CN115209996A - 用于处理颗粒和细胞的微流体盒 - Google Patents

Abstract

本文描述了一种用于从样品中的污染物中纯化预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的微流体盒，所述盒包括第一平面支撑件和第二平面支撑件，所述第一平面支撑件和所述第二平面支撑件各自具有顶表面和底表面，其中所述第一平面支撑件和/或所述第二平面支撑件的所述顶表面包括从一个或多个入口延伸至一个或多个出口的至少一个嵌入通道；所述至少一个嵌入通道包括多个障碍物，其中所述微流体盒包括至少一个空隙空间，所述空隙空间被配置为在将所述第一平面支撑件和所述第二平面支撑件组装到所述微流体盒中时变形。

Description

用于处理颗粒和细胞的微流体盒

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月28日提交的美国临时申请系列号62/954,478的权益，其全文通过引用并入本文。

背景技术

用于个性化疗法的细胞制备通常需要从患者身上收集生物材料，从收集的材料中纯化特定细胞类型，以及对纯化的细胞进行工程化或培养。在CAR T细胞疗法的情况下，通常需要处理大量血液或血液衍生的单采或白细胞单采制剂以获得适合基因工程化和扩增的T细胞制剂。微流体基于尺寸的程序提供了一种快速、温和且多功能的处理选项。然而，有一些因素，包括在微流体装置操作过程中的生物碎片沉积，可能会减慢处理速度并导致纯化效果较差。因此，开发性能更好的装置和更好的方法来提高生物材料的纯化速度是非常有意义的。

发明内容

本文描述了某些与微流体装置一起使用的分离盒，其经过改进以允许制造具有精细特征(诸如用于基于尺寸的分离的柱或障碍物、用于细胞的围栏(holding pens)和其他微流体特征)的盒。还描述了某些与微流体装置一起使用的分离盒，其经过改进以允许在具有多个泳道(lane)或通道(channel)的盒中的流体流动，诸如延伸一定长度以防止不希望的混合、由于不希望的混合导致的湍流以及归因于一些正排量泵的输送脉冲性质的分隔壁。

本文在一个方面描述了一种用于从样品中的污染物中纯化预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的微流体盒，该盒包括第一平面支撑件和第二平面支撑件，第一平面支撑件和第二平面支撑件各自具有顶表面和底表面，其中第一平面支撑件和/或第二平面支撑件的顶表面包括从一个或多个入口延伸至一个或多个出口的至少一个嵌入通道；至少一个嵌入通道包括多个障碍物。

在某些实施方案中，微流体盒包括至少一个空隙空间，该空隙空间被配置为在将第一平面支撑件和第二平面支撑件组装到微流体盒中时变形。在某些实施方案中，第一平面支撑件和第二平面支撑件的底表面包括至少一个空隙空间，该空隙空间被配置为当第一平面支撑件的底部被压向第二平面支撑件的底部时变形。在某些实施方案中，至少一个空隙空间被配置为防止至少一个嵌入通道、一个或多个入口、一个或多个出口、多个障碍物或其组合的损坏、位移或变形。在某些实施方案中，至少一个空隙空间被配置为防止多个障碍物的损坏、位移或变形。在某些实施方案中，微流体盒包括1:1比例的空隙空间与通道。在某些实施方案中，至少一个空隙空间包括的总表面积为至少一个嵌入通道的总表面积的至少约90％。在某些实施方案中，至少一个空隙空间包括的总表面积为至少一个嵌入通道的总表面积的至少约100％。在某些实施方案中，至少一个空隙空间包括的总表面积为至少一个嵌入通道的总表面积的至少约110％。在某些实施方案中，至少一个空隙空间被分隔成两个或更多个空隙空间，该两个或更多个空隙空间定位在第一平面支撑件和/或第二平面支撑件的底表面上与障碍物阵列相对。在某些实施方案中，平面支撑件由黏合在一起的两层材料制成。在某些实施方案中，微流体盒还包括障碍物黏合层，该障碍物黏合层黏合到平面支撑件的表面并黏合到至少一个嵌入通道中的多个障碍物的顶表面，以防止流体或样品在盒操作期间流动溢过多个障碍物。在某些实施方案中，障碍物黏合层包括与至少一个嵌入通道的一个或多个入口流体连接的允许样品流入至少一个嵌入通道的一个或多个通路和与至少一个嵌入通道的一个或多个出口流体连接的允许流体从一个或多个出口流出的一个或多个通路。在某些实施方案中，定位障碍物以限定盒的临界尺寸，使得当样品被施加到盒的入口并流向出口时，样品中大于临界尺寸的颗粒或细胞与样品中小于临界尺寸的颗粒或细胞分离。在某些实施方案中，一个或多个出口包括至少一个产物出口，其中尺寸大于盒的临界尺寸的靶颗粒或靶细胞被引导至至少一个产物出口。在某些实施方案中，一个或多个出口包括至少一个废物出口，而尺寸小于盒的临界尺寸的污染物流向至少一个废物出口。在某些实施方案中，多个障碍物具有菱形或细长菱形形状。在某些实施方案中，多个障碍物具有圆形或椭圆形形状。在某些实施方案中，多个障碍物具有六边形形状。在某些实施方案中，多个障碍物垂直于流体流动方向伸长，使得它们具有不同于它们的垂直长度(P2)的水平长度(P1)。在某些实施方案中，P1为约10μm至约160μm且P2为约5μm至约80μm。在某些实施方案中，P1为约10μm至约80μm且P2为约15μm至约60μm。在某些实施方案中，P1为约15μm至约30μm且P2为约25μm至约45μm。在某些实施方案中，P1为约40μm且P2为约20μm。在某些实施方案中，P1比P2长50％至150％。在某些实施方案中，多个障碍物具有延伸到平行间隙中的顶点，使得间隙在任一侧侧翼是指向彼此但不彼此直接相对的一个或多个顶点。在某些实施方案中，多个障碍物具有延伸到垂直间隙中的顶点，使得间隙在任一侧侧翼是指向彼此且彼此直接相对的顶点。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少1列。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少10列。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少30列。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少50列。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少约60列。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少约50行。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少约100行。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少约300行。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少约600行。在某些实施方案中，第一平面支撑件或第二平面支撑件包括至少10个嵌入通道。在某些实施方案中，第一平面支撑件和/或第二平面支撑件包括至少20个嵌入通道。在某些实施方案中，第一平面支撑件和/或第二平面支撑件包括约28个嵌入通道。在某些实施方案中，第一平面支撑件和/或第二平面支撑件包括约30个嵌入通道。在某些实施方案中，第一平面支撑件和/或第二平面支撑件包括至少约50个嵌入通道。在某些实施方案中，微流体盒的一个或多个入口包括至少一个或多个样品入口和至少一个或多个流体入口；其中至少一个或多个样品入口通过分隔壁与至少一个或多个流体入口分开，分隔壁从一个或多个样品入口朝向出口延伸到至少一个嵌入通道中的障碍物阵列中，并且方向平行于流体流动方向。在某些实施方案中，分隔壁延伸多个障碍物长度的至少10％。在某些实施方案中，分隔壁延伸多个障碍物长度的至少20％。在某些实施方案中，分隔壁延伸多个障碍物长度的至少60％。在某些实施方案中，一个或多个入口、一个或多个出口或两者流体连接至第一蠕动泵、第二蠕动泵或两者。在某些实施方案中，第一蠕动泵和第二蠕动泵串行流体连接。在某些实施方案中，第一蠕动泵和第二蠕动泵并行流体连接。在某些实施方案中，盒由聚合物制成。

在某些实施方案中，聚合物是热塑性聚合物。在某些实施方案中，热塑性聚合物选自高密度聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或环烯烃共聚物。在某些实施方案中，热塑性聚合物是环烯烃共聚物。

本文在一个方面描述了一种用于从样品中的污染物中纯化预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的微流体盒，该盒包括第一平面支撑件和第二平面支撑件，第一平面支撑件和第二平面支撑件各自具有顶表面和底表面，其中第一平面支撑件和/或第二平面支撑件的顶表面包括从一个或多个入口延伸至一个或多个出口的至少一个嵌入通道；至少一个嵌入通道包括多个障碍物，其中微流体盒包括至少一个空隙空间，该空隙空间被配置为在将第一平面支撑件和第二平面支撑件组装到微流体盒中时变形。在某些实施方案中，第一平面支撑件和第二平面支撑件的底表面包括至少一个空隙空间，该空隙空间被配置为当第一平面支撑件的底部被压向第二平面支撑件的底部时变形。在某些实施方案中，至少一个空隙空间被配置为防止至少一个嵌入通道、一个或多个入口、一个或多个出口、多个障碍物或其组合的损坏、位移或变形。在某些实施方案中，至少一个空隙空间被配置为防止多个障碍物的损坏、位移或变形。在某些实施方案中，微流体盒包括1:1比例的空隙空间与通道。在某些实施方案中，至少一个空隙空间包括的总表面积为至少一个嵌入通道的总表面积的至少约90％。在某些实施方案中，至少一个空隙空间包括的总表面积为至少一个嵌入通道的总表面积的至少约100％。在某些实施方案中，至少一个空隙空间包括的总表面积为至少一个嵌入通道的总表面积的至少约110％。在某些实施方案中，至少一个空隙空间被分隔成两个或更多个空隙空间，该两个或更多个空隙空间定位在第一平面支撑件和/或第二平面支撑件的底表面上与障碍物阵列相对。在某些实施方案中，平面支撑件由黏合在一起的两层材料制成。在某些实施方案中，微流体盒还包括障碍物黏合层，该障碍物黏合层黏合到平面支撑件的表面并黏合到至少一个嵌入通道中的多个障碍物的顶表面，以防止流体或样品在盒操作期间流动溢过多个障碍物。在某些实施方案中，障碍物黏合层包括与至少一个嵌入通道的一个或多个入口流体连接的允许样品流入至少一个嵌入通道的一个或多个通路和与至少一个嵌入通道的一个或多个出口流体连接的允许流体从一个或多个出口流出的一个或多个通路。在某些实施方案中，定位障碍物以限定盒的临界尺寸，使得当样品被施加到盒的入口并流向出口时，样品中大于临界尺寸的颗粒或细胞与样品中小于临界尺寸的颗粒或细胞分离。在某些实施方案中，一个或多个出口包括至少一个产物出口，其中尺寸大于盒的临界尺寸的靶颗粒或靶细胞被引导至至少一个产物出口。在某些实施方案中，一个或多个出口包括至少一个废物出口，而尺寸小于盒的临界尺寸的污染物流向至少一个废物出口。在某些实施方案中，多个障碍物具有菱形或细长菱形形状。在某些实施方案中，多个障碍物具有圆形或椭圆形形状。在某些实施方案中，多个障碍物具有六边形形状。在某些实施方案中，多个障碍物垂直于流体流动方向伸长，使得它们具有不同于它们的垂直长度(P2)的水平长度(P1)。在某些实施方案中，P1为约10μm至约160μm且P2为约5μm至约80μm。在某些实施方案中，P1为约10μm至约80μm且P2为约15μm至约60μm。在某些实施方案中，P1为约15μm至约30μm且P2为约25μm至约45μm。在某些实施方案中，P1为约40μm且P2为约20μm。在某些实施方案中，P1比P2长50％至150％。在某些实施方案中，多个障碍物具有延伸到平行间隙中的顶点，使得间隙在任一侧侧翼是指向彼此但不彼此直接相对的一个或多个顶点。在某些实施方案中，多个障碍物具有延伸到垂直间隙中的顶点，使得间隙在任一侧侧翼是指向彼此且彼此直接相对的顶点。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少1列。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少10列。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少30列。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少50列。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少约60列。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少约50行。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少约100行。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少约300行。在某些实施方案中，多个障碍物被布置成至少约600行。在某些实施方案中，第一平面支撑件或第二平面支撑件包括至少10个嵌入通道。在某些实施方案中，第一平面支撑件和/或第二平面支撑件包括至少20个嵌入通道。在某些实施方案中，第一平面支撑件和/或第二平面支撑件包括约28个嵌入通道。在某些实施方案中，第一平面支撑件和/或第二平面支撑件包括约30个嵌入通道。在某些实施方案中，第一和/或第二平面支撑件包括至少约50个嵌入通道。在某些实施方案中，微流体盒的一个或多个入口包括至少一个或多个样品入口和至少一个或多个流体入口；其中至少一个或多个样品入口通过分隔壁与至少一个或多个流体入口分开，分隔壁从一个或多个样品入口朝向出口延伸到至少一个嵌入通道中的障碍物阵列中，并且方向平行于流体流动方向。在某些实施方案中，分隔壁延伸多个障碍物长度的至少10％。在某些实施方案中，分隔壁延伸多个障碍物长度的至少20％。在某些实施方案中，分隔壁延伸多个障碍物长度的至少60％。在某些实施方案中，一个或多个入口、一个或多个出口或两者流体连接至第一蠕动泵、第二蠕动泵或两者。在某些实施方案中，第一蠕动泵和第二蠕动泵串行流体连接。在某些实施方案中，第一蠕动泵和第二蠕动泵并行流体连接。在某些实施方案中，盒由聚合物制成。

在某些实施方案中，聚合物是热塑性聚合物。在某些实施方案中，热塑性聚合物选自高密度聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或环烯烃共聚物。在某些实施方案中，热塑性聚合物是环烯烃共聚物。

还描述了一种微流体组装件，其包括多个微流体盒，多个微流体盒处于流体连接。在某些实施方案中，微流体盒是堆叠的。在某些实施方案中，多个微流体盒是两个。在某些实施方案中，微流体盒处于并行流体连接。在某些实施方案中，微流体盒处于串行流体连接。

还描述了一种制造微流体盒的方法，其中通过将第一平面支撑件和第二平面支撑件的底部压在一起使得障碍物阵列不变形来制造盒。在某些实施方案中，至少一个嵌入通道、障碍物或两者通过模压、热模压、辊对辊模压或注塑成型来制造。在某些实施方案中，微流体盒在制造过程中被UV光固化。本文还描述了一种用于从样品中的污染物中富集预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的方法，该方法包括：(a)获得包括靶颗粒或靶细胞和污染物的样品；(b)通过以下步骤将靶颗粒或靶细胞与污染物分离：(i)将样品施加到微流体盒上的一个或多个样品入口；(ii)使样品流向盒上的出口；以及(iii)从一个或多个出口获得富集有靶颗粒或靶细胞的产物，同时去除污染物。在某些实施方案中，靶颗粒或靶细胞的尺寸大于障碍物阵列的临界尺寸，并且至少一些污染物的尺寸小于障碍物阵列的临界尺寸，并且其中靶细胞或靶颗粒流向一个或多个产物出口，在此处获得富集有靶细胞或靶颗粒的产物，而尺寸小于障碍物阵列的临界尺寸的污染物流向一个或多个废物出口。在某些实施方案中，盒的流速为约400mL每小时。在某些实施方案中，盒的流速为至少约100mL每小时或更大。在某些实施方案中，盒的流速为至少约300mL每小时或更大。在某些实施方案中，盒的流速为约1000mL每小时。在某些实施方案中，盒的内部压力为至少约1.5磅每平方英寸或更大。在某些实施方案中，盒的内部压力为约15磅每平方英寸。在某些实施方案中，盒的内部压力为约50磅每平方英寸或更小。在某些实施方案中，盒的内部压力为约10磅每平方英寸至约20磅每平方英寸。在某些实施方案中，样品是血液或血液相关产物。在某些实施方案中，样品是单采或白细胞单采样品。在某些实施方案中，样品包括血小板作为污染物。在某些实施方案中，该方法导致从样品中去除至少80％的血小板。在某些实施方案中，该方法导致从样品中去除至少90％的血小板。在某些实施方案中，该方法导致从样品中去除至少95％的血小板。在某些实施方案中，富集的靶细胞包括白细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞包括干细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞包括外周血单个核细胞。在某些实施方案中，外周血单个核细胞包括CD3+细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括对富集的靶细胞进行基因工程化，以获得基因工程化的靶细胞。在某些实施方案中，所述基因工程化包括用重组核酸转染或转导靶细胞。在某些实施方案中，富集的靶细胞或基因工程化的靶细胞通过在体外培养它们进行扩增。

在本文中描述的另一个方面是产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞的方法，该方法包括：(a)获得包括T细胞的样品；(b)通过以下步骤将T细胞与污染物分离：(i)将样品施加到微流体盒上的一个或多个样品入口；(ii)使样品流向盒的出口；以及(iii)从产物出口获得富集有T细胞的产物；(c)对步骤b)中获得的富集产物中的T细胞进行基因工程化，以在其表面产生嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，样品是血液、单采产物或白细胞单采产物。在某些实施方案中，所述对T细胞进行基因工程化包括转染或转导靶细胞，并且通过在体外培养细胞进一步扩增基因工程化的靶细胞。

在本文描述的另一个方面是产生嵌合抗原受体(CAR)自然杀伤细胞的方法，该方法包括：(a)获得包括自然杀伤细胞的样品；(b)通过以下步骤将自然杀伤细胞与污染物分离：(i)将样品施加到微流体盒上的一个或多个样品入口；(ii)使样品流向盒的出口；以及(iii)从产物出口获得富集有自然杀伤细胞的产物；(c)对步骤b)中获得的富集产物中的自然杀伤细胞进行基因工程化，以在其表面产生嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，样品是血液样品、单采产物或白细胞单采产物。在某些实施方案中，所述对自然杀伤细胞进行基因工程化包括转染或转导靶细胞，并且将基因工程化的靶细胞通过在体外培养细胞进一步扩增。

从以下详细说明中，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案。如将认识到的，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，应该认为附图和说明都是示例性的，而不是限制性的。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以相同的程度通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用的方式并入一样。此外，US5,427,663；US 5,837,115；US 6,685,841；US 6,913,697；US7,150,812；US7,276,170；US 7,318,902；7,472,794；US 7,735,652；US 7,988,840；US 8,021,614；US 8,282,799；US 8,304,230；US8,579,117；US 10/324,011；US 2005/0282293；US 2006/0134599；US 2007/0160503；US 2006/0121624；US 2005/0266433；US2007/0026381；US2007/0026413；US 2007/0026414；US2007/0026415；US 2007/0026417；2007/0059680；US2007/0059718；US 2007/0059781；US 2007/0059774；US 2007/0099207；US2007/0196820；US 2006/0223178；US 2008/0124721；US2008/0090239；US 2008/0113358；US 2014/0342375；US2016/0139012；US 2019/0071639；和WO 2012094642中的每一个通过引用以其全文并入本文。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包括的公开内容相矛盾的范围内，说明书旨在取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。

附图说明

本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下阐述其中利用了本发明的原理的说明性实施方案以及附图(在此也为“图(figure)”和“图(FIG.)”)的详细描述，可以更好地理解本发明的特征和优点，所述附图是：

图1A-1G示出了DLD的不同操作模式。

图2示出了通道的各种使用，其具有相对于图1A-1C中所示的障碍物阵列的可替代障碍物阵列。

图3A-3D示出了装置的实施方案，该装置包括可用于微流体装置中的14个平行通道的布置。

图4A-4D示出了2个通道。图4B-4D示出了通道的区段的放大视图。

图5是“凸块阵列”装置的横截面图，该装置具有安置在微流体通道中的等边三角形形状的障碍物。

图6A-6B示出了菱形柱的阵列。

图7A-7C描绘了堆叠的分离组装件，其中两个微流体装置组合成单个单元。

图8A-8B描绘了可能在图7中描绘的装置中找到的两个通道。图8B中示出了通道的区段的放大视图。在此示例中，通道具有不对称间隔的菱形障碍物阵列，其中G1大于G2。菱形是偏移的，因此每个连续的行都相对于前一行横向位移。

图9显示了壳内的微流体装置的堆叠组装件，其连同壳一起可称为“匣”。

图10A和10B显示了由两个壁界定的通道，其具有样品入口和流体入口。

图11是两个等边三角形柱(左分图)之间的归一化速度流和两个圆形柱(右分图)之间的归一化速度流的比较。

图12是三角形(下线)和圆形(上线)障碍物阵列的预测临界直径与阵列倾斜角(ε)的关系图。

图13是示出了倾斜角(图中的“阵列倾斜度”)对间隙长度G的影响的图。

图14是示出了障碍物边缘圆度(表示为r/S)对在由边缘界定的间隙的一侧上表现出的临界尺寸的影响的图。

图15是示出了施加的压力对在具有三角形柱的凸块阵列(数据显示为三角形)和具有圆形柱的凸块阵列(数据显示为圆形)中颗粒速度的影响的图。

图16A和16B：显示了包括6层的单盒DLD元件的横截面视图：2层DLD微柱、2层用于射流进样器通道的空隙空间褶皱区和2层末端层。图16B显示了由细长菱形或六边形柱阵列组成的非限制性示例DLD层的俯视图。

图17A-C显示了装载到装置匣中的2个DLD元件盒的照片的俯视图。图17B显示了装载到装置匣中的DLD盒的左侧俯视图。图17C显示了装载到装置匣中的DLD盒的右侧俯视图。

图18A和B显示了空隙空间的布置的具体实施方案，其显示了平面支撑件的底部视图(18A)和横截面视图(18B)。

图19A和B显示了当平面支撑件被堆叠以形成微流体盒时的空隙空间的替代实施方案(显示横截面视图)。

具体实施方式

本发明主要涉及基于尺寸的微流体分离，尤其涉及DLD在制备具有治疗价值的细胞中的用途。本文提供了有关制造和使用微流体装置以及使用DLD进行涉及生物材料的分离的指南。

虽然本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，对本领域技术人员将是显而易见的是，仅通过举例的方式来提供这样的实施方案。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员清楚许多变型、改变和替代。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在两个或更多个数值的系列中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等同于大于或等于1，大于或等于2，或大于或等于3。

当术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”在两个或更多个数值的系列中的第一个数值之前时，术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等同于小于或等于3，小于或等于2，或小于或等于1。

定义

单采：如本文所用，该术语是指将来自患者或供体的血液分离成其组分(例如，白细胞、血小板和红细胞)的过程。“单采样品”是该程序的最终结果。更具体的术语是“血小板单采”(指血小板的分离)和“白细胞单采”(指白细胞的分离)。在本文中，术语“分离”是指获得与全血或其他起始材料相比富集有特定组分的产物，并且不意味着已达到绝对纯度。

CAR T细胞：术语“CAR”是“嵌合抗原受体”的首字母缩写词。因此，“CAR T细胞”是经过基因工程化以表达嵌合受体的T细胞。

CAR T细胞疗法：该术语是指使用CAR T细胞治疗疾病或病症的任何程序。可以治疗的疾病包括血液肿瘤和实体肿瘤、自身免疫性疾病和传染病。

载体：如本文所用，术语“载体”是指介质，例如，珠或颗粒，由生物或合成材料制成，添加到制剂中以直接或间接结合(即，通过一个或多个中间细胞、颗粒或化合物)到存在的一些或所有化合物或细胞。载体可由多种不同材料制成，包括DEAE-葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、胶原蛋白和藻酸盐，通常尺寸为1-1000μm。它们可以是包被的或未包被的，并且具有可以被修饰以包括识别抗原或细胞表面其他分子的亲和介质(例如，抗体、激活剂、半抗原、适体、颗粒或其他化合物)。载体也可以被磁化并且它们可以包括赋予细胞或细胞复合物非尺寸相关的次级特性的颗粒(例如，Janus或草莓样颗粒)。例如，颗粒可产生可用于下游过程(诸如磁分离、电穿孔、基因转移和/或特定分析化学过程)的化学、电化学或磁性特性。颗粒还可能引起细胞代谢变化、激活细胞或促进细胞分裂。

“以促进DLD分离的方式”结合的载体：该术语是指载体和结合载体的方法，它们会根据情况影响细胞、蛋白质或颗粒在DLD期间的行为方式。具体来说，“以促进DLD分离的方式结合”意味着：a)结合必须表现出对特定靶细胞类型、蛋白质或颗粒的特异性；以及b)结合必须产生复合物，相对于未结合的细胞、蛋白质或颗粒，该复合物的尺寸增加。在与靶细胞结合的情况下，必须增加至少2μm(或者以百分比表示时增加至少20、50、100、200、500或1000％)。在治疗或其他用途需要从复合物中释放靶细胞、蛋白质或其他颗粒以实现其预期用途的情况下，术语“以促进DLD分离的方式”还要求复合物允许这样的释放，例如通过化学或酶促切割、化学溶解、消化，由于与其他结合剂竞争，或通过物理剪切(例如，使用移液管产生剪切应力)而释放，并且释放的靶细胞、蛋白质或其他颗粒必须保持活性；例如，治疗性细胞在从复合物中释放后仍必须保持使其具有治疗用途的生物活性。

载体也可以“以补充DLD分离的方式”结合：该术语是指改变细胞或细胞复合物的化学、电化学或磁性特性或改变细胞的一种或多种生物活性的载体和结合载体的方法，无论它们是否增加尺寸到足以促进DLD分离。补充DLD分离的载体不一定与靶细胞特异性结合，即它们可能必须与使它们具有特异性的一些其他介质组合，或者它们可以简单地添加到细胞制剂中并被允许非特异性结合。术语“以补充DLD分离的方式”和“以促进DLD分离的方式”并不是相互排斥的。结合既可以补充DLD分离，也可以促进DLD分离。例如，多糖载体可以在其表面上具有增加细胞生长速率的激活剂，并且这些载体中的一种或多种的结合也可以促进DLD分离。替代地，结合可能只是促进DLD分离或只是补充DLD分离。

样品：如本文所用，术语“样品”通常是指任何含有或怀疑含有核酸分子或细胞的样品。例如，样品可以是含有一种或多种核酸分子或细胞的生物样品。生物样品可以获自(例如，提取或分离)或包括：血液(例如，全血)、血浆、血清、尿液、唾液、黏膜排泄物、痰、粪便和泪液。样品可以包含血液、血液产物(诸如白细胞单采或单采产物)，该血液产物还包含抗凝剂(例如，EDTA、EGTA、肝素、柠檬酸盐、ACD-A或凝血酶抑制剂)。生物样品可以是流体或组织样品(例如，皮肤样品)。在一些示例中，样品获自无细胞体液，诸如全血。在一些示例中，样品可以包括循环肿瘤细胞。在一些示例中，样品是环境样品(例如，土壤、废物、环境空气等)、工业样品(例如，来自任何工业过程的样品)和食品样品(例如，乳制品、蔬菜产品和肉类产品)。样品可以在装载到微流体装置之前进行处理。样品可以适当地是单采产物或白细胞单采产物(例如，leukopak)。

靶细胞：如本文所用，“靶细胞”是本文描述的各种程序要求或设计用于纯化、收集、工程化等的细胞。具体细胞是什么将取决于使用该术语的上下文。例如，如果程序的目标是分离特定种类的干细胞，那么该细胞将是该程序的靶细胞。

分离或纯化：除非另有说明，否则本文所用的这些术语是同义词，并且是指所期望产物相对于不想要的材料的富集。这些术语并不一定意味着产物是完全分离的或完全纯的。例如，如果起始样品的靶细胞占样品中细胞的2％，并且执行的程序导致组合物中靶细胞占存在的细胞的60％，则该程序已成功分离或纯化靶细胞。

术语“障碍物阵列”在本文中作为同义词使用并且描述了安置在流动通道中的障碍物的有序阵列，细胞或含有颗粒的流体可以通过该流动通道。障碍物阵列包括布置成一列(沿着流体流动的路径)的多个障碍物。允许细胞或其他颗粒通过的障碍物(沿着流体流动的路径)之间形成间隙。这样的阵列或列可以布置成一个或多个重复行(垂直于流体流动的路径)。

如本文所述，“通道”或“泳道”是指布置成离散分隔单元的多个障碍物，这样的通道可以在任一侧由壁界定，从而分隔离散泳道。通道可以从一个或多个共用输入并行延伸到一个或多个共用输出。通道可以串行流体连接。

确定性横向位移：如本文所用，术语“确定性横向位移”或“DLD”是指其中颗粒基于它们的尺寸在通过微流体障碍物阵列的路径上确定性地偏转的过程。该过程可用于分离细胞，这通常是本文讨论的情况。然而，重要的是要认识到DLD也可用于浓缩细胞和用于缓冲液交换(参见图1)。过程在本文中通常根据连续流动来描述(DC条件；即，主体流体流动仅在一个方向上)。然而，DLD也可以在振荡流下工作(AC条件；即，主体流体流动在两个方向之间交替)。

临界尺寸：通过障碍物阵列的颗粒的“临界尺寸”、“临界直径”或“预定尺寸”描述了能够跟随流体层流流动的颗粒的尺寸限制。大于临界尺寸的颗粒可能会从流体的流动路径中“撞出”，而尺寸小于临界尺寸(或预定尺寸)的颗粒将不会位移。

流体流动：如本文中结合DLD使用的术语“流体流动”和“主体流体流动”是指流体在大体方向上穿过障碍物阵列的宏观运动。这些术语没有考虑使流体绕过障碍物从而使流体继续沿大体方向移动的流体流的临时位移。

倾斜角ε：在凸块阵列装置中，倾斜角是主体流体流动方向与阵列中连续障碍物行的排列所定义的方向之间的角度(参见图5)。

阵列方向：在障碍物阵列装置中，“阵列方向”是由阵列中的连续障碍物行的排列定义的方向。如果在穿过间隙并遇到下游障碍物后，颗粒在障碍物阵列中“偏转”，则颗粒的整体轨迹遵循障碍物阵列的阵列方向(即，以相对于主体流体流动的倾斜角ε行进)。如果颗粒的整体轨迹在这些情况下遵循主体流体流动的方向，则颗粒不会被撞出。

约：如本文所用，术语“约”是指接近规定量的10％以内的量。

总体概述

本发明涉及微流体装置，其中通过使生物样品通过微流体通道中的障碍物阵列来执行基于尺寸的纯化。它部分基于这样的概念，即通过延长垂直于流体流动方向的障碍物间隙并减少平行于流体流动的间隙长度，可以更快地处理给定尺寸的细胞。

上面讨论的装置特性可以通过一系列细长形状的障碍物来实现，最优选的障碍物是菱形或六边形。六边形障碍物是最优选的，因为它们提供与菱形相同的加工优势，但导致装置更容易制造并且更耐生物淤积。

尽管使用不对称间隙提高通量并允许装置运行更长时间，但缩小平行间隙可能会给装置的大规模生产带来实际问题，特别是在模压、成型或脱模方面。通过使用多边形的细长障碍物，这个问题可以减少并且对狭窄间隙的需求在一定程度上被抵消，这些障碍物优选具有在平行间隙中指向彼此的顶点，但顶点彼此偏移(而不是直接彼此相对，参见图6A-6B)。这种设计通过使间隙更长而不是更窄来减少通过平行间隙的流量(也称为次通量)。相反，垂直间隙中的顶点优选地彼此直接相对。因此，本文公开的装置的主要特征是存在障碍物阵列，其中垂直间隙和平行间隙不对称，即，它们的尺寸不同。通过改变间距，与分离相同尺寸范围内的颗粒和细胞但具有相同长度的垂直和平行间隙的装置相比，可以降低流动阻力。

对于一些样品，当样品被送入装置时，生物淤积和流体混合可能会持续影响分离。例如，阵列入口处的生物淤积可能会迫使血液或单采样品过早地扩散到第二流体流中，从而导致白细胞靶细胞产物中的血小板和红细胞污染。定位成将样品入口与其他流体的入口分开并在通道的中途终止的分隔壁可用于隔离生物淤积区域并暂时防止流动流之间的接触。结果，共流流体具有有限的扩散混合时间，并且可以改进靶细胞或颗粒的纯化。通常，分隔壁将从样品入口延伸微流体通道长度的10％至50％的任何距离，但根据与分离相关的情况，壁可以更短或更长。

分隔壁的另一个优点是它们减少了在使用波动压力源推动样品和其他流体通过装置时可能发生的不需要的混合。例如，蠕动泵可用于驱动流体通过装置，并具有保持封闭系统环境的优点，即，样品不接触泵的内部，而仅通过被泵头挤压的管道行进。然而，蠕动可能会产生有规律的压力波动，这往往会导致流动流混合。当存在分隔壁时，它可以作为这些波动的挡板，限制否则会发生的不需要的混合。结果，应该实现改进的分离。

本微流体装置的另一个特征是它们可以用作组装件的一部分，其中两个或更多个装置堆叠在一起并通过公共歧管进样。每个堆叠的微流体装置包括具有一个或多个嵌入通道的平面支撑件，每个通道包含单独的障碍物阵列。支撑件通常具有多个通道，在某些情况下，这些通道可以嵌入支撑件的顶表面和底表面。在组装件中的一个或多个装置上使用多个通道可以对大量样品进行微流体处理。例如，本文所述的微流体装置的组装件可以设计为每小时处理大于100mL的样品(例如，未稀释的单采样品)，这取决于具体的处理目标，更大的体积(大于200、300、400或500mL每小时)是优选的。

总的来说，本发明的装置的特征在于以下一些或全部：1)不对称布置的障碍物，其中垂直于主体流体流动的间隙与平行于主体流体流动的间隙长度不同；2)顶点延伸到间隙中的细长多边形障碍物；3)平行间隙任一侧的相对于彼此偏移的顶点；4)垂直间隙任一侧的优选彼此直接相对的顶点；5)一个或多个分隔壁，其将样品入口与其他流体的入口分隔开，并沿通道部分向下延伸；6)任选地使用蠕动或其他波动压力源，以推动样品和其他流体通过具有分隔壁的装置；以及7)将多个单独的微流体装置组装成堆叠组装件，每个装置具有多个通道。

具体实施方案概述

在第一方面，本发明涉及一种用于从样品中的污染物中纯化预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的微流体装置。该装置具有通常为矩形的平面支撑件，并且可以由与分离方法兼容的任何材料制成，包括硅、玻璃、混合材料或(优选地)聚合物。支撑件将具有顶表面和底表面，其中之一或两者具有从一个或多个样品入口和一个或多个不同流体入口延伸至一个或多个产物出口和一个或多个不同废物出口的至少一个嵌入通道。流体入口(与样品入口相反)有时可称为“缓冲液”或“洗涤”入口，并且根据分离的目标，可用于将各种流体输送到通道中。除非使用或上下文另有说明，否则应理解“流体”可以是缓冲液，包含试剂，构成细胞的生长培养基或通常是任何液体，并且包含与装置操作和用户目标兼容的任何组分。

当流体通过样品或流体入口被施加到装置上时，它会通过通道流向出口，从而定义主体流体流动的方向。为了分离不同尺寸的细胞或颗粒，通道包括排列成沿通道纵向延伸(从入口到出口)的列和穿过通道横向延伸的行的障碍物阵列。随后的每一行障碍物相对于前一行横向移动，从而定义了阵列方向，该方向偏离主体流体流动的方向一个倾斜角(ε)。障碍物被定位以便限定临界尺寸，使得当样品被施加到装置的入口并流向出口时，样品中大于临界尺寸的颗粒或细胞遵循阵列方向，并且小于临界尺寸的颗粒在主体流体流动方向上流动，从而导致分离。

阵列中的一行中的相邻障碍物由间隙G1隔开，间隙G1垂直于主体流体流动方向，而一列中的相邻障碍物由间隙G2隔开，间隙G2平行于主体流体流动方向(参见图6A和6B)。本装置的一个特征是间隙G2的尺寸与间隙G1的尺寸之比不等于1，G1通常比G2宽(例如，宽10-100％)。阵列中的每个障碍物都具有至少两个顶点，并且被定位为使得每个间隙的任一侧都有至少一个顶点。在优选实施方案中，顶点延伸到平行间隙中，使得间隙的任一侧侧翼是一个或多个指向彼此但不直接相对的顶点，并且/或者障碍物具有延伸到垂直间隙中的顶点，使得间隙的任一侧侧翼是指向彼此且直接相对的顶点(参见图6A和6B)。

微流体装置通常还具有障碍物黏合层，该障碍物黏合层黏合到平面支撑件的表面并黏合到通道中的障碍物以防止流体或样品在装置操作期间流动溢过障碍物。障碍物黏合层可以包括一个或多个通路，该一个或多个通路与通道的入口和通道的出口流体连接，其允许流体流动。

一般而言，微流体装置将用于将尺寸大于装置临界尺寸的靶颗粒或靶细胞与尺寸小于临界尺寸的污染物分离。当含有靶细胞或颗粒的样品通过样品入口被施加到装置上并流体地通过通道时，靶细胞或靶颗粒将流向一个或多个产物出口，在此处获得富集有靶细胞或靶颗粒的产物。在本上下文中使用的术语“富集”是指产物中靶细胞或颗粒与污染物的比率高于样品中的比率。尺寸小于临界尺寸的污染物将主要流向多一个或多个废物出口，在此处它们可以被收集或丢弃。

尽管分离的目的通常是将靶细胞或颗粒与较小的污染物分离，但有时用户可能希望将靶细胞或颗粒与较大的污染物分离。在这些情况下，可以使用临界尺寸大于靶细胞或颗粒但小于污染物的微流体装置。两个或更多个具有不同临界尺寸的障碍物阵列的组合，无论是在单个装置上还是在多个装置上，也可以用于分离。例如，装置可以具有通道，其具有临界尺寸大于T细胞但小于粒细胞和单核细胞的第一障碍物阵列和临界尺寸小于T细胞但大于血小板和红细胞的第二阵列。在这样的装置上处理血液样品允许收集其中T细胞已与粒细胞、单核细胞、血小板和红细胞分离的产物。障碍物阵列的顺序对结果不应该很重要，即，具有较小临界尺寸的阵列可能位于具有较大临界尺寸的阵列之前或之后。具有不同临界尺寸的阵列也可以位于细胞通过的单独装置上。

宽阵列和多个出口可用于收集多种产物，例如，单核细胞可在一个出口获得，而T细胞可在不同的出口获得。因此，使用多个阵列和多个出口可以允许同时收集比如果使用单个阵列时更纯的几种产物。如下文进一步讨论的，可以通过使用堆叠在一起的许多装置来维持高通量。

优选地，在微流体装置中使用的障碍物具有多边形形状，优选菱形或六边形形状的障碍物。障碍物通常也会被拉长，使得它们垂直于主体流体流动的长度(P1)与它们平行于主体流体流动的宽度(P2)不同(P1通常更长)，例如，差异10-100％(参见图6B)。通常，P1将比P2长至少15％、30％、50％、100％或150％。以范围表示，P1可以比P2长10-150％(15-100％；或20-70％)。

微流体装置还可以包括从装置的样品入口延伸到通道中的障碍物阵列中的分隔壁，在样品入口处它将样品入口与流体入口分开并防止混合(参见图10A和10B)。分隔壁的取向平行于主体流体流动的方向，并朝向样品和流体出口延伸。壁在到达通道末端之前终止，允许此后样品和流体流相互接触。它通常应以障碍物阵列长度的至少10％的距离延伸，但可以延伸阵列的至少20％、40％、60％或70％。以范围表示，壁通常会延伸障碍物阵列长度的10-70％。多于一个的分隔壁也可以存在于装置中，并且取决于分离的目的，可以以不同的方式定位。

为了增加可以处理体积的速率，可以通过用一个或多个堆叠的装置覆盖第一微流体来制造堆叠的分离组装件，其中每个堆叠的装置的底表面与第一微流体装置的顶表面或者顶表面上的障碍物黏合层接触，或与另一个堆叠的装置的顶表面或顶表面上的障碍物黏合层接触。通过第一公共歧管将样品提供给所有装置的样品入口，并且通过可能与第一歧管相同或可能不同的第二歧管将流体供应至流体入口。将产物通过一个或多个产物导管从产物出口去除，并且将废物通过一个或多个不同于产物导管的废物导管从废物出口去除。通常，堆叠的分离组装件将具有2至9个堆叠的装置以及第一微流体装置。然而，也可以使用更多数量的装置。此外，支持物的顶表面和/或底表面可以具有多个(例如，2-40或2-30)嵌入通道并且用于纯化靶颗粒或靶细胞。

堆叠的分离组装件可以具有附接至第一微流体装置的底表面和/或堆叠的微流体装置的顶表面的储器黏合层。储器黏合层应包括具有允许流体流入通道上的入口的一个或多个通路的第一端，以及任选地，在与第一端相对的第二端处的允许流体流入或流出通道的产物出口和废物出口的一个或多个通路，这些通路由不透流体的材料隔开。

如图9所示，堆叠的装置组装件可以支撑在匣中，其特征在于存在带有端口的外壳，该端口允许将样品和流体输送到匣中以及将产物和废物从匣中输送出来。该图显示了带有两个入口端口和两个出口端口的匣。然而，可以使用进出匣的多个端口，并且可以基本上同时收集几个产物。还将认识到，匣可以是系统的一部分，其中存在本领域公知和常用的组件。这样的常见组件包括用于控制流体流动的泵、阀和处理器；用于监测系统参数(诸如流量和压力)的传感器；用于监测流体特性(诸如pH值或盐度)的传感器；用于确定细胞或颗粒浓度的传感器；和用于确定匣中或从匣中收集的材料中存在的细胞或颗粒的类型的分析仪。更一般地，可以使用本领域已知的并且与匣、被处理的材料和处理目标兼容的任何设备。

在另一个方面，本发明涉及一种用于从污染物中纯化预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的方法，该方法通过获得包括靶颗粒或靶细胞和污染物的样品并使用本文讨论的任何微流体装置或堆叠的分离组装件进行纯化。通过将样品施加到以上讨论的任何微流体装置上的一个或多个样品入口或施加到第一微流体装置或装置组装件中的堆叠的装置上的样品入口来完成纯化。可以使用歧管将样品施加到入口，特别是在使用堆叠的装置时。然后样品通过通道流向装置的出口。通常，靶颗粒或靶细胞的尺寸将大于装置上障碍物阵列的临界尺寸，并且至少一些污染物的尺寸将小于临界尺寸。结果，靶细胞或靶颗粒将流向一个或多个产物出口，在此处获得富集有靶细胞或靶颗粒的产物，而尺寸小于临界尺寸的污染物将流向一个或多个废物出口。然而，如前所述，可能存在靶细胞或靶颗粒小于污染物并且选择临界尺寸大于靶细胞或颗粒且小于污染物的装置的情况。在这些情况下，装置的一般操作将基本相同，但污染物将沿阵列方向流动，并且靶细胞或颗粒将沿主体流体流动方向前进。

样品可获自个体或患者，尤其是患有癌症、自身免疫性疾病或传染病的患者。在某个实施方案中，样品是血液或来源于血液(例如，单采或白细胞单采样品)，并且靶细胞是树突状细胞、白细胞(尤其是T细胞)、干细胞、B-细胞、NK-细胞、单核细胞或祖细胞。在这些情况下，污染物通常包括红细胞和/或血小板。纯化应产生富集靶细胞的产物，并且其中样品中至少80％(优选90％，更优选95％)的血小板和/或红细胞已被去除。

一旦获得纯化的靶细胞，就可以通过用重组核酸转染或转导它们进行基因工程化。然后，它们可以任选地在培养中扩增，并最终用于治疗从中获得样品的患者。

特别有意义的是，本发明包括用于产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞的方法，该方法是通过：a)获得包括T细胞的样品；b)通过将样品施加到本文讨论的任何微流体装置或堆叠的装置上的一个或多个样品入口，将T细胞与污染物分离；c)使样品流向装置的出口；以及d)从产物出口获得富集有T细胞的产物。一旦回收T细胞，就对其进行基因工程化，优选通过用重组核酸转染或转导它们，以便它们在其表面表达嵌合抗原受体。将基因工程化的靶细胞通过在体外培养细胞进行扩增，并且可以治疗性地施用于提供样品的患者。

含有T细胞的样品优选是来自患有癌症、自身免疫性疾病或传染病的患者或来自HLA匹配的(与待治疗的患者匹配的)供体的血液、单采产物或白细胞单采产物。细胞可以以促进或补充DLD分离的方式与一种或多种载体结合，然后可以通过DLD纯化细胞或复合物。本发明包括制造的CAR T细胞和其中使用CAR T细胞的CAR T细胞疗法。

I.设计微流体盒

本公开内容提供用于纯化颗粒或细胞的微流体盒(即装置、芯片、匣、板、微流体装置、盒、DLD装置等)。本公开内容的微流体盒可以使用DLD方法操作。本公开内容的微流体盒可以由聚合材料(例如，热塑性塑料)形成，并且可以包括具有顶表面和底表面的第一平面支撑件和具有顶表面和底表面的第二平面支撑件中的一个或多个，其中第一和第二平面支撑件的顶表面包括从一个或多个入口延伸至一个或多个出口的至少一个嵌入通道；至少一个嵌入通道包括障碍物阵列，其中第一平面支撑件和第二平面支撑件的底表面包括空隙空间，空隙空间被配置为当第一平面支撑件的底部被压向第二平面支撑件的底部时变形。本公开内容的微流体盒可以是单次使用或一次性装置。作为替代方案，微流体盒可以是多次使用装置。使用聚合物(例如，热塑性塑料)来形成微流体结构可以允许使用廉价且高度可扩展的软模压工艺，而空隙空间可以提供改进的快速制造能力并避免在制造过程中损坏障碍物(即柱、DLD阵列等)。

本文所述的盒可通过确定性横向位移或DLD操作。参考图1A-1G，DLD可以包括三种不同的操作模式。操作模式包括：i)分离(图1A)，ii)缓冲液交换(图1B)和iii)浓缩(图1C)。在每种模式中，高于临界直径的颗粒从进入点沿阵列方向偏转，从而根据装置的几何形状进行尺寸选择、缓冲液交换或浓缩。在所有情况下，低于临界直径的颗粒在层流条件下直接通过装置并随后离开装置。图1D显示了用于分离模式的14泳道DLD设计。微流体盒的分离区的全长可以为约75mm并且宽度可以为约40mm，每个单独的通道的宽度为约1.8mm。图1E-1F是塑料菱形柱阵列和出口的合并收集端口的放大视图。图1G描绘了使用装置在10PSI下处理的白细胞单采产物。

本文所述的盒可以以多个方向布置以实现不同的DLD模式或产物结果(图2)。图2显示了四个通道，带有侧壁(1)和障碍物阵列(2)。含有血液、细胞或颗粒的样品通过顶部的样品入口(3)进入通道，缓冲液、试剂或介质在单独的流体入口(4)进入通道。当它们流向通道底部时，尺寸大于阵列临界直径(>Dc)的细胞或颗粒以由障碍物的阵列方向确定的角度流动，并与尺寸小于阵列临界直径(<Dc)的细胞和颗粒分离。

参考图3A-3D，盒的实施方案可以包括14个平行通道的布置，这些通道可以用于微流体装置或盒中。图3B-3D示出了盒的区段的放大视图。在此图中，通道具有间隙逐渐变小的三个区(区段)。盒有共用样品入口，例如，用于血液，它将样品送入每个通道上的入口。缓冲液通道有单独的入口，但根据处理目标，其可用于将带有试剂、生长培养基的流体或其他流体引入通道。在每个通道的底部有产物出口，产物出口通常用于回收尺寸大于通道中障碍物阵列临界直径的靶细胞或颗粒。各个通道的出口送入共用产物出口，靶细胞或颗粒可从该共用产物出口回收。还显示了废物出口，其中尺寸低于通道中障碍物阵列临界直径的细胞和颗粒排出。

参考图4A-4D，盒的实施方案可以包括2个通道。图4B-4D示出了通道的区段的放大视图。通道具有三个区段，其被设计以具有逐渐减小直径的障碍物和间隙。

一些盒可能具有“凸块阵列”，该“凸块阵列”具有安置在微流体通道中的等边三角形障碍物，如图5的横截面图所示。在图中，流体按从左到右的方向流动，如标有“流体”的箭头所示。在该阵列中，等边三角形柱以相对于流体流动方向倾斜的平行四边形格子布置安置。也可以使用其他格子布置(例如，正方形、矩形、梯形、六边形等格子)。选择倾斜角∈(epsilon)，因此装置是周期性的。在该实施方案中，18.4度(1/3弧度)的倾斜角使装置在三行之后呈周期性。倾斜角ε还表示阵列方向偏离流体流动方向的角度。柱之间的间隙用等边三角形边长S表示为G。显示在柱之间延伸的流线，将柱之间的流体流动分成相等体积流量的三个区域(“流管”)。当流体流动沿所示方向时，相对较大的颗粒(尺寸大于阵列的临界尺寸)会遵循阵列倾斜角。相对较小的颗粒(尺寸小于阵列的临界尺寸)遵循流体流动方向。

本文提供的盒可以包括菱形柱阵列，如图6A-6B中所示。图6A显示了对称的障碍物阵列，其中垂直于流体流动方向的间隙(例如，间隙1(G1))和平行于流体流动的方向的间隙(例如，间隙2(G2))的长度大致相同。菱形障碍物可能有两种直径，一种垂直于流体流动方向(P1)，另一种平行于流体流动方向(P2)。该图的右侧显示了不对称阵列，其中平行间隙比垂直间隙短。尽管与对称阵列相比，非对称阵列中的G1已加宽，但间隙G2的减小导致阵列的临界直径与对称阵列相同。因此，这两个阵列在分离样品中给定直径的颗粒或细胞方面应该大致相同有效。然而，G1的加宽允许更高的样品通量并减少通道堵塞。图6B在左侧显示了菱形障碍物阵列，这些障碍物已经被拉长，使得它们的垂直直径比它们的水平直径长。图6的中间区段显示了已拉长使其水平直径大于其垂直直径的菱形柱，图的最右侧区段显示了已水平拉长的六边形障碍物。

参考图7A-7C，本文描述的盒可以包括堆叠的分离组装件，其中两个微流体装置或盒组合成单个单元。最上面的装置(5)包括平面支撑件(6)，平面支撑件(6)可以使用多种材料制成，但最优选是聚合材料并且平面支撑件(6)具有顶表面(7)和底表面(12)。支撑件的顶表面(7)包含储器，这些储器提供在支撑件一端的样品入口(9)和缓冲液或其他流体入口(10)和在另一端的产物出口(14)和废物出口(13)。每个储器使用小通孔((9)、(10)、(13)、(14)的内部)通过支撑件流体连接，该小通孔将顶表面(7)连接到底表面(12)上的通道。支撑件的底表面(12)有许多嵌入的微流体通道(8)，每个通道都有由通道连接的障碍物阵列(参见图1A-1C、2、3B-3D、4B-4D、5、6A和6B和8B)。嵌入的微流体层与障碍物黏合层(15)黏合，障碍物黏合层(15)密封第一装置并防止流体在操作期间流动溢过障碍物。堆叠中的第二微流体装置显示为(16)，它在最顶部表面包含嵌入的微流体通道，并由与最顶部装置相同的障碍物黏合层(15)密封。储器黏合层(18)也显示为具有细长开口(19)，细长开口(19)允许液体通过通道入口和液体通过通道出口。储器黏合层类似于障碍物黏合层，不同之处在于它附接到装置的表面而不是障碍物，并且可以连接到给装置堆叠供料的一个或多个储器或连接到歧管。显示了用于对齐堆叠的装置的孔(11)。如上所述，两个嵌入的微流体表面面对相同的障碍物黏合层。替代性配置是在两个装置的顶表面上都有嵌入的通道，在装置之间有中间层，它既用作下方嵌入通道的障碍物黏合层，又用作上方储器的分布层。图7B显示了一起形成单个组装单元的多个微流体装置的堆叠。在这个堆叠的顶部(任选地在顶部和底部)是歧管(22)，歧管(22)具有歧管入口分配器(24)的进样管(23)和从歧管产物出口(27)引出的导管(28)。通向流体入口(25)的进样管和用于从废物出口(26)排出流体的导管也将存在，但未在图中显示。图7C显示了已安装在外壳(21)中的堆叠的分离组装件(20)。

图7中描绘的装置中可能存在的两个通道也在图8A-8B中示出。图8B中示出了通道的区段的放大视图。在此示例中，通道具有不对称间隔的菱形障碍物阵列，其中G1大于G2。菱形是偏移的，因此每个连续的行都相对于前一行横向位移。

本公开内容在本文中提供了在壳(21)内的微流体装置(20)的堆叠组装件，它们一起可以被称为“匣”(图9)。端口(29)用作样品的进样口，样品通过壳进样到歧管(22)。端口(29)连接到歧管进样口(23)，歧管进样口(23)通过歧管样品入口(24)将样品分配到通道样品入口。施加后，样品流过包含障碍物阵列的通道(参见图3-6)，并且具有大于临界尺寸的颗粒或细胞的产物在歧管产物出口(27)离开堆叠装置。然后，产物从歧管出口流过产物导管(28)并通过产物出口端口(31)传送出匣。流体流入匣并通过端口(51)流向歧管，端口(51)与歧管流体进样口(49)相连。它通过歧管流体入口(25)分配到通道流体入口。流体流过通道，小于临界尺寸的颗粒或细胞主要通过歧管废物出口(26)离开堆叠装置。然后，这些颗粒或细胞流过废物导管(50)，废物导管(50)通过出口端口(30)将废物从匣中传送出来。

本文提供的盒或装置的一个实施方案可以包括由两个壁(32)界定的通道，该通道具有样品入口(33)和流体入口(34)(图10A-B)。存在分隔壁(35)以防止样品流动流与流体流动流混合。分隔壁延伸进入障碍物阵列(36)并在大约一半处结束。阵列中的箭头显示尺寸大于阵列临界尺寸的靶细胞的行进方向。最初在进入障碍物阵列后，靶细胞从流体流动方向转向，直到它们到达分隔壁。然后它们沿着壁行进直到壁结束。此后，它们继续转向，直到它们在产物出口(37)处离开通道。尺寸小于障碍物阵列临界尺寸的颗粒不会转向并在废物出口(38)处离开通道。图10B还显示了由壁(43)界定的通道，该通道具有样品入口(39)、试剂入口(40)和缓冲液或其他流体的入口(42)。样品在入口进入并流到障碍物阵列(44)上。在那里，大于阵列临界直径的颗粒或细胞转向到试剂流中，在那里它们发生反应。分隔壁(41)从试剂入口沿障碍物阵列(44)部分向下延伸，并将试剂流与缓冲液流或其他流体流分开。该壁将试剂流中的细胞或颗粒保持更长的时间，从而为反应提供更多时间。在分隔壁的末端，颗粒或细胞继续转向到产物出口(48)，在那里它们可以被收集。在此过程中，细胞或颗粒与未反应的试剂分离。第二分隔壁(45)从第一分隔壁(41)的末端延伸到废物出口(47)，在这里缓冲液或其他流体、试剂和小颗粒或细胞会离开装置并且可以被收集或丢弃。第二废物出口(46)用于去除试剂、其中样品中颗粒或细胞悬浮的流体以及小于障碍物阵列临界直径的颗粒或细胞。这些材料可以被回收或丢弃。

可以对两个等边三角形柱(左分图)之间的归一化速度流和两个圆形柱(右分图)之间的归一化速度流进行比较(图11)，证明障碍物或柱形状的影响。图11的阴影部分表示曲线下面积的相等比例，证明流过三角形的点的颗粒的临界半径(<15％间隙宽度)明显小于流过圆柱的颗粒的临界半径(>20％间隙宽度)。

图12是三角形(下线)和圆形(上线)障碍物阵列的预测临界直径与阵列倾斜角(ε)的关系图。图12的分析进一步证明了柱形状在使图11中所示的颗粒或细胞位移方面的影响。

参考图13，可以示出倾斜角(图中的“阵列倾斜度”)对间隙长度G的影响。G_T是指三角形柱之间的间隙长度，G_C是指圆形柱之间的间隙长度。随着阵列倾斜度的增加，三角形柱和圆形柱之间的阵列特定临界尺寸(D_C)所需的间隙长度差异减小。

图14示出了障碍物边缘圆度(表示为r/S)对在由边缘界定的间隙的一侧上表现出的临界尺寸的影响。对于给定的间隙长度，增加柱的圆度会增加柱的临界尺寸值。

除了临界尺寸外，在施加恒定压力的情况下，不同形状的柱也可能影响颗粒速度。图15示出了施加的压力对在具有三角形柱的凸块阵列(数据显示为三角形)和具有圆形柱的凸块阵列(数据显示为圆形)中颗粒速度的影响。给定施加的压力，具有三角形柱的阵列将导致比具有圆形柱的阵列更大的颗粒速度。此外，随着压力的增加，颗粒速度增加的速率在三角形柱阵列中也大于圆形柱阵列。

参考图16A，本文所述的盒包括在顶部和/或底部的密封/盖1600和包括多个促进分离的的障碍物1620的分离层1605、流体层1610和允许在不使多个障碍物变形的情况下制造盒的空隙空间或褶皱区。参考图16B，多个障碍物1620可以排列成行1625和列1630，使得间隙1635被配置为允许流体和细胞的通路形成。障碍物可以排列成使得它们在重复行之间没有偏移或最小偏移地堆叠。参考图17A至C，两个或更多个盒可堆叠或串行或并行连接以实现更大的分离或更高的通量。

由于类似的装置或微流体盒在亚毫米级上运行并处理微升、纳升或更少量的流体，因此制造中的主要障碍是避免在模压或组装过程中障碍物的损坏或变形。例如，芯片的处理可能会对平面支撑件造成压力，尤其是当平面支撑件被压在一起时，这可能会导致一个或多个平面支撑件、障碍物(即障碍物阵列)以及各种分离泳道的变形或破坏。这样的变形或破坏可能导致净化颗粒或细胞方面的性能显著丧失，或者可能完全损害微流体盒的功能。为了避免制造和组装过程中的潜在变形和缺陷，其他微流体系统需要较慢的制造运行或接受降低的性能。

在一个方面，本公开内容提供了用于纯化细胞或颗粒的微流体盒。微流体盒可以包括第一平面支撑件。第一平面支撑件可以包括顶表面和底表面。装置可以包括第二平面支撑件。第二平面支撑件可以包括顶表面和底表面。顶表面可以包括从一个或多个入口延伸至一个或多个出口的至少一个嵌入通道。至少一个嵌入通道可以包括障碍物阵列。第一平面支撑件和第二平面支撑件的底表面可以包括空隙空间。空隙空间可以被配置为当第一平面支撑件的底部被压向第二平面支撑件的底部时变形。

根据本描述的分离沿着嵌入平面支撑件中的通道发生，该通道包括多个障碍物。对于本描述的盒，可以使用第一和第二平面表面。第一和第二平面表面可以堆叠(例如，底部对底部或顶部对底部，具有使通量和分离能力加倍的间隔物，同时保持小的覆盖区。第一和/或第二平面表面的顶表面可以包括至少1个嵌入通道至约500个嵌入通道。顶表面可以包括至少1个嵌入通道至约2个嵌入通道、1个嵌入通道至约5个嵌入通道、1个嵌入通道至约20个嵌入通道、1个嵌入通道至约50个嵌入通道、1个嵌入通道至约100个嵌入通道、1个嵌入通道至约500个嵌入通道、约2个嵌入通道至约5个嵌入通道、约2个嵌入通道至约20个嵌入通道、约2个嵌入通道至约50个嵌入通道、约2个嵌入通道至约100个嵌入通道、约2个嵌入通道至约500个嵌入通道、约5个嵌入通道至约20个嵌入通道、约5个嵌入通道至约50个嵌入通道、约5个嵌入通道至约100个嵌入通道、约5个嵌入通道至约500个嵌入通道、约20个嵌入通道至约50个嵌入通道、约20个嵌入通道至约100个嵌入通道、约20个嵌入通道至约500个嵌入通道、约50个嵌入通道至约100个嵌入通道、约50个嵌入通道至约500个嵌入通道或约100个嵌入通道至约500个嵌入通道。顶表面可以包括至少1个嵌入通道、约2个嵌入通道、约5个嵌入通道、约20个嵌入通道、约50个嵌入通道、约100个嵌入通道或约500个嵌入通道。顶表面可以包括至少1个嵌入通道、约2个嵌入通道、约5个嵌入通道、约20个嵌入通道、约50个嵌入通道或约100个嵌入通道。顶表面可以包括至少至多约2个嵌入通道、约5个嵌入通道、约20个嵌入通道、约50个嵌入通道、约100个嵌入通道或约500个嵌入通道。顶表面或第一或第二平面表面可以包括约28个通道(堆叠时为56个)。另外的第三、第四、第五或第六平面表面也可以包括与第一或第二平面表面相似数量的嵌入通道。

微流体盒可以包括至少1个入口至约50个入口。微流体盒可以包括至少1个入口至约2个入口、1个入口至约5个入口、1个入口至约10个入口、1个入口至约20个入口、1个入口至约50个入口、约2个入口至约5个入口、约2个入口至约10个入口、约2个入口至约20个入口、约2个入口至约50个入口、约5个入口至约10个入口、约5个入口至约20个入口、约5个入口至约50个入口、约10个入口至约20个入口、约10个入口至约50个入口或约20个入口至约50个入口。微流体盒可以包括至少1个入口、约2个入口、约5个入口、约10个入口、约20个入口或约50个入口。微流体盒可以包括至少1个入口、约2个入口、约5个入口、约10个入口或约20个入口。微流体盒可以包括至少至多约2个入口、约5个入口、约10个入口、约20个入口或约50个入口。入口可由共用流体系统或双流体系统进样(一个用于缓冲液/稀释剂，一个用于样品)。

微流体盒可以包括至少1个出口至约50个出口。微流体盒可以包括至少1个出口至约2个出口、1个出口至约5个出口、1个出口至约10个出口、1个出口至约20个出口、1个出口至约50个出口、约2个出口至约5个出口、约2个出口至约10个出口、约2个出口至约20个出口、约2个出口至约50个出口、约5个出口至约10个出口、约5个出口至约20个出口、约5个出口至约50个出口、约10个出口至约20个出口、约10个出口至约50个出口或约20个出口至约50个出口。微流体盒可以包括至少1个出口、约2个出口、约5个出口、约10个出口、约20个出口或约50个出口。微流体盒可以包括至少1个出口、约2个出口、约5个出口、约10个出口或约20个出口。微流体盒可以包括至少至多约2个出口、约5个出口、约10个出口、约20个出口或约50个出口。出口可以供给共用流体系统或双流体系统(一个用于废物，一个用于富集的靶细胞或颗粒)。

包括两个或更多个平面表面的盒可以包括空隙空间以保护泳道中的障碍物阵列，因为它们的小尺寸导致它们易于变形，从而导致故障。

微流体盒的空隙空间可以被配置为变形、弯曲、膨胀、塌陷或褶皱。空隙空间可以被配置为保护障碍物、通道、入口、出口、平面表面或它们的任何组合免受损坏、位移、变形或故障。空隙空间可以包括褶皱区，褶皱区被配置为保护障碍物、通道、入口、出口、平面表面或它们的任何组合免受损坏、位移、变形或故障。空隙空间可具有约1立方微米至约10,000立方微米的体积。空隙空间可以具有约1立方微米至约5立方微米、约1立方微米至约10立方微米、约1立方微米至约30立方微米、约1立方微米至约50立方微米、约1立方微米至约100立方微米、约1立方微米至约300立方微米、约1立方微米至约1,000立方微米、约1立方微米至约3,000立方微米、约1立方微米至约10,000立方微米、约5立方微米至约10立方微米、约5立方微米至约30立方微米、约5立方微米至约50立方微米、约5立方微米至约100立方微米、约5立方微米至约300立方微米、约5立方微米至约1,000立方微米、约5立方微米至约3,000立方微米、约5立方微米至约10,000立方微米、约10立方微米至约30立方微米、约10立方微米至约50立方微米、约10立方微米至约100立方微米、约10立方微米至约300立方微米、约10立方微米至约1,000立方微米、约10立方微米至约3,000立方微米、约10立方微米至约10,000立方微米、约30立方微米至约50立方微米、约30立方微米至约100立方微米、约30立方微米至约300立方微米、约30立方微米至约1,000立方微米、约30立方微米至约3,000立方微米、约30立方微米至约10,000立方微米、约50立方微米至约100立方微米、约50立方微米至约300立方微米、约50立方微米至约1,000立方微米、约50立方微米至约3,000立方微米、约50立方微米至约10,000立方微米、约100立方微米至约300立方微米、约100立方微米至约1,000立方微米、约100立方微米至约3,000立方微米、约100立方微米至约10,000立方微米、约300立方微米至约1,000立方微米、约300立方微米至约3,000立方微米、约300立方微米至约10,000立方微米、约1,000立方微米至约3,000立方微米、约1,000立方微米至约10,000立方微米或约3,000立方微米至约10,000立方微米的体积。空隙空间可以具有约1立方微米、约5立方微米、约10立方微米、约30立方微米、约50立方微米、约100立方微米、约300立方微米、约1,000立方微米、约3,000立方微米或约10,000立方微米的体积。空隙空间可以具有至少约1立方微米、约5立方微米、约10立方微米、约30立方微米、约50立方微米、约100立方微米、约300立方微米、约1,000立方微米或约3,000立方微米的体积。空隙空间可以具有至多约5立方微米、约10立方微米、约30立方微米、约50立方微米、约100立方微米、约300立方微米、约1,000立方微米、约3,000立方微米或约10,000立方微米的体积。空隙空间可以是约X立方微米。

参考图18A，其示出了本公开内容的平面支撑件1806的底表面1812的非限制性视图。底表面可以包括多个空隙空间1815，此处所示的这些空隙空间布置成与平面支撑件的长度平行延伸的条带。空隙空间在障碍物阵列或列(未示出)或由制造在平面支撑件的顶表面上的障碍物列(未示出)形成的泳道下方延伸。参考图18B，显示了平面支撑件1806的截面视图。平面支撑件的顶表面1807包括形成为阵列或列的多个单独的障碍物1820，形成间隙1835以允许流体、细胞和/或颗粒的流动。在嵌入平面支撑件的底表面1812中的障碍物下方是空隙空间1815。与泳道相对的空隙空间的面积(长x宽)可以是泳道的面积(长x宽)的至少约80％。在某些实施方案中，与泳道相对的空隙空间的面积(长x宽)可以是泳道的面积(长x宽)的至少约90％、100％、110％或120％，直至并包括约150％。

在一种配置中，两个平面支撑件的空隙空间是对称的或几乎对称的。并在图16A中显示为背靠背压紧。然而，如图所示19显示为替代性布置。在这样的情况下，支撑件不是背靠背压紧而是堆叠，空隙空间位于障碍物层上方(如19A中所示)或下方(如19B中所示)。

空隙空间可以被分成两个或更多个空隙空间。空隙空间可以被分成至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个空隙空间。空隙空间可以被恰好分成两个空隙空间。对于每个包括障碍物的平面支撑件，通道或泳道与空隙空间之间的比率可以是1:1。

平面支撑件可以由黏合在一起的两层材料制成。这些层可以通过黏合剂、聚合物或热塑性塑料黏合在一起。这些层可以包括聚合物或热塑性塑料。聚合物或热塑性塑料层或黏合材料可以包括高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PT)、聚碳酸酯(PC)或环烯烃共聚物(COC)。

盒的顶层可以包括在至少一个嵌入通道、空隙空间、至少一个入口、至少一个出口或其组合中的障碍物阵列。盒的底层可以包括在至少一个嵌入通道、空隙空间、至少一个入口、至少一个出口或其组合中的障碍物阵列。这些层可以定位到平面支撑件在它们的侧表面、底表面或顶表面上结合在一起的位置。空隙空间可以在黏合在一起的平面支撑件的界面内，或在界面外。

微流体盒还可以包括障碍物黏合层，障碍物黏合层黏合到平面支撑件的表面和嵌入通道中的障碍物阵列的顶表面，以防止流体或样品在盒操作期间流动溢过障碍物阵列。障碍物黏合层可以是金属的、聚合物的或热塑性的。障碍物黏合层可以是覆盖物或膜。聚合物或热塑性塑料层或黏合材料可以包括高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PT)、聚碳酸酯(PC)或环烯烃共聚物(COC)。微流体盒可以包括位于顶平面支撑件外侧的两个障碍物黏合层。微流体盒可以包括位于盒中间的单个障碍物黏合层作为平面支撑件的黏合介质。障碍物黏合层可以包括与嵌入通道的一个或多个入口流体连接的允许样品流入通道的一个或多个通路和与通道的一个或多个出口流体连接的允许流体从一个或多个出口流出的一个或多个通路。这样的障碍物层可以包括与嵌入通道的一个或多个入口或一个或多个出口流体连接的至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约20、至少约30、至少约50或至少约100个通路。

微流体盒可以具有定位成限定盒的临界尺寸的障碍物，使得当样品被施加到盒的入口并流向出口时，样品中大于临界尺寸的颗粒或细胞与样品中小于临界尺寸的颗粒或细胞分离。每个障碍物可能有它自己的单独的亚临界尺寸，各个障碍物的总和限定了盒的临界尺寸。盒的一个或多个出口可以包括至少一个产物出口，其中尺寸大于盒的临界尺寸的靶颗粒或细胞被引导至至少一个产物出口。盒的一个或多个出口可以包括至少一个产物出口，其中尺寸小于盒的临界尺寸的靶颗粒或细胞被引导至至少一个产物出口。盒可具有至少约1、至少约2、至少约3、至少约5、至少约10或至少约50个产物出口。一个或多个出口可以包括至少一个废物出口。尺寸小于临界尺寸的污染物、颗粒或细胞可以流向至少一个废物出口。尺寸大于临界尺寸的污染物、颗粒或细胞可以流向至少一个废物出口。盒可具有至少约1、至少约2、至少约3、至少约5、至少约10或至少约50个废物出口。

盒中使用的障碍物可以是柱形或三角形、正方形、矩形、菱形、梯形、六边形、泪珠形、圆形、半圆形、顶侧水平的三角形和底侧水平的三角形。此外，相邻障碍物可以具有这样的几何形状，使得限定间隙的障碍物部分关于沿主体流体流动方向延伸的间隙轴线对称或不对称。障碍物可以具有延伸到平行间隙中的顶点，使得间隙在任一侧侧翼是指向彼此但不彼此直接相对的一个或多个顶点。障碍物可以具有延伸到垂直间隙中的顶点，使得间隙在任一侧侧翼是指向彼此且彼此直接相对的顶点。障碍物的位置和形状可以在单个芯片中变化。可以根据任何特定要求将另外的障碍物添加到装置的任何位置。此外，装置中障碍物的形状可能不同。针对特定要求可以使用柱形状、尺寸和位置的任何组合。盒可以仅包括菱形或六边形障碍物。

障碍物形状可以垂直于流体流动方向伸长，使得它们具有不同于它们的垂直长度(P2)的水平长度(P1)。P1可以具有约1μm至约160μm的长度。P1可以具有约1μm至约10μm、约1μm至约15μm、约1μm至约30μm、约1μm至约40μm、约1μm至约80μm、约1μm至约160μm、约10μm至约15μm、约10μm至约30μm、约10μm至约40μm、约10μm至约80μm、约10μm至约160μm、约15μm至约30μm、约15μm至约40μm、约15μm至约80μm、约15μm至约160μm、约30μm至约40μm、约30μm至约80μm、约30μm至约160μm、约40μm至约80μm、约40μm至约160μm或约80μm至约160μm。P1可以具有约1μm、约10μm、约15μm、约30μm、约40μm、约80μm或约160μm的长度。P1可以具有至少约1μm、约10μm、约15μm、约30μm、约40μm或约80μm的长度。P1可以具有至多约10μm、约15μm、约30μm、约40μm、约80μm或约160μm的长度。P2可以具有约1μm至约160μm的长度。P2可以具有约1μm至约10μm、约1μm至约15μm、约1μm至约30μm、约1μm至约40μm、约1μm至约80μm、约1μm至约160μm、约10μm至约15μm、约10μm至约30μm、约10μm至约40μm、约10μm至约80μm、约10μm至约160μm、约15μm至约30μm、约15μm至约40μm、约15μm至约80μm、约15μm至约160μm、约30μm至约40μm、约30μm至约80μm、约30μm至约160μm、约40μm至约80μm、约40μm至约160μm或约80μm至约160μm的长度。P2可以具有约1μm、约10μm、约15μm、约30μm、约40μm、约80μm或约160μm的长度。P2可以具有至少约1μm、约10μm、约15μm、约30μm、约40μm或约80μm的长度。P2可以具有至多约10μm、约15μm、约30μm、约40μm、约80μm或约160μm的长度。P1可以比P2长约25％至约200％。P1可以比P2长约25％至约50％、约25％至约75％、约25％至约100％、约25％至约150％、约25％至约200％、约50％至约75％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约75％至约100％、约75％至约150％、约75％至约200％、约100％至约150％、约100％至约200％或约150％至约200％。P1可以比P2长约25％、约50％、约75％、约100％、约150％或约200％。P1可以比P2长约至少约25％、约50％、约75％、约100％或约150％。P1可以比P2长至多约50％、约75％、约100％、约150％或约200％。

微流体盒可以包括作为障碍物阵列的障碍物。障碍物可以布置成列和行，形成离散的阵列。障碍物阵列可以包括至少约5列至约50列。障碍物阵列可以包括至少约5列至约10列、约5列至约28列、约5列至约29列、约5列至约30列、约5列至约50列、约10列至约28列、约10列至约29列、约10列至约30列、约10列至约50列、约28列至约29列、约28列至约30列、约28列至约50列、约29列至约30列、约29列至约50列或约30列至约50列。障碍物阵列可以包括至少约5列、约10列、约28列、约29列、约30列或约50列。障碍物阵列可以包括至少约5列、约10列、约28列、约29列或约30列。障碍物阵列可以包括至少至多约10列、约28列、约29列、约30列或约50列。障碍物阵列可以包括至少约20行至约500行。障碍物阵列可以包括至少约20行至约30行、约20行至约60行、约20行至约100行、约20行至约200行、约20行至约500行、约30行至约60行、约30行至约100行、约30行至约200行、约30行至约500行、约60行至约100行、约60行至约200行、约60行至约500行、约100行至约200行、约100行至约500行或约200行至约500行。障碍物阵列可以包括至少约20行、约30行、约60行、约100行、约200行或约500行。障碍物阵列可以包括至少约20行、约30行、约60行、约100行或约200行。障碍物阵列可以包括至少至多约30行、约60行、约100行、约200行或约500行。多个障碍物阵列可以布置在离散的泳道中。第一平面支撑件或第二平面支撑件的障碍物阵列形成约10个泳道至约50个泳道。第一平面支撑件或第二平面支撑件的障碍物阵列形成约10个泳道至约20个泳道、约10个泳道至约28个泳道、约10个泳道至约30个泳道、约10个泳道至约50个泳道、约20个泳道至约28个泳道、约20个泳道至约30个泳道、约20个泳道至约50个泳道、约28个泳道至约30个泳道、约28个泳道至约50个泳道或约30个泳道至约50个泳道。第一平面支撑件或第二平面支撑件的障碍物阵列形成约10个泳道、约20个泳道、约28个泳道、约30个泳道或约50个泳道。第一平面支撑件或第二平面支撑件的障碍物阵列形成至少约10个泳道、约20个泳道、约28个泳道或约30个泳道。第一平面支撑件或第二平面支撑件的障碍物阵列形成至多约20个泳道、约28个泳道、约30个泳道或约50个泳道。

每个盒可以包括至少一组、至少两组、至少三组或至少四组障碍物阵列。每个平顶表面可以包括至少一个或至少两个阵列。盒可以包括总共约20个泳道至约100个泳道。盒可以包括总共约20个泳道至约40个泳道、约20个泳道至约56个泳道、约20个泳道至约60个泳道、约20个泳道至约100个泳道、约40个泳道至约56个泳道、约40个泳道至约60个泳道、约40个泳道至约100个泳道、约56个泳道至约60个泳道、约56个泳道至约100个泳道或约60个泳道至约100个泳道。盒可以包括总共约20个泳道、约40个泳道、约56个泳道、约60个泳道或约100个泳道。盒可以包括总共至少约20个泳道、约40个泳道、约56个泳道或约60个泳道。盒可以包括总共至多约40个泳道、约56个泳道、约60个泳道或约100个泳道。

微流体盒的入口、出口或两者可以与泵或马达流体连接以驱动盒内外的流体流动。入口、出口或两者可与至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个泵流体连接。泵可以是蠕动泵。泵可以彼此流体连接或隔离。盒的入口和出口可以与彼此并行连接的两个蠕动泵流体连接。盒的入口和出口可以与彼此串行连接的两个蠕动泵流体连接。

微流体盒可由金属、聚合物或热塑性塑料制成。聚合物或热塑性塑料可以包括高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PT)、聚碳酸酯(PC)或环烯烃共聚物(COC)。在一个示例中，微流体盒包括环烯烃共聚物。

本公开内容还提供了一种微流体组装件，其包括流体连接的多个微流体盒。组装件中的盒可以堆叠或层叠。多个微流体盒可以包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30个盒。多个盒可以串行或并行地流体连接。

细胞，例如，通过单采术或白细胞单采术制备的组合物中的细胞，可以通过使用微流体盒进行DLD来分离，微流体盒具有通道，流体通过通道从一端的入口流到另一端的出口。基于尺寸的微流体分离的基本原理和用于分离细胞的障碍物阵列的设计已在别处提供(参见，US 2014/0342375；US 2016/0139012；7,318,902和US 7,150,812，在此以其全文并入本文)并且也在以下部分中进行了总结。

在DLD期间，含有细胞的流体样品在入口处被引入装置，并与流经装置的流体一起被带到出口。当样品中的细胞穿过装置时，它们会遇到柱或其他障碍物，这些柱或其他障碍物的位置会形成细胞必须通过的间隙或孔隙。每行连续的障碍物相对于前一行位移，以形成与流动通道中的流体流动方向不同的阵列方向。由这两个方向定义的“倾斜角”以及障碍物之间的间隙宽度、障碍物的形状以及形成间隙的障碍物的取向是确定阵列“临界尺寸”的主要因素。尺寸大于临界尺寸的细胞沿阵列方向行进，而不是沿主体流体流动的方向行进，而尺寸小于临界尺寸的颗粒沿主体流体流动方向行进。在用于白细胞单采衍生组合物的装置中，可以选择阵列特征导致白细胞沿阵列方向转向而红细胞和血小板继续沿主体流体流动方向。为了将所选类型的白细胞与其他具有相似尺寸的白细胞分离，然后可以使用载体，载体以促进DLD分离的方式结合该细胞，从而产生比未复合的白细胞更大的复合物。然后可以在具有小于复合物但大于未复合细胞的临界尺寸的装置上进行分离。

II.制造和操作微流体装置

用于制造和使用能够基于尺寸分离细胞的微流体装置的一般程序在本领域中是众所周知的。这样的装置包括在US 5,837,115；US 7,150,812；US 6,685,841；US 7,318,902；7,472,794；和US 7,735,652中描述的那些；所有这些都通过引用以其全文并入本文。提供可能有助于制造和使用本发明装置的其他参考文献包括：US 5,427,663；US 7,276,170；US 6,913,697；US 7,988,840；US 8,021,614；US 8,282,799；US 8,304,230；US 8,579,117；US 2006/0134599；US 2007/0160503；US 20050282293；US 2006/0121624；US2005/0266433；US 2007/0026381；US 2007/0026414；US 2007/0026417；US 2007/0026415；US 2007/0026413；US 2007/0099207；US 2007/0196820；US 2007/0059680；US 2007/0059718；US 2007/005916；US 2007/0059774；US 2007/0059781；US 2007/0059719；US2006/0223178；US 2008/0124721；US 2008/0090239；US 2008/0113358；和WO 2012094642，其中每一个也通过引用以其全文并入本文。在描述装置的制造和使用的各种参考文献中，US 7,150,812提供了特别好的指导，而7,735,652尤其关注用于对具有血液中发现的细胞的样品进行分离的微流体装置(在这方面，另见US 2007/0160503)。

可以使用通常制造微米级和纳米级流体处理装置的任何材料(包括硅、玻璃、塑料和混合材料)来制造装置。有多种适用于微流体制造的热塑性材料可供选择，提供广泛的机械和化学特性选择，可以利用这些特性并进一步针对特定应用进行定制。在一个方面，微流体盒可以通过软模压和UV光固化来制造。

微流体盒(或装置、匣、芯片等)可以通过以下技术制造，这些技术包括复制模塑、使用PDMS的软光刻、热固性聚酯、模压、软模压、热模压、辊对辊模压、注塑成型、激光烧蚀、UV光固化及其组合。更多详细信息可在Fiorini等人(BioTechniques 38:429-446(2005年3月))的“Disposable microfluidic devices:fabrication,function and application”中找到，其通过引用以其全文并入本文。由Keith E.Herold和Avraham Rasooly编辑的书籍“Lab on a Chip Technology”，Caister Academic Press Norfolk UK(2009)是用于制造方法的另一种资源，在此通过引用以其全文并入本文。

高通量模压方法，诸如热塑性塑料的卷轴对卷轴加工，是工业微流体芯片生产的一种有吸引力的方法。使用单芯片热模压技术可以成为在原型制作阶段实现高质量微流体装置的一种成本有效的技术。Yang等人的“Microfluidic device fabrication bythermoplastic hot-embossing”(Methods Mol.Biol.949:115-23(2013))中描述了用于在两种热塑性塑料聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和/或聚碳酸酯(PC)中复制微尺度特征的方法，其通过引用以其全文并入本文。

流动通道可以使用两个或更多个部件来构造，这两个或更多个部件在组装时形成封闭腔体(优选地具有用于添加或排出流体的孔口)，其中安置有障碍物。障碍物可以在组装成流动通道的一个或多个部件上制造，或者它们可以以夹在限定流动通道边界的两个或更多个部件之间的插入件的形式制造。

障碍物可以是在阵列中穿过流动通道横向延伸并沿通道从入口到出口纵向延伸的固体。当障碍物在障碍物的一端与流动通道的一个面成为一体(或为其延伸)时，障碍物的另一端可以密封或压靠在流动通道的相对面上。在障碍物的一端和流动通道的面之间可以容忍小空间(优选小得无法容纳用于预期用途的任何感兴趣颗粒)，只要该空间不会对障碍物的结构稳定性或装置的相关流动特性产生不利影响。

可以对表面进行涂层以改变其特性，而用于制造装置的聚合物材料可以通过多种方式进行修饰。在一些情况下，在天然聚合物中的或通过湿化学或等离子体处理添加的官能团(诸如胺或羧酸)用于交联蛋白质或其他分子。可以使用表面胺基团使DNA附接到COC和PMMA底物上。，可以使用诸如

等表面活性剂通过将

添加到PDMS制剂中使表面具有亲水性和蛋白质排斥性。在一些情况下，将一层PMMA旋涂在装置(例如，微流体芯片)上，并且PMMA“掺杂”有羟丙基纤维素以改变其接触角。

为了减少细胞或化合物(例如，由裂解的细胞释放或在生物样品中发现的)非特异性吸附在通道壁上，一个或多个壁可以被化学修饰为非黏附的或排斥的。壁可以涂有商业不黏试剂(诸如用于形成水凝胶的那些)的薄膜涂层(例如，单层)。可用于修饰通道壁的化学物质的其他示例包括低聚乙二醇、氟化聚合物、有机硅烷、硫醇、聚乙二醇、透明质酸、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、黏蛋白、聚-HEMA、甲基丙烯酸酯PEG和琼脂糖。带电聚合物也可用于排斥带相反电荷的物质。用于排斥的化学物质的类型和附着到通道壁的方法可以取决于被排斥的物质的性质以及壁和被附着的物质的性质。这样的表面修饰技术在本领域中是众所周知的。可以在组装装置之前或之后对壁进行官能化。

III.CAR T和NK细胞

用于制备和使用CAR T和自然杀伤(NK)细胞的方法在本领域是众所周知的。程序已在例如US 9,629,877；US 9,328,156；US 8,906,682；US 2017/0224789；US 2017/0166866；US 2017/0137515；US 2016/0361360；US 2016/0081314；US 2015/0299317；和US2015/0024482中进行了描述；其每个通过引用以其全文并入本文。

本公开内容提供了用于纯化可包括嵌合抗原受体(CAR)T和NK细胞的颗粒或细胞的微流体盒(即，装置、芯片、匣、板、微流体装置、盒、DLD装置等)和方法。微流体盒(即装置、芯片、匣、板、微流体装置、盒、DLD装置等)可以是本文所述的那些微流体盒中的任何一种。通过为下游基因工程化和CAR T或NK细胞生产提供更纯的T或NK细胞产物，所描述的盒的使用可以允许生产更有效的CAR T或NK细胞。可以通过去除用于生产CAR T或NK细胞的其他方法无法去除的血小板来生产更有效的CAR T或NK细胞。

用于产生嵌合抗原受体(CAR)T或NK细胞的方法可以包括获得包括T或NK细胞的样品并将T或NK细胞与污染物分离。污染物可以包括血小板或本文所述的其他污染物。分离污染物可以包括将样品施加到本文所述的任何盒或装置的一个或多个样品入口，使样品流向盒的出口，从产物出口获得富集有T或NK细胞的产物，以及对富集产物中的T细胞进行基因工程化，以在T或NK细胞表面产生嵌合抗原受体。该方法的样品可以包括单采产物或白细胞单采产物。该方法的基因工程化可以包括如本文所述的基因工程化方法。该方法可以进一步包括通过在体外培养细胞来扩增CAR T或NK细胞。

可以根据本文的装置和方法设计的CAR T细胞疗法的一些商业示例包括axicabtagene ciloleucel、tisagenlecleucel和brexucabtagene autoleucel。

IV.使用DLD的分离过程

本文所述的DLD装置可用于纯化细胞、细胞片段、细胞加合物或核酸。使用装置的血液组分的分离和纯化可以在例如美国公开号US 2016/0139012中找到，其教导通过引用以其全文并入本文。

通过DLD方法生产的细胞的纯度、产率和活力会因许多因素而异，包括起始材料的性质、所采用的确切程序和DLD装置的特性。优选地，应获得至少60％的纯化、产率和活力，更优选更高的百分比，至少70、80或90％。

在一个方面，本公开内容提供了用于从样品中的污染物中富集预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的方法。用于富集靶颗粒或靶细胞的方法使用如本文别处所述的任何盒、微流体盒、匣、芯片、装置、流体装置或微流体装置。一种方法可以包括获得包括靶颗粒或靶细胞和污染物的样品。该方法还可以包括通过将样品施加到本文所述的任何盒、匣或装置上的一个或多个样品入口来将靶颗粒或靶细胞与污染物分离。该方法可以进一步包括使样品流向本文所述的任何盒、匣或装置上的出口。该方法可以进一步包括从一个或多个出口获得富集有靶颗粒或靶细胞的产物，同时去除污染物。该方法可能导致从污染物中纯化或分离细胞或颗粒的卓越能力，产生更高的细胞产率，提高产物在体外扩增的能力，以及富集的细胞产物更适合转导或其他基因工程化。

该方法可能需要使用确定性横向位移，由此装置具有如本文所述的临界尺寸并且污染物和靶颗粒或靶细胞基于具有不同的临界尺寸而被分离。该方法可以包括使含有靶颗粒或靶细胞和污染物的样品流向本文所述的任何盒、匣或装置，其中靶颗粒或靶细胞的尺寸大于障碍物阵列的临界尺寸，并且至少一些污染物的尺寸小于障碍物阵列的临界尺寸，并且其中靶细胞或靶颗粒流向一个或多个产物出口，在此处获得富集有靶细胞或靶颗粒的产物，而尺寸小于障碍物阵列的临界尺寸的污染物流向一个或多个废物出口。该方法可以包括使含有靶颗粒或靶细胞和污染物的样品流向本文所述的任何盒、匣或装置，其中靶颗粒或靶细胞的尺寸小于障碍物阵列的临界尺寸，并且至少一些污染物的尺寸大于障碍物阵列的临界尺寸，并且其中靶细胞或靶颗粒流向一个或多个产物出口，在此处获得富集有靶细胞或靶颗粒的产物，而尺寸大于障碍物阵列的临界尺寸的污染物流向一个或多个废物出口。

该方法可以包括使含有靶颗粒或靶细胞和污染物的样品以恒定流速或可变流速流向本文所述的任何盒、匣或装置。该方法的盒流速可以是约400mL每小时。该方法的盒流速可以是约100mL每小时至约1,000mL每小时。该方法的盒流速可以是约100mL每小时至约200mL每小时、约100mL每小时至约400mL每小时、约100mL每小时至约800mL每小时、约100mL每小时至约1,000mL每小时、约200mL每小时至约400mL每小时、约200mL每小时至约800mL每小时、约200mL每小时至约1,000mL每小时、约400mL每小时至约800mL每小时、约400mL每小时至约1,000mL每小时或约800mL每小时至约1,000mL每小时。该方法的盒流速可以是约100mL每小时、约200mL每小时、约400mL每小时、约800mL每小时或约1,000mL每小时。该方法的盒流速可以是至少约100mL每小时、约200mL每小时、约400mL每小时或约800mL每小时。该方法的盒流速可以是至多约200mL每小时、约400mL每小时、约800mL每小时或约1,000mL每小时。

该方法可以包括盒内的内部压力。盒的内部压力可以为至少约15磅每平方英寸。盒的内部压力可以为至少约1.5磅每平方英寸至约50磅每平方英寸。盒的内部压力可以为至少约1.5磅每平方英寸至约5磅每平方英寸、约1.5磅每平方英寸至约10磅每平方英寸、约1.5磅每平方英寸至约15磅每平方英寸、约1.5磅每平方英寸至约20磅每平方英寸、约1.5磅每平方英寸至约50磅每平方英寸、约5磅每平方英寸至约10磅每平方英寸、约5磅每平方英寸至约15磅每平方英寸、约5磅每平方英寸至约20磅每平方英寸、约5磅每平方英寸至约50磅每平方英寸、约10磅每平方英寸至约15磅每平方英寸、约10磅每平方英寸至约20磅每平方英寸、约10磅每平方英寸至约50磅每平方英寸、约15磅每平方英寸至约20磅每平方英寸、约15磅每平方英寸至约50磅每平方英寸或约20磅每平方英寸至约50磅每平方英寸。盒的内部压力为至少约1.5磅每平方英寸、约5磅每平方英寸、约10磅每平方英寸、约15磅每平方英寸、约20磅每平方英寸或约50磅每平方英寸。盒的内部压力可以为至少约1.5磅每平方英寸、约5磅每平方英寸、约10磅每平方英寸、约15磅每平方英寸或约20磅每平方英寸。盒的内部压力可以为至少至多约5磅每平方英寸、约10磅每平方英寸、约15磅每平方英寸、约20磅每平方英寸或约50磅每平方英寸。

该方法的靶颗粒或靶细胞可以包括干细胞、血小板、滑膜细胞、成纤维细胞、β细胞、肝细胞、巨核细胞、胰腺细胞、DE3溶原细胞、酵母细胞、植物细胞、藻类细胞、单核细胞、T细胞、B细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、先天性淋巴细胞、自然杀伤细胞、白细胞、外周血单个核细胞、CD3+细胞、神经元、血小板、癌细胞、肌肉细胞或上皮细胞。该方法可以包括富集靶颗粒或靶细胞以产生富集的靶细胞，富集的靶细胞包括干细胞、血小板、滑膜细胞、成纤维细胞、β细胞、肝细胞、巨核细胞、胰腺细胞、DE3溶原细胞、酵母细胞、植物细胞、藻类细胞、单核细胞、T细胞、B细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、先天性淋巴细胞、自然杀伤细胞、白细胞、外周血单个核细胞、CD3+细胞、神经元、血小板、癌细胞、肌肉细胞或上皮细胞。该方法的污染物可以包括干细胞、血小板、滑膜细胞、成纤维细胞、β细胞、肝细胞、巨核细胞、胰腺细胞、DE3溶原细胞、酵母细胞、植物细胞、藻类细胞、单核细胞、T细胞、B细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、先天性淋巴细胞、自然杀伤细胞、白细胞、外周血单个核细胞、CD3+细胞、神经元、血小板、癌细胞、肌肉细胞或上皮细胞。例如，靶细胞可以是外周血单个核细胞，并且污染物可以是血小板。例如，靶细胞可以是CD3+细胞，并且污染物可以是血小板。该方法可导致去除超过90％的血小板。该方法可导致去除约50％的血小板至约99％的血小板。该方法可导致去除约50％的血小板至约75％的血小板、约50％的血小板至约80％的血小板、约50％的血小板至约90％的血小板、约50％的血小板至约95％的血小板、约50％的血小板至约99％的血小板、约75％的血小板至约80％的血小板、约75％的血小板至约90％的血小板、约75％的血小板至约95％的血小板、约75％的血小板至约99％的血小板、约80％的血小板至约90％的血小板、约80％的血小板至约95％的血小板、约80％的血小板至约99％的血小板、约90％的血小板至约95％的血小板、约90％的血小板至约99％的血小板或约95％的血小板至约99％的血小板。该方法可导致去除约50％的血小板、约75％的血小板、约80％的血小板、约90％的血小板、约95％的血小板或约99％的血小板。该方法可导致去除至少约50％的血小板、约75％的血小板、约80％的血小板、约90％的血小板或约95％的血小板。该方法可导致去除至多约75％的血小板、约80％的血小板、约90％的血小板、约95％的血小板或约99％的血小板。

该方法可以包括修饰富集的靶细胞。该方法可以包括对富集的靶细胞进行基因工程化，以获得基因工程化的靶细胞。基因工程化包括用重组核酸转染或转导靶细胞。基因工程化方法可以包括使用TALEN、锌指核酸酶、CRISPR-Cas相关蛋白、同源重组、病毒载体或异源质粒。该方法还可以包括通过在体外培养来扩增富集的靶细胞或基因工程化的细胞。

V.技术背景

已经描述了“障碍物阵列”装置，并且例如在美国专利号7,150,812(其通过引用以其全文并入本文)中解释了它们的基本操作。凸块阵列主要通过分离穿过障碍物阵列(通常是周期性排列的阵列)的颗粒来操作，分离发生在遵循主体流体流动方向的颗粒和遵循偏离主体流体流动的方向的“阵列方向”的颗粒之间。

A.分级分离范围

在微流体装置上按尺寸分离的物体包括细胞、生物分子、无机珠和其他物体。分级分离的典型尺寸范围为100纳米至50微米。然而，较大和较小的颗粒有时也可能被分级分离。

B.容量

根据装置或装置组合的设计，处理样品的速度会有很大差异。优选地，装置和组装件应该能够在一小时内处理超过500ml的样品。

C.通道

装置可以包括一个或多个通道，一个或多个通道具有一个或多个入口和一个或多个出口。入口可用于样品或粗(即，未纯化)流体组合物、缓冲液或引入试剂。出口可用于收集产物或可用作废物的出口。通道可以为约0.5到100mm宽和约2-200mm长，但不同的宽度和长度也是可能的。深度可以为1-1000μm，并且装置上可以存在1到500个或更多个通道。

本文描述的各个方面的具体实施方案可以通过以下编号的实施方案来说明。

1.一种用于从样品中的污染物中纯化预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的微流体装置，该装置包括具有顶表面和底表面的平面支撑件，其中顶表面和/或底表面包括至少一个嵌入通道，至少一个嵌入通道从一个或多个样品入口和一个或多个不同的流体入口延伸到一个或多个产物出口和一个或多个不同的废物出口；其中：(a)当流体通过样品和/或流体入口被施加到通道时，它会通过通道流向出口，从而定义主体流体流动的方向；(b)通道包括布置成沿通道纵向延伸的列和穿过通道横向延伸的行的障碍物阵列，其中定位障碍物以限定临界尺寸，使得当样品被施加到装置的入口并流向出口时，样品中大于临界尺寸的颗粒或细胞与样品中小于临界尺寸的颗粒或细胞分离；并且其中：(i)行中的相邻障碍物由垂直于主体流体流动方向的间隙G1分隔开；(ii)列中的相邻障碍物由与主体流体流动方向平行的间隙G2分隔开；(iii)间隙G2的尺寸与间隙G1的尺寸之比不等于1；(iv)随后的每一行障碍物相对于前一行横向移动，从而定义了阵列方向，阵列方向偏离主体流体流动方向一个倾斜角(ε)；(v)障碍物具有至少两个顶点，使得每个间隙的任一侧侧翼是至少一个顶点。2.如实施方案1所述的装置，其进一步包括障碍物黏合层，障碍物黏合层黏合到平面支撑件的表面并黏合到嵌入在表面中的通道中的障碍物，以防止流体或样品在装置的操作期间流动溢过障碍物。3.如实施方案2所述的微流体装置，其中障碍物黏合层包括与通道的样品入口流体连接的允许样品流入通道的一个或多个通路和与通道的出口流体连接的允许流体从出口流出的一个或多个通路。4.如实施方案1-3中任一项所述的微流体装置，其中靶颗粒或靶细胞的尺寸大于装置的临界尺寸，并且至少一些污染物的尺寸小于临界尺寸，并且其中障碍物以一种方式安置使得当所述样品被施加到装置的入口并流体通过通道时，靶细胞或靶颗粒流向一个或多个产物出口，在此处获得包括靶细胞或靶颗粒的富集产物，而尺寸小于临界尺寸的污染物流向一个或多个废物出口。5.如实施方案1-4中任一项所述的微流体装置，其中障碍物具有多边形形状。6.如实施方案5所述的微流体装置，其中障碍物具有菱形或六边形形状。7.如实施方案5或实施方案6所述的微流体装置，其中障碍物垂直于主体流体的方向伸长，使得它们具有不同于它们的垂直长度(P2)的水平长度(P1)。8.如实施方案6所述的微流体装置，其中P1比P2长至少15％。9.如实施方案6所述的微流体装置，其中P1比P2长10％-150％。10.如实施方案6所述的微流体装置，其中P1比P2长15％-100％。11.如实施方案6所述的微流体装置，其中P1比P2长20％-70％。12.如实施方案1-11中任一项所述的微流体装置，其中障碍物具有延伸到平行间隙中的顶点，使得间隙在任一侧侧翼是指向彼此但不彼此直接相对的一个或多个顶点。13.如实施方案1-12中任一项所述的微流体装置，其中障碍物具有延伸到垂直间隙中的顶点，使得间隙在任一侧侧翼是指向彼此且彼此直接相对的顶点。14.如实施方案1-13中任一项所述的微流体装置，其中一个或多个样品入口与一个或多个流体入口被分隔壁隔开，分隔壁从一个或多个样品入口朝向出口延伸到通道中的障碍物阵列中，并且方向平行于主体流体流动的方向。15.如实施方案14所述的微流体装置，其中分隔壁延伸障碍物阵列的长度的至少10％。16.如实施方案14所述的微流体装置，其中分隔壁延伸障碍物阵列的长度的至少20％。17.如实施方案14所述的微流体装置，其中分隔壁延伸障碍物阵列的长度的至少40％。18.如实施方案14所述的微流体装置，其中分隔壁延伸障碍物阵列的长度的至少60％。19.如实施方案1-18中任一项所述的微流体装置，其中装置的入口和/或出口连接到蠕动泵。20.一种堆叠的分离组装件，其包括至少两个如实施方案1-19中任一项所述的微流体装置。21.一种堆叠的分离组装件，其包括选自如实施方案1-19中任一项所述的微流体装置的第一微流体装置，以及也选自如实施方案1-19中任一项所述的微流体装置的一个或多个堆叠的微流体装置，其中：(a)每个堆叠的装置的底表面与第一微流体装置的顶表面或顶表面上的障碍物黏合层接触，或者与另一个堆叠的装置的顶表面或顶表面上的障碍物黏合层接触；(b)将样品通过第一共用歧管提供给样品入口；(c)将流体通过第二歧管供应到流体入口，第二歧管与第一歧管可以相同或可以不相同；(d)将产物通过一个或多个导管从产物出口去除；(e)将废物通过与(d)的一个或多个导管不同的一个或多个导管从废物出口去除；(f)第一微流体装置和堆叠的微流体装置任选地安装在共用的外壳内。22.如实施方案22所述的堆叠的分离组装件，其中组装件包括至少2个堆叠的微流体装置。23.如实施方案22所述的堆叠的分离组装件，其进一步包括至少一个储器黏合层，至少一个储器黏合层附接到第一微流体装置的底表面和/或堆叠的微流体装置的顶表面，并且其在第一端包括允许流体流入通道上的入口的一个或多个通路并且在与第一端相对的第二端包括允许流体从通道的产物出口和废物出口流出的一个或多个通路，并且其中位于所述储器层的第一和第二端的通路由不透流体的材料隔开。24.如实施方案22或23中任一项所述的堆叠的分离组装件，其中一个或多个微流体装置的平面支撑件的顶表面和底表面都包括具有用于分离靶颗粒或靶细胞的障碍物的一个或多个通道。25.一种用于从样品中的污染物中纯化预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的方法，该方法包括：(a)获得包括所述靶颗粒或靶细胞和所述污染物的样品；(b)通过以下步骤将靶颗粒或靶细胞与污染物分离：(i)将样品施加到如实施方案1-21中任一项所述的微流体装置上或如实施方案22-24中任一项所述的第一微流体装置或堆叠的装置上的一个或多个样品入口；(ii)使样品流向如实施方案1-21中任一项所述的装置上或如实施方案22-24中任一项所述的第一微流体装置或堆叠的装置上的出口；以及(iii)从一个或多个出口获得富集有靶颗粒或靶细胞的产物。26.如实施方案25所述的方法，其中靶颗粒或靶细胞的尺寸大于障碍物阵列的临界尺寸，并且至少一些污染物的尺寸小于临界尺寸，并且其中靶细胞或靶细胞流向一个或多个产物出口，在此处获得富含靶细胞或靶颗粒的产物，而尺寸小于临界尺寸的污染物流向一个或多个废物出口。27.如实施方案26所述的方法，其中样品是血液或来源于血液。28.如实施方案26所述的方法，其中样品是单采样品或白细胞单采样品。29.如实施方案27或28所述的方法，其中样品包括血小板作为污染物。30.如实施方案29所述的方法，其中该方法导致从样品中去除至少80％的血小板。31.如实施方案29所述的方法，其中该方法导致从样品中去除至少90％的血小板。32.如实施方案29所述的方法，其中该方法导致从样品中去除至少95％的血小板。33.如实施方案27-31中任一项所述的方法，其中靶细胞是白细胞。34.如实施方案27-31中任一项所述的方法，其中靶细胞是干细胞。35.如实施方案27-31中任一项所述的方法，其中靶细胞是B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞或祖细胞。36.如实施方式27-31中任一项所述的方法，其中靶细胞是树突状细胞。37.如实施方案25-36中任一项所述的方法，其中样品获自患者。38.如实施方案37所述的方法，其中患者患有癌症、自身免疫性疾病或传染病。39.如实施方案25-38中任一项所述的方法，其进一步包括对纯化的靶细胞进行基因工程化。40.如实施方案39所述的方法，其中所述基因工程化包括用重组核酸转染或转导靶细胞。41.如实施方案39或40所述的方法，其中基因工程化的靶细胞通过在体外培养它们进行扩增。42.一种产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞的方法，该方法包括：(a)获得包括T细胞的样品；(b)通过以下步骤将T细胞与污染物分离：(i)将样品施加到如实施方案1-21中任一项所述的微流体装置上或如实施方案22-24中任一项所述的第一微流体装置或堆叠的装置上的一个或多个样品入口；(ii)使样品流向装置的出口；以及(iii)从产物出口获得富集有T细胞的产物；(c)对步骤b)中获得的富集产物中的T细胞进行基因工程化，以在其表面产生嵌合抗原受体(CAR)。43.如实施方案42所述的方法，其中样品是来自患者的血液、单采产物或白细胞单采产物。44.如实施方案42或43所述的方法，其中所述基因工程化包括转染或转导靶细胞，并且将基因工程化的靶细胞通过在体外培养细胞进一步扩增。45.如实施方案42-44中任一项所述的方法，其中通过在微流体装置上执行确定性横向位移来实现分离。46.如实施方案42-44中任一项所述的方法，其中所述样品获自患有癌症、自身免疫性疾病或传染病的患者。47.如实施方案46所述的方法，其中在获得样品后，以促进DLD分离的方式使T细胞与一种或多种载体结合。48.通过如实施方案42-47中任一项所述的方法制备的CART细胞。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，对本领域技术人员将是显而易见的是，仅通过示例的方式来提供这样的实施方案。并不旨在将本发明限制为说明书中提供的具体实施例。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文的实施方案的描述和说明并不意味着以限制性含义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变型、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所述的取决于多种条件和变量的具体描述、配置或相对比例。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明还应涵盖任何这样的替代方案、修改、变型或等同物。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。

本文引用的所有参考文献均通过引用完整并入。现在已经充分描述了本发明，本领域技术人员将理解，本发明可以在广泛且等效的条件、参数等范围内执行，而不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围。

Claims (88)

1.一种用于从样品中的污染物中纯化预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的微流体盒，所述盒包括第一平面支撑件和第二平面支撑件，所述第一平面支撑件和所述第二平面支撑件各自具有顶表面和底表面，其中所述第一平面支撑件和/或所述第二平面支撑件的所述顶表面包括从一个或多个入口延伸至一个或多个出口的至少一个嵌入通道；所述至少一个嵌入通道包括多个障碍物，其中所述微流体盒包括至少一个空隙空间，所述空隙空间被配置为在将所述第一平面支撑件和所述第二平面支撑件组装到所述微流体盒中时变形。

2.如权利要求1所述的微流体盒，其中所述第一平面支撑件和所述第二平面支撑件的所述底表面包括至少一个空隙空间，所述空隙空间被配置为当所述第一平面支撑件的底部被压向所述第二平面支撑件的底部时变形。

3.如权利要求1所述的微流体盒，其中所述至少一个空隙空间被配置为防止所述至少一个嵌入通道、所述一个或多个入口、所述一个或多个出口、所述多个障碍物或其组合的损坏、位移或变形。

4.如权利要求1至3中任一项所述的微流体盒，其中所述至少一个空隙空间被配置为防止所述多个障碍物的损坏、位移或变形。

5.如权利要求1至3中任一项所述的微流体盒，其包括1:1比例的空隙空间与通道。

6.如权利要求1至3中任一项所述的微流体盒，其中所述至少一个空隙空间包括的总表面积为所述至少一个嵌入通道的总表面积的至少约90％。

7.如权利要求1至3中任一项所述的微流体盒，其中所述至少一个空隙空间包括的总表面积为所述至少一个嵌入通道的总表面积的至少约100％。

8.如权利要求1至3中任一项所述的微流体盒，其中所述至少一个空隙空间包括的总表面积为所述至少一个嵌入通道的总表面积的至少约110％。

9.如权利要求1至8中任一项所述的微流体盒，其中所述至少一个空隙空间被分隔成两个或更多个空隙空间，所述两个或更多个空隙空间定位在所述第一平面支撑件和/或所述第二平面支撑件的底表面上与所述障碍物阵列相对。

10.如权利要求1至9中任一项所述的微流体盒，其中所述平面支撑件由黏合在一起的两层材料制成。

11.如权利要求1至10中任一项所述的微流体盒，其还包括障碍物黏合层，所述障碍物黏合层黏合到所述平面支撑件的表面并黏合到所述至少一个嵌入通道中的所述多个障碍物的顶表面，以防止流体或样品在所述盒的操作期间流动溢过所述多个障碍物。

12.如权利要求11所述的微流体盒，其中所述障碍物黏合层包括与所述至少一个嵌入通道的所述一个或多个入口流体连接的允许样品流入所述至少一个嵌入通道的一个或多个通路和与所述至少一个嵌入通道的所述一个或多个出口流体连接的允许流体从所述一个或多个出口流出的一个或多个通路。

13.如权利要求1至12中任一项所述的微流体盒，其中定位所述障碍物以限定所述盒的临界尺寸，使得当样品被施加到所述盒的入口并流向出口时，所述样品中大于所述临界尺寸的颗粒或细胞与所述样品中小于所述临界尺寸的颗粒或细胞分离。

14.如权利要求13所述的微流体盒，其中所述一个或多个出口包括至少一个产物出口，其中尺寸大于所述盒的所述临界尺寸的所述靶颗粒或靶细胞被引导至所述至少一个产物出口。

15.如权利要求13所述的微流体盒，其中所述一个或多个出口包括至少一个废物出口，而尺寸小于所述盒的所述临界尺寸的污染物流向所述至少一个废物出口。

16.如权利要求1至15中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物具有菱形形状。

17.如权利要求1至15中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物具有圆形形状或椭圆形形状。

18.如权利要求1至15中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物具有六边形形状。

19.如权利要求16至18所述的微流体盒，其中所述多个障碍物垂直于流体流动方向伸长，使得它们具有不同于它们的垂直长度(P2)的水平长度(P1)。

20.如权利要求19所述的微流体盒，其中P1为约10μm至约160μm并且P2为约5μm至约80μm。

21.如权利要求19所述的微流体盒，其中P1为约10μm至约80μm并且P2为约15μm至约60μm。

22.如权利要求19所述的微流体盒，其中P1为约15μm至约30μm并且P2为约25μm至约45μm。

23.如权利要求19所述的微流体盒，其中P1为约40μm并且P2为约20μm。

24.如权利要求19所述的微流体盒，其中P1比P2长50％至150％。

25.如权利要求1至24中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物具有延伸到平行间隙中的顶点，使得所述间隙在任一侧侧翼是指向彼此但不彼此直接相对的一个或多个顶点。

26.如权利要求1至24中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物具有延伸到垂直间隙中的顶点，使得所述间隙在任一侧侧翼是指向彼此且彼此直接相对的顶点。

27.如权利要求1至26中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物布置成至少1列。

28.如权利要求1至26中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物布置成至少10列。

29.如权利要求1至26中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物布置成至少30列。

30.如权利要求1至26中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物布置成至少50列。

31.如权利要求1至26中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物布置成至少约60列。

32.如权利要求1至31中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物布置成至少约50行。

33.如权利要求1至31中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物布置成至少约100行。

34.如权利要求1至31中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物布置成至少约300行。

35.如权利要求1至31中任一项所述的微流体盒，其中所述多个障碍物布置成至少约600行。

36.如权利要求1至35中任一项所述的微流体盒，其中所述第一平面支撑件或所述第二平面支撑件包括至少10个嵌入通道。

37.如权利要求1至35中任一项所述的微流体盒，其中所述第一平面支撑件和/或所述第二平面支撑件包括至少20个嵌入通道。

38.如权利要求1至35中任一项所述的微流体盒，其中所述第一平面支撑件和/或所述第二平面支撑件包括约28个嵌入通道。

39.如权利要求1至35中任一项所述的微流体盒，其中所述第一平面支撑件和/或所述第二平面支撑件包括约30个嵌入通道。

40.如权利要求1至35中任一项所述的微流体盒，其中所述第一平面支撑件和/或所述第二平面支撑件包括至少约50个嵌入通道。

41.如权利要求1至40中任一项所述的微流体盒，其中所述一个或多个入口包括至少一个或多个样品入口和至少一个或多个流体入口；其中所述至少一个或多个样品入口通过分隔壁与所述至少一个或多个流体入口分开，所述分隔壁从所述一个或多个样品入口朝向所述出口延伸到所述至少一个嵌入通道中的所述障碍物阵列中，并且方向平行于流体流动方向。

42.如权利要求41所述的微流体盒，其中所述分隔壁延伸所述多个障碍物的长度的至少10％。

43.如权利要求41所述的微流体盒，其中所述分隔壁延伸所述多个障碍物的长度的至少20％。

44.如权利要求41所述的微流体盒，其中所述分隔壁延伸所述多个障碍物的长度的至少60％。

45.如权利要求1至44中任一项所述的微流体盒，其中所述一个或多个入口、所述一个或多个出口或两者流体连接至第一蠕动泵、第二蠕动泵或两者。

46.如权利要求45所述的微流体盒，其中所述第一蠕动泵和所述第二蠕动泵串行流体连接。

47.如权利要求45所述的微流体盒，其中所述第一蠕动泵和所述第二蠕动泵并行流体连接。

48.如权利要求1至47中任一项所述的微流体盒，其中所述盒由聚合物制成。

49.如权利要求48所述的微流体盒，其中所述聚合物是热塑性聚合物。

50.如权利要求48所述的微流体盒，其中所述热塑性聚合物选自高密度聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或环烯烃共聚物。

51.如权利要求48所述的微流体盒，其中所述热塑性聚合物是环烯烃共聚物。

52.一种微流体组装件，其包括多个微流体盒，所述微流体盒如权利要求1至51中任一项所述，其中所述多个微流体盒处于流体连接。

53.如权利要求52所述的微流体组装件，其中所述微流体盒是堆叠的。

54.如权利要求52所述的微流体组装件，其中所述多个微流体盒是两个。

55.如权利要求52所述的微流体组装件，其中所述微流体盒处于并行流体连接。

56.如权利要求52所述的微流体组装件，其中所述微流体盒处于串行流体连接。

57.一种制造如权利要求1至56中任一项所述的微流体盒的方法，其中通过将所述第一平面支撑件和所述第二平面支撑件的底部压在一起使得所述障碍物阵列不变形来制造所述盒。

58.如权利要求57所述的制造方法，其中所述至少一个嵌入通道、障碍物或两者通过模压、热模压、辊对辊模压或注塑成型来制造。

59.如权利要求57或58中任一项所述的制造方法，其中所述微流体盒在制造期间被UV光固化。

60.一种用于从样品中的污染物中富集预定尺寸的靶颗粒或靶细胞的方法，其包括：

a)获得包括所述靶颗粒或靶细胞和所述污染物的样品；

b)通过以下步骤将所述靶颗粒或靶细胞与所述污染物分离：

i)将所述样品施加到如权利要求1至56中任一项所述的微流体盒上的一个或多个样品入口；

ii)使所述样品流向如权利要求1至56中任一项所述的盒上的所述出口；以及

iii)从一个或多个出口获得富集有所述靶颗粒或靶细胞的产物，同时去除所述污染物。

61.如权利要求60所述的方法，其中所述靶颗粒或靶细胞的尺寸大于所述障碍物阵列的临界尺寸，并且至少一些污染物的尺寸小于所述障碍物阵列的临界尺寸，并且其中靶细胞或靶颗粒流向所述一个或多个产物出口，在此处获得富集有靶细胞或靶颗粒的产物，而尺寸小于所述障碍物阵列的所述临界尺寸的污染物流向一个或多个废物出口。

62.如权利要求60或61所述的方法，其中所述盒的流速为约400mL每小时。

63.如权利要求60或61所述的方法，其中所述盒的流速为至少约100mL每小时或更大。

64.如权利要求60或61所述的方法，其中所述盒的流速为至少约300mL每小时或更大。

65.如权利要求60或61所述的方法，其中所述盒的流速为约1000mL每小时。

66.如权利要求60或61所述的方法，其中所述盒的内部压力为至少约1.5磅每平方英寸或更大。

67.如权利要求60或61所述的方法，其中所述盒的内部压力为约15磅每平方英寸。

68.如权利要求60或61所述的方法，其中所述盒的内部压力为约50磅每平方英寸或更小。

69.如权利要求60或61所述的方法，其中所述盒的内部压力为约10磅每平方英寸至约20磅每平方英寸。

70.如权利要求60至69中任一项所述的方法，其中所述样品是血液或血液相关产物。

71.如权利要求60至69中任一项所述的方法，其中所述样品是单采样品或白细胞单采样品。

72.如权利要求60至71中任一项所述的方法，其中所述样品包括血小板作为污染物。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述方法导致从所述样品中去除至少80％的所述血小板。

74.如权利要求72所述的方法，其中所述方法导致从所述样品中去除至少90％的所述血小板。

75.如权利要求72所述的方法，其中所述方法导致从所述样品中去除至少95％的所述血小板。

76.如权利要求60至75中任一项所述的方法，其中所述富集的靶细胞包括白细胞。

77.如权利要求60至75中任一项所述的方法，其中所述富集的靶细胞包括干细胞。

78.如权利要求60至75中任一项所述的方法，其中所述富集的靶细胞包括外周血单个核细胞。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述外周血单个核细胞包括CD3+细胞。

80.如权利要求60至79中任一项所述的方法，其进一步包括对所述富集的靶细胞进行基因工程化，以获得基因工程化的靶细胞。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述基因工程化包括用重组核酸转染或转导所述靶细胞。

82.如权利要求80或81所述的方法，其中所述富集的靶细胞或基因工程化的靶细胞通过在体外培养它们进行扩增。

83.一种产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞的方法，其包括：

a)获得包括T细胞的样品；

b)通过以下步骤将所述T细胞与污染物分离：

i)将所述样品施加到如权利要求1至56中任一项所述的微流体盒上的一个或多个样品入口；

ii)使所述样品流向所述盒的所述出口；以及

iii)从所述产物出口获得富集有T细胞的产物；

c)对步骤b)中获得的富集产物中的所述T细胞进行基因工程化，以在其表面产生所述嵌合抗原受体(CAR)。

84.如权利要求83所述的方法，其中所述样品是血液、单采产物或白细胞单采产物。

85.如权利要求83或84所述的方法，其中对所述T细胞进行所述基因工程化包括转染或转导所述靶细胞，并且将所述基因工程化的靶细胞通过在体外培养所述细胞进一步扩增。

86.一种产生嵌合抗原受体(CAR)自然杀伤细胞的方法，其包括：

a)获得包括自然杀伤细胞的样品；

b)通过以下步骤将所述自然杀伤细胞与污染物分离：

i)将所述样品施加到如权利要求1至56中任一项所述的微流体盒上的一个或多个样品入口；

ii)使所述样品流向所述盒的所述出口；以及

iii)从所述产物出口获得富集有自然杀伤细胞的产物；

c)对步骤b)中获得的富集产物中的所述自然杀伤细胞进行基因工程化，以在其表面产生所述嵌合抗原受体(CAR)。

87.如权利要求86所述的方法，其中所述样品是血液样品、单采产物或白细胞单采产物。

88.如权利要求86或87所述的方法，其中对所述自然杀伤细胞进行所述基因工程化包括转染或转导所述靶细胞，并且将所述基因工程化的靶细胞通过在体外培养所述细胞进一步扩增。

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