附细胞”是指能够黏附至表面的细胞。黏附细胞包括细胞培养中使用的永生化细胞，并且可以来源于哺乳动物宿主。在一些实例中，黏附细胞可以在纯化之前被胰蛋白酶化。黏附细胞的实例包括MRC-5细胞；HeLa细胞；Vero细胞；NIH 3T3细胞；L929细胞；Sf21细胞；Sf9细胞；A549细胞；A9细胞；AtT-20细胞；BALB/3T3细胞；BHK-21细胞；BHL-100细胞；BT细胞；Caco-2细胞；Chang细胞；Clone 9细胞；Clone M-3细胞；COS-1细胞；COS-3细胞；COS-7细胞；CRFK细胞；CV-1细胞；D-17细胞；Daudi细胞；GH1细胞；GH3细胞；HaK细胞；HCT-15细胞；HL-60细胞；HT-1080细胞；HT-29细胞；HUVEC细胞；I-10细胞；IM-9细胞；JEG-2细胞；Jensen细胞；Jurkat细胞；K-562细胞；KB细胞；KG-1细胞；L2细胞；LLC-WRC 256细胞；McCoy细胞；MCF7细胞；WI-38细胞；WISH细胞；XC细胞；Y-1细胞；CHO细胞；Raw 264.7；BHK-21细胞；包括293A、293T和类似细胞的HEK293细胞；HEP G2细胞；BAE-1细胞；SH-SY5Y细胞；及其任何衍生物以包括工程化和重组株系。
在一些实施方案中，程序可以包括从诸如生长培养基的稀释物中分离细胞，这可以提供对黏附细胞的培养物的有效保持。例如，在生长培养基中的黏附细胞的培养物可以被交换到包含转染试剂的转染培养基中，到被设计成在黏附细胞中引发变化(诸如干细胞分化)的第二生长培养基中，或到被设计成从培养物去除化合物的顺序性洗涤缓冲液中。
在特别优选的程序中，通过与以促进DLD分离的方式结合的一种或更多种载体缔合来纯化黏附细胞。载体可以是本文描述的类型，并且结合可以稳定和/或活化细胞。通常，载体将在1μm-1000μm范围内，但有时也可以在此范围之外。
载体和细胞之间的缔合应该产生尺寸相对于未与载体缔合的其他材料增加的复合物。取决于细胞和载体的具体尺寸和存在的细胞和载体的数量，复合物可以是从比未复合的细胞大几个百分点至比未复合的细胞的尺寸大许多倍的任何尺寸。为了促进分离，增加至少20％是期望的，更高的百分比(50；100；1000或更高)是优选的。
C.活化的细胞
DLD设备也可以在程序中使用，用于将活化的细胞或能够被活化的细胞与多于一个其他细胞分离。经历活化的细胞可以大规模生长，但是在优选的实施方案中，细胞来源于单个患者并且DLD在收集后至少几个小时内进行。术语“活化的细胞”或“能够被活化的细胞”是指已经或能够分别通过与细胞活化剂缔合、孵育或接触而被活化的细胞。能够被活化的细胞的实例可以包括在免疫或炎性应答中起作用的细胞，诸如：T细胞、B细胞；调节T细胞、巨噬细胞、树突细胞、粒细胞、先天淋巴细胞、巨核细胞、自然杀伤细胞、凝血细胞、滑膜细胞和类似细胞；在新陈代谢中起作用的细胞，诸如β细胞、肝细胞和胰腺细胞；以及能够诱导蛋白质表达的重组细胞，诸如DE3溶原化的大肠杆菌(E.coli)细胞、酵母细胞、植物细胞等。
通常，一种或更多种载体将在其表面上具有活化剂。细胞活化剂的实例包括蛋白质、抗体、细胞因子、CD3、CD28、针对特定蛋白质的抗原、辅助性T细胞、受体和糖蛋白；激素，诸如胰岛素、胰高血糖素等；IPTG、乳糖、异乳糖、脂质、糖苷、萜类、类固醇和生物碱。可活化细胞应该通过可活化的细胞和载体表面上的细胞活化剂之间的相互作用至少部分地与载体缔合。形成的复合物可以只比未复合的细胞大几个百分点，或者是未复合的细胞尺寸的许多倍。为了促进分离，至少20％的增加是期望的，更高的百分比(40、50、100、1000或更高)是优选的。
D.将细胞与毒性物质分离
DLD还可以在被设计成去除可能对细胞具有毒性的化合物或保持细胞免受毒性化合物的污染的纯化中使用。实例包括抗生素、低温保存剂、抗真菌剂、毒性代谢物、叠氮化钠、金属离子、金属离子螯合剂、内毒素、增塑剂、杀虫剂及其任何组合。设备可以用于从细胞去除毒性化合物，以确保来自细胞的物质的连续产生。在一些实例中，细胞可以是对数期细胞。术语“对数期细胞”是指处于以指数对数生长为特征的生长阶段的活跃分裂的细胞。在对数期，细胞群可以以恒定的速率加倍，使得绘制细胞数的自然对数相对于时间的曲线产生一条直线。
分离毒性物质的能力对多种细胞可能是重要的，所述多种细胞包括：细菌菌株诸如BL21、Tuner、Origami、Origami B、Rosetta、C41、C43、DH5α、DH10β或XL1Blue；酵母菌株诸如酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)和亚罗酵母属(Yarrowia)的酵母菌株；藻类；和哺乳动物细胞培养物，包括MRC-5细胞；HeLa细胞；Vero细胞；NIH 3T3细胞；L929细胞；Sf21细胞；Sf9细胞；A549细胞；A9细胞；AtT-20细胞；BALB/3T3细胞；BHK-21细胞；BHL-100细胞；BT细胞；Caco-2细胞；Chang细胞；Clone 9细胞；Clone M-3细胞；COS-1细胞；COS-3细胞；COS-7细胞；CRFK细胞；CV-1细胞；D-17细胞；Daudi细胞；GH1细胞；GH3细胞；HaK细胞；HCT-15细胞；HL-60细胞；HT-1080细胞；HT-29细胞；HUVEC细胞；I-10细胞；IM-9细胞；JEG-2细胞；Jensen细胞；Jurkat细胞；K-562细胞；KB细胞；KG-1细胞；L2细胞；LLC-WRC 256细胞；McCoy细胞；MCF7细胞；WI-38细胞；WISH细胞；XC细胞；Y-1细胞；CHO细胞；Raw 264.7；BHK-21细胞；包括293A、293T和类似细胞的HEK 293细胞；HEP G2细胞；BAE-1细胞；SH-SY5Y细胞；干细胞及其包括工程化和重组细胞株的任何衍生物的培养物。
E.纯化从细胞分泌的物质
DLD设备也可以在纯化从细胞分泌的物质中使用。这种分泌的物质的实例包括蛋白质、肽、酶、抗体、燃料、生物燃料(诸如来源于藻类的那些生物燃料)、聚合物、小分子(诸如简单有机分子)、复杂有机分子、药物和前药(pro-drug)、碳水化合物及其任何组合。分泌的产物可以包含治疗上有用的蛋白质，诸如胰岛素、伊马替尼(Imatinib)、T细胞、T细胞受体、Fc融合蛋白、抗凝血剂、血液因子、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein)、工程化蛋白支架、酶、生长因子、激素、干扰素、白细胞介素和溶血栓剂(thrombolytics)。
图15是描绘DLD在纯化分泌的产物中的用途的示意图。在一些实例中，细胞可以是在缓冲液、生长培养基等的水性悬浮液中，使得细胞将产物分泌到悬浮液中。这样的分泌的产物的实例包括蛋白质、肽、酶、抗体、燃料、生物燃料(诸如来源于藻类的那些生物燃料)、聚合物、小分子(诸如简单有机分子)、复杂有机分子、药物和前药、碳水化合物及其任何组合。分泌的产物可以包括治疗上有用的蛋白质，诸如胰岛素、伊马替尼、T细胞、T细胞受体、Fc融合蛋白、抗凝血剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白支架、酶、生长因子、激素、干扰素、白细胞介素和溶血栓剂。
纯化可以例如在其中细胞具有大于分泌的化合物的预定尺寸的预定尺寸、其中细胞的预定尺寸大于或等于临界尺寸并且分泌的化合物的预定尺寸小于临界尺寸的情况下进行。在这样的配置中，当细胞被施加至DLD设备时，细胞可以在第一方向上被偏转，而分泌的化合物可以在第二方向上被偏转，从而将分泌的化合物与细胞分离。此外，分泌的蛋白质可以被以促进DLD分离的方式结合的大载体捕获。然后可以进行DLD，并且然后可以处理载体-蛋白质复合物以进一步纯化或释放蛋白质。
这样的方法可以以迭代的方式进行，使得分离的颗粒群可以连续地循环回到设备中用于进一步分离。在这个方面，图16和图17是迭代过程的示意图，其中分离的细胞在分离后循环回到DLD设备中。在一些实例中，细胞可以从第一设备循环至第二个不同设备中，该第二个不同设备具有包括不同临界尺寸的障碍物。这样的系统可以允许通过操纵临界尺寸的范围系统性分离多于一个尺寸范围。在其他实例中，细胞可以循环回到之前被用于分离所述分离的颗粒的同一设备。该系统可以是对连续纯化活跃分裂的细胞或被活跃表达的化合物有益的。例如，此类方法可以与纯化分泌的产物的方法相结合，以既从一个流动流中收集分泌的产物，又从另一个流动流中收集产生分泌的产物的细胞。由于细胞可以连续地产生分泌产物，纯化的细胞可以被重新施加至设备以从细胞连续地收集分泌的产物。
F.纯度和产率
通过本文讨论的DLD方法产生的细胞的纯度、产率和存活率将基于许多因素而变化，所述因素包括起始材料的性质、使用的确切程序和DLD设备的特征。优选地，应该获得至少60％的纯度、产率和存活率，至少70％、80％或90％的更高的百分比是更优选的。在优选的实施方案中，所述方法可以用于以至少70％的纯度、产率和存活率(更高的百分比(至少80％、85％或90％)是优选的)从全血、单采血液成分术产物或白细胞单采术产物中分离白细胞。
V.技术背景
不受任何具体理论的束缚，微流体的一些技术方面的一般讨论可以有助于理解影响本领域进行的分离的因素。已经公开了多种用于分离颗粒的微型筛分基质(microfabricated sieving matrix)(Chou等人,Proc.Natl.Acad.Sci.96:13762(1999)；Han等人，Science 288:1026(2000)；Huang等人,Nat.Biotechnol.20:1048(2002)；Turner等人,Phys.Rev.Lett.88(12):128103(2002)；Huang等人,Phys.Rev.Lett.89:178301(2002)；美国专利第5,427,663号；美国专利第7,150,812号；美国专利第6,881,317号)。已经描述了碰撞阵列(也被称为“障碍物阵列”)设备，并且解释了它们的基本操作，例如在美国专利第7,150,812号中，该文献通过引用整体并入本文。碰撞阵列基本上通过分离通过障碍物的阵列(通常，周期性有序的阵列)的颗粒操作，分离发生在遵循偏移主体流体流动方向的或施加场方向的“阵列方向”的颗粒之间(US 7,150,812)。
A.碰撞阵列
在一些阵列中，相邻障碍物的几何形状使得限定间隙的障碍物的部分关于在主体流体流动方向上延伸的间隙的轴线对称。流过这样的间隙的流体的速度或体积分布是近似地跨间隙的抛物线形的，在限定间隙的每个障碍物的表面的流体速度和流量为零(假设无滑流条件(non-slip flow condition))，并且在间隙的中心点处达到最大值。该分布是抛物线形的，与限定间隙的障碍物之一相邻的给定宽度的流体层和与限定间隙的另一个障碍物相邻的相同宽度的流体层包含相等比例的流体流量，意指不管颗粒行进到哪个障碍物附近，在通过间隙期间被“碰撞”的颗粒的临界尺寸是相等的。
在一些情况中，可以通过对障碍物进行塑形和布置障碍物，使得将流体流动偏转到障碍物之间的间隙的相邻障碍物的部分关于在主体流体流动方向上延伸的间隙的轴线是非对称的，来改进障碍物阵列的颗粒尺寸分离性能。这样的进入间隙的流动对称性的缺乏可以引起间隙内的非对称的流体流动分布。流向间隙一侧的流体的浓度(即，通过间隙的非对称流体流动分布的结果)可以降低被诱导在阵列方向上而不在主体流体流动方向上行进的颗粒的临界尺寸。这是因为流动分布的非对称性引起相邻于包含通过间隙的选择的比例的流体流量的一个障碍物的流动层的宽度，和包含相同比例的流体流量并且与限定间隙的另一个障碍物相邻的流体层的宽度之间的差异。与障碍物相邻的流体层的不同宽度限定了表现出两种不同临界颗粒尺寸的间隙。如果穿过间隙的颗粒超过运载该颗粒的流体层的临界尺寸，则颗粒可以被碰撞(即，在阵列方向上行进，而不在主体流体流动方向上行进)。因此，如果穿过具有非对称流动分布的间隙的颗粒在与一个障碍物相邻的流体层中行进，则颗粒被碰撞是可能的，但是如果颗粒在与限定间隙的另一个障碍物相邻的流体层中行进，则颗粒不被碰撞。
在另一方面，减少限定间隙的障碍物的边缘的圆度可以提高障碍物阵列的颗粒尺寸分离性能。举例来说，具有尖锐顶点的三角形横截面的障碍物的阵列比具有圆形顶点的相同尺寸和相同间隔的三角形障碍物阵列表现出更小的临界颗粒尺寸。
因此，通过使在障碍物阵列中限定间隙的障碍物的边缘锐化，可以在不必然地降低障碍物的尺寸的情况下减小在主体流体流动的影响下在阵列方向上偏转的颗粒的临界尺寸。相反地，具有更尖锐边缘的障碍物可以比具有较不尖锐的边缘的相同尺寸的障碍物间隔更远，但仍然与具有较不尖锐的边缘的相同尺寸的障碍物产生等价的颗粒分离性质。
B.分级分离范围
微流体上通过尺寸分离的物体包括细胞、生物分子、无机珠和其他物体。分级分离的通常尺寸在从100纳米至50微米的范围。然而，有时也可以分级分离更大和更小的颗粒。
C.容量
取决于设计，设备或设备的组合可以用于处理约10μl至至少500μl之间的样品、约500μl和约40mL之间的样品、约500μl和约20mL之间的样品、约20mL和约200mL之间的样品、约40mL和约200mL之间的样品或至少200mL的样品。
D.通道
设备可以包括具有一个或更多个入口和一个或更多个出口的一个或多个(multiple)通道。入口可以用于样品或粗(即，未被纯化的)流体组合物、用于缓冲液或以引入试剂。出口可以用于收集产物或可以用作废弃物的出口。通道可以是约0.5mm至100mm宽，且约2mm-200mm长，但是不同的宽度和长度也是可能的。深度可以是1μm-1000μm，并且可以存在从1至100个或更多个的任何数目的通道。容量可以在从几μl到许多mL的非常宽的范围变化，并且设备可以具有多于一个区(级或部分)，所述多于一个区(级或部分)具有不同的障碍物配置。
E.间隙尺寸(柱或障碍物之间的边缘到边缘的距离)
障碍物的阵列中的间隙尺寸(柱或障碍物之间的边缘到边缘的距离)可以从约几微米(例如，1-500微米)变化或大于1毫米。在一些实施方案中，障碍物可以具有1微米-3000微米的直径，并且可以具有各种形状(圆形、三角形、泪珠形、菱形、正方形、矩形等)。柱的第一行可以位于接近入口(例如，在5μm以内)或远离超过1mm。
(F)可堆叠的芯片
设备可以包含多于一个可堆叠的芯片。设备可以包含约1-50个芯片。在一些实例中，设备可以具有以串联或并联或两者兼有布置的多于一个芯片。
VI.发明构思
下文带编号的段落展示了作为本申请的一部分的本发明构思。这些构思以示例性实施方案E1-E234的形式表示。
E1.一种工程化靶细胞群的方法，所述方法包括：
a)从粗流体组合物分离所述靶细胞，其中所述分离程序包括在微流体设备上进行确定性侧向位移(DLD)，其中所述设备包括：
i)从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中所述通道由第一壁和与所述第一壁相对的第二壁界定；
ii)成行布置在所述通道中的障碍物阵列，每后一行的障碍物相对于前一行侧向地偏移，并且其中所述障碍物以这样的方式布置使得，当所述粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，靶细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且与所述靶细胞具有不同尺寸的污染性细胞或颗粒流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口；
b)对从所述一个或更多个收集出口获得的所述靶细胞遗传工程化以具备期望的表型。
E2.如E1所述的方法，其中所述遗传工程化包括对所述靶细胞转染或转导，和通过体外培养经遗传工程化的靶细胞来扩增它们。
E3.如E2所述的方法，其中表现出所述期望的表型的靶细胞的产率比通过Ficoll离心而不进行DLD分离的相同细胞大至少10％。
E4.如E1所述的方法，其中所述粗流体组合物是血液或通过对血液进行单采血液成分术或白细胞单采术获得的组合物。
E5.如E1-4中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是白细胞。
E6.如E1-4中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞或祖细胞。
E7.如E1-4中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是树突细胞。
E8.如E1-7中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是从患者获得的。
E9.如E8所述的方法，其中所述粗流体组合物中的靶细胞在被转导或转染前不与载体结合。
E10.如E8所述的方法，其中在进行DLD前，靶细胞与一种或更多种载体以促进或补充DLD分离的方式结合。
E11.如E9所述的方法，其中在进行DLD后以及在对靶细胞进行转导或转染之前或之后，靶细胞与一种或更多种载体以促进或补充DLD分离的方式结合。
E12.如E10或11所述的方法，其中所述一种或更多种载体在其表面上包含与所述靶细胞特异性结合的亲和剂。
E13.如E12所述的方法，其中所述剂是抗体、活化剂、半抗原或适体。
E14.如E10-13中任一项所述的方法，其中所述载体的直径与所述靶细胞的直径至少一样大。
E15.如E10-13中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径不超过所述靶细胞的直径的50％。
E16.如E10-13中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径是所述靶细胞的直径的至少两倍。
E17.如E10-13中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径不超过所述靶细胞的直径的25％。
E18.如E10-13中任一项所述的方法，其中一组载体具有与所述靶细胞至少一样大的直径，并且第二组载体具有不超过所述靶细胞的直径的50％的直径。
E19.如E10-13中任一项所述的方法，其中一组载体具有所述靶细胞的直径的至少两倍的直径，并且第二组载体具有不超过所述靶细胞的直径的25％大的直径。
E20.如E10-19中任一项所述的方法，其中所述载体由胶原蛋白或多糖制成。
E21.如E10-20中任一项所述的方法，其中所述载体由明胶或藻酸盐制成。
E22.如E10-21中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物从患者获得，并且从获得所述粗流体组合物完成的时间到所述靶细胞首次与载体结合，历时不超过4小时。
E23.如E10-21中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是来源于患者血液的单采血液成分术产物或白细胞单采术产物，并且从单采血液成分术或白细胞单采术完成的时间到所述靶细胞首次与载体结合，历时不超过4小时。
E24.如E1-23中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物从患者获得，并且从获得所述粗流体组合物完成的时间到靶细胞首次被转染或转导，历时不超过5小时。
E25.如E1-23中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是来源于患者血液的单采血液成分术产物或白细胞单采术产物，并且从单采血液成分术或白细胞单采术完成的时间到靶细胞首次被转染或转导，历时不超过5小时。
E26.如E24或25所述的方法，其中直到靶细胞首次被转染或转导，历时不超过4小时。
E27.一种产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞的方法，所述方法包括：
a)获得包含T细胞的粗流体组合物；
b)对所述粗流体组合物使用微流体设备进行确定性侧向位移(DLD)，所述微流体设备包括：
i)从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中所述通道由第一壁和与所述第一壁相对的第二壁界定；
ii)成行布置在所述通道中的障碍物阵列，每后一行的障碍物相对于前一行侧向地偏移，并且其中所述障碍物以这样的方式布置使得，当所述粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，所述组合物中的T细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且在所述粗流体组合物中且与所述T细胞具有不同尺寸的细胞或颗粒流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口；
c)对在步骤b)中获得的富集的产物中的T细胞遗传工程化，以在其表面产生所述嵌合抗原受体(CAR)。
E28.如E27所述的方法，其中所述粗流体组合物是从来自患者的血液的单采血液成分术或白细胞单采术获得的产物，并且其中，当所述粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，所述组合物中的T细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且在所述粗流体组合物中且具有不同尺寸的红细胞、血小板或其他颗粒流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口。
E29.如E27或28所述的方法，其中所述遗传工程化包括对所述靶细胞转染或转导，以及进一步通过使所述细胞在体外生长而被扩增经遗传工程化的靶细胞。
E30.如E27-29中任一项所述的方法，其中在其表面上表达所述嵌合受体的T细胞的产率比从所述粗流体组合物中通过Ficoll离心而不进行DLD分离的T细胞大至少10％。
E31.如E30所述的方法，其中在其表面上表达所述嵌合受体的T细胞的产率比从所述粗流体组合物中通过Ficoll离心而不进行DLD分离的T细胞大至少20％。
E32.如E30所述的方法，其中在其表面上表达所述嵌合受体的T细胞的产率比从所述粗流体组合物中通过Ficoll离心而不进行DLD分离的T细胞大至少50％。
E33.如E27-32中任一项所述的方法，其中所述CAR包含a)包含抗原结合结构域的胞外区；b)跨膜区；c)胞内区，并且其中所述CAR T细胞任选地包含为所述细胞提供分子开关的一个或更多个重组序列，所述分子开关当被触发时减少CAR T细胞的数目或活性。
E34.如E33所述的方法，其中所述抗原结合结构域是来自单克隆抗体的重链和轻链二者的抗原结合区的单链可变片段(scFv)。
E35.如E33或34所述的方法，其中所述CAR包含连接所述胞外区和所述跨膜区的2-20个氨基酸的铰链区。
E36.如E35所述的方法，其中所述跨膜区包含CD8或CD28蛋白序列。
E37.如E33-36中任一项所述的方法，其中所述胞内区包含来源于CD3-ζ、CD137或CD28的胞内结构域的信号传导结构域。
E38.如E27-37中任一项所述的方法，其中包含T细胞的所述粗流体组合物从患有癌症、自身免疫疾病或传染病的患者获得。
E39.如E38所述的方法，其中在获得包含T细胞的所述粗流体组合物后，在所述流体组合物中的所述T细胞与一种或更多种载体以促进DLD分离的方式结合。
E40.如E39所述的方法，其中，在进行DLD前，T细胞与一种或更多种载体以促进DLD分离的方式结合。
E41.如E39所述的方法，其中在进行DLD后和在T细胞被遗传工程化之前或之后，T细胞与一种或更多种载体以促进DLD分离的方式结合。
E42.如E39-41所述的方法，其中所述一种或更多种载体在其表面上包含与所述T细胞特异性结合的抗体或活化剂。
E43.如E39-42中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径与所述T细胞的直径至少一样大。
E44.如E39-42中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径不超过所述T细胞的直径的50％。
E45.如E39-42中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径是所述T细胞的直径的至少两倍。
E46.如E39-42中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径不超过所述T细胞的直径的25％。
E47.如E39-42中任一项所述的方法，其中一组载体具有与所述T细胞至少一样大的直径，并且第二组载体具有不超过所述T细胞的直径的50％的直径。
E48.如E39-42中任一项所述的方法，其中一组载体具有所述T细胞的直径的至少两倍的直径，并且第二组载体具有不超过所述T细胞的直径的25％的直径。
E49.如E39-48中任一项所述的方法，其中所述载体由胶原蛋白或多糖制成。
E50.如E39-49中任一项所述的方法，其中所述载体由明胶或藻酸盐制成。
E51.如E39-50中任一项所述的方法，其中从获得包含T细胞的所述粗流体组合物完成的时间到所述T细胞与载体结合，历时不超过4小时。
E52.如E39-50中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是来源于患者的血液的单采血液成分术产物或白细胞单采术产物，并且从单采血液成分术或白细胞单采术完成的时间到所述靶细胞与载体结合，历时不超过4小时。
E53.如E27-50中任一项所述的方法，其中从获得包含T细胞的所述粗流体组合物完成的时间到T细胞首次被转染或转导，历时不超过5小时。
E54.如E27-50中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是来源于患者的血液的单采血液成分术产物或白细胞单采术产物，并且从单采血液成分术或白细胞单采术完成的时间到T细胞首次被转染或转导，历时不超过5小时。
E55.如E53或54所述的方法，其中直到T细胞首次被转染或转导，历时不超过4小时。
E56.如E27-55中任一项所述的方法，其中产生所述CAR T细胞的所有步骤在获得包含T细胞的粗流体组合物的同一设备中进行，并且所有步骤在总共不超过4小时内完成。
E57.CAR T细胞，所述CAR T细胞是通过E27-55中任一项所述的方法制造的。
E58.一种治疗患者的癌症、自身免疫疾病或传染病的方法，所述方法包括向所述患者施用被工程化以表达嵌合抗原受体的CAR T细胞，所述嵌合抗原受体识别来自所述患者的癌细胞、自身免疫细胞或感染细胞上的抗原，其中所述CAR T细胞通过包括以下步骤的方法产生：
a)从患者获得包含T细胞的粗流体组合物；
b)对所述粗流体组合物使用微流体设备进行确定性侧向位移(DLD)，所述微流体设备包括：
i)从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中所述通道由第一壁和与所述第一壁相对的第二壁界定；
ii)成行布置在所述通道中的障碍物阵列，每后一行的障碍物相对于前一行侧向地偏移，并且其中所述障碍物以这样的方式布置使得，当所述粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，所述组合物中的T细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且在所述粗流体组合物中且与所述T细胞具有不同尺寸的细胞或颗粒流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口；
c)对在步骤b)中获得的所述T细胞遗传工程化，以在其表面上表达嵌合抗原受体(CAR)；
d)通过使经工程化的T细胞在体外生长来扩大所述细胞的数目；和
e)对从其获得所述粗流体组合物的患者施用所述经工程化的T细胞。
E59.如E58所述的方法，其中所述粗流体组合物是从来自所述患者的血液获得的单采血液成分术或白细胞单采术产物，并且其中，当所述粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，所述组合物中的T细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且在所述粗流体组合物中且具有不同尺寸的红细胞、血小板或其他颗粒流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口。
E60.如E58或59所述的方法，其中遗传工程化包括对所述靶细胞转染或转导。
E61.如E60所述的方法，其中在其表面上表达所述嵌合受体的细胞的产率比从所述粗流体组合物中通过Ficoll离心而不进行DLD分离的T细胞大至少10％。
E62.如E60所述的方法，其中在其表面上表达所述嵌合受体的靶细胞的产率比从所述粗流体组合物中通过Ficoll离心而不进行DLD分离的T细胞大至少50％。
E63.如E58-62中任一项所述的方法，其中所述CAR包含a)包含抗原结合结构域的胞外区；b)跨膜区；和c)胞内区，并且其中所述CAR T细胞任选地包含为所述细胞提供分子开关的一个或更多个重组序列，所述分子开关当被触发时减少CAR T细胞的数目或活性。
E64.如E63所述的方法，其中所述抗原结合结构域是来自单克隆抗体的重链和轻链二者的抗原结合区的单链可变片段(scFv)。
E65.如E63或64所述的方法，其中所述CAR包含连接所述胞外区和所述跨膜区的2-20个氨基酸的铰链区。
E66.如E63-65中任一项所述的方法，其中所述跨膜区包含CD8或CD28蛋白序列。
E67.如E63-66中任一项所述的方法，其中所述胞内区包含来源于CD3-ζ、CD 137、CD28的胞内结构域的信号传导结构域。
E68.如E58-67中任一项所述的方法，其中所述患者患有白血病。
E69.如E68所述的方法，其中所述白血病是急性淋巴母细胞性白血病。
E70.如E68或69所述的方法，其中所述CAR将CD19或CD20识别为抗原。
E71.如E58-67中任一项所述的方法，其中所述患者患有实体瘤。
E72.如E71所述的方法，其中所述CAR识别选自由以下组成的组的抗原：CD22；RORI；间皮素；CD33/IL3Ra；c-Met；PSMA；糖脂F77；EGFRvIII；GD-2；NY-ESO-1TCR；MAGE A3TCR；及其组合。
E73.如E58-72中任一项所述的方法，其中，在获得包含T细胞的所述粗流体组合物后，所述流体中的所述T细胞与载体以促进DLD分离的方式结合。
E74.如E73所述的方法，其中在进行DLD前，T细胞与一种或更多种载体以促进DLD分离的方式结合。
E75.如E73所述的方法，其中在进行DLD后和在T细胞被遗传工程化以表达嵌合受体之前或之后，T细胞与一种或更多种载体以促进DLD分离的方式结合。
E76.如E73-75所述的方法，其中所述一种或更多种载体在其表面上包含与所述T细胞特异性结合的抗体或活化剂。
E77.如E73-76中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径与所述T细胞的直径至少一样大。
E78.如E73-76中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径不超过所述T细胞的直径的50％。
E79.如E73-76中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径是所述T细胞的直径的至少两倍。
E80.如E73-76中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径不超过所述T细胞的直径的25％。
E81.如E80所述的方法，其中一组载体具有与所述T细胞至少一样大的直径，并且第二组载体具有不超过所述T细胞的直径的50％的直径。
E82.如E73-81中任一项所述的方法，其中一组载体具有所述T细胞的直径的至少两倍的直径，并且第二组载体具有不超过所述T细胞的直径的25％的直径。
E83.如E73-82中任一项所述的方法，其中所述载体由胶原蛋白或多糖制成。
E84.如E73-83中任一项所述的方法，其中所述载体由明胶或藻酸盐制成。
E85.如E73-84中任一项所述的方法，其中从获得包含T细胞的所述粗流体组合物完成的时间到所述T细胞与载体结合，历时不超过4小时。
E86.如E73-84中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是来源于患者血液的单采血液成分术产物或白细胞单采术产物，并且从单采血液成分术或白细胞单采术完成的时间到所述靶细胞与载体结合，历时不超过4小时。
E87.如E73-84中任一项所述的方法，其中从获得包含T细胞的所述粗流体组合物完成的时间到所述T细胞首次被转染或转导，历时不超过5小时。
E88.如E73-84中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是来源于患者血液的单采血液成分术产物或白细胞单采术产物，并且从单采血液成分术或白细胞单采术完成的时间到T细胞首次被转染或转导，历时不超过5小时。
E89.如E87或88所述的方法，其中直到T细胞首次被转染或转导，历时不超过4小时。
E90.如E58-89中任一项所述的方法，其中T细胞比经由不包括DLD的方法处理的细胞早至少1天可用于向患者施用。
E91.如E58-89中任一项所述的方法，其中靶细胞比经由不包括DLD的方法处理的细胞早至少3天可用于向患者施用。
E92.一种从患者收集靶细胞的方法，所述方法包括：
a)从所述患者获得包含靶细胞的粗流体组合物；
b)对包含靶细胞的所述粗流体组合物使用微流体设备进行确定性侧向位移(DLD)，以获得富集靶细胞的组合物；
其中，在DLD之前或之后，靶细胞与一种或更多种载体以促进DLD分离的方式结合，并且其中从由所述患者获得包含靶细胞的所述粗流体组合物完成的时间到所述靶细胞与载体结合，历时不超过5小时。
E93.如E92所述的方法，其中所述一种或更多种载体在其表面上包含与所述靶细胞特异性结合的抗体或活化剂。
E94.如92或93所述的方法，其中所有的所述载体的直径与所述靶细胞的直径至少一样大。
E95.如E92或93所述的方法，其中所有的所述载体的直径不超过所述靶细胞的直径的50％。
E96.如E92或93所述的方法，其中所有的所述载体的直径是所述靶细胞的直径的至少两倍。
E97.如E92或93所述的方法，其中所有的所述载体的直径不超过所述靶细胞的直径的25％。
E98.如E92或93所述的方法，其中一组载体具有与所述靶细胞至少一样大的直径，并且第二组载体具有不超过所述靶细胞的直径的50％的直径。
E99.如E92或93所述的方法，其中一组载体具有为所述T细胞的直径的至少两倍大的直径，并且第二组载体具有不超过所述T细胞的直径的25％的直径。
E100.如E92-99中任一项所述的方法，其中所述载体由胶原蛋白或多糖制成。
E101.如E92-100中任一项所述的方法，其中所述载体由明胶或藻酸盐制成。
E102.如E92-101中任一项所述的方法，其中从获得包含靶细胞的所述粗流体组合物完成的时间到所述靶细胞与载体结合，历时不超过4小时。
E103.如E92-101中任一项所述的方法，其中从获得包含靶细胞的所述粗流体组合物完成的时间到所述靶细胞与载体结合，历时不超过3小时。
E104.如E92-103中任一项所述的方法，其中包含靶细胞的所述粗流体组合物通过对来自所述患者的血液进行单采血液成分术或白细胞单采术获得。
E105.如E92-104中任一项所述的方法，其中使用病毒载体对通过DLD得到的富集了靶细胞的所述组合物中的靶细胞进行转导。
E106.如E105所述的方法，其中靶细胞被电转染、化学转染或通过纳米颗粒的手段转染。
E107.如E92-106中任一项所述的方法，其中所述微流体设备包括：
a)从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中所述通道由第一壁和与所述第一壁相对的第二壁界定；
b)成行布置在所述通道中的障碍物阵列，每后一行的障碍物相对于前一行侧向地偏移，并且其中所述障碍物以这样的方式布置使得，当包含靶细胞的所述粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，靶细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且在所述粗流体组合物中且与所述靶细胞具有不同尺寸的污染性细胞或颗粒流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口。
E108.如E92-107中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是T细胞。
E109.如E108所述的方法，其中所述T细胞选自由以下组成的组：自然杀伤T细胞；中枢记忆T细胞；辅助性T细胞和调节T细胞。
E110.如E92-107中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是干细胞。
E111.如E92-107中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是B细胞、巨噬细胞、树突细胞或粒细胞。
E112.如E92-111中任一项所述的方法，其中包含靶细胞的所述粗流体组合物包含用作抗凝血剂或防止血小板活化的一种或更多种添加剂。
E113.如E112所述的方法，其中所述添加剂选自由噻氯匹定、肌苷、原儿茶酸、乙酰水杨酸和替罗非班组成的组。
E114.如E92-113中任一项所述的方法，其中步骤a)和b)都在从所述患者获得包含靶细胞的所述粗流体组合物的场所进行。
E115.如E92-114中任一项所述的方法，其中从由所述患者获得包含靶细胞的所述粗流体组合物完成的时间到所述靶细胞与载体结合，历时不超过4小时。
E116.如E92-114中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是来源于所述患者的血液的单采血液成分术产物或白细胞单采术产物，并且从单采血液成分术或白细胞单采术完成的时间到所述靶细胞与载体结合，历时不超过4小时。
E117.如E92-116中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：
c)对细胞遗传工程化和/或扩增细胞数量；和/或
d)用收集的所述靶细胞治疗从其获得所述靶细胞的同一患者。
E118.如E117所述的方法，其中，所述靶细胞在步骤d)后被冻存。
E119.如E117或118所述的方法，其中在步骤c)中培养的靶细胞是在活化剂的存在下培养的T细胞。
E120.如E119所述的方法，其中所述活化剂与载体结合。
E121.如E58-89中任一项所述的方法，其中靶细胞比经由不包括DLD的方法处理的细胞早至少1天可用于向患者施用。
E122.如E58-89中任一项所述的方法，其中靶细胞比经由不包括DLD的方法处理的细胞早至少3天可用于向患者施用。
E123.靶细胞，所述靶细胞是通过如E92-122中任一项所述的方法产生的。
E124.一种治疗患者的疾病或状况的方法，所述方法包括向所述患者施用如E123所述的靶细胞。
E125.一种将黏附细胞与多于一个其他细胞分离的方法，所述方法包括：
a)将包含所述多于一个其他细胞和所述黏附细胞的粗流体组合物与一种或更多种载体接触，所述黏附细胞与所述一种或更多种载体以促进DLD分离的方式结合，其中所述黏附细胞与载体在接触时或接触后至少部分地缔合以生成载体缔合的黏附细胞复合物，其中所述载体缔合的黏附细胞复合物包括相对于所述多于一个其他细胞中的细胞增加的尺寸，并且其中所述载体缔合的黏附细胞复合物的尺寸大于或等于临界尺寸，并且所述多于一个其他细胞中的细胞包括小于所述临界尺寸的尺寸；
b)将所述粗流体组合物施加至设备，其中所述设备包括成行布置的障碍物阵列，其中所述行相对于彼此侧向地偏移，其中所述行被配置成使大于或等于所述临界尺寸的颗粒在第一方向上偏转，并且使小于所述临界尺寸的颗粒在第二方向上偏转；和
c)使包含所述载体缔合的黏附细胞复合物的样品流过所述设备，其中所述载体缔合的黏附细胞复合物被所述障碍物在所述第一方向上偏转，并且所述多于一个其他细胞中的细胞在所述第二方向上被偏转，从而将所述载体缔合的黏附细胞复合物与所述多于一个其他细胞分离；
d)收集包含分离的载体缔合的黏附细胞复合物的流体组合物。
E126.如E125所述的方法，其中所述黏附细胞作为包含所述黏附细胞和多于一个其他细胞的粗流体组合物的一部分从患者收集，并且其中从由所述患者获得所述粗流体组合物完成的时间到所述黏附细胞首次与载体结合，历时不超过3小时。
E127.如E125所述的方法，其中从由所述患者获得所述粗流体组合物完成的时间到所述黏附细胞首次与所述载体结合，历时不超过2小时。
E128.如E125所述的方法，其中从由所述患者获得所述粗流体组合物完成的时间到所述黏附细胞首次与所述载体结合，历时不超过1小时。
E129.如E125所述的方法，其中从由所述患者获得所述粗流体组合物完成的时间到首次从所述设备收集所述黏附细胞或所述载体缔合的黏附细胞复合物，历时不超过4小时。
E130.如E125所述的方法，其中从由所述患者获得所述粗流体组合物完成的时间到首次从所述设备收集所述黏附细胞或所述载体缔合的黏附细胞复合物，历时不超过4小时。
E131.如E125-130中任一项所述的方法，其中所述载体在其表面上包含与所述黏附细胞特异性结合的抗体或活化剂。
E132.如E125-131中任一项所述的方法，其中所述载体的直径与所述黏附细胞的直径至少一样大。
E133.如E125-131中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径是所述黏附细胞的直径的至少两倍。
E134.如E125-131中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径是所述黏附细胞的直径的至少十倍。
E135.如E125-131中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径是10-600μm。
E136.如E125-135中任一项所述的方法，其中所述黏附细胞选自由以下组成的组：MRC-5细胞；HeLa细胞；Vero细胞；NIH 3T3细胞；L929细胞；Sf21细胞；Sf9细胞；A549细胞；A9细胞；AtT-20细胞；BALB/3T3细胞；BHK-21细胞；BHL-100细胞；BT细胞；Caco-2细胞；Chang细胞；Clone 9细胞；Clone M-3细胞；COS-1细胞；COS-3细胞；COS-7细胞；CRFK细胞；CV-1细胞；D-17细胞；Daudi细胞；GH1细胞；GH3细胞；HaK细胞；HCT-15细胞；HL-60细胞；HT-1080细胞；HEK细胞、HT-29细胞；HUVEC细胞；I-10细胞；IM-9细胞；JEG-2细胞；Jensen细胞；Jurkat细胞；K-562细胞；KB细胞；KG-1细胞；L2细胞；LLC-WRC 256细胞；McCoy细胞；MCF7细胞；WI-38细胞；WISH细胞；XC细胞；Y-1细胞；CHO细胞；Raw 264.7细胞；HEP G2细胞；BAE-1细胞；SH-SY5Y细胞及其任何衍生物。
E137.如E125-135中任一项所述的方法，其中所述黏附细胞是干细胞。
E138.一种将活化的细胞与多于一个其他细胞分离的方法，所述方法包括：
a)将包含能够被活化的细胞和多于一个其他细胞的粗流体组合物与一种或更多种载体接触，其中至少一种载体包含细胞活化剂，其中所述细胞活化剂与能够被所述细胞活化剂活化的细胞在接触时或接触后至少部分地缔合以生成载体缔合的细胞复合物，其中所述细胞活化剂与所述能够被所述细胞活化剂活化的细胞的缔合至少部分地活化所述能够被活化的细胞，其中所述载体缔合的细胞复合物包括相对于所述多于一个其他细胞中的细胞增加的尺寸，并且其中所述载体缔合的细胞复合物的尺寸大于或等于临界尺寸，并且所述多于一个其他细胞中的细胞包括小于所述临界尺寸的尺寸；
b)将所述样品施加至设备，其中所述设备包括成行布置的障碍物阵列；其中所述行相对于彼此侧向地偏移，其中所述行被配置成将大于或等于所述临界尺寸的颗粒在第一方向上偏转，并且将小于所述临界尺寸的颗粒在第二方向上偏转；和
c)使所述样品流过所述设备，其中所述载体缔合的细胞复合物被所述障碍物在所述第一方向上偏转，并且在所述多于一个其他细胞中的所述细胞在所述第二方向上被偏转，从而将所述活化的细胞与所述多于一个其他细胞分离；
d)收集包含分离的载体缔合的细胞复合物的流体组合物。
E139.如E138所述的方法，其中所述能够被活化的细胞选自由以下组成的组：T细胞、B细胞、调节T细胞、巨噬细胞、树突细胞、粒细胞、先天淋巴细胞、巨核细胞、自然杀伤细胞、凝血细胞、滑膜细胞、β细胞、肝细胞、胰腺细胞；DE3溶原化的细胞、酵母细胞、植物细胞和干细胞。
E140.如E138或139所述的方法，其中所述细胞活化剂是蛋白质。
E141.如E140所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。
E142.如E140所述的方法，其中所述蛋白质选自由以下组成的组：CD3、CD28、抗原、辅助性T细胞、受体、细胞因子、糖蛋白及其任何组合。
E143.如E138所述的方法，其中所述细胞活化剂选自由以下组成的组：胰岛素、IPTG、乳糖、异乳糖、脂质、糖苷、萜烯、类固醇、生物碱及其任何组合。
E144.如E138-143中任一项所述的方法，其中所述能够被活化的细胞作为包含所述能够被活化的细胞和多于一个其他细胞的粗流体组合物的一部分从患者收集，并且其中从由所述患者获得所述粗流体组合物完成的时间到所述能够被活化的细胞与所述载体结合，历时不超过4小时。
E145.如E138-143中任一项所述的方法，其中从由所述患者获得所述粗流体组合物完成的时间到所述能够被活化的细胞与所述载体结合，历时不超过3小时。
E146.如E138-143所述的方法，其中从由所述患者获得所述粗流体组合物完成的时间到所述能够被活化的细胞与所述载体结合，历时不超过2小时。
E147.如E138-143中任一项所述的方法，其中从由所述患者获得所述粗流体组合物完成的时间到步骤c)完成，历时不超过4小时。
E148.如E138-143中任一项所述的方法，其中从由所述患者获得所述粗流体组合物完成的时间到步骤c)完成，历时不超过3小时。
E149.如E138-148中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径与所述能够被活化的细胞至少一样大。
E150.如E138-148中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径是所述能够被活化的细胞的直径的至少两倍。
E151.如E138-148中任一项所述的方法，其中所有的所述载体的直径是所述能够被活化的细胞的直径的至少十倍。
E152.如E138-148中任一项所述的方法，其中所述载体的直径是10-600μm。
E153.一种连续纯化从细胞分泌的产物的方法，所述方法包括：
a)获得包含所述细胞的流体组合物，其中所述细胞悬浮在所述流体组合物中，其中所述细胞将所述分泌的产物分泌到悬浮液中，其中所述细胞具有的预定尺寸大于所述分泌的产物的预定尺寸，并且其中所述细胞的所述预定尺寸大于或等于临界尺寸，并且所述分泌的产物的所述预定尺寸小于所述临界尺寸；
b)将包含所述细胞的所述流体组合物施加至设备，其中所述设备包括成行布置的障碍物阵列；其中所述行相对于彼此侧向地偏移，其中所述行被配置成使大于或等于所述临界尺寸的颗粒在第一方向上偏转，并且使小于所述临界尺寸的颗粒在第二方向上偏转；
c)使所述样品流过所述设备，其中所述细胞被所述障碍物在所述第一方向上偏转，并且所述分泌的产物在所述第二方向上被偏转，从而将所述分泌的产物与所述细胞分离；
d)收集所述分泌的产物，从而产生具有基本纯的所述分泌的产物的样品；
e)收集包含所分离的细胞的回收的流体组合物；和
f)将包含所述分离的细胞的所述回收的流体组合物再施加至所述设备，并且重复步骤(a)至(e)；从而连续纯化来自所述细胞的所述分泌的产物。
E154.如E153所述的方法，其中所述分泌的产物选自由以下组成的组：蛋白质、抗体、生物燃料、聚合物、小分子及其任何组合。
E155.如E153所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：细菌细胞、藻类细胞、哺乳动物细胞和肿瘤细胞。
E156.一种用于降低单采血液成分术样品中血小板与白细胞的比率的方法，所述方法包括在不存在离心或淘析的情况下对所述样品进行确定性侧向位移(DLD)，其中获得其中血小板与白细胞的比率比使用离心或淘析代替DLD进行的相同程序获得的比率低至少20％的产物。
E157.如E156所述的方法，其中获得其中血小板与白细胞的比率比使用密度梯度离心或逆流离心进行的相同程序获得的比率低至少20％的产物。
E158.如E156所述的方法，其中获得其中血小板与白细胞的比率比使用淘析进行的相同程序获得的比率低至少20％的产物。
E159.如E156所述的方法，其中获得其中血小板与白细胞的比率比使用离心或淘析代替DLD获得的比率低至少50％的产物。
E160.如E156-159中任一项所述的方法，其中在DLD之前不存在对所述单采血液成分术样品进行的分离步骤。
E161.如E156-160中任一项所述的方法，其中DLD在不包含改变血小板的尺寸的嵌入剂并且不促进血小板凝集的缓冲液中进行。
E162.如E156-159中任一项所述的方法，其中DLD在不包含右旋糖或其它高电荷聚合物的缓冲液中进行。
E163.如E156-162中任一项所述的方法，其中所述产物中血小板的总数目比所述单采血液成分术样品中低至少70％。
E164.如E156-163中任一项所述的方法，其中所述产物中血小板的总数目比所述单采血液成分术样品中低至少90％。
E165.一种用于从单采血液成分术样品纯化T细胞的方法，所述方法包括对所述样品进行DLD，随后进行亲和分离步骤，并且通过在活化剂的存在下培养来扩增所述T细胞，其中获得的T细胞的数目是通过使用Ficoll离心代替DLD进行的相同程序产生的数目的至少两倍。
E166.如E165所述的方法，其中所述亲和分离步骤包括使用包括与CD3结合的抗体的磁珠或颗粒。
E167.如E165所述的方法，其中培养14天后获得的T细胞的数目是通过使用Ficoll离心代替DLD进行的相同程序产生的数目的至少2倍。
E168.如E165所述的方法，其中培养14天后获得的T细胞的数目是通过使用Ficoll离心代替DLD进行的相同程序产生的数目的至少4倍。
E169.如E156-168中任一项所述的方法，其中当用载体转化所述DLD产物中的细胞以表达重组表型时，表现出期望的表型的细胞的产率比通过Ficoll离心而不进行DLD分离的相同细胞大至少10％。
E170.如E156-169中任一项所述的方法，其中当用载体转化所述DLD产物中的细胞以表达重组表型时，表现出期望的表型的T细胞的产率比通过Ficoll离心而不进行DLD分离的相同细胞大至少20％。
E171.如E163-165中任一项所述的方法，其中所述DLD产物中的记忆T细胞相对于T细胞的总数目的百分比比使用相同程序但用Ficoll离心代替DLD产生的百分比高至少10％。
E172.根据E156-171中任一项所述的方法，其中所述方法被用于产生用于CAR T细胞疗法的T细胞，并且使用DLD代替Ficoll离心将产生足以治疗患者的数目的细胞所需的时间降低至少20％。
E173.如E172所述的方法，其中用于产生CAR T细胞的方法不包括其中细胞被冷冻的步骤。
E174.如E172或E173所述的方法，其中T细胞的处理在进行单采血液成分术的同一场所进行。
E175.如E172-174中任一项所述的方法，其中T细胞在进行单采血液成分术的同一场所被遗传转化。
E176.如E156-169中任一项所述的方法，其中从单采血液成分术的样品收集完成的时间到进行DLD的时间，历时不超过1小时。
E177.一种用于降低单采血液成分术样品中血小板与白细胞的比率的方法，所述方法包括在不存在离心或淘析的情况下对所述样品进行确定性侧向位移(DLD)，其中获得了一种产物，其中所述产物中血小板的总数目比所述单采血液成分术样品中低至少90％。
E178.如E177所述的方法，其中DLD在不包含改变血小板的尺寸的嵌入剂并且不促进血小板凝集的缓冲液中进行。
E179.如E177所述的方法，其中DLD在不包含右旋糖或其它高电荷聚合物的缓冲液中进行。
E180.一种产生CAR T细胞的方法，所述方法包括：
a)通过单采血液成分术从患者获得样品组合物，其中所述样品组合物包含T细胞；
b)对所述样品组合物进行DLD以将存在的血小板的总数目降低至少70％，其中DLD在微流体设备上进行，所述微流体设备包括：
i)从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中所述通道由第一壁和与所述第一壁相对的第二壁界定；
ii)成行布置在所述通道中的障碍物阵列，每后一行的障碍物相对于前一行侧向地偏移，并且其中所述障碍物以这样的方式布置使得，当所述粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，所述组合物中的T细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且其中血小板和比T细胞小的其他物质流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口；
c)对在步骤b)中获得的所述富集的产物中的T细胞遗传工程化，以在其表面上产生嵌合抗原受体(CAR)；
d)培养所述T细胞以扩大其数目；
e)将所述T细胞转移到用于向患者施用的药物组合物中。
E181.如E180所述的方法，其中至少90％的血小板在步骤b)中被去除。
E182.如E180或E181所述的方法，其中所有的分离步骤和浓缩步骤使用DLD进行。
E183.如E180-182中任一项所述的方法，其中在培养之前或在培养期间，细胞被暴露于T细胞活化剂。
E184.如E180-183中任一项所述的方法，其中在步骤b)中和在步骤c)之前，细胞被转移到其中存在或添加有T细胞活化剂的培养基中。
E185.如E184所述的方法，其中包含活化剂的所述培养基通过DLD处理以将活化剂与细胞分离并且将细胞转移到其中存在或添加有用于对细胞重组地工程化的载体的培养基中。
E186.如E180-185中任一项所述的方法，其中细胞在它们被转移到用于向患者施用的药物组合物中之前不被冷冻。
E187.如E180-185中任一项所述的方法，其中所述细胞在任何步骤均不被冷冻。
E188.如E180-187中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少1天结束。
E189.如E180-187中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少3天结束。
E190.如E180-187中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少5天结束。
E191.如E180-187中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少10天结束。
E192.如E180-191中任一项所述的方法，其中，在步骤d)中，培养14天后获得的T细胞的数目是通过使用Ficoll离心代替DLD进行的相同程序产生的数目的至少2倍。
E193.如E180-191中任一项所述的方法，其中，在步骤d)中，培养14天后获得的T细胞的数目是通过使用Ficoll离心代替DLD进行的相同程序产生的数目的至少4倍。
E194.一种制备CAR T细胞的方法，所述方法包括：
a)通过单采血液成分术从患者收集细胞；
b)对步骤a)中获得的所述细胞进行DLD以将白细胞与其他细胞和颗粒分离，并且将所述白细胞转移到支持其生长且具有或补充有T细胞活化剂的培养基中；
c)进行DLD以从步骤b)的所述培养基分离T细胞并将细胞转移到一种培养基中，在所述培养基中所述T细胞被重组工程化以在其表面上表达嵌合抗原受体(CAR)；
d)进行DLD以将所述T细胞与试剂分离并将所述细胞转移到生长培养基中；
e)培养所述细胞以扩大其数目；
f)进行DLD以将扩增的T细胞转移到用于向患者施用的培养基中。
E195.如E194所述的方法，其中细胞在它们被转移到用于向患者施用的药物组合物中之前不被冷冻。
E196.如E194所述的方法，其中细胞在任何步骤均不被冷冻。
E197.如E194-196中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少3天结束。
E198.如E194-196中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少5天结束。
E199.如E194-196中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少10天结束。
E200.一种制备用于治疗患者的CAR T细胞的方法，所述方法包括：
a)通过单采血液成分术从患者收集细胞；
b)对在步骤a)中获得的所述细胞进行DLD以将白细胞与其他细胞和颗粒分离并将所述白细胞转移到支持其生长且具有或补充有T细胞活化剂的培养基中；
c)将T细胞从步骤b)的培养基分离到包含用于对所述T细胞遗传工程化以在其表面上产生嵌合抗原受体(CAR)的载体的培养基中；
d)进行DLD以将T细胞与试剂分离并将所述细胞转移到用于向患者施用的培养基中。
E201.如E200所述的方法，其中细胞在它们被转移到用于向患者施用的药物组合物中之前不被冷冻。
E202.如E200所述的方法，其中细胞在任何步骤均不被冷冻。
E203.如E200-202中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少3天结束。
E204.如E200-202中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少5天结束。
E205.如E200-202中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少10天结束。
E206.如E180-205中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，获得其中血小板与白细胞的比率比使用离心或淘析代替DLD获得的比率低至少50％的产物。
E207.如E180-205中任一项所述的方法，其中表现出期望的CAR T表型的T细胞的产率比通过Ficoll离心分离而不进行DLD的相同细胞大至少10％。
E208.如E180-205中任一项所述的方法，其中表现出期望的CAR T表型的T细胞的产率比通过Ficoll离心而不进行DLD分离的相同细胞大至少20％。
E209.如E180-208中任一项所述的方法，其中产生足够用于治疗患者的数目的T细胞所需的时间比使用Ficoll离心而不是DLD以从单采血液成分术起始材料分离细胞进行相同方法时短至少5％。
E210.如E180-209中任一项所述的方法，其中产生足够用于治疗患者的数目的T细胞所需的时间比使用Ficoll离心而不是DLD以从单采血液成分术起始材料分离细胞进行相同方法时短至少10％。
E211.如E180-209中任一项所述的方法，其中当将通过所述方法制备的细胞被施用到患者时，所述细胞表现出比使用离心或淘析代替DLD从单采血液成分术组合物处理的细胞的衰老少至少10％。
E212.如E180-209中任一项所述的方法，其中当通过所述方法制备的细胞被施用到患者时，所述细胞表现出与使用离心或淘析代替DLD从单采血液成分术组合物处理的细胞相比时增加的效力。
E213.一种用于治疗患者的疾病或状况的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的通过如E180-209中任一项所述的方法制备的细胞。
E214.如E213所述的方法，其中所述疾病或状况是癌症。
E215.一种产生治疗活性细胞的方法，所述方法包括：
a)从患者获得包含所述细胞的样品组合物；
b)对所述样品进行DLD以产生富集治疗活性细胞的组合物，其中DLD在微流体设备上进行，所述微流体设备包括：
i)从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中所述通道由第一壁和与所述第一壁相对的第二壁界定；
ii)成行布置在所述通道中的障碍物阵列，每后一行的障碍物相对于前一行侧向地偏移，并且其中所述障碍物以这样的方式布置使得，当粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，所述组合物中的所述治疗活性细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且其中比所述治疗活性细胞小的细胞和物质流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口；
c)任选地对在步骤b)中获得的富集的产物中的所述治疗活性细胞遗传工程化；
d)任选地培养所述治疗活性细胞以扩大其数目；
e)将所述治疗活性细胞转移到用于向患者施用的药物组合物。
E216.如E215所述的方法，其中所述治疗活性细胞是干细胞。
E217.如E216所述的方法，其中所述干细胞存在于循环中，并且所述样品组合物通过单采血液成分术制备。
E218.如E217所述的方法，其中至少70％的血小板被从步骤b)的富集的产物去除。
E219.如E217所述的方法，其中至少90％的血小板被从步骤b)的富集的产物去除。
E220.如E215-219中任一项所述的方法，其中所有的分离步骤和浓缩步骤使用DLD进行。
E221.如E215-220中任一项所述的方法，其中细胞在它们被转移到用于向患者施用的药物组合物之前不被冷冻。
E222.如E215-220中任一项所述的方法，其中细胞在任何步骤均不被冷冻。
E223.如E215-222中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少1天结束。
E224.如E215-222中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少3天结束。
E225.如E215-222中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少5天结束。
E226.如E215-222中任一项所述的方法，其中从所述样品组合物获得的所述治疗活性细胞的产率比通过其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序获得的数目高至少25％。
E227.如E215-222中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少3天结束。
E228.如E215-222中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过除了DLD之外的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少5天结束。
E229.如E215-222中任一项所述的方法，其中产生足够用于治疗患者的数目的治疗活性细胞所需的时间比使用Ficoll离心而不是DLD进行从所述样品组合物分离细胞的相同方法时短至少5％。
E230.如E215-222中任一项所述的方法，其中产生足够用于治疗患者的数目的治疗活性细胞所需的时间比使用Ficoll离心而不是DLD进行从所述样品组合物分离细胞的相同方法时短至少10％。
E231.如E215-230中任一项所述的方法，其中当通过所述方法制备的所述治疗活性细胞被施用到患者时，所述细胞表现出比使用离心或淘析代替DLD从单采血液成分术组合物处理的细胞的衰老少至少10％。
E232.如E215-230中任一项所述的方法，其中当通过所述方法制备的所述治疗活性细胞被施用到患者时，所述细胞与使用离心或淘析代替DLD从所述样品组合物处理的细胞相比时表现出增加的效力。
E233.一种用于治疗患者的疾病或状况的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的通过如E215-230中任一项所述的方法制备的治疗活性细胞。
E234.如E233所述的方法，其中所述治疗活性细胞是干细胞并且所述疾病或状况是遗传病。
E235.一种对靶细胞群工程化的方法，所述方法包括：
a)从粗流体组合物分离靶细胞，其中分离在微流体设备上使用基于尺寸差异将靶细胞与所述粗流体组合物中的其他细胞分离的一种或更多种程序进行，并且其中分离产生富集靶细胞的组合物；
b)对从步骤a)获得的所述靶细胞遗传工程化，以具备期望的表型；
其中靶细胞在被遗传工程化之前未被离心或淘析。
E236.如E235所述的方法，其中所述靶细胞是白细胞或干细胞。
E237.如E235所述的方法，其中所述靶细胞是T细胞。
E238.如E235-237中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是从患者获得的血液或单采血液成分术制备物。
E239.如E238所述的方法，其中靶细胞的分离在使得富集靶细胞的所述组合物具有比所述单采血液成分术制备物中低至少70％的血小板的总数目的条件下进行。
E240.如E239所述的方法，其中富集靶细胞的所述组合物中的血小板的总数目比所述单采血液成分术制备物中低至少90％。
E241.如E240所述的方法，其中血小板与靶细胞的比率比所述单采血液成分术制备物中低至少50％。
E242.如E238所述的方法，其中所述靶细胞是分离后在细胞培养中被扩增的T细胞。
E243.如E242所述的方法，其中培养14天后获得的T细胞的数目是在其中T细胞通过包括离心步骤的方法被分离的程序中的至少2倍。
E244.如E242所述的方法，其中培养14天后获得的T细胞的数目是在其中T细胞通过包括离心步骤的方法被分离的程序中的至少4倍。
E245.如E244所述的方法，其中培养物中的记忆T细胞相对于T细胞的总数目的百分比比其中T细胞通过包括离心步骤的方法分离的程序高至少10％。
E246.如E244所述的方法，其中培养物中的记忆T细胞相对于T细胞的总数目的百分比比其中T细胞通过包括离心步骤的方法分离的程序高至少20％。
E247.如E235-246中任一项所述的方法，其中当用载体转化富集靶细胞的所述组合物中的细胞以表达重组表型时，表现出所述期望的表型的靶细胞的产率比通过离心分离的相同细胞的产率大至少20％。
E248.如E238-247中任一项所述的方法，其中从单采血液成分术的样品收集完成的时间到进行使用所述微流体设备的分离的时间，历时不超过1小时。
E249.如E238-247中任一项所述的方法，其中从由所述患者获得所述单采血液成分术的样品完成的时间到靶细胞的分离完成，历时不超过4小时。
E250.如E238-247中任一项所述的方法，其中从由所述患者获得所述单采血液成分术的样品完成的时间到细胞被遗传工程化，历时不超过4小时。
E251.一种产生CAR T细胞的方法，所述方法包括：
a)通过单采血液成分术从患者获得粗流体组合物，其中所述样品组合物包含T细胞；
b)从所述粗流体组合物分离所述T细胞，其中分离在微流体设备上使用基于尺寸差异将T细胞与所述粗流体组合物中的血小板和其他细胞分离的一种或更多种程序进行，并且其中所述分离产生富集T细胞且去除了血小板的组合物；
c)对从步骤a)获得的所述T细胞遗传工程化以在其表面上产生嵌合抗原受体(CAR)，并且其中所述T细胞在被遗传工程化之前的任何步骤均未被离心或淘析；
d)培养经遗传工程化的T细胞以扩大其数目；
e)收集步骤d)中产生的经培养的细胞。
E252.如E251所述的方法，其中，在步骤e)中，T细胞通过被转移到用于向患者施用的药物组合物中被收集。
E253.如E251或252所述的方法，其中细胞在被收集之前不被冷冻。
E254.如E251-253中任一项所述的方法，其中至少90％的血小板在步骤b)中被去除。
E255.如E251-254中任一项所述的方法，其中在培养前或在培养期间，细胞被暴露于T细胞活化剂或载体。
E256.如E255所述的方法，其中所述活化剂与所述载体都不与磁珠或颗粒结合。
E257.如E251-256中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过不包括使用微流体设备的方法被分离或浓缩的程序相比，所述CAR T细胞提前至少1天可用于向患者施用。
E258.如E251-256中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过不包括使用微流体设备的方法被分离或浓缩的程序相比，所述CAR T细胞提前至少3天可用于向患者施用。
E259.如E251-258中任一项所述的方法，其中，在步骤d)中，培养14天后获得的CART细胞的数目是通过使用Ficoll离心获得的细胞产生的数目的至少2倍。
E260.如E251-258中任一项所述的方法，其中，在步骤d)中，培养14天后获得的CART细胞的数目是通过使用Ficoll离心进行的相同程序产生的数目的至少4倍。
E261.如E251-260中任一项所述的方法，其中T细胞和CAR T细胞在被施用到患者之前从未被冷冻。
E262.一种制备用于治疗患者的CAR T细胞的方法，所述方法包括：
a)通过单采血液成分术从所述患者获得粗流体组合物，其中所述组合物包含T细胞；
b)从所述粗流体组合物分离所述T细胞，其中分离在微流体设备上使用基于尺寸差异将T细胞与所述粗流体组合物中的血小板和其他细胞分离的一种或更多种程序进行，并且其中所述分离产生富集T细胞且耗尽了血小板的组合物；
c)对从步骤a)获得的所述T细胞遗传工程化以在其表面上产生嵌合抗原受体(CAR)，并且其中所述T细胞在被遗传工程化之前的任何步骤均不被离心或淘析；
d)培养经遗传工程化的T细胞以扩大其数目；
e)在微流体设备上使用基于尺寸差异将T细胞与试剂分离的一种或更多种程序分离T细胞。
E263.如E262所述的方法，其中细胞在它们被转移到用于向患者施用的药物组合物中之前不被冷冻。
E264.如E262所述的方法，其中细胞在任何步骤均不被冷冻。
E265.如E262-264中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过不使用微流体设备的方法被分离或浓缩的程序相比，所述方法提前至少3天结束。
E266.如E262-265中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过不包括使用微流体设备的方法被分离或浓缩的程序相比，所述CAR T细胞提前至少1天可用于向患者施用。
E267.如E262-265中任一项所述的方法，其中，与其中细胞通过不包括使用微流体设备的方法被分离或浓缩的程序相比，所述CAR T细胞提前至少3天可用于向患者施用。
E268.如E262-267中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，获得其中血小板与白细胞的比率比使用离心或淘析获得的比率低至少50％的产物组合物。
E269.如E262-268中任一项所述的方法，其中产生足够用于治疗患者的数目的CART细胞所需的时间比使用通过Ficoll离心分离的细胞进行相同方法时短至少5％。
E270.如E262-269中任一项所述的方法，其中产生足够用于治疗患者的数目的CART细胞所需的时间比使用Ficoll离心进行以从单采血液成分术起始材料分离细胞的相同方法时短至少10％。
E271.如E262-270中任一项所述的方法，其中当通过所述方法制备的细胞被施用到患者时，所述细胞表现出比使用离心或淘析从单采血液成分术组合物处理的细胞的衰老少至少10％。
E272.一种用于治疗患者的疾病或状况的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的通过如E235-271中任一项所述的方法制备的细胞。E273.如E272所述的方法，其中所述疾病或状况是癌症。
实施例
以下实施例意图说明但不限制本发明。
实施例1
本研究集中在对于CAR-T细胞制造而言是不可或缺的单采血液成分术样品。与供体健康相关的固有可变性(inherent variability)、疾病状态和之前的化学疗法都会影响白细胞单采术收集物的质量，并且可能影响制造方案中各种步骤的效力(Levine等人,Mol.Therapy:Meth.Clin.Dev.4:92-101(2017))。为了对自动化DLD白细胞富集进行负荷测试(stress test)，从通常具有接近正常的红细胞计数、10-20倍高的淋巴细胞和单核细胞以及几乎不具有粒细胞的血小板单采术捐献物中收集残留白细胞(LRS腔室级分)。所述血小板单采术捐献物还具有相比于正常外周血液约10倍高的血小板计数。
12名供体被处理，并且对主要血细胞类型的产率以及通过DLD对比Ficoll-Hypaque密度梯度离心(“金标准”)的处理能力(processivity)进行了比较。这些供体中的4名供体也在15天的时间段中被评估了“T细胞扩增能力”。每个供体样品都通过DLD和Ficoll二者处理，并且对于研究了T细胞扩增能力的4名供体，样品使用直接磁性提取处理。
材料和方法
微芯片设计和制造：在本研究中使用的DLD阵列由单区域、镜像、菱形柱设计组成(参见D’Silva,J.,“Throughout Microfluidic Capture of Rare Cells from LargeVolumes of Blood”提交至普林斯顿大学全体教员的博士学位候选论文(2016))。每个芯片存在14个并行的阵列，产生14-道的DLD设备(图1D)。该设备被设计为在柱之间有16μm的间隙和1/42的倾斜，产生约4μm的临界直径。塑料DLD设备使用被称为软模压(soft-embossing)的方法生成。首先，使用标准光刻和深反应离子蚀刻技术(PrincetonUniversity，PRISM)制备了用于塑料DLD微芯片的硅(Si)母版。然后通过在Si特征上浇铸和固化弹性体，将硅母版上的特征转移至软弹性体模具(Edge Embossing,Medford,MA)。弹性体被剥离，以产生硅母版的可重复使用的负型压印(negative imprint)。将塑料空白片(blank sheet)放置在弹性体模具之间，并且然后使用压力和温度的组合，将塑料挤出到软弹性体负型模具的特征(孔)中，复制原始硅母版的正型特征和深度。然后将软工具从塑料设备上剥离，产生表面被模压至约100μm深度、具有围绕微柱的阵列的流动通道和沟槽的图案的一个平坦的塑料件(图1D，插图)。用于流体进入微芯片的输入端和输出端的端口被创建。通过超声清洗后，用热敏的、亲水粘合剂(ARFLow Adhesives Research,Glen Rock,PA)对该设备加盖。整个芯片是40mm×75mm，和1mm厚—小于信用卡的尺寸。
DLD微芯片操作：微流体设备被组装在具有流体连接的光学透明和耐压的歧管内。使用恒定气动调节器(pneumatic controller)(MFCS-EZ,Fluigent,Lowell,MA)驱动流体通过DLD微芯片。使用了两个分离的压力控制，一个用于缓冲液，并且一个用于样品。缓冲液线(buffer line)的流动路径包括连接缓冲液储存器(60mL注射器)、在线脱气器(BiotechDEGASi,Minneapolis,MN)和歧管的缓冲液入口端口的管道。样品的流动路径包括连接样品储存器(20mL注射器)、保持大于微芯片标称间隙尺寸(16μm)的聚集物的25mm直径的20μmPureFlow尼龙过滤器(Clear Solutions,Inc.San Clemente,CA)和歧管上的样品入口端口的管道。歧管的出口端口通过管道连接至用于废弃物和产物级分的收集储存器。
在样品被装载之前，将微芯片、过滤器和管道用运行缓冲液灌注(primed)并封闭持续15分钟。通过将运行缓冲液装载到缓冲液储存器(60mL注射器)中并然后加压，灌注DLD设备；然后流体通过管道并进入歧管的“缓冲液流入(Buffer in)”端口(图1)。歧管端口中的空气经由该入口上的另一个端口排出，并且然后密封该端口。然后缓冲液被驱动通过微芯片并从产物和废弃物出口二者排出，排尽微柱阵列中的所有空气。同时，缓冲液反冲(back flushed)通过歧管上的“样品流入(Sample IN)”端口和通过在线过滤器，冲走任何空气。这个灌注步骤花费约5分钟的手动时间(hands-on time)，并去除微芯片、歧管和管道中的所有空气。在灌注步骤之后，缓冲液继续冲洗设备，持续另外的15分钟，以封闭所有内表面；该步骤是自动化的，并且不需要手动时间。
在封闭步骤之后，系统被减压，并且样品被装载到样品容器(20mL注射器)中。在装载到DLD上之前，样品(见以下)被稀释，1份样品比4份运行缓冲液(0.2×)。首先将缓冲液源再加压，然后将样品源再加压，引起缓冲液和样品都进入它们各自在歧管上的的端口和微芯片，并且并行流过微芯片(参见i)分离模式，图1A)。一旦样品被装载和处于运行压力，系统自动化地处理整个样品体积。产品和废弃物级分二者被收集在预先称重的50mL的无菌锥形管中，并且在收集后称重以确定收集的体积。
缓冲液体系。在DLD上测试了三种不同的无EDTA缓冲剂制剂：在磷酸盐缓冲盐水[无Ca++/Mg++(Quality biological,Gaithersburg,MD)]中的0.5％ F127(Pluronic F-127,Sigma Aldrich,St.Louis,MO)，在磷酸盐缓冲盐水[无Ca++/Mg++]中的1％牛血清白蛋白(BSA)(Affymetrix,Santa Clara,CA)，和由50％的Plasmalyte-A(Baxter,Deerfield,IL)与50％的包含1.0％ BSA(Affymetrix,Santa Clara,CA)、1.0mM N-乙酰半胱氨酸、2％右旋糖和0.45％NaCl(全部来自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的混合物组成的等渗淘析缓冲液(Elutriation Buffer)(EB)。缓冲液每天新鲜制备，并且在DLD上使用之前通过0.2μm过滤瓶无菌过滤。尽管用添加泊洛沙姆已经建立了更好的DLD性能，但扩增组中的所有样品都使用等渗淘析缓冲液处理，以与当前的CAR-T细胞制造方法最佳匹配(align)(Johnson等人,Cancer Cell Res.27:38-58(2017))。
生物样品。使用Trima系统(Terumo,Tokyo,Japan)，从当地血库获得来自正常筛查供体的血小板单采术捐献物的白细胞减少系统(LRS)腔室样品。在通过血库收集的时间完成细胞计数。在我们的实验室中使用Beckman Coulter AcT2 Diff2临床血液分析仪验证了计数，并且计数在76-313.3×103个WBC/μL和0.8-4.87×106个血小板/μL之间的范围。所有样品在室温在轨道式震荡器(Biocotek,China)上保存过夜，并且然后在第二天(约24小时后)处理以模拟过夜运送。每个供体样品通过DLD和Ficoll二者处理，并且对于用于T细胞扩增和免疫表型研究的4名供体，样品还使用直接磁性提取处理。
Ficoll-Hypaque。通过将LRS样品在RPMI(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)中稀释至0.5×获得外周血液单核细胞(PBMC)，铺于50mL锥形管中的等体积Ficoll-Hypaque(GE,Pittsburgh,PA)上，并在400×g离心35min，转子自由摆动并且无制动。离心后，弃去上层，并且将交界面的PBMC级分转移至新的50mL管中，并且补足至20mL的RPMI。通过在400×g离心10min洗涤PBMC，弃去上清液，并且用20mL的RPMI重悬浮沉淀，并且在200×g再次洗涤10min。去除上清液，并且将沉淀重悬浮于包含RPMI-1640+10％胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)加抗生素，青霉素100单位/mL和链霉素100μg/mL(Thermo-Fisher,Waltham,MA)的完全培养基中。
细胞分离、计数和免疫荧光染色。在使用上文描述的方法分离之前和之后，使用血液细胞分析仪(Beckman-Coulter AcT2 Diff2)确定所得产物的细胞计数。一旦在培养物中并且活化后，细胞计数使用ScepterTM2.0手持细胞计数器(Millipore,Billerica,MA)和通过使用流式细胞术的绝对计数确定。然后，将来自输入、产物和废弃物级分的细胞装载到聚赖氨酸包被的载玻片上持续10min，并且然后在PBS中的4％多聚甲醛(p-formaldehyde)+0.5％Triton X-100中固定持续15min，然后在PBS中通过离心洗涤3次。将载玻片在黑暗中用缀合的一级抗体CD41-A647和CD41-FITC(二者来自BioLegend San Diego,CA)孵育持续60min，并用PBS洗涤三次，然后封片在含有DNA染料DAPI(Thermo-Fisher,Waltham,MA)的缓慢淬灭封片剂(slow-fade mounting media)中。用EtalumaTMLumascope 620荧光倒置显微镜(Carlsbad,CA)观察载玻片。从BioLegend(San Diego,CA)获得了缀合荧光团的抗体(mAb)：CD25-PE、CD25-APC、CD95-FITC、CD45RA-BV605、CD45RO-PECy7、CD197/CCR7 PE、CD279-PE、CD28 PE-Cy5、CD45-PerCP、CD3-FITC、CD3-BV421、CD4-AF700、CD8-APC-AF780、CD61-FITC、CD41-FITC、CD45-Alexa647。通过台盼蓝排除法确定了通过DLD获得的WBC和通过Ficoll-Hypaque纯化的PBMC的存活力。
活化和磁性分离。关于扩增组中的T细胞刺激，将DLD、Ficoll和LRS产物稀释至1×107个T细胞/mL，然后用洗涤并平衡过的抗CD3/CD28缀合的磁珠(5.0μm)以3.2∶1珠/细胞的比率(Thermo-Fisher,Waltham,MA)活化60min，并且然后将活化的T细胞通过持续5min的磁耗尽(magnetic depletion)分离。去除未结合的细胞，并且进一步将结合珠的细胞培养在完全培养基中(下文)。在直接磁体的方案中，将0.5mL的LRS样品(与通过DLD或Ficoll处理的相同的供体)与免疫磁性CD3/CD28珠孵育1小时。然后，将混合物相对于磁体放置5分钟，以捕获T细胞。将与磁珠结合的细胞(活化的细胞)取出并且然后如上文稀释至0.5×106/mL，以便在完全培养基中培养。
培养三天之后，将重组人类IL-2(BioLegend,San Diego,CA)以200IU/mL添加至孔。在细胞培养持续长达15天后，从细胞中去除珠，并且在每个时间点对细胞进行计数。为了去除珠，通过使孔中的细胞通过5mL移液管10次，重悬这些细胞。接下来，使细胞悬浮液通过1mL的移液管40次，随后使用200μL的吸头剧烈吸打1min。然后将细胞悬浮液放置在磁体一侧，持续5min，并且将非磁性级分转移至新管中并计数。培养孔中的细胞数目使用Scepter手持细胞计数器并通过流式细胞术确定。
细胞培养和细胞活化。对于放入细胞培养物中的每一种T细胞制品，除了上文描述的被刺激的细胞外，将未被刺激的细胞(对照)在完全培养基(RPMI+10％FBS+抗生素)中调节至0.5×106/mL，并且在6孔板(Corning,NY)中铺板并且在37℃、5％CO2于湿化的培养箱中培养。对于每个条件，在每个时间点对每名供体以未被刺激的、用IL2刺激的和未用IL2刺激的单独的孔，以消除由于取样和可靠计数所需的去珠操作(de-beading activity)引起的扩增中断的任何可能性，特别是在第3天。
流式细胞术。通过流式细胞术的免洗涤绝对计数用于CD3+细胞在所有时间点的计数，初始第0天计数使用TruCount管(BD Biosciences,San Jose,CA)以精确地确定回收的和计数的细胞数目。随后的数天使用25,000个123珠(Affymetrix,Santa Clara,CA)，所述123珠作为内部对照相对于TruCount管被标记(indexed)。将100μL细胞悬浮液用缀合的抗体CD3 FITC、CD25 PE和CD45 PerCP在黑暗中在TruCount管中或通过添加了25,000个123珠(Affymetrix,Santa Clara,Ca)染色30min。然后将细胞稀释至250μL的PBS，最终DRAQ5TMDNA染料(Thermo-Fisher,Waltham,MA)浓度是1.0mM。接下来，在获取之前，将被染色的细胞用另外的250μL在PBS中的1.2％多聚甲醛固定过夜。对于绝对计数细胞术，在BD FACSCalibur(BD Biosciences,San Jose,CA)上使用荧光阈值(CD45 PerCP)获取了最少25,000个事件或2500个珠事件。表型分析也在所有时间点使用由CD3、CD45RA、CD95、CD279、CD25、CD4和CD8组成的7色活化/无反应组(anergy panel)进行。在第15天，该组被修改以创建聚焦T中央记忆细胞的9色组，所述9色组增加了CD45RO PE-Cy7、CD28 PE-Cy5并用CD197/CCR7 PE替代CD279/PD1 PE。对于多色染色，将100μl的细胞悬浮液如上所述地染色，并重悬浮于750μLPBS中并通过在400×g离心洗涤，并随后重悬浮于250μL 1.2％多聚甲醛中，并且固定过夜，然后在四激光BD FACSAria II(BD Biosciences,San Jose,CA)上使用前向角散射阈值采集20,000个事件。所有数据分析使用Flowlogic软件(Inivai,Melbourne,Australia)进行。
结果
单采血液成分术产物的DLD微芯片和Ficoll处理
DLD和Ficoll分离方法被用于处理从12名不同的正常供体获得的12个LRS样品。在接收并处理的那12个样品中，11个样品簇集中在分别为148.7×103/μL WBC和2.52×106/μL血小板计数的平均值附近(图2A、2B)。具有313.3×103/μL WBC和4.87×106/μL血小板计数的第12个样品可在散点图中作为红色三角形被观察到(图2A)。这个样品在处理时充分地聚集，使得它迅速堵塞了20μm预过滤器，并且因此没有完全进入DLD。输入样品的显微术检查示出了，这个样品中充满了尺寸在25μm-50μm范围的血小板-WBC聚集体，观察到大至直径250μm的多个聚集体(图2C、2D)。此外，WBC和血小板计数二者比平均WBC和血小板计数大3个标准差。使用四分位法(quartile method)，这个样品被归类为轻度异常；使用Grubbs异常检验和0.05的α水平，这个样品还被归类为异常。20因此，基于极高的WBC和血小板计数和太过严重的凝集和损伤，这个供体被从本研究排除。
在图2A中示出了输入材料(被稀释至0.2×的LRS产物)的代表性图像。来自相同输入供体的DLD(图2E)和Ficoll(图2C)细胞产物的典型显微照片，发现DLD中与Ficoll相比显著更低的背景血小板水平(绿色的CD41-FITC)。还示出了如被收集在管中的相应的细胞产物(图2G、H)。DLD处理使从RBC和血小板中取出WBC的过程自动化，生成用于产物的一管和用于废弃物的一管，而Ficoll样品仍然需要进一步人工处理以吸取上方的血浆层和下方的Ficoll层的操作地限定的交界面(operationally-defined interface)处的PMBC层(图2H)；此外，需要另外的最少两次离心洗涤，以去除大部分污染性血小板。
在表2中概述了11个样品的WBC的回收率以及红细胞和血小板去除率。来自DLD的PBMC的平均细胞回收率是～80％，比Ficoll(63％)高17％，并且在考虑了在DLD和磁性样品二者中的CD3细胞数目后，DLD产物比直接磁体(44％)高36％。通过DLD的平均血小板去除率(83％)优于Ficoll(56.5％)和直接磁体(77％)二者。在这些24小时的样品中，对于DLD和Ficoll二者，平均红细胞去除率是97％，而对于直接磁体方法，平均红细胞去除率是94％。与通过Ficoll获得的细胞的平均存活率是97％相比，通过DLD获得的细胞的平均存活率是96％。
通过Ficoll技术在50mL锥形管中处理单个样品的相等等分试样花费的平均总时间计时约90分钟，需要大约30分钟熟练的手动时间。使用我们的单个微芯片层试验板系统(single microchip layer breadboard system)计时的运行以短得多的时间处理，为50分钟，并且需要25分钟的手动时间，而大约20分钟完全是因为流体组件的组装(因为在其他方面无需介入的设备的原型特性)。
细胞扩增和表征
在DLD或Ficoll富集后，将细胞使用CD3/CD28磁珠以3.2个珠/CD3+细胞的目标活化，持续60分钟，分离并在铺板之前计数。由于流式细胞仪的访问受限，和关于产物细胞计数中潜在的珠干扰的考虑，我们通过计数输入和非磁性级分二者和通过减法得到与磁体结合的T细胞数目来评估T细胞计数，使用磁性分离效率为90％(基于制造商报告的效率)的假设。在铺板到培养物中后，准确的T细胞计数使用通过流式细胞术的绝对计数和通过Coulter计数×CD3阳性细胞％确定；这些计数确定了原始的磁性CD3+细胞去除过程仅有44％的效率(表2)。这意味着，对于DLD和Ficoll级分二者，3.2个珠/CD3+细胞的目标所属的原始计算值实际上平均是2.3(比目标设定更少的珠/T细胞)，并且在直接磁体级分中的5:1的比(比目标设定显著更多的珠/T细胞)可能引起直接磁体级分具有与DLD和Ficoll组二者相比甚至更高倍数的扩增。
在每个时间点进行培养物的流式细胞术表征，以评估细胞活化的一致性。如在第8天测量的对于Ficoll、DLD和直接磁体，CD3+细胞的CD25表达改变(图3)。IL-2受体阳性(CD25)的CD3细胞以蓝色(CD4+图)和红色(CD8+图)示出。与Ficoll和直接磁体制备相比，DLD制备的细胞示出了跨4名供体更一致的CD25表型表达，CD25是对CD3/CD28刺激的应答的指示物。DLD制备的CD3+细胞对共刺激的具有平均73％的应答，相比之下Ficoll为51％(都以2.3个珠/细胞刺激)，而以5:1的更高的比刺激的直接磁体级分仅具有54％的应答。
对于Ficoll和DLD的未刺激的对照示出了显著的差异，DLD制备的细胞与Ficoll相比在培养物中保持CD25阴性(图9)。有趣的是，直接磁体级分中的供体37直到第8天前都没有应答，但确实在较晚的时间点扩增(也在图5A中示出)，表明一些样品对直接磁体方法的可能延迟的应答。
除了评价CD25外，使用为CD45RA-和CD25+的CD3+细胞的百分比跟踪向记忆细胞表型的转化。图4中所示的结果表明，与通过Ficoll和直接磁体处理的细胞相比，更大百分比的通过DLD产生的被培养的细胞对共刺激应答。此外，CD25-CD45RA-的CD3细胞的百分比在DLD级分中是最低的，是12％，相比而言，Ficoll和直接磁体分别为33％和29％，表明DLDCD3细胞向CD25+CD45RA-群体的更完全的转化。在第8天，对于DLD的CD45RA-CD25+群体的标准差是10.1％，相比而言，对于Ficoll的标准差是24.8％且对于直接磁体的标准差是53.4％。
确定各培养物在第3天、第8天和第15天的扩增倍数；数据在图5A中示出。该图示出了每个供体样品跨每种方法的扩增。虽然直接磁体方法表现得显示出较高的扩增，计数可能受不同的珠:细胞比(和对应的铺板密度的差异)极大地影响。不管如何，4名供体在扩增倍数方面示出了显著的可变性。此外，尽管具有抗生素存在，直接磁体组供体#21的第15天的培养物受到污染，并且不得不被弃去。无法知道对于供体#21的第8天扩增数据是否受污染物影响。
Ficoll和DLD之间的比较是有效的且直接得多：这些细胞以相同的密度铺板，并且以相同的珠:细胞比刺激。尽管DLD细胞的平均扩增倍数没有显著高于Ficoll细胞的平均扩增倍数，但是跨4名供体的组和在被调查的所有日子，扩增的一致性是惊人的。此外，培养物中具有中央记忆表型的细胞的百分比，对于DLD组平均是74％，对比于Ficoll组和直接磁体组分别是47％和48％。将图5A中的扩增倍数乘以产率百分比(表1)和记忆百分比(图5B)表明，尽管关于珠:细胞比的比较是次佳的，但是从DLD组产生相比Ficoll组或直接磁体组平均2倍的记忆细胞。
图6示出了鉴定本研究中使用的记忆细胞的表型方法，所述方法被设计成消除脱落抗原(shed antigen)诸如CD62L的任何问题(Mahnke等人,Eur.J.of Immunol.43:2797-2809(2013))。中央记忆细胞被顺序性地门控，并且然后被再度门控以培养物中所有其他CD3+细胞显示CD45R0+、CD95+、CD28+和CD197/CCR7+阳性的CD3+T细胞。使用大于50％的培养物为中央记忆表型的任意值作为转化度量，DLD组示出100％(4/4)供体实现中央记忆转化，平均74％的细胞是记忆表型，跨供体的变异系数是13％。相比之下，Ficoll组示出了50％(2/4)转化，具有平均47％的记忆细胞和29％的变异。直接磁体组实现了33％(1/3)转化，具有平均48％的记忆细胞和相关的79％的变异。
表2.DLD、Ficoll和直接磁体富集的比较
实施例2：血小板加回实验
基本原理
先前已经发现来源于DLD分离和纯化的WBC是健康的，并且对由CD3/CD28抗体的活化应答，并且向着它们的Tcm(T中央记忆)表型分化(Campos-Gonzalez等人，SLAS，2018年1月23日，在线发表于doi.org/10.1177/2472630317751214)。此外，在IL-2的存在下，Tcm细胞相应地并且与来源于其他方法如Ficoll的细胞相似地扩增和增殖。
DLD细胞纯化的一个关键特征是有效去除红细胞和血小板，以提供高度纯化的白细胞(WBC)产物。相比之下，Ficoll来源的白细胞(PBMC)取决于样品质量显示出更多污染性红细胞和血小板。平均而言，Ficoll来源的细胞中的血小板“污染”为44％，具有约22％的可变性范围，而DLD细胞仅表现出17％的血小板污染，具有的可变性为+/-12％。
因为DLD处理的单采血液成分术血液中的血小板去除与Ficoll分离的单采血液成分术血液相比时惊人的差异，对将自体血小板添加到DLD纯化的白细胞是否在一段时间内影响增殖和Tcm产生进行了研究。
实验详情
从当地血库收集两种不同的白细胞减少系统-单采血液成分术(“LRS-单采血液成分术”)样品，作为对照或收集在2.0mM EDTA中。所有四个样品通过两种不同的方法平行相同地处理：DLD处理和Ficoll梯度离心。该血库提供的初始血小板:WBC比率通过coulter计数器确定来注释和确认。
根据我们先前描述的方案，通过用PBS中的1.0％BSA/5.0mM EDTA将血液稀释至0.2×，通过DLD处理3.0ml的每一种LRS血液。样品用1.0％BSA/PBS缓冲液在标准压力和条件下运行，对每一种样品使用单独的DLD-14道芯片。收集产物和废弃物，并且使用coulter计数器测量细胞性(cellularity)。
将来自两种不同供体和条件(收集在2.0mM EDTA中或作为对照)的3.0ml的每一种LRS血液产物用3.0ml的磷酸盐缓冲盐水(减去钙和镁)1:1稀释，并且铺在50ml锥形管中的6.0ml的Ficoll-Paque的上方。外周单核细胞PBMC通过在400×g无制动离心35min获得。将上层或富含血浆的级分去除并且转移到另一支管并用PBS/1.0％BSA 1:1稀释。通过离心用过量的PBS洗涤PBMC，一次在400×g持续10min并且第二次在200×g持续10min。将两种上清液转移到新的50ml锥形管并且用PBS/1.0％BSA 1:1稀释。将稀释的富含血浆的级分和两种上清液在1,200×g离心15min，弃去上清液，并将沉淀重悬于PBS/1.0％BSA中，合并并在1,200×g再次离心15min。弃去上清液，并通过温和吹打将沉淀级分或血小板级分重悬于1.0ml的PBS/1.0％BSA中。使用coulter计数器测量血小板。将相应的血小板以期望的比率(0×、0.1×、0.5×和1.0×初始血小板计数)加回到DLD来源的WBC，并且在用CD3/CD28磁珠(Thermo Fisher)活化之前孵育1h。
在活化后，将细胞放置在完全RPMI培养基+10％FBS+抗生素中，并且在37℃和5％CO2在湿化的培养箱中培养设定的时间。在第3天、第7天和第14天，使用图中指示的抗体的组合，通过多色流式细胞术分析细胞等分试样。获得在不同天数的细胞培养物等分试样，并且如先前描述地对细胞去珠，然后准备用于流式细胞术。此外，细胞增殖通过使用Scepter手动细胞计数器测量。然后，我们比较了Ficoll来源的细胞与从DLD处理获得的那些细胞之间在对照条件下和当将血小板以不同比率加回到DLD细胞时的差异。我们使用的参数是不同时间点的细胞数目和根据其表型通过流式细胞术确定的Tcm细胞的数目。
下文的方案说明了在该实验期间遵循的总体实验设计，步骤从上到下进行。
结果与结论
使用DLD获得的白细胞一致地显示出比使用Ficoll获得的白细胞少的血小板(参见图19-21)。这些结果还证明了来源于DLD的T细胞与来自Ficoll的其对应物相比明显更优的扩增(图22)。此外，将血小板加回DLD分离的细胞使它们的扩增能力降低到与无血小板的DLD细胞相同的水平(图22)。这些结果支持了这样的假设，即在血液产物的DLD处理期间血小板的更有效减少产生了对CD3/CD28活化和IL-2扩增应答更强的白细胞。
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本文引用的所有参考文献被通过引用完全并入。现在已经充分描述了本发明，本领域技术人员将理解，本发明可以而不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围的众多且等同的条件、参数等范围内进行。

Claims (26)

1.一种工程化靶细胞群的方法，所述方法包括：
a)从粗流体组合物分离所述靶细胞，其中所述分离程序包括在微流体设备上进行确定性侧向位移(DLD)，其中所述设备包括：
i)从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中所述通道由第一壁和与所述第一壁相对的第二壁界定；
ii)成行布置在所述通道中的障碍物阵列，每后一行的障碍物相对于前一行侧向地偏移，并且其中所述障碍物以这样的方式布置使得，当所述粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，靶细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且与所述靶细胞具有不同尺寸的污染性细胞或颗粒流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口；
b)对从所述一个或更多个收集出口获得的所述靶细胞遗传工程化以具备期望的表型；
c)培养所述靶细胞以扩增它们的数量；
其中所述遗传工程化的和扩增的靶细胞中作为T中央记忆细胞的CD3阳性T细胞的百分比高于通过Ficoll密度梯度离心或直接磁体从相同的粗流体组合物中分离的遗传工程化的和扩增的细胞群中作为T中央记忆细胞的CD3阳性T细胞的百分比。
2.一种工程化靶细胞群的方法，所述方法包括：
a)从粗流体组合物分离所述靶细胞，其中所述分离程序包括在微流体设备上进行确定性侧向位移(DLD)，其中所述设备包括：
i)从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中所述通道由第一壁和与所述第一壁相对的第二壁界定；
ii)成行布置在所述通道中的障碍物阵列，每后一行的障碍物相对于前一行侧向地偏移，并且其中所述障碍物以这样的方式布置使得，当所述粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，靶细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且与所述靶细胞具有不同尺寸的污染性细胞或颗粒流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口；和
b)对从所述一个或更多个收集出口获得的所述靶细胞遗传工程化以具备期望的表型；
其中所述粗流体组合物中的靶细胞在被转导或转染前不与载体结合。
3.一种工程化靶细胞群的方法，所述方法包括：
a)从粗流体组合物分离所述靶细胞，其中所述分离程序包括在微流体设备上进行确定性侧向位移(DLD)，其中所述设备包括：
i)从样品入口延伸到一个或更多个流体出口的至少一个通道，其中所述通道由第一壁和与所述第一壁相对的第二壁界定；和
ii)成行布置在所述通道中的障碍物阵列，每后一行的障碍物相对于前一行侧向地偏移，并且其中所述障碍物以这样的方式布置使得，当所述粗流体组合物被施加至所述设备的入口并且流体流动地通过所述通道时，靶细胞流向收集富集的产物的一个或更多个收集出口，并且与所述靶细胞具有不同尺寸的污染性细胞或颗粒流向与所述收集出口分隔的一个或更多个废弃物出口；和
b)对从所述一个或更多个收集出口获得的所述靶细胞遗传工程化以具备期望的表型；
其中在进行DLD前，靶细胞与一种或更多种载体以促进或补充DLD分离的方式结合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述遗传工程化包括对所述靶细胞转染或转导。
5.如权利要求4所述的方法，其中表现出所述期望的表型的靶细胞的产率比通过Ficoll离心而不进行DLD分离的相同细胞大至少10％。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是血液或通过对血液进行单采血液成分术或白细胞单采术获得的组合物。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是白细胞。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞或祖细胞。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是树突细胞。
10.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是从患者获得的。
11.如权利要求1或3所述的方法，其中在进行DLD后以及在对靶细胞进行转导或转染之前或之后，靶细胞与一种或更多种载体以促进或补充DLD分离的方式结合。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述一种或更多种载体在其表面上包含与所述靶细胞特异性结合的亲和剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述亲和剂是抗体、活化剂、半抗原或适体。
14.如权利要求2或3所述的方法，其中所述载体的直径与所述靶细胞的直径至少一样大。
15.如权利要求2或3所述的方法，其中所有的所述载体的直径不超过所述靶细胞的直径的50％。
16.如权利要求2或3所述的方法，其中所有的所述载体的直径是所述靶细胞的直径的至少两倍。
17.如权利要求2或3所述的方法，其中所有的所述载体的直径不超过所述靶细胞的直径的25％。
18.如权利要求2或3所述的方法，其中一组载体具有与所述靶细胞至少一样大的直径，并且第二组载体具有不超过所述靶细胞的直径的50％的直径。
19.如权利要求2或3所述的方法，其中一组载体具有所述靶细胞的直径的至少两倍的直径，并且第二组载体具有不超过所述靶细胞的直径的25％大的直径。
20.如权利要求2或3所述的方法，其中所述载体由胶原蛋白或多糖制成。
21.如权利要求2或3所述的方法，其中所述载体由明胶或藻酸盐制成。
22.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物从患者获得，并且从获得所述粗流体组合物完成的时间到所述靶细胞首次与载体结合，历时不超过4小时。
23.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物是来源于患者血液的单采血液成分术产物或白细胞单采术产物，并且从单采血液成分术或白细胞单采术完成的时间到所述靶细胞首次与载体结合，历时不超过4小时。
24.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述粗流体组合物从患者获得，并且从获得所述粗流体组合物完成的时间到靶细胞首次被转染或转导，历时不超过5小时。
25.如权利要求1或3所述的方法，其中在步骤b)中工程化所述靶细胞之前，进行亲和分离步骤。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述亲和分离步骤包括使用含有靶特异性抗体的磁珠。
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