CN112188930B - 通过确定性侧向位移与产物再循环的组合的纯化和浓缩 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微流体程序，其中细胞或颗粒通过产物的再循环来纯化。本发明涉及通过在微流体设备上进行确定性侧向位移同时使产物再循环来同时纯化和浓缩细胞或其他颗粒的方法。

Description

通过确定性侧向位移与产物再循环的组合的纯化和浓缩

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年5月13日提交的美国临时专利申请第62/670,839号的权益。

发明领域

本发明涉及通过在微流体设备上进行确定性侧向位移(deterministic lateraldisplacement)同时使产物再循环来同时纯化和浓缩细胞或其他颗粒的方法。

发明背景

确定性侧向位移(DLD)通常使用两种同流(co-flowing)的液体，一种含有颗粒(样品)，并且另一种是洗涤/收集流体(“运行”或“洗涤”流体)。在DLD期间，高于阵列的临界直径的颗粒被偏转到洗涤流体中，而低于临界直径的颗粒遵循样品流的流动方向。最终产物(收集的)流中颗粒的浓度取决于样品流中颗粒的输入浓度、样品与洗涤流体的比以及作为产物被收集的总体积的百分比。使用大多数目前的DLD程序获得高浓缩倍数是可能的，但是可能增加污染的风险(低于临界直径的颗粒被收集在产物流中)，或者可能需要非常长的具有额外冗余的DLD阵列以确保有效碰撞进入窄的收集宽度。

也难以调整通过DLD产生的产物的浓度，以实现基于逐次运行的一致性或使具有不同输入细胞计数的多个供体样品获得的结果标准化。虽然样品总是可以稀释的，但是浓缩的挑战性远远更大。在不对每个样品进行不同的预先(up-front)稀释的情况下，具有不同输入浓度的样品不能被标准化成单一输出浓度。

使用目前的程序控制产物浓度的另一个问题是通常需要相对大体积的洗涤流体。限制这些体积应导致较高的产物浓度，但总是必须有足够的洗涤流体来处理整个样品体积。

发明概述

一般描述

本发明基于这样的概念，即通过使产物流再循环回到微流体设备上并代替洗涤流体施加产物流，控制DLD产物的最终浓度是可能的。最初，样品和洗涤流体(还在本文中被更具体地称为洗涤缓冲液或洗涤试剂)两者均被供给到设备上。然后，在运行期间的选定点，将运载洗涤流体的入口密封，并且来自设备出口的产物通过该入口供给到洗涤流体的位置。这可以使用标准阀来实现，使用例如加压容器、蠕动泵或注射泵来推动再循环的产物流。

在将收集的产物(P1)再循环到设备上的时间期间，发生两个过程。第一，在再循环的产物附近流动的样品基于尺寸被分级分离(fractionated)，使得大颗粒被偏转到“洗涤流”(现在的P1)中并且被引导到产物出口。第二，P1中颗粒的数目增加，从而提高了产物浓度。可以表征该过程的一种方式是根据“浓度比”，该浓度比是洗涤流体的百分比与收集的产物的百分比的比。一组典型的比可以是：入口处为60％的样品和40％的洗涤流体，并且出口处为20％的产物和80％的废弃物。在这些情况下，如果P1被作为洗涤流体再循环，则洗涤流中的颗粒将被浓缩2x(40％/20％)，因为它们仍然在阵列中被偏转并进入产物收集流中。因此，收集的产物(P2)除了含有来自在该时间段期间处理的样品的细胞之外，还含有浓度为2x的P1细胞。

这种方法的一个优点是输出产物的最终浓度取决于再循环的次数和所使用的初始洗涤体积。因此，该方法是可容易调整的。例如，在非常稀的供体样品的情况下，操作者可以选择相对于(against)洗涤流体仅运行小体积的样品，并且然后使产物再循环若干次，以处理剩余的样品。因此，可以获得较高的浓缩倍数。这允许操作者(或仪器)输送任何输出浓度，而不管输入浓度如何。这也意味着仪器可以被优化，以输送下游测定步骤所需的固定产物浓度，而不依赖于输入的供体浓度。使用者将简单地输入初始供体浓度，并选择期望的输出浓度。使用该信息，仪器将调整再循环的次数以实现所选择的值。

这种方法的另一个优点是在不需要单独的浓缩器设备(顺次连接的(in-line)或作为第二通道(second pass)运行)的情况下实现浓缩。浓缩发生在用于细胞分离的相同DLD上，并且处理供体样品所需的时间保持与如果仅相对于洗涤缓冲液运行样品时相同。

所需的洗涤流体的体积也显著较少。不需要足够的洗涤流体来处理整个样品，洗涤体积将减少的量与再循环的产物的体积相对应。例如，如果在处理了约50％的样品后开始再循环，则洗涤流体的体积将减少约一半。

实施方案

在本发明的第一方面，本发明涉及一种从包含小于预定尺寸的细胞或颗粒的样品中分离预定尺寸的靶细胞或靶颗粒的方法。该方法包括在分隔的入口将样品和洗涤流体施加到微流体设备。洗涤流体可以是水或水性缓冲液，并且可以任选地包含与样品组分发生化学反应的试剂或者与靶细胞或靶颗粒特异性相互作用的抗体、载体或活化剂。当最初施加到设备时，即，在产物的任何再循环之前，洗涤流体应不含靶细胞或颗粒，并且没有任何小于预定尺寸的细胞或颗粒。

微流体设备应优选地被配置用于确定性侧向位移(DLD)，确定性侧向位移(DLD)是一种涉及使样品流过与流体流动的方向成小角度倾斜的专门设计的微柱阵列的方法(参见，Davis等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:14779-14784(2006)；Inglis,等人,LabChip 6:655-658(2006)；Chen,等人,Biomicrofluidics.9(5):054105(2015))，这些文献通过引用以其整体并入本文。因此，微流体设备将具有成行布置的障碍物阵列，障碍物的每一个后续的行相对于前一行侧向地偏移。障碍物应被定位成使得将靶细胞或靶颗粒偏转到第一出口(在第一出口它们可以作为靶细胞或颗粒产物被回收)，并且将小于预定尺寸的细胞或颗粒引导到第二出口(在第二出口它们可以作为废弃物被收集或弃去)。

通过使样品和洗涤流体流过微流体设备来进行DLD。在该过程期间，靶细胞或靶颗粒产物的至少一部分从第一出口再循环，以替代施加到设备入口的洗涤流体的全部或至少一部分。在该程序期间或在该程序结束时，从第一出口获得包含靶细胞或颗粒的最终产物。

为了利于再循环，微流体设备上的第一出口可以包括阀或与阀连接，该阀可以用于将靶细胞或靶颗粒产物转移到导管，该导管将产物再循环至微流体设备上的入口。类似地，微流体设备可以具有入口，该入口包括阀或与阀连接，该阀可以用于将通过入口进入设备的进料从供给洗涤流体的导管转换到供给靶细胞或靶颗粒产物的导管。

在一些实施方案中，再循环至微流体板的靶细胞或靶颗粒在重新施加到微流体设备之前、期间或之后与载体、抗体、荧光标签、活化剂或化合物反应或结合。在优选的实施方案中，靶细胞，例如白细胞，或更具体地，T细胞，是靶细胞，并且被载体、抗体或活化剂特异性结合。如在该情况中使用的，词语“特异性”意指相对于被载体结合的样品中的每个非靶细胞，至少100个(并且优选地至少1000个)靶细胞将被载体结合。这样的结合可以用于促进细胞分裂(在活化剂的情况下)，或者有助于细胞的测定或进一步纯化(在抗体的情况下)。

在DLD程序期间，载体可以用于改变细胞的行为。例如，在一个位置离开设备的细胞可以与载体结合以形成复合物，该复合物在不同位置离开该同一设备。因此，可以实现基于尺寸的分离，否则这将是不可能的。在这种情况下，载体的结合应“以促进DLD分离的方式”进行。如在本上下文中使用的，该术语意指该方法必须最终导致对特定靶细胞类型表现出特异性的结合，所述结合提供复合物的尺寸相对于未结合细胞增加至少2μm(并且可选择地，当以百分比表示时至少20％、50％、100％、200％、500％或1000％)，并且在治疗或其他用途需要游离靶细胞的情况下，所述结合允许靶细胞通过化学裂解或酶裂解、化学溶解、消化、由于与其他结合剂的竞争、通过物理剪切(例如使用移液管以产生剪切应力)或通过其他手段从复合物中释放。载体还可以以补充DLD分离的方式结合。

为了确定浓度，可以对靶细胞或靶颗粒产物进行细胞或颗粒计数。基于此，可以确定是否继续使产物再循环。根据实施该过程的一方的目的，相对于样品中的浓度，细胞或颗粒可以被浓缩至少3倍或至少10倍。在细胞的情况下，再循环与微流体处理联合将优选地是在该过程期间用于浓缩的唯一方法(sole method)。对于将被遗传工程化和/或治疗性使用的细胞来说尤其如此。

本文描述的方法可以用于分离和浓缩来源于生物反应器、烧瓶、培养板、培养袋、生物流体或提取物以及来源于组织的制剂的细胞。特别优选的是预定尺寸的白细胞(优选T细胞，并且最优选CAR-T细胞)或干细胞。包含这些细胞的样品可以是血液，通过进行单采血液成分术(apheresis)、白细胞单采术(leukapheresis)或白细胞减少术(leukoreduction)获得的组合物或leukopak制剂，并且将通常包含小于预定尺寸的血小板或红细胞。此外，可以通过本领域使用的任何方法，包括电转染、化学转染或通过纳米颗粒手段的转染或使用病毒转导使细胞遗传工程化。

在一些实例中，被再循环的白细胞或干细胞可以与载体、抗体或活化剂以促进或补充DLD分离的方式结合。结合应发生在细胞已经通过微流体设备至少一次之后，并且在再循环至微流体设备之前、期间或之后。在细胞待被治疗性使用的情况下，制备细胞的方法不应包括离心步骤，并且应进行再循环，直到获得一定浓度的细胞，该浓度足以允许将它们治疗性地施用至患者或用于随后的处理。类似地，在释放之前在浓缩回路中添加病毒或遗传物质可以是可能的。此外，优选的是，在从患者获得用于分离待治疗性地使用的细胞的样品的情况下，从获得样品完成的时间直到通过DLD完成细胞处理，历时不超过4小时。

对于本领域技术人员将容易明显的是，经过一些修改，本文描述的程序可以适于将靶细胞或颗粒与较大尺寸的污染物分离。除了涉及上文描述的方法之外，本发明还包括通过所述方法产生的细胞(包括白细胞、干细胞和CAR-T细胞)或颗粒。

用于制备纯化的遗传工程化的靶细胞的整合方法

在优选的实施方案中，上文描述的程序可以用作用于制备遗传工程化的靶细胞的方法的一部分。具体地，本发明包括一种制备纯化的遗传工程化的靶细胞的方法，该方法通过：a)获得包含预定尺寸的靶细胞和小于预定尺寸的一个或更多个污染性细胞或污染性颗粒的样品；b)在第一入口将样品施加到微流体设备，并且在第二入口施加洗涤流体，其中微流体设备包括障碍物阵列，所述障碍物阵列被定位成使得将靶细胞的流差异化地偏转到第一出口(在第一出口靶细胞可以作为靶细胞产物被回收)，并将小于预定尺寸的污染性细胞或污染性颗粒引导到第二出口(在第二出口小于预定尺寸的污染性细胞或污染性颗粒可以被回收或作为废弃物被弃去)；c)使样品和洗涤流体流过该设备，其中确定第一出口处的靶细胞浓度，并且靶细胞的至少一部分从出口再循环，以替代被施加到该设备入口的洗涤流体的全部或至少一部分，所述再循环被继续或重复，直到达到期望的产物细胞浓度PC；d)一旦达到PC，引导靶细胞的流使得它们从第一出口被收集，或者可选择地，将靶细胞的流引导到靶细胞被转化或转染以形成遗传工程化的靶细胞的位点；e)在步骤d中靶细胞已经被转化或转染形成遗传工程化的靶细胞的情况下，从遗传工程化期间使用的病毒、试剂或其他物质中纯化遗传工程化的靶细胞以形成纯化的遗传工程化的靶细胞，优选地通过使遗传工程化的靶细胞流到该纯化发生的位点或设备；以及f)收集步骤e)中产生的纯化的遗传工程化的靶细胞，或者使步骤e)中产生的纯化的遗传工程化的靶细胞流到在收集前其被进一步处理的位点。在优选的实施方案中，从步骤b)向微流体设备施加细胞到收集细胞的所有步骤作为单一连续过程进行。还优选的是，在该过程期间，除了上文讨论的具有产物再循环程序的微流体分离之外，不使用其他手段用于浓缩靶细胞。

如本文使用的术语“预定尺寸的细胞”是指所选择的待分离的靶细胞的尺寸。该尺寸可以通过实验确定或者从本领域获知。例如，人类T细胞的尺寸是本领域已知的，血小板和红细胞的尺寸也是已知的。因此，可以进行分离，其中T细胞是“预定尺寸的靶细胞”，并且血小板和红细胞是被分离的污染性细胞。术语“预定尺寸”也可以在设计用于进行分离的微流体设备的上下文中使用。例如，通过障碍物阵列的颗粒的术语“临界尺寸”或“预定尺寸”可以用于描述能够跟随流体的层流的颗粒的尺寸限值。例如，较大的颗粒可以从流体的流动路径被“碰撞”出来，而具有低于临界尺寸(或预定尺寸)的尺寸的颗粒不一定会如此移位。

许多类型的细胞可以用作靶细胞，包括治疗上有活性的细胞，诸如淋巴细胞和干细胞。T淋巴细胞是特别优选的，因为这些细胞可以被遗传工程化以在其表面上产生嵌合抗原受体(CAR)，并且形成在治疗上有价值的嵌合抗原受体T细胞。

用于将靶细胞与小于预定尺寸的细胞或颗粒分离(即步骤b)和步骤c)中)的最优选的方法是通过DLD。DLD还可以在步骤e)中使用，以将遗传工程化的靶细胞与用于转化或转染靶细胞的试剂、病毒或其他物质分离。在遗传工程化的细胞会在细胞培养物中扩增的情况下(通常在产生CAR T时进行)，可以在步骤e)中移除用于转化或转染靶细胞的物质，同时将细胞转移到生长培养基中。一旦被转移，就可以收集和培养细胞，或者可选择地，细胞可以直接流到培养将发生的位点。

在上文讨论的方法中使用的洗涤流体可以是水或水性缓冲液，并且洗涤流体中可以包含与细胞、颗粒或其他组分发生化学反应的试剂，或者包含与靶细胞特异性相互作用的抗体、载体或活化剂。

通常，引导靶细胞离开设备是由于包括阀或与阀连接的出口。取决于其是打开还是关闭，阀将靶细胞：a)从出口引导到将细胞再循环至微流体设备的入口的导管；或者b)从出口引导到靶细胞被转化或转染以形成遗传工程化的靶细胞的位点。优选地，阀被配置为通过将靶细胞引导到将细胞再循环至微流体设备上的入口的导管，对低于期望浓度PC的靶细胞浓度作出电响应，并且被配置为通过将靶细胞引导到它们被收集的位点或它们被转化或转染以形成遗传工程化的靶细胞的位点，对处于或高于PC的靶细胞浓度作出电响应。

再循环至微流体设备入口的靶细胞可以在被重新施加到微流体设备之前、期间或之后与载体、抗体、荧光标签、活化剂或化合物反应或结合。例如，白细胞或干细胞可以与载体、抗体或活化剂以促进或补充DLD分离的方式结合。

靶细胞的再循环可以继续到相对于在样品中的浓度，靶细胞被浓缩至少3倍、优选地至少5倍、并且仍然更优选地至少10倍。还优选的是，在从步骤a)获得样品直到收集细胞的整个时间期间，不对靶细胞进行离心或冷冻。此外，样品优选地从最终将被所产生的细胞治疗的患者获得，并且从获得样品完成的时间直到步骤f)完成，历时不超过10小时(优选地不超过5小时)。

最优选的样品是血液或通过例如通过单采血液成分术或白细胞单采术处理血液获得的组合物。这种类型的样品可以用于例如将白细胞与血小板和/或红细胞分离。

本发明不仅涵盖上文描述的方法，而且还涵盖通过所述方法制备的纯化的遗传工程化的靶细胞、基于这些细胞的治疗组合物以及使用治疗组合物治疗患者的方法。

附图简述

图1A-图1G：图1A-图1C图示了一种类型的DLD设备的不同操作模式。这包括：i)分离(图1A)、ii)缓冲液交换(图1B)和iii)浓缩(图1C)。在每个模式中，高于临界直径的基本上所有颗粒从进入点(point of entry)偏转到阵列方向上，导致尺寸选择、缓冲液交换或浓度随设备的几何形状变化。在所有情况下，低于临界直径的颗粒在层流条件下直接通过设备，并且随后在出口离开设备。DLD设备连同制备和使用所述设备的方法已经在文献中被描述，参见例如US 2016/0139012；US 2017/0333900；US 2016/0047735；US 2017/0209864；US 2017/0248508和US 2019/0071639，这些文献中的每一篇在此通过引用以其整体并入本文。

图1D示出了用于分离模式的14道DLD设计。描绘的阵列和微通道的全长是75mm并且宽度是40mm，每个单独的道宽1.8mm。图1E-图1F是塑料的菱形柱阵列和用于出口的加固收集端口的放大视图。图1G描绘了使用设备处理的白细胞单采术产物的照片。

图2：图2是示出了通用的单个芯片(current individual chip)如何被设计成可层层堆叠(stackable in layers)以实现任何具体应用所需的通量的示意图。

图3：图3的最左边的图图示了细胞在DLD期间的运动。缓冲液和样品被施加到设备的分隔的入口端口。当样品朝向出口前进时，尺寸大于阵列的临界尺寸的细胞从样品流(外部，通道的阴影部分)移动到缓冲液流(中心，通道的点状部分)，并且最终从产物出口离开。分图1-3示出了DLD程序中的各个步骤，其中存在产物的再循环。在分图1中，样品(白色，在上部样品储存器中)和缓冲液(点状的，在上部缓冲液储存器中)通过分隔的入口施加到微流体设备。含有大于阵列的临界尺寸的细胞的产物从产物出口收集(点状的，在底部产物储存器中)，并且废弃物从废弃物出口收集(澄清的，在底部废弃物储存器中)。注意，从产物储存器到缓冲液入口的阀是关闭的，而从缓冲液储存器到缓冲液入口的阀是打开的。在分图2中，从产物储存器到缓冲液入口的阀已经打开，并且从缓冲液储存器到缓冲液入口的阀已经关闭。因此，产物被循环回到微流体设备。在分图3中，处理已经进行到接近完成。废弃物的总体积增加，并且产物的总体积减少。

说明性表格

以下表中示出了从程序预期的计算结果。数值基于14道微流体设备的一组选择的输入和输出条件。应认识到，具有不同布局(和入口/出口的比)的微流体设备将具有不同地依比例确定的数值。

表3：DLD处理，然后以浓缩模式第二次通过时再循环

表4：DLD处理；最初使用缓冲液，但然后使DLD产物作为用于剩余部分的缓冲液再循环

总结

定义

单采血液成分术：如本文使用的，该术语是指其中来自患者或供体的血液被分离为其组分，例如血浆、白细胞和红细胞的程序。更具体的术语是“血小板单采术(plateletpheresis)”(指血小板的分离)和“白细胞单采术”(指白细胞的分离)。在该上下文中，术语“分离”是指获得与全血相比富含特定组分的产物，并且不意指已经达到绝对纯度。

CAR T细胞：术语“CAR”是“嵌合抗原受体”的首字母缩略词。因此，“CAR T细胞”是已经被遗传工程化以表达嵌合受体的T细胞。用于制备和使用CAR T细胞的方法是本领域熟知的。程序已经在例如US 9,629,877；US 9,328,156；US 8,906,682；US 2017/0224789；US2017/0166866；US 2017/0137515；US 2016/0361360；US 2016/0081314；US 2015/0299317；和US 2015/0024482中描述，这些文献中的每一篇通过引用以其整体并入本文。

CAR T细胞疗法：该术语是指其中用CAR T细胞治疗疾病的任何程序。可以被治疗的疾病包括血液和实体瘤癌症、自身免疫疾病和传染病。

载体：如本文使用的，术语“载体”是指由生物材料或合成材料制成的剂，例如珠或颗粒，所述剂为了直接或间接(即，通过一种或更多种中间细胞、颗粒或化合物)结合存在的一些或所有化合物或细胞的目的被添加到制剂中。载体可以由包括以下的多种不同的材料制成：DEAE-葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、胶原蛋白和藻酸盐，并且将通常具有1μm-1000μm的尺寸。载体可以被包被或不被包被，并且具有被修饰以包含识别细胞表面上的抗原或其他分子的亲和剂(例如，抗体、活化剂、半抗原、适体、颗粒或其他化合物)的表面。载体还可以被磁化，并且这可以提供补充DLD的另外的纯化手段，并且载体可以包含赋予细胞或细胞复合物非尺寸相关的次要性质的颗粒(例如，Janus或草莓样颗粒)。例如，颗粒可以产生可以在下游过程诸如磁分离、电穿孔、基因转移和/或具体的分析化学过程中使用的化学、电化学或磁性性质。颗粒还可以引起细胞中的代谢变化、使细胞活化或以其他方式促进细胞分裂。

“以促进DLD分离的方式”结合的载体：该术语是指载体和结合载体的方法，根据上下文，所述载体影响细胞、蛋白质或颗粒在DLD期间的行为。具体地，“以促进DLD分离的方式结合”意指：a)结合必须表现出对特定靶细胞类型、蛋白质或颗粒的特异性；和b)必须产生这样的复合物，该复合物提供相对于未结合的细胞、蛋白质或颗粒的复合物尺寸增加。在结合靶细胞的情况下，必须存在至少2μm的增加(并且可选择地当以百分比表示时，至少20％、50％、100％、200％、500％或1000％的增加)。在治疗或其他用途需要靶细胞、蛋白质或其他颗粒从复合物中释放以实现其预期用途的情况下，那么术语“以促进DLD分离的方式”还需要复合物允许这样的释放，例如通过化学裂解或酶裂解、化学溶解、消化、由于与其他结合剂的竞争或通过物理剪切(例如使用移液管以产生剪切应力)，并且被释放的靶细胞、蛋白质或其他颗粒必须保持活性；例如，从复合物释放后的治疗性细胞必须仍然保持使它们在治疗上有用的生物活性。

载体可以“以补充DLD分离的方式”结合：该术语涉及载体和结合载体的方法，所述载体改变细胞或细胞复合物的化学、电化学或磁性性质或者改变细胞的一种或更多种生物活性，不管它们是否增加了足以促进DLD分离的尺寸。补充DLD分离的载体也不一定特异性地结合靶细胞，即所述载体可能必须与使载体变得特异性的一些其他剂组合，或者所述载体可以简单地添加到细胞制剂中并被允许非特异性地结合。术语“以补充DLD分离的方式”和“以促进DLD分离的方式”不相互排斥。结合可以既补充DLD分离又促进DLD分离。例如，多糖载体可以在其表面上具有增加细胞生长速率的活化剂，并且这些载体中的一个或更多个载体的结合也可以促进DLD分离。可选择地，结合可以仅促进DLD分离，或者仅补充DLD分离。

靶细胞：如本文使用的，“靶细胞”是本文描述的多种程序需要或被设计要纯化、收集、工程化等的细胞。具体的细胞是什么将取决于使用该术语的上下文。例如，如果程序的目标是分离特定种类的干细胞，则该细胞是该程序的靶细胞。

分离、纯化：除非另外指示，否则如本文使用的这些术语是同义的，并且是指相对于不想要的物质富集期望的产物。这些术语不一定意指产物被完全分离或者是完全纯的。例如，如果起始样品具有的靶细胞构成样品中细胞的2％，并且进行了产生其中靶细胞是存在的细胞的60％的组合物的程序，则该程序已经成功地分离或纯化了靶细胞。

确定性侧向位移：如本文使用的，术语“确定性侧向位移”或“DLD”是指，其中基于颗粒的尺寸与一些阵列参数的关系，颗粒在通过阵列的某路径上被确定性地偏转的方法。通常，本文根据连续流(DC条件；即，主体流体仅在单一方向上流动)描述方法。然而，DLD也可以在振荡流(AC条件；即，主体流体在两个方向之间交替流动)下工作。

临界尺寸：通过障碍物阵列的颗粒的“临界尺寸”或“预定尺寸”描述了能够遵循流体的层流的颗粒的尺寸限值。大于临界尺寸的颗粒可以从流体的流动路径被“碰撞”出来，而具有低于临界尺寸(或预定尺寸)的尺寸的颗粒不一定如此移位。当通过间隙的流体流的曲线(profile)关于在主体流体流动方向上平分该间隙的平面对称时，该间隙两侧的临界尺寸可以是相同的；然而，当曲线是非对称的时，该间隙两侧的临界尺寸可以不同。

流体流动：如本文结合DLD使用的，术语“流体流动”和“主体流体流动”是指流体在总体方向上跨障碍物阵列的宏观移动。这些术语不考虑流体在障碍物周围移动以便该流体继续在该总体方向上移动的流体流的暂时性位移。

倾斜角ε：在碰撞阵列设备中，倾斜角是主体流体流动方向和通过对准阵列中顺序性障碍物(在主体流体流动方向上)的行限定的方向之间的角度。

阵列方向：在碰撞阵列设备中，“阵列方向”是通过对准阵列中顺序性障碍物的行限定的方向。如果颗粒在通过间隙并且遇到下游障碍物时，颗粒的总体轨迹遵循碰撞阵列的阵列方向(即，相对于主体流体流动成倾斜角ε行进)，则该颗粒在碰撞阵列中被“碰撞”。在这些情况下，如果颗粒的总体轨迹遵循主体流体流动方向，则颗粒不被碰撞。

发明详述

本发明涉及DLD在制备具有治疗价值的细胞中的用途。下面的文本提供了关于本文公开的方法的总体指导和可以帮助制造和使用在实施这些方法时涉及的设备的信息。

I.设计微流体板

细胞(特别是通过单采血液成分术或白细胞单采术制备的组合物中的细胞)以及颗粒可以通过使用微流体设备进行DLD来分离，所述微流体设备包括流体从设备的一端处或设备的一端附近的一个或更多个入口流到相对端处或相对端附近的出口的通道。基于尺寸的微流体分离的基本原理和用于分离细胞的障碍物阵列的设计已经在别处提供(参见US2014/0342375、US 2016/0139012；7,318,902和US 7,150,812，这些文献在此以其整体并入本文)，并且也在下面的部分中进行了概述。

在DLD期间，将包含颗粒或细胞的流体样品在入口引入到设备中，并且与流过设备的流体一起运载到出口。当样品中的细胞穿过设备时，它们遇到柱或其他障碍物，所述柱或其他障碍物已经成行定位并且形成细胞必须通过的间隙或孔隙。障碍物的每一个连续的行相对于前一行移位以便形成与流动通道中流体流动方向不同的阵列方向。由这两个方向限定的“倾斜角”，连同与障碍物之间的间隙的宽度、障碍物的形状和形成间隙的障碍物的朝向是确定阵列的“临界尺寸”的主要因素。尺寸大于临界尺寸的细胞在阵列方向上行进，而不在主体流体流动方向上行进，并且尺寸小于临界尺寸的颗粒在主体流体流动方向上行进。在用于单采血液成分术或白细胞单采术来源的组合物的设备中，可以选择引起白细胞在阵列方向上偏转，而红细胞和血小板继续处于主体流体流动方向的阵列特征。然后，为了将所选择类型的白细胞与具有相似尺寸的其他细胞分离，可以使用以促进DLD分离并从而产生大于未复合的白细胞的复合物的方式与细胞结合的载体。然后可能在具有小于复合物但大于未复合的细胞的临界尺寸的设备上进行分离。

在设备中使用的障碍物可以采用圆柱形或是三角形、正方形、矩形、菱形、梯形、六边形或泪珠形的形状。此外，相邻的障碍物可以具有使得限定间隙的障碍物的部分关于在主体流体流动方向上延伸的间隙的轴线是对称的或非对称的几何形状。

II.制造和操作微流体设备

用于制造和使用能够基于尺寸分离细胞或颗粒的微流体设备的一般程序是本领域熟知的。这样的设备包括在US 5,837,115；US 7,150,812；US 6,685,841；US 7,318,902；7,472,794；和US 7,735,652中描述的那些设备；其都在此通过引用以其整体并入。提供可能有助于制造和使用用于本发明的设备的指导的其他参考文献包括：US 5,427,663；US 7,276,170；US 6,913,697；US 7,988,840；US 8,021,614；US 8,282,799；US8,304,230；US 8,579,117；US 2006/0134599；US 2007/0160503；US 20050282293；US 2006/0121624；US2005/0266433；US 2007/0026381；US 2007/0026414；US 2007/0026417；US 2007/0026415；US 2007/0026413；US 2007/0099207；US 2007/0196820；US 2007/0059680；US 2007/0059718；US 2007/005916；US 2007/0059774；US 2007/0059781；US 2007/0059719；US2006/0223178；US 2008/0124721；US 2008/0090239；US 2008/0113358；和WO2012094642，其也都通过引用以其整体并入本文。在描述设备制造和使用的多个参考文献中，US 7,150,812提供了特别好的指导，并且关于对具有存在于血液中的细胞的样品进行分离的微流体设备，7,735,652是特别令人感兴趣(关于这一点，还参见US 2007/0160503)。

设备可以使用来自通常制造微米级和纳米级流体处理设备的任何材料制造，所述材料包括硅、玻璃、塑料和杂化材料(hybrid material)。适于微流体制造的多种热塑性材料是可用的，提供了多种机械性质和化学性质可供选择，所述机械性质和化学性质可以是杠杆式的(leveraged)并可针对具体应用进一步调整。

用于制造设备的技术包括复制成形(Replica molding)、用PDMS的软光刻术、热固性聚酯、模压(embossing)、注射成形、激光烧蚀及其组合。另外的细节可以在Fiorini等人的“Disposable microfluidic devices:fabrication,function and application”(BioTechniques 38:429-446(2005年3月))中找到，该文献在此通过引用以其整体并入本文。由Keith E.Herold和Avraham Rasooly编辑的书籍“Lab on a Chip Technology”，Caister Academic Press Norfolk UK(2009)是制造方法的另一个来源，并且在此通过引用以其整体并入本文。

对热塑性塑料的高通量模压方法，诸如卷到卷(reel-to-reel)加工是用于工业微流体芯片生产的有吸引力的方法。使用单芯片热模压可能是在原型设计(prototyping)阶段期间用于实现高质量微流体设备的有成本效益(cost-effective)的技术。在两种热塑性塑料，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和/或聚碳酸酯(PC)中复制微米级特征件(microscalefeature)的方法在Yang等人的“Microfluidic device fabrication by thermoplastichot-embossing”(Methods Mol.Biol.949:115-23(2013))中描述，该文献在此通过引用以其整体并入本文。

流动通道可以使用两个或更多个片材(piece)来构造，当被组装时，所述片材形成具有布置在其中的障碍物的封闭腔室(优选地具有用于添加或排出流体的穴(orifice)的腔室)。障碍物可以在被制造在一个或更多个片材上，所述一个或更多个片材被组装形成流动通道，或者障碍物可以被制造成插入物的形式，该插入物被夹在限定流动通道的边界的两个或更多个片材之间。

障碍物可以是跨流动通道延伸的实心体，在一些情况中，从流动通道的一面延伸到流动通道的相对面。在障碍物在障碍物的一端与流动通道的一面成一体(或是流动通道的延伸部分)时，障碍物的另一端可以被密封到或按压在流动通道的相对面。在障碍物的一端和流动通道的面之间的小空间(优选地小到不能容纳对预期用途而言是感兴趣的任何颗粒)是可容许的，条件是该空间不会不利地影响障碍物的结构稳定性或设备的相关流动性质。

存在的障碍物的数目应足以实现阵列的颗粒分离性质。通常，障碍物可以成行和成列地组织(注意：术语“行和列”的使用不意指或暗示行和列彼此垂直)。以大体上横向于(transverse)流动通道中流体流动的方向排列的障碍物可以被称为成列的障碍物。一列中彼此相邻的障碍物可以限定流体流过的间隙。

相邻列中的障碍物可以以一定角度彼此偏移，该角度由称为ε(epsilon)的倾斜角表征。因此，对于彼此相邻的若干列(即，被大体上横穿列的单一方向的流体流动连续通过的障碍物的若干列)，列中对应的障碍物可以彼此偏移，使得对应的障碍物形成相对于流体流过列的方向成角度ε延伸的一行障碍物。可以选择倾斜角并且可以使列彼此间隔开，使得1/ε(当以弧度表示时)是整数，并且障碍物的列周期性重复。在单一列中的障碍物也可以彼此偏移相同或不同的倾斜角。举例来说，行和列可以被布置成相对于彼此成90度的角度，行和列都相对于主体流体流过流动通道的方向以相同的角度ε倾斜。

表面可以被涂覆以改变它们的性质，并且用于制造设备的聚合材料可以以许多方式修饰。在一些情况中，天然聚合物中的或通过湿化学或等离子体处理(plasmatreatment)的手段添加的官能团诸如胺或羧酸被用于交联蛋白质或其他分子。DNA可以使用表面胺基团附接到COC和PMMA基底。表面活性剂诸如可以通过将/>添加到PDMS制剂中而用于使表面亲水和排斥蛋白质。在一些情况中，将PMMA层旋涂在设备例如微流体芯片上，并且用羟丙基纤维素“掺入”PMMA以改变其接触角。

为了降低细胞或化合物(例如通过裂解的细胞释放的或在生物样品中发现的化合物)非特异性吸附到通道壁上，一个或更多个壁可以被化学修饰为非粘附性的或排斥性的。壁可以用商业的非粘附性试剂(诸如用于形成水凝胶的那些)的薄膜涂层(例如，单层)包被。可以用于改进通道壁的化学物质的另外的实例包括寡聚乙二醇、氟化聚合物、有机硅烷、硫醇、聚乙二醇、透明质酸、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、粘蛋白、聚HEMA、甲基丙烯酸酯化的PEG和琼脂糖。还可以使用带电荷的聚合物诸如肝素以排斥带相反电荷的物质。用于排斥的化学品种类的类型和附接到通道壁的方法可以取决于被排斥的物质的性质以及壁和被附接的物质的性质。这样的表面修饰技术是本领域熟知的。可以在设备组装之前或之后将壁官能化。

III.使用DLD的分离方法

本文描述的DLD设备可以用于纯化细胞、细胞片段、细胞加合物(cell adduct)或核酸。如本文讨论的，这些设备还可以用于将感兴趣的细胞群体与多于一个其他细胞分离。血液组分使用设备的分离和纯化可以例如在美国公布第US2016/0139012号中找到，该文献的教导通过引用以其整体并入本文。下面提供了对几个说明性分离的简要讨论。

A.存活细胞

在一种实施方案中，设备在被设计成将存活细胞与非存活细胞分离的程序中使用。术语“存活细胞”是指能够生长、活跃地分裂、能够增殖等的细胞。在存活细胞具有大于非存活细胞的尺寸的实例中，DLD设备可以被设计成包括大于非存活细胞的预定尺寸且小于存活细胞的预定尺寸的临界尺寸。临界尺寸可以小至是非存活细胞的预定尺寸的1.1倍大(或小)，但通常更大的程度(或更小)是优选的，例如约1.2倍-2倍，并且优选地3倍-10倍。

B.粘附细胞

在另一种实施方案中，DLD设备可以用于分离粘附细胞。如本文使用的，术语“粘附细胞”是指能够粘附至表面的细胞。粘附细胞包括细胞培养中使用的永生化细胞，并且可以来源于哺乳动物宿主。在一些实例中，粘附细胞可以在纯化之前被胰蛋白酶处理。粘附细胞的实例包括MRC-5细胞；HeLa细胞；Vero细胞；NIH 3T3细胞；L929细胞；Sf21细胞；Sf9细胞；A549细胞；A9细胞；AtT-20细胞；BALB/3T3细胞；BHK-21细胞；BHL-100细胞；BT细胞；Caco-2细胞；Chang细胞；Clone 9细胞；Clone M-3细胞；COS-1细胞；COS-3细胞；COS-7细胞；CRFK细胞；CV-1细胞；D-17细胞；Daudi细胞；GH1细胞；GH3细胞；HaK细胞；HCT-15细胞；HL-60细胞；HT-1080细胞；HT-29细胞；HUVEC细胞；I-10细胞；IM-9细胞；JEG-2细胞；Jensen细胞；Jurkat细胞；K-562细胞；KB细胞；KG-1细胞；L2细胞；LLC-WRC 256细胞；McCoy细胞；MCF7细胞；WI-38细胞；WISH细胞；XC细胞；Y-1细胞；CHO细胞；Raw 264.7；BHK-21细胞；包括293A、293T和类似细胞的HEK293细胞；HEP G2细胞；BAE-1细胞；SH-SY5Y细胞；及其包括工程化和重组株系的任何衍生物。

在一些实施方案中，程序可以包括从诸如生长培养基的稀释物中分离细胞，这可能需要对粘附细胞的培养物的有效保持。例如，在生长培养基中的粘附细胞的培养物可以被交换到包含转染试剂的转染培养基中，被交换到被设计成引发粘附细胞内的变化(诸如干细胞的分化)的第二生长培养基中，或被交换到被设计成从培养物中移除化合物的顺序性洗涤缓冲液中。

在优选的程序中，通过与以促进DLD分离的方式结合一种或更多种载体缔合来纯化粘附细胞。载体可以是本文描述的类型，并且结合可以稳定和/或活化细胞。通常，载体将在1μm-1000μm范围内，但有时也可以在此范围之外。

载体和细胞之间的缔合应产生相对于未与载体缔合的其他物质尺寸增加的复合物。取决于细胞和载体的具体尺寸和存在的细胞和载体的数量，复合物可以是从比未复合的细胞大几个百分点至是未复合的细胞的尺寸的许多倍的任何尺寸。为了利于分离，增加至少20％是期望的，更高的百分比(50；100；1000或更高)是优选的。

C.活化的细胞

DLD设备也可以在用于将活化的细胞或能够被活化的细胞与多于一个其他细胞分离的程序中使用。经历活化的细胞可以大规模生长，但是在优选的实施方案中，细胞来源于单个患者并且DLD在收集后至少几个小时内进行。术语“活化的细胞”或“能够被活化的细胞”是指已经或能够分别通过与细胞活化剂缔合、孵育或接触而被活化的细胞。能够被活化的细胞的实例可以包括在免疫反应或炎性反应中起作用的细胞，诸如：T细胞、B细胞；调节性T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、先天性淋巴细胞、巨核细胞、自然杀伤细胞、凝血细胞、滑膜细胞等；在新陈代谢中起作用的细胞，诸如β细胞、肝细胞和胰腺细胞；以及能够诱导蛋白质表达的重组细胞，诸如DE3溶原化的大肠杆菌(E.coli)细胞、酵母细胞、植物细胞等。

通常，一种或更多种载体在其表面上具有活化剂。细胞活化剂的实例包括蛋白质、抗体、细胞因子、CD3、CD28、针对特定蛋白质的抗原、辅助性T细胞、受体和糖蛋白；激素，诸如胰岛素、胰高血糖素等；IPTG、乳糖、异乳糖、脂质、糖苷、萜类、类固醇和生物碱。可活化的细胞应通过可活化的细胞和载体表面上的细胞活化剂之间的相互作用至少部分地与载体缔合。形成的复合物可以只比未复合的细胞大几个百分点，或者是未复合的细胞的尺寸的许多倍。为了利于分离，至少20％的增加是期望的，更高的百分比(40、50、100、1000或更高)是优选的。

D.将细胞与毒性物质分离

DLD还可用于纯化，其被设计成移除可能对细胞具有毒性的化合物或保持细胞免受毒性化合物的污染。实例包括抗生素、低温保存剂、抗真菌剂、毒性代谢物、叠氮化钠、金属离子、金属离子螯合剂、内毒素、增塑剂、杀虫剂及其任何组合。设备可以用于从细胞移除毒性化合物，以确保从所述细胞连续生产物质。在一些实例中，细胞可以是对数期细胞。术语“对数期细胞”是指处于以指数对数生长为特征的生长阶段的活跃分裂的细胞。在对数期，细胞群体可以以恒定的速率加倍，使得绘制细胞数的自然对数相对于时间的曲线产生一条直线。

分离毒性物质的能力对包括以下的多种细胞可能是重要的：细菌菌株诸如BL21、Tuner、Origami、Origami B、Rosetta、C41、C43、DH5α、DH10β或XL1Blue；酵母菌株诸如酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)和亚罗酵母属(Yarrowia)的酵母菌株；藻类；和哺乳动物细胞培养物，包括MRC-5细胞；HeLa细胞；Vero细胞；NIH 3T3细胞；L929细胞；Sf21细胞；Sf9细胞；A549细胞；A9细胞；AtT-20细胞；BALB/3T3细胞；BHK-21细胞；BHL-100细胞；BT细胞；Caco-2细胞；Chang细胞；Clone 9细胞；Clone M-3细胞；COS-1细胞；COS-3细胞；COS-7细胞；CRFK细胞；CV-1细胞；D-17细胞；Daudi细胞；GH1细胞；GH3细胞；HaK细胞；HCT-15细胞；HL-60细胞；HT-1080细胞；HT-29细胞；HUVEC细胞；I-10细胞；IM-9细胞；JEG-2细胞；Jensen细胞；Jurkat细胞；K-562细胞；KB细胞；KG-1细胞；L2细胞；LLC-WRC 256细胞；McCoy细胞；MCF7细胞；WI-38细胞；WISH细胞；XC细胞；Y-1细胞；CHO细胞；Raw 264.7；BHK-21细胞；包括293A、293T和类似细胞的HEK 293细胞；HEP G2细胞；BAE-1细胞；SH-SY5Y细胞；干细胞及其包括工程化和重组株系的任何衍生物的培养物。

V.技术背景

不受任何特定理论的束缚，对微流体的一些技术方面的一般讨论可以有助于理解影响本领域进行的分离的因素。已经公开了多种用于分离颗粒的微型筛分基质(microfabricated sieving matrix)(Chou等人,Proc.Natl.Acad.Sci.96:13762(1999)；Han等人，Science 288:1026(2000)；Huang等人,Nat.Biotechnol.20:1048(2002)；Turner等人,Phys.Rev.Lett.88(12):128103(2002)；Huang等人,Phys.Rev.Lett.89:178301(2002)；美国专利第5,427,663号；美国专利第7,150,812号；美国专利第6,881,317号)。已经描述了碰撞阵列(也被称为“障碍物阵列”)设备，并且解释了它们的基本操作，例如在美国专利第7,150,812号中，该文献通过引用以其整体并入本文。碰撞阵列基本上通过分离通过障碍物的阵列(通常，周期性有序的阵列)的颗粒来运行，分离发生在遵循“阵列方向”的颗粒之间，所述“阵列方向”偏移主体流体流动方向或偏离施加的场的方向(US 7,150,812)。

A.碰撞阵列

在一些阵列中，相邻障碍物的几何形状使得限定间隙的障碍物的部分关于在主体流体流动方向上延伸的间隙的轴线对称。流过这样的间隙的流体的速度或体积曲线是近似地跨该间隙的抛物线形，在限定间隙的每个障碍物的表面处流体速度和流量为零(假设无滑流条件(no-slip flow condition))，并且在间隙的中心点处达到最大值。该曲线是抛物线形的，与限定间隙的障碍物之一相邻的给定宽度的流体层和与限定间隙的另一个障碍物相邻的相同宽度的流体层包含相等比例的流体流量，意指不管颗粒行进到哪个障碍物附近，在通过间隙期间被“碰撞”的颗粒的临界尺寸是相等的。

在一些情况中，可以通过对障碍物进行塑形和布置，使得将流体流偏转到障碍物之间的间隙的相邻障碍物的部分关于在主体流体流动方向上延伸的间隙的轴线是非对称的，来改进障碍物阵列的颗粒尺寸分离性能。这种缺乏进入间隙的流动对称性可以引起间隙内的非对称的流体流动曲线。流向间隙一侧的流体的浓度(即，通过间隙的非对称流体流动曲线的结果)可以降低被诱导在阵列方向上而不在主体流体流动方向上行进的颗粒的临界尺寸。这是因为流动曲线的非对称性引起与包含选择的比例的通过间隙的流体流量的一个障碍物相邻的流动层的宽度和包含相同比例的流体流量并且与限定间隙的另一个障碍物相邻的流体层的宽度之间的差异。与障碍物相邻的流体层的不同宽度限定了表现出两种不同临界颗粒尺寸的间隙。如果穿过间隙的颗粒超过运载其的流体层的临界尺寸，则颗粒可以被碰撞(即，在阵列方向上行进，而不在主体流体流动方向上行进)。因此，如果穿过具有非对称流动曲线的间隙的颗粒在与一个障碍物相邻的流体层中行进，则该颗粒可能被碰撞，但是如果颗粒在与限定间隙的另一个障碍物相邻的流体层中行进，则该颗粒不被碰撞。

在另一方面，减少限定间隙的障碍物的边缘的圆度可以提高障碍物阵列的颗粒尺寸分离性能。举例来说，具有尖锐顶点的三角形横截面的障碍物的阵列可以表现出比具有圆形顶点的相同尺寸和相同间隔的三角形障碍物阵列更小的临界颗粒尺寸。

因此，通过使障碍物阵列中限定间隙的障碍物的边缘锐化，可以减小在主体流体流动的影响下在阵列方向上偏转的颗粒的临界尺寸，而不必须降低障碍物的尺寸。相反地，具有更尖锐边缘的障碍物可以比具有不太尖锐边缘的相同尺寸的障碍物间隔更远，但仍然产生与具有不太尖锐边缘的相同尺寸的障碍物等效的颗粒分离性质。

B.分级分离范围

微流体设备上通过尺寸分离的物体包括细胞、生物分子、无机珠和其他物体。分级分离的典型尺寸在100纳米至50微米的范围。然而，有时也可以对更大和更小的颗粒进行分级分离。

C.容量

取决于设计，设备或设备的组合可以用于处理约10μl至至少500μl之间的样品、约500μl和约40mL之间的样品、约500μl和约20mL之间的样品、约20mL的样品和约200mL之间的样品、约40mL的样品和约200mL之间的样品或至少200mL的样品。在一些实例中，被处理的材料的总体积可以在50ml和5000ml之间、100ml和4000ml之间或500ml和2000ml之间。起始材料包括血液、来源于血液的制剂(例如，单采血液成分术或白细胞单采术制剂)、其他生物流体或提取物、培养物中生长的细胞等。

D.通道

设备可以包括具有一个或更多个入口和一个或更多个出口的一个或更多个(multiple)通道。入口可以用于样品或粗(即，未被纯化的)流体组合物、用于缓冲液或用于引入试剂。出口可以用于收集产物或者可以用作废弃物的出口。通道可以是约0.5mm至100mm宽，且约2mm-200mm长，但是不同的宽度和长度也是可能的。深度可以是1μm-1000μm，并且可以存在从1至100个的任何数目的通道或更多。体积可以在从几μl到许多mL的非常宽的范围变化，并且设备可以具有多于一个区(级或部分)，所述多于一个区(段(stage)或部分(section))具有不同的障碍物配置。

E.间隙尺寸(柱或障碍物之间的边缘到边缘的距离)

障碍物的阵列中的间隙尺寸(柱或障碍物之间的边缘到边缘的距离)可以从约几微米(例如，1-500微米)变化或大于1毫米。在一些实施方案中，障碍物可以具有1微米-3000微米的直径，并且可以具有多种形状(圆形、三角形、泪珠形、菱形、正方形、矩形等)。柱的第一行可以接近入口(例如，在5μm以内)或远离入口超过1mm定位。

F.可堆叠的芯片

设备可以包括多于一个可堆叠的芯片。设备可以包括约1-50个芯片。在一些实例中，设备可以具有以串联或并联或两者兼有地放置的多于一个芯片。

实施例

以下实施例意图说明而非限制本发明。

将正常的血液样品稀释至0.2x，并且在DLD上以正常分离模式进行处理(相对于缓冲液运行样品)。收集的初始产物级分具有基于输入计数以及DLD设备的入口与出口的比率预期的浓度(进一步0.28x稀释)。在运行中途，将收集的产物作为“洗涤流”再循环至DLD设备中。随着DLD产物继续再循环，在不同的时间点收集不同级分。将DLD产物的最终体积和浓度与样品的输入体积和浓度进行比较，以获得回收率值。多次通过后的WBC的净回收率为97.5％，并且从输入物质到产物物质的浓度倍数变化为2.9x(对比相对于运行缓冲液处理样品时从输入到产物的0.28x的初始变化)。

____________________

本文引用的所有参考文献通过引用完全并入。现在已经充分描述了本发明，本领域的技术人员将理解，本发明可以在条件、参数等的宽泛且等同的范围内进行，而不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围。

Claims (42)

1.一种从包含小于预定尺寸的细胞或颗粒样品中分离所述预定尺寸的靶细胞或靶颗粒的方法，所述方法包括：

a)在分隔的入口将所述样品和洗涤流体都施加到微流体设备，其中：

i)施加到所述设备的所述洗涤流体不含所述靶细胞或所述靶颗粒，并且不含小于所述预定尺寸的所述细胞或颗粒；

ii)所述微流体设备包括成行布置的障碍物阵列，障碍物的每一个后续的行相对于前一行侧向地偏移，并且其中所述障碍物被定位成使得将靶细胞或靶颗粒差异化地偏转到第一出口并将小于所述预定尺寸的所述细胞或颗粒引导到第二出口，在所述第一出口所述靶细胞或靶颗粒能够作为靶细胞或靶颗粒产物被回收，并且在所述第二出口小于所述预定尺寸的所述细胞或颗粒能够作为废弃物被收集或弃去；

b)通过使所述样品和所述洗涤流体流过所述设备来进行确定性侧向位移DLD，其中在所述DLD进行期间，所述靶细胞或靶颗粒产物的至少一部分被再循环一次或更多次，以替代被施加到所述设备的所述洗涤流体的全部或至少一部分；

c)在步骤b)期间或在步骤b)结束时，从所述第一出口收集包含靶细胞或靶颗粒的最终产物。

2.如权利要求1所述的方法，其中在所述靶细胞或靶颗粒产物已经被再循环之后停止再循环，并将洗涤流体再次施加到所述微流体设备。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述洗涤流体是水或水性缓冲液，和/或a)所述洗涤流体中包含与细胞、颗粒或其他组分发生化学反应的试剂；或b)所述洗涤流体包含与靶细胞或靶颗粒特异性相互作用的抗体、载体或活化剂。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一出口包括阀或与阀连接，所述阀能够用于将所述靶细胞或靶颗粒产物转移到导管，所述导管将产物再循环至所述微流体设备上的入口。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述微流体设备包括入口，所述入口包括阀或与阀连接，所述阀能够用于将通过所述入口进入所述设备的进料从供给洗涤缓冲液的导管转换到供给细胞或靶颗粒产物的导管。

6.如权利要求1所述的方法，其中再循环至所述微流体设备的所述靶细胞或靶颗粒产物在重新施加到所述微流体设备之前、期间或之后与载体、抗体、荧光标签、活化剂或化合物反应或结合。

7.如权利要求1所述的方法，其中对所述靶细胞或靶颗粒产物进行细胞或颗粒计数。

8.如权利要求1所述的方法，其中继续再循环，直到相对于所述样品中的浓度，细胞或颗粒被浓缩至少3倍。

9.如权利要求1所述的方法，其中继续再循环，直到相对于所述样品中的浓度，细胞或颗粒被浓缩至少5倍。

10.如权利要求1所述的方法，其中继续再循环，直到相对于所述样品中的浓度，细胞或颗粒被浓缩至少10倍。

11.如权利要求1所述的方法，其中再循环和微流体处理联合是用于浓缩细胞或颗粒的唯一方法。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含预定尺寸的靶细胞或干细胞以及小于所述预定尺寸的细胞。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述靶细胞是白细胞，并且小于所述预定尺寸的细胞是血小板或红细胞。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述样品是血液或通过对血液进行单采血液成分术或白细胞单采术获得的组合物。

15.如权利要求12所述的方法，其中被再循环的白细胞或干细胞与载体、抗体或活化剂以促进或补充DLD分离的方式结合。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述白细胞是T细胞。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述方法在用于产生CAR-T细胞的工艺中使用。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述工艺不包括离心步骤。

19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述方法用于充分地浓缩细胞以允许将它们施用至患者。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述样品从患者获得，并且从获得所述样品完成的时间直到DLD完成，历时不超过4小时。

21.一种制备纯化的遗传工程化的靶细胞的方法，所述方法包括：

a)获得包含预定尺寸的靶细胞和小于所述预定尺寸的一个或更多个污染性细胞或污染性颗粒的样品；

b)在第一入口将所述样品施加到微流体设备并在第二入口施加洗涤流体，其中所述微流体设备包括障碍物阵列，所述障碍物阵列被定位成使得将靶细胞的流差异化地偏转到第一出口并将小于所述预定尺寸的污染性细胞或污染性颗粒引导到第二出口，在所述第一出口所述靶细胞能够作为靶细胞产物被回收；

c)使所述样品和所述洗涤流体流过所述设备，其中确定所述第一出口处的靶细胞浓度，并且所述靶细胞的至少一部分从所述第一出口再循环，以替代被施加到所述设备的入口的所述洗涤流体的全部或至少一部分，继续或重复所述再循环，直到达到期望的产物细胞浓度PC；

d)一旦达到PC，将所述靶细胞的流从所述第一出口引导到所述靶细胞被转化或转染以形成遗传工程化的靶细胞的位点；

e)使所述遗传工程化的靶细胞流到设备中，在所述设备中，将所述遗传工程化的靶细胞与用于转化或转染所述靶细胞的试剂、病毒或其他物质分离，以形成纯化的遗传工程化的靶细胞；

f)收集所述纯化的遗传工程化的靶细胞或使所述纯化的遗传工程化的靶细胞流到其在收集之前被进一步处理的另一个位点。

22.如权利要求21所述的方法，其中从步骤b)向微流体设备施加细胞到收集细胞的所有步骤作为单一连续过程进行。

23.如权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述靶细胞是淋巴细胞或干细胞。

24.如权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述靶细胞是T淋巴细胞。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述T淋巴细胞被遗传工程化以在其表面上产生嵌合抗原受体(CAR)。

26.如权利要求21所述的方法，其中在步骤b)和步骤c)中，通过DLD将靶细胞与大于或小于所述预定尺寸的细胞或颗粒分离。

27.如权利要求21所述的方法，其中在步骤e)中，所述设备是微流体设备，并且通过DLD将所述遗传工程化的靶细胞与用于转化或转染所述靶细胞的试剂、病毒或其他物质分离。

28.如权利要求21所述的方法，其中在步骤e)中，在分离用于转化或转染所述靶细胞的试剂、病毒或其他物质期间，将所述纯化的遗传工程化的靶细胞转移到生长培养基中并在步骤f)中收集并在细胞培养物中扩增或者使其流到其被培养并且然后被收集的位点。

29.如权利要求21所述的方法，其中所述洗涤流体是水或水性缓冲液，和/或：a)所述洗涤流体中包含与细胞、颗粒或其他组分发生化学反应的试剂；或b)包含与靶细胞特异性相互作用的抗体、载体或活化剂。

30.如权利要求21所述的方法，其中所述第一出口包括阀或与阀连接，所述阀能够用于将所述靶细胞引导到将产物再循环至所述微流体设备上的入口的导管，或者可选择地，所述阀能够将所述靶细胞的流从所述第一出口引导到所述靶细胞被转化或转染以形成遗传工程化的靶细胞的位点。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述阀被配置为通过将所述靶细胞引导到将所述产物再循环至所述微流体设备上的入口的导管来对低于PC的靶细胞浓度作出电响应，并且被配置为通过将所述靶细胞引导到所述靶细胞被转化或转染以形成遗传工程化的靶细胞的位点来对处于或高于PC的靶细胞浓度作出电响应。

32.如权利要求21所述的方法，其中再循环至所述微流体设备的所述靶细胞在重新施加到所述微流体设备之前、期间或之后与载体、抗体、荧光标签、活化剂或化合物反应或结合。

33.如权利要求21所述的方法，其中继续再循环，直到相对于所述样品中的浓度，靶细胞被浓缩至少3倍。

34.如权利要求21所述的方法，其中继续再循环，直到相对于所述样品中的浓度，靶细胞被浓缩至少5倍。

35.如权利要求21所述的方法，其中再循环和微流体处理联合是用于浓缩细胞或颗粒的唯一方法。

36.如权利要求21所述的方法，其中在从步骤a)获得样品直到步骤f)收集细胞的整个时间期间，不对靶细胞进行离心。

37.如权利要求21所述的方法，其中在从步骤a)获得样品直到步骤f)收集细胞的整个时间期间，不对靶细胞进行冷冻。

38.如权利要求21所述的方法，其中所述样品是血液或通过对血液进行单采血液成分术或白细胞单采术获得的组合物。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述靶细胞是白细胞，并且在步骤b)和步骤c)中，进行DLD以将所述白细胞与血小板和/或红细胞分离。

40.如权利要求21所述的方法，其中被再循环的白细胞或干细胞与载体、抗体或活化剂以促进或补充DLD分离的方式结合。

41.如权利要求21所述的方法，其中所述样品从患者获得，并且从获得所述样品完成的时间直到步骤f)完成，历时不超过10小时。

42.如权利要求41所述的方法，其中从获得所述样品完成的时间直到步骤f)完成，历时不超过5小时。