JP2023159105A - マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 - Google Patents
マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023159105A JP2023159105A JP2023122659A JP2023122659A JP2023159105A JP 2023159105 A JP2023159105 A JP 2023159105A JP 2023122659 A JP2023122659 A JP 2023122659A JP 2023122659 A JP2023122659 A JP 2023122659A JP 2023159105 A JP2023159105 A JP 2023159105A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- dld
- cell
- patient
- carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 998
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 329
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 292
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 95
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 37
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 1466
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 377
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 claims description 158
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 131
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims description 123
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 118
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims description 113
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 108
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 96
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 95
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 82
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 claims description 76
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 64
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 61
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 53
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 48
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims description 45
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 claims description 45
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 39
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 38
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 34
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 32
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 32
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 32
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 31
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 29
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 27
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 25
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 21
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 claims description 19
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 17
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 17
- -1 T helper cell Proteins 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 15
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 14
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 13
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 12
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 12
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 12
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 11
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 11
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 11
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 10
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 9
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 9
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 9
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 9
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 9
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 9
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 8
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 8
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 7
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 7
- 229940126530 T cell activator Drugs 0.000 claims description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 claims description 7
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 6
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 claims description 6
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 claims description 5
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 claims description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 230000009758 senescence Effects 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 5
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 4
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 4
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 claims description 4
- DLRVVLDZNNYCBX-CAPXFGMSSA-N allolactose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1OC[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-CAPXFGMSSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 4
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 claims description 4
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 claims description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004964 innate lymphoid cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 claims description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 claims description 4
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 claims description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 4
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BSYNRYMUTXBXSQ-FOQJRBATSA-N 59096-14-9 Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1[14C](O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-FOQJRBATSA-N 0.000 claims description 3
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000005528 B01AC05 - Ticlopidine Substances 0.000 claims description 3
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 3
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 3
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 claims description 3
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 3
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 3
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 claims description 3
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 claims description 3
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 3
- PHWBOXQYWZNQIN-UHFFFAOYSA-N ticlopidine Chemical compound ClC1=CC=CC=C1CN1CC(C=CS2)=C2CC1 PHWBOXQYWZNQIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005001 ticlopidine Drugs 0.000 claims description 3
- COKMIXFXJJXBQG-NRFANRHFSA-N tirofiban Chemical compound C1=CC(C[C@H](NS(=O)(=O)CCCC)C(O)=O)=CC=C1OCCCCC1CCNCC1 COKMIXFXJJXBQG-NRFANRHFSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003425 tirofiban Drugs 0.000 claims description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 19
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 115
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 101
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 20
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 18
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 18
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 16
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 12
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 12
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 12
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 12
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 12
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 11
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 10
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 10
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 8
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 8
- 238000003491 array Methods 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000004049 embossing Methods 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 5
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 5
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 5
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 5
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 4
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 description 4
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 4
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 3
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 3
- VJBCNMFKFZIXHC-UHFFFAOYSA-N azanium;2-(4-methyl-5-oxo-4-propan-2-yl-1h-imidazol-2-yl)quinoline-3-carboxylate Chemical compound N.N1C(=O)C(C(C)C)(C)N=C1C1=NC2=CC=CC=C2C=C1C(O)=O VJBCNMFKFZIXHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N (r)-(6-ethoxyquinolin-4-yl)-[(2s,4s,5r)-5-ethyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]methanol;hydrochloride Chemical compound Cl.C([C@H]([C@H](C1)CC)C2)CN1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OCC)C=C21 QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100031102 C-C motif chemokine 4 Human genes 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 101100054773 Caenorhabditis elegans act-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 2
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 2
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 2
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 2
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 2
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000002940 repellent Effects 0.000 description 2
- 239000005871 repellent Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000004229 Alkannin Substances 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000037914 B-cell disorder Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 239000004287 Dehydroacetic acid Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004398 Ethyl lauroyl arginate Substances 0.000 description 1
- 239000004214 Fast Green FCF Substances 0.000 description 1
- 239000004230 Fast Yellow AB Substances 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004284 Heptyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000004233 Indanthrene blue RS Substances 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000004235 Orange GGN Substances 0.000 description 1
- 239000004218 Orcein Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 239000004237 Ponceau 6R Substances 0.000 description 1
- 239000004236 Ponceau SX Substances 0.000 description 1
- 239000004285 Potassium sulphite Substances 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000004231 Riboflavin-5-Sodium Phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000004288 Sodium dehydroacetate Substances 0.000 description 1
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 1
- 239000004283 Sodium sorbate Substances 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 239000004234 Yellow 2G Substances 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000019232 alkannin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004191 allura red AC Substances 0.000 description 1
- 235000012741 allura red AC Nutrition 0.000 description 1
- 239000004411 aluminium Substances 0.000 description 1
- 235000010210 aluminium Nutrition 0.000 description 1
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 description 1
- 235000012735 amaranth Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 230000003373 anti-fouling effect Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000004176 azorubin Substances 0.000 description 1
- 235000012733 azorubine Nutrition 0.000 description 1
- 239000001654 beetroot red Substances 0.000 description 1
- 235000012677 beetroot red Nutrition 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000004126 brilliant black BN Substances 0.000 description 1
- 235000012709 brilliant black BN Nutrition 0.000 description 1
- 239000004161 brilliant blue FCF Substances 0.000 description 1
- 235000012745 brilliant blue FCF Nutrition 0.000 description 1
- 239000004109 brown FK Substances 0.000 description 1
- 235000012713 brown FK Nutrition 0.000 description 1
- 239000001678 brown HT Substances 0.000 description 1
- 235000012670 brown HT Nutrition 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004301 calcium benzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010237 calcium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Substances [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004281 calcium formate Substances 0.000 description 1
- 235000019255 calcium formate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004294 calcium hydrogen sulphite Substances 0.000 description 1
- 235000010260 calcium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000004303 calcium sorbate Substances 0.000 description 1
- 235000010244 calcium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004295 calcium sulphite Substances 0.000 description 1
- 235000010261 calcium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 235000019241 carbon black Nutrition 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000004106 carminic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012730 carminic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000001752 chlorophylls and chlorophyllins Substances 0.000 description 1
- 235000012698 chlorophylls and chlorophyllins Nutrition 0.000 description 1
- 239000001679 citrus red 2 Substances 0.000 description 1
- 235000013986 citrus red 2 Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000004121 copper complexes of chlorophylls and chlorophyllins Substances 0.000 description 1
- 235000012700 copper complexes of chlorophylls and chlorophyllins Nutrition 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000708 deep reactive-ion etching Methods 0.000 description 1
- 235000019258 dehydroacetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000004316 dimethyl dicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000010300 dimethyl dicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000004174 erythrosine Substances 0.000 description 1
- 235000012732 erythrosine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004403 ethyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010228 ethyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 235000019240 fast green FCF Nutrition 0.000 description 1
- 235000019233 fast yellow AB Nutrition 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000009501 film coating Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229920002313 fluoropolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Substances OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 235000010193 gold Nutrition 0.000 description 1
- 239000004333 gold (food color) Substances 0.000 description 1
- 239000004120 green S Substances 0.000 description 1
- 235000012701 green S Nutrition 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000019251 heptyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 235000019239 indanthrene blue RS Nutrition 0.000 description 1
- 239000004179 indigotine Substances 0.000 description 1
- 235000012738 indigotine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000004407 iron oxides and hydroxides Substances 0.000 description 1
- 235000010213 iron oxides and hydroxides Nutrition 0.000 description 1
- 238000012804 iterative process Methods 0.000 description 1
- 238000002032 lab-on-a-chip Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003698 laser cutting Methods 0.000 description 1
- 239000004335 litholrubine BK Substances 0.000 description 1
- 235000010187 litholrubine BK Nutrition 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H magnesium;potassium;trisodium;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate;acetate;tetrachloride;nonahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[Mg+2].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].CC([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004311 natamycin Substances 0.000 description 1
- 235000010298 natamycin Nutrition 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019236 orange GGN Nutrition 0.000 description 1
- 235000019248 orcein Nutrition 0.000 description 1
- 150000001282 organosilanes Chemical class 0.000 description 1
- 239000004306 orthophenyl phenol Substances 0.000 description 1
- 235000010292 orthophenyl phenol Nutrition 0.000 description 1
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004177 patent blue V Substances 0.000 description 1
- 235000012736 patent blue V Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011338 personalized therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 1
- 229940081858 plasmalyte a Drugs 0.000 description 1
- 238000009428 plumbing Methods 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229940068917 polyethylene glycols Drugs 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229940068984 polyvinyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000004175 ponceau 4R Substances 0.000 description 1
- 235000012731 ponceau 4R Nutrition 0.000 description 1
- 235000019238 ponceau 6R Nutrition 0.000 description 1
- 235000019237 ponceau SX Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Substances [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004300 potassium benzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010235 potassium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004293 potassium hydrogen sulphite Substances 0.000 description 1
- 235000010259 potassium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000004297 potassium metabisulphite Substances 0.000 description 1
- 235000010263 potassium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004304 potassium nitrite Substances 0.000 description 1
- 235000010289 potassium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019252 potassium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004172 quinoline yellow Substances 0.000 description 1
- 235000012752 quinoline yellow Nutrition 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 239000004180 red 2G Substances 0.000 description 1
- 235000012739 red 2G Nutrition 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000000820 replica moulding Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 235000019234 riboflavin-5-sodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004248 saffron Substances 0.000 description 1
- 235000013974 saffron Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 235000010191 silver Nutrition 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011091 sodium acetates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000019259 sodium dehydroacetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004402 sodium ethyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010226 sodium ethyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004289 sodium hydrogen sulphite Substances 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000004296 sodium metabisulphite Substances 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000004290 sodium methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010268 sodium methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Substances [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 239000004307 sodium orthophenyl phenol Substances 0.000 description 1
- 235000010294 sodium orthophenyl phenol Nutrition 0.000 description 1
- 239000004404 sodium propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010230 sodium propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019250 sodium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulphite Substances [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000002174 soft lithography Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004291 sulphur dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000010269 sulphur dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000004173 sunset yellow FCF Substances 0.000 description 1
- 235000012751 sunset yellow FCF Nutrition 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004149 tartrazine Substances 0.000 description 1
- 235000012756 tartrazine Nutrition 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000012815 thermoplastic material Substances 0.000 description 1
- 229920001187 thermosetting polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004308 thiabendazole Substances 0.000 description 1
- 235000010296 thiabendazole Nutrition 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000010215 titanium dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000004108 vegetable carbon Substances 0.000 description 1
- 235000012712 vegetable carbon Nutrition 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007704 wet chemistry method Methods 0.000 description 1
- 235000019235 yellow 2G Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
- C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
- B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
- B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
- B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2400/00—Moving or stopping fluids
- B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
- B01L2400/084—Passive control of flow resistance
- B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2531/00—Microcarriers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
- C12N2533/74—Alginate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Fluid Mechanics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Biophysics (AREA)
Abstract
【課題】治療的用途がある細胞を収集し、かつ迅速に処理する方法を提供する。【解決手段】a)標的細胞を粗流体組成物から単離する工程であって、単離手順が、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含み、該デバイスが、第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれているチャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、該チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、該標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、該収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイを含む、工程;b)前記収集出口から得られた標的細胞を所望の表現型を有するように遺伝子操作する工程、を含む、標的細胞の集団を操作する方法とする。【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
この出願は、2017年9月1日に出願された米国仮特許出願第62/553,723号の恩典;2017年10月3日に出願された米国仮特許出願第62/567,553号の恩典;2018年2月26日に出願された仮特許出願第62/635,304号の恩典;および2018年4月12日に出願された仮特許出願第62/656,939号の恩典を主張し、加えて、本願は、2017年10月23日に出願されたPCT/US2017/057876の一部継続出願である。これらの先行出願は全て、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
この出願は、2017年9月1日に出願された米国仮特許出願第62/553,723号の恩典;2017年10月3日に出願された米国仮特許出願第62/567,553号の恩典;2018年2月26日に出願された仮特許出願第62/635,304号の恩典;および2018年4月12日に出願された仮特許出願第62/656,939号の恩典を主張し、加えて、本願は、2017年10月23日に出願されたPCT/US2017/057876の一部継続出願である。これらの先行出願は全て、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
連邦支援研究に関する言明
この発明は、National Institutes of Healthにより授与された認可番号CA174121および番号HL110574による政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
この発明は、National Institutes of Healthにより授与された認可番号CA174121および番号HL110574による政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、治療用の細胞および組成物を調製する方法に、主として向けられる。その方法は、サイズに基づいて細胞を分離するマイクロ流体デバイスを使用する。
細胞治療、特にCAR-T細胞治療は、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)およびB細胞リンパ腫などのB細胞疾患を処置することにおいて並外れた効力を示している。結果として、自己治療の需要が劇的に増加しており、開発の努力は、神経膠芽腫などの固形腫瘍により特徴づけられる癌に焦点を合わせるように広げられている(Vonderheide, et al., Immunol. Rev. 257:7-13 (2014); Fousek, et al., Clin. Cancer Res. 21:3384-3392 (2015); Wang, et al., Mol. Ther. Oncolytics 3:16015 (2016); Sadelain, et al., Nature 545:423-431 (2017))。焦点を向けられた、幹細胞などの自己細胞の集団におけるCRISPR/Cas-9を用いての標的化遺伝子編集は、さらに需要を喚起し得る(Johnson, et al., Cancer Cell Res. 27:38-58 (2017))。
個別治療のための細胞の調製は、通常、血液バンキングから適合させた手順、または治療適用にはあまり適していないタンパク質バイオプロセス手順に頼る労働集約的なプロセスである。部分的に、細胞特異的分離(Powell, et al., Cytotherapy 11:923-935 (2009); TerumoBCT. ELUTRA Cell Separation System. Manufacturer recommendations for the Enrichment of Lymphocytes from Apheresis Residues)を達成するが、それを細胞生存率および収率を犠牲にして行う(Chiche-Lapierre, Cytotherapy 18(6):S47 (2016))調製を用いるプロセスのために、処理工程に関連した細胞損失は、典型的にはかなりある(Hokland, et al., Scand. J. Immunol. 11:353-356 (1980); Stroncek, et al., J. Transl. Med. 12:241 (2014))。したがって、より効率的なプロセスの必要性がある。
本発明は、とりわけ、細胞、特に、治療的用途がある細胞を収集し、かつ迅速に処理する方法に向けられる。その方法の多くは、流体フローの方向からわずかな角度で傾斜している、特別にデザインされた、マイクロポストアレイを含有するマイクロ流体デバイスを通して試料を流すことを含むプロセスである、決定論的横置換(DLD)に頼る(Davis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:14779-14784 (2006); Inglis, et al., Lab Chip 6:655-658 (2006); Chen, et al., Biomicrofluidics. 9(5):054105 (2015))。マイクロポストアレイの標的サイズより大きい細胞は、マイクロポストによりクリーンバッファー流へ優しく偏向され(「バンピング」され)、より小さい、偏向されなかった細胞および粒子から効果的に分離され得、その上、傷つけることがないプロセスにおいて、細胞を同時に洗浄し得る。細胞処理に関してのDLDの有利な特徴は表1に記載されている。
標的細胞を操作するための方法
それの第1の態様において、本発明は、標的細胞集団を遺伝子操作する方法に向けられる。これは、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換(DLD)を実施することにより、標的細胞を粗流体組成物から単離することにより行われる。そのデバイスは、試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延び、かつ第1の壁およびその第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、少なくとも1つのチャネルの存在により特徴づけられる。障害物のアレイは、チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列され、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしている。その障害物は、粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、チャネルを通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、混入細胞または粒子は、収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている。いったん標的細胞が、デバイスを用いて精製されたならば、それらは、その細胞に所望の表現型を付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、治療上の価値のある細胞にするタンパク質)を発現するように設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入される。その後、細胞集団は、インビトロ(in vitro)での培養により増殖され得る。培養および増殖された時、所望の表現型を示す組換え的に操作された標的細胞の収率は、DLDに供されていない同一の細胞(特に、Ficoll遠心分離に曝されたが、DLDには曝されなかった細胞)より、好ましくは、少なくとも10%高く、より好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、または50%高い。
それの第1の態様において、本発明は、標的細胞集団を遺伝子操作する方法に向けられる。これは、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換(DLD)を実施することにより、標的細胞を粗流体組成物から単離することにより行われる。そのデバイスは、試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延び、かつ第1の壁およびその第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、少なくとも1つのチャネルの存在により特徴づけられる。障害物のアレイは、チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列され、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしている。その障害物は、粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、チャネルを通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、混入細胞または粒子は、収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている。いったん標的細胞が、デバイスを用いて精製されたならば、それらは、その細胞に所望の表現型を付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、治療上の価値のある細胞にするタンパク質)を発現するように設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入される。その後、細胞集団は、インビトロ(in vitro)での培養により増殖され得る。培養および増殖された時、所望の表現型を示す組換え的に操作された標的細胞の収率は、DLDに供されていない同一の細胞(特に、Ficoll遠心分離に曝されたが、DLDには曝されなかった細胞)より、好ましくは、少なくとも10%高く、より好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、または50%高い。
好ましい実施形態において、粗流体組成物は、血液、より好ましくは、患者の血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施することにより取得されている白血球の調製物である。好ましい標的細胞には、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、および前駆細胞が挙げられ、T細胞(特に、ナチュラルキラーT細胞)が最も好ましい。白血球はさておき、他の細胞型、例えば、樹状細胞または幹細胞もまた、標的細胞としての役割を果たし得る。
一般的に、標的細胞を含有する粗流体組成物は、凍結することなしに(少なくとも、それらが遺伝子操作される時点まで)、かつ収集される現地で処理される。粗流体組成物は、好ましくは、患者の血液であり、より好ましくは、そのような血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施した結果として得られた白血球を含有する組成物である。しかしながら、用語「粗流体組成物」はまた、リンパ液または滑液などの体液、加えて、骨髄または他の組織から調製された流体組成物も含む。粗流体組成物はまた、腫瘍または他の異常組織に由来し得る。
標的細胞が、遺伝子操作される前に、担体に結合していることは必須ではないが、DLDが初めて実施される前かまたは後のいずれかに(好ましくは、前に)、それらに、1つまたは複数の担体を結合させることは好ましい。これが生じる正確な手段は本発明にとって重要ではないが、結合は、「DLD分離を促進するように」行われるべきである。本関連において用いられる場合、この用語は、その方法が、特定の標的細胞型に対する特異性を示し、結合していない細胞に対してその複合体のサイズの少なくとも2μm(およびあるいは、パーセンテージとして表現される場合、少なくとも20%、50%、100%、200%、500%、または1000%)の増加を提供し、治療または他の用途が遊離型標的細胞を必要とする場合、標的細胞が、複合体から、化学的または酵素的切断、化学的溶解、消化により、他の結合剤との競合により、例えばピペットを用いて、ずり応力を生じる、物理的剪断により、または他の手段により、放出されることを可能にする、結合を最終的に生じなければならないことを意味する。
好ましい実施形態において、担体は、担体が特異性を以て、標的細胞と直接、結合することを可能にする親和性物質(例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、アプタマー、核酸配列、または他の化合物)を表面上に有する。あるいは、標的細胞と担体の両方と、特異性を以て結合する中間のタンパク質、細胞、または他の作用物質が存在し得る。例えば、標的細胞上の表面抗原を認識し、しかも、担体とも特異性を以て(例えば、担体表面上の第2の抗体のその存在、アビジン/ビオチン結合、またはいくつかの他の類似した相互作用により)結合する抗体が、用いられ得る。加えて、標的細胞は、他の細胞と特異性を以て相互作用して、複合体を形成する場合もあり、そのように行うことにおいて、その他の細胞は、生物学的担体としての役割を果たし得、すなわち、それらは、標的細胞の有効サイズを増加させ得、それにより、複合体化していない細胞からのそれの分離を容易にし得る。例えば、ヒトT細胞は、ヒツジ赤血球または自己ヒト赤血球と相互作用して、細胞のロゼットを形成し得、それは、その後、複合体として精製することができる。あるいは、他の担体が、そのようなロゼットにおける細胞と、特異性を以て結合して、サイズに基づいた分離をさらに促進し得る。
この関連において用いられる場合、語「特異性」は、粗流体組成物において、結合した非標的細胞の1個に対して、少なくとも100個(好ましくは、少なくとも1000個)の標的細胞が担体により結合するだろうことを意味する。担体がDLD後に結合する場合、その結合は、標的細胞が遺伝子操作される前または後に生じ得る。
担体の結合は、細胞を安定化し、それらを活性化する(例えば、分裂するために)のに役立ち得、または1つの型の細胞の別の型の細胞からの単離を促進するのに役立ち得る。上記で示唆されているように、担体の細胞との結合は、本方法において様々な時点で起こり得、その時点には、細胞が取得されている最中の時間の間が挙げられる。分離を向上させるために、担体は、単一担体の1個の細胞との結合が細胞単独のサイズより実質的に大きい担体-細胞の複合体を生じるように選択され得る。あるいは、標的細胞より小さい担体が、用いられ得る。この場合、数個の担体が、1個の細胞と特異性を以て結合し、それにより、1個の細胞および複数の担体を有する複合体を形成することが好ましい。DLD中、複合体化標的細胞は、類似したサイズを有する非複合体化細胞から分離されて、さもなければ起こらなかっただろう精製を提供し得る。
そのような分離を達成するために、その複合体の直径は、好ましくは、非複合体化標的細胞より少なくとも20%長く、より好ましくは、少なくとも50%長く、少なくとも2倍の長さ、または少なくとも10倍の長さであるべきである。上記で言及されているように、このサイズの増加は、単一の大きい担体の標的細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。これは、a)標的細胞の直径と少なくとも同じ(または他の実施形態において、少なくとも2倍もしくは少なくとも10倍の)長さの直径を有する担体のみ;b)標的細胞の直径の50%以下(または他の実施形態において、25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体のみ;またはc)これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物(例えば、標的細胞と少なくとも同じ(または少なくとも2倍もしくは10倍の)長さの直径を有する担体の1つの群および標的細胞の直径の50%以下(または25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体の第2の群が存在し得る)を用いて、達成され得る。典型的には、担体は、1~1000μm(多くの場合、5~600μmまたは5~400μmの範囲)の直径を有する。理想的には、複合体は、複合体のサイズより低いが、非複合体化非標的細胞または混入物のサイズより高い臨界サイズを有する障害物のアレイを有するマイクロ流体デバイス上でのDLDにより、他の細胞または混入物から分離されるだろう。
加えて、担体は、この技術によりDLDによる分離を直接的に促進するというよりむしろ、「DLD分離を補完する」ように働き得る。例えば、担体(例えば、ヤヌスまたはイチゴ様粒子)は、化学的、電気化学的、または磁気的性質などのすぐに使用可能な示差的な、サイズに関係しない二次的性質を支援し、かつそれらが結合する細胞へ与える2つ以上の異なる化学的性質を含み得、これらの性質は下流プロセスにおいて用いられ得る。したがって、その粒子は、磁気分離、エレクトロポレーション、または遺伝子移入を容易にするように用いられ得る。それらはまた、例えば代謝または再生に関する、細胞の性質の有利な変化を与え得る。
特に重要な実施形態において、担体の結合は、特定の白血球、特に、ナチュラルキラーT細胞を含むT細胞を他の白血球、例えば、顆粒球および単球から、ならびに/または他の細胞から、分離する手段として用いられ得る。これは、例えば、DLDが、担体に結合していない標的細胞に、標的細胞より小さい臨界サイズを有する障害物のアレイを用いて、実施され、ならびにまた、標的細胞および担体を含む複合体に、その複合体より小さいが、非複合体化細胞より大きい臨界サイズを有する障害物のアレイを用いて、実施される、2段階プロセスで、行われ得る。DLD工程は、いずれの順序でも実施することができ、すなわち、DLDは、非複合体化標的細胞に実施される前または後に、複合体に実施され得る。
粗流体組成物の取得が完了した時点から、標的細胞が初めて担体に結合するまで、4時間より長く(好ましくは、3時間より長く、2時間より長く、または1時間より長く)経過するべきではない。加えて、粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時点まで、5時間より長く(好ましくは、4時間より長く、3時間より長く、または2時間より長く)経過するべきではない。
特に好ましい実施形態において、上記の方法における標的細胞は、T細胞(特に、ナチュラルキラーT細胞およびメモリーT細胞)であり、これらは、表面上にキメラ抗原受容体を発現するように操作される。これらのCAR T細胞を作製するための手順は、下記でより具体的に記載されている。
CAR T細胞を作製するための方法
本発明は、T細胞(特に、ナチュラルキラーT細胞およびメモリーT細胞)を含む粗流体組成物を取得し、マイクロ流体デバイスを用いて、前記組成物にDLDを実施することにより、CAR T細胞を作製する方法を含む。一般的に、T細胞を含む粗流体組成物は、患者の血液に由来し、かつ白血球を含有するアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物である。
本発明は、T細胞(特に、ナチュラルキラーT細胞およびメモリーT細胞)を含む粗流体組成物を取得し、マイクロ流体デバイスを用いて、前記組成物にDLDを実施することにより、CAR T細胞を作製する方法を含む。一般的に、T細胞を含む粗流体組成物は、患者の血液に由来し、かつ白血球を含有するアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物である。
マイクロ流体デバイスは、試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1つのチャネルを有しなければならず、そのチャネルは、第1の壁およびその第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている。障害物のアレイは、チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列され、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしている。これらの障害物は、T細胞を含む粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、流体的にチャネルを通過する時、T細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、T細胞とは異なる(一般的には、より小さい)サイズの他の細胞(例えば、赤血球および血小板)または他の粒子は、収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている。いったん取得されたならば、そのT細胞は、当技術分野において十分、確立された手順を用いて、表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を産生するように遺伝子操作される。これらの受容体は、一般的に、疾患または異常な状態に関連した細胞の表面上にある抗原を結合するはずである。例えば、その受容体は、癌細胞の表面に固有であり、またはそこに過剰発現している抗原を結合し得る。この点において、CD19は、そのような抗原である場合がある。
CAR発現T細胞の遺伝子操作は、一般的に、T細胞に核酸をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、いったん作製されたならば、CAR T細胞は、その細胞をインビトロで成長させることにより、数が増加し得る。アクチベーターまたは他の因子が、このプロセス中に加えられて、成長を促進し得、用いられ得るその作用物質の中には、IL-2およびIL-15がある。DLD、組換え操作、および増殖後の、表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率は、いくつかの実施形態において、DLDに供されていないこと以外は同じ様式で調製されたT細胞より少なくとも10%高いはずであり、好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、または50%高い。同様に、いくつかの実施形態において、表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率は、Ficoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも10%高いはずであり、好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、または50%高い。
キメラ受容体は、典型的には、a)抗原結合ドメインを有する細胞外領域、b)膜貫通領域、およびc)細胞内領域を有する。その細胞はまた、トリガーされた時、CAR T細胞の数または活性を低下させる分子スイッチをその細胞に提供する配列で組換え的に操作され得る。好ましい実施形態において、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の一本鎖可変断片(scFv)である。好ましくは、細胞外領域と膜貫通領域を接続する2~20個のアミノ酸のヒンジ領域もまた存在する。膜貫通領域は、CD3ζ、CD4、CD8、またはCD28タンパク質配列を有し得、細胞内領域は、典型的にはCD3ζ、CD137、またはCD28に由来した、シグナル伝達ドメインを有するべきである。活性を制御または刺激するように働く他のシグナル伝達配列もまた含まれ得る。
T細胞を含む粗流体組成物を取得した後、またはそれらが収集されている最中の時間の間、T細胞に、上記で論じられた理由により、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させ得る。これは、好ましくは、DLDを実施する前に行われる。しかしながら、それはまた、DLDを実施した後で、かつ細胞が初めてトランスフェクションまたは形質導入される前または後のいずれかで、起こってもよい。好ましい実施形態において、担体は、T細胞、好ましくは、ナチュラルキラーT細胞と特異性を以て結合する親和性物質(例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマー)を表面上に含むべきである。この関連において用いられ場合、用語「特異性」は、担体が、組成物中のいかなる他の細胞と比較しても、所望のT細胞と優先的に結合することを意味する。例えば、担体は、それが異なる型の細胞を結合する事例ごとに、100個または1000個のCD8+ T細胞と結合し得る。
いくつかの実施形態において、担体は、球状の形をとり得、コラーゲン、ポリスチレンを含む多糖、アクリルアミド、アルギン酸塩、および磁性材料を含む、生物学的かまたは合成的かのいずれかの材料で作られ得る。加えて、担体は、DLD分離を補完するように、働き得る。
分離を達成することを助けるために、T細胞と担体の間で形成された複合体の直径は、好ましくは、非複合体化T細胞より少なくとも20%長く、好ましくは、少なくとも50%長く、少なくとも2倍の長さ、または少なくとも10倍の長さであるべきである。このサイズの増加は、単一の大きい担体の標的細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。結合は、a)T細胞の直径と少なくとも同じ(または他の実施形態において、少なくとも2倍、もしくは少なくとも10倍の)長さの直径を有する担体のみ;b)T細胞の直径の50%以下(または他の実施形態において、25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体のみ;またはc)これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物(例えば、T細胞と少なくとも同じ(または少なくとも2倍もしくは10倍の)長さの直径を有する担体の1つの群およびT細胞の直径の50%以下(または25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体の第2の群が存在し得る)を用いることを含み得る。典型的には、担体は、1~1000μm(多くの場合、5~600μmまたは5~400μmの範囲)の直径を有する。理想的には、複合体は、複合体のサイズより低いが、非複合体化非標的細胞または混入物のサイズより高い臨界サイズを有する障害物のアレイを有するマイクロ流体デバイス上でのDLDにより、非複合体化細胞または混入物から分離されるだろう。
標的細胞に関して上記で論じられているように、T細胞の精製は、2段階プロセスを含み得る。例えば、DLDは、T細胞より小さい臨界サイズを有する障害物のアレイを用いて、担体と結合していないT細胞に実施され得る。その後、他の細胞または粒子と一緒に、その分離されたT細胞を含有する組成物を回収し、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体と結合させ得、その場合、T細胞は特異性を以て結合する。その後、それにより形成された複合体は、複合体より小さいが、非複合体化細胞より大きい臨界サイズを有する障害物のアレイにおいて分離され得る。原理的には、DLD工程は、いずれの順序でも実施することができ、すなわち、それは、最初に複合体に、または最初に非複合体化T細胞に、実施され得る。
好ましくは、T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から(例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から)、T細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く(より好ましくは、3時間より長く、2時間より長く、または1時間より長く)経過するべきではない。加えて、T細胞の取得が完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時点まで、5時間より長く(好ましくは、4時間より長く、3時間より長く、または2時間より長く)経過するべきではない。理想的には、CAR T細胞を作製することにおける全工程は、そのT細胞を含む粗流体組成物が取得される同じ施設で実施され、全工程は、4時間以内(好ましくは、3時間以内)で、かつその細胞を凍結することなく、完了する。
CAR T細胞を用いる、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患の処置
別の態様において、本発明は、癌細胞抗原、または自己免疫疾患もしくは感染性疾患の原因であり、またはそれに寄与する細胞上の抗原を認識するキメラ抗原受容体を発現するように操作されたCAR T細胞を投与することにより、患者を癌、自己免疫疾患、または感染性疾患について処置する方法に向けられる。CAR T細胞は、上記のセクションで論じられた方法を用いて、すなわち、T細胞を含む粗流体組成物(好ましくは、患者から引き出された白血球含有アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物)を取得し、その後、マイクロ流体デバイスを用いてその組成物にDLDを実施することにより、作製され得る。その後、この様式で回収されたCAR T細胞(好ましくは、ナチュラルキラーT細胞およびメモリーT細胞)は、その細胞をインビトロで成長させることにより、増殖される。最後に、その細胞は、患者に投与され、その患者は、一般的に、そのT細胞が単離された血液を提供した同じ患者であるべきである。
別の態様において、本発明は、癌細胞抗原、または自己免疫疾患もしくは感染性疾患の原因であり、またはそれに寄与する細胞上の抗原を認識するキメラ抗原受容体を発現するように操作されたCAR T細胞を投与することにより、患者を癌、自己免疫疾患、または感染性疾患について処置する方法に向けられる。CAR T細胞は、上記のセクションで論じられた方法を用いて、すなわち、T細胞を含む粗流体組成物(好ましくは、患者から引き出された白血球含有アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物)を取得し、その後、マイクロ流体デバイスを用いてその組成物にDLDを実施することにより、作製され得る。その後、この様式で回収されたCAR T細胞(好ましくは、ナチュラルキラーT細胞およびメモリーT細胞)は、その細胞をインビトロで成長させることにより、増殖される。最後に、その細胞は、患者に投与され、その患者は、一般的に、そのT細胞が単離された血液を提供した同じ患者であるべきである。
好ましくは、DLD、組換え操作、および増殖後の、表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率は、DLDに供されていないこと以外は同じ様式で調製されたT細胞より少なくとも10%高く、より好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、または50%高い。例えば、表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率は、Ficoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも10%高くてもよい、好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、または50%高くてもよい。
キメラ受容体は、典型的には、少なくとも、a)抗原結合ドメインを有する細胞外領域、b)膜貫通領域、およびc)細胞内領域を有する。その細胞はまた、トリガーされた時、CAR T細胞の数または活性を低下させる分子スイッチをその細胞に提供する配列で組換え的に操作され得る。好ましい実施形態において、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の一本鎖可変断片(scFv)である。細胞外領域と膜貫通領域を接続する2~20個のアミノ酸のヒンジ領域もまた存在する。膜貫通領域自体は、CD3ζ、CD4、CD8、またはCD28タンパク質配列を有し得、細胞内領域は、典型的にはCD3ζおよび/またはCD28細胞内ドメインに由来した、シグナル伝達ドメインを有する。活性を制御または刺激するように働く他のシグナル伝達配列もまた含まれ得る。
粗流体組成物を取得した後、または粗流体組成物が収集されている最中の時間の間、その組成物に存在するT細胞に、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させ得る。これは、好ましくは、DLDを実施する前に行われる。しかしながら、それはまた、DLDを実施した後で、かつ細胞が遺伝子操作される前または後のいずれかで、起こってもよい。好ましくは、その結合は、DLD分離を促進し、担体は、その表面上に、T細胞、特にナチュラルキラーT細胞と特異性を以て結合する抗体、アクチベーター、または他の作用物質を含む。この関連において用いられ場合、用語「特異性」は、担体が、組成物中のいかなる他の細胞と比較しても、所望のT細胞と優先的に結合することを意味する。例えば、担体は、他の型の細胞と結合する担体あたり、100個または1000個のCD8+ T細胞と結合し得る。
T細胞と担体の間で形成された複合体の直径は、好ましくは、非複合体化T細胞より少なくとも20%長く、より好ましくは、少なくとも50%長く、少なくとも2倍の長さ、または少なくとも10倍の長さであるべきである。このサイズの増加は、単一の大きい担体の細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。結合は、a)T細胞の直径と少なくとも同じ(または他の実施形態において、少なくとも2倍、もしくは少なくとも10倍の)長さの直径を有する担体のみ;b)T細胞の直径の50%以下(または他の実施形態において、25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体のみ;またはc)これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物(例えば、T細胞と少なくとも同じ(または少なくとも2倍もしくは10倍の)長さの直径を有する担体の1つの群およびT細胞の直径の50%以下(または25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体の第2の群が存在し得る)を用いることを含み得る。典型的には、担体は、1~1000μm(多くの場合、5~600μmまたは5~400μmの範囲)の直径を有する。理想的には、複合体は、複合体のサイズより低いが、非複合体化非標的細胞または混入物のサイズより高い臨界サイズを有する障害物のアレイを有するマイクロ流体デバイス上でのDLDにより、非複合体化細胞または混入物から分離されるだろう。
T細胞の精製は、2段階プロセスを含み得る。例えば、DLDは、T細胞より小さい臨界サイズを有する障害物のアレイを用いて、担体と結合していないT細胞に実施され得る。その後、他の細胞または粒子と一緒に、その分離されたT細胞を含有する組成物を回収し、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体と結合させ得、その場合、T細胞は特異性を以て結合する。その後、それにより形成された複合体は、複合体より小さいが、非複合体化細胞より大きい臨界サイズを有する障害物のアレイにおいて分離され得る。原理的には、DLD工程は、いずれの順序でも実施することができ、すなわち、それは、最初に複合体に、または最初に非複合体化T細胞に、実施され得る。
好ましくは、T細胞の取得が完了した時点から(例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から)、T細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く(より好ましくは、3時間より長く、2時間より長く、または1時間より長く)経過するべきではない。加えて、T細胞の取得が完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時点まで、5時間より長く(好ましくは、4時間より長く、3時間より長く、または2時間より長く)経過するべきではない。理想的には、CAR T細胞を作製することにおける全工程は、T細胞を含む粗流体組成物が取得される同じ施設で実施され、全工程は、4時間以内(好ましくは、3時間以内)で完了する。
このようにして作製されたCAR T細胞は、臨床医学の分野において十分、確立された手順を用いて、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病について患者を処置することに用いられ得、これらの場合において、CARは、腫瘍抗原としてCD19またはCD20を認識し得る。方法はまた固形腫瘍について用いられ得、その場合において、認識される抗原には、CD22;RORI;メゾテリン;CD33/IL3Ra;c-Met;PSMA;糖脂質F77;EGFRvIII;GD-2;NY-ESO-l;MAGE A3;およびそれらの組合せが挙げられ得る。自己免疫疾患に関して、CAR T細胞は、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、強直性脊椎炎、1型糖尿病、または血管炎を処置するために用いられ得る。
いくつかの実施形態において、上記の方法により作製された標的細胞は、その細胞が、DLDを含まない方法を用いて作製された場合より早く、患者への投与に利用可能であろう。 これらの細胞は、1日またはそれ以上早く、好ましくは、2日、3日、4日、5日、またはそれ以上早く、投与され得る。細胞は、粗流体組成物の取得が完了した時点から8~10日以内に投与され得る。
細胞の収集および処理
本発明はまた、細胞を迅速に処理するように設計され、かつ一般的に、その細胞が収集される現地で実施することができる、患者由来の細胞を収集および処理するためのプロトコールに向けられる。プロトコールは、上記の標的細胞およびCAR T細胞を調製するための方法の一部分として用いられ得る。これらのプロトコールの一部の態様は、図13および図14に図示され、図12に示されたプロトコールと対比され得る。図示された特定の手順において、全血のアフェレーシスにより取得された組成物が得られ、その後、その組成物におけるT細胞が選択される。この関連における用語「選択される」は、T細胞が、T細胞を特異性(上記で定義されているような)を以て認識する作用物質により結合されることを意味する。その後、DLDを用いて、選択されたT細胞を単離し、これらの細胞を、選ばれた流体培地へ移す。
本発明はまた、細胞を迅速に処理するように設計され、かつ一般的に、その細胞が収集される現地で実施することができる、患者由来の細胞を収集および処理するためのプロトコールに向けられる。プロトコールは、上記の標的細胞およびCAR T細胞を調製するための方法の一部分として用いられ得る。これらのプロトコールの一部の態様は、図13および図14に図示され、図12に示されたプロトコールと対比され得る。図示された特定の手順において、全血のアフェレーシスにより取得された組成物が得られ、その後、その組成物におけるT細胞が選択される。この関連における用語「選択される」は、T細胞が、T細胞を特異性(上記で定義されているような)を以て認識する作用物質により結合されることを意味する。その後、DLDを用いて、選択されたT細胞を単離し、これらの細胞を、選ばれた流体培地へ移す。
より一般的には、本発明は、a)標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程;およびb)前記流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施して、標的細胞が濃縮された組成物を得る工程であって、DLDの前かまたは後のいずれかに、標的細胞に、DLD分離を促進するように、担体を結合させる、工程により、標的細胞を収集する方法に関する。例えば、標的細胞と特異性(上記で定義されているような)を以て結合する親和性物質(例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマー)を表面上に有する担体が、用いられ得る。
担体を、望ましい場合には、標的細胞が患者から収集されている最中の時間の間、標的細胞に結合させ得、標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、その標的細胞に担体を結合させるまで、5時間より長く(好ましくは、4時間より長く、3時間より長く、2時間より長く、または1時間より長く)経過するべきではない。
標的細胞と1つまたは複数の担体との間で形成された複合体の直径は、好ましくは、非複合体化細胞より少なくとも20%長く、好ましくは、少なくとも50%長く、少なくとも2倍の長さ、または少なくとも10倍の長さであるべきである。このサイズの増加は、単一の大きい担体の標的細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。結合は、i)標的細胞の直径と少なくとも同じ(または他の実施形態において、少なくとも2倍、もしくは少なくとも10倍の)長さの直径を有する担体のみ;ii)標的細胞の直径の50%以下(または他の実施形態において、25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体のみ;またはiii)これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物(例えば、標的細胞と少なくとも同じ(または少なくとも2倍もしくは10倍の)長さの直径を有する担体の1つの群および標的細胞の直径の50%以下(または25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体の第2の群が存在し得る)を用いることを含み得る。典型的には、担体は、1~1000μm(多くの場合、5~600μmまたは5~400μmの範囲)の直径を有する。理想的には、複合体は、複合体のサイズより低いが、非複合体化細胞または混入物のサイズより高い臨界サイズを有する障害物のアレイを有するマイクロ流体デバイス上でのDLDにより、他の細胞または混入物から分離されるだろう。
好ましい実施形態において、標的細胞を含む粗流体組成物は、患者由来の血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施することにより取得される。この組成物は、抗凝固剤として働き、または血小板の活性化を防ぐ1つまたは複数の添加物を含み得る。そのような添加物の例には、単独または組合せでの、チクロピジン、イノシン、プロトカテキュ酸、アセチルサリチル酸、およびチロフィバンが挙げられる。
マイクロ流体デバイスは、試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1つのチャネルを有しなければならず、そのチャネルは、第1の壁およびその第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている。チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイもまた存在しなければならず、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、その結果、前記標的細胞を含む粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、流体的にチャネルを通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、粗流体組成物中にあり、かつ標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子は、収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる。
特に好ましい実施形態において、標的細胞は、ナチュラルキラーT細胞、セントラルメモリーT細胞、ヘルパーT細胞、および制御性T細胞からなる群から選択されるT細胞であり、ナチュラルキラーT細胞が最も好ましい。代替の好ましい実施形態において、標的細胞は、幹細胞、B細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、または前駆細胞である。
工程a)およびb)に加えて、本発明の方法は、c)ウイルスベクターを用いて細胞に形質導入することにより、細胞を遺伝子操作する工程(あるいは、細胞は、電気的に、化学的に、もしくはナノ粒子を用いて、トランスフェクションされ、および/または数を増加され得る)、および/またはd)その標的細胞が取得された同じ患者を、収集された標的細胞で処置する工程を含み得る。加えて、前記収集された細胞は、培養および/または凍結保存され得る。標的細胞がT細胞である場合、培養は、一般的に、アクチベーター、好ましくは、担体に結合しているアクチベーターの存在下で行われるべきである。T細胞培養に含まれ得る因子の中には、IL-2およびIL-15がある。
いくつかの実施形態において、上記の方法により作製された標的細胞は、その細胞が、DLDを含まない方法を用いて作製された場合より早く、患者への投与に利用可能であろう。 これらの細胞は、1日またはそれ以上早く、好ましくは、2日、3日、4日、5日、またはそれ以上早く、投与され得る。細胞は、粗流体組成物の取得が完了した時点から8~10日以内に投与され得る。
上記で論じられた方法に加えて、本発明は、その方法により作製された標的細胞、およびその標的細胞が患者に投与される処置方法を含む。
DLDを使用して白血球の特性を変えること
白血球調製物中の血小板のレベルを減少させることは、CAR T細胞の作製に関して、および他の治療的使用のための白血球の調製の両方において利点を有する。この点で、本発明は、部分的には、DLDがアフェレーシス試料中の血小板の総数を、一般的にフィコール分離を使用する場合(図19-21を参照)、特に血小板凝集を促進しないバッファーを使用する場合(図22-23参照)よりも効果的に減少させるという概念に基づく。T細胞に特異的に結合する磁気ビーズに基づく分離と組み合わせて使用すると、DLDは、かかるビーズを単独またはFicoll遠心分離と組み合わせてのどちらかで使用する場合よりも迅速に増殖できる細胞の調製物をもたらす(図24を参照)。この効果は、部分的に、血小板数の減少、および存在する血小板の数とは無関係の要因による(図24を参照)。さらに、DLD/磁気ビーズ手順を使用して取得される結果はより一貫性があり(図25を参照)、この手順からの増殖されたT細胞は、Ficoll/磁気ビーズアプローチを使用して調製される集団と比較した場合、セントラルメモリー表現型を有するT細胞のパーセンテージが高い(図26を参照)。a)より早いT細胞の増殖およびb)セントラルメモリー細胞のより高いパーセンテージと組み合わされる、DLDからの高い初期の細胞回収率は、治療的に有効なレベルのT細胞がより迅速に患者に利用可能にされることができることを意味する。
白血球調製物中の血小板のレベルを減少させることは、CAR T細胞の作製に関して、および他の治療的使用のための白血球の調製の両方において利点を有する。この点で、本発明は、部分的には、DLDがアフェレーシス試料中の血小板の総数を、一般的にフィコール分離を使用する場合(図19-21を参照)、特に血小板凝集を促進しないバッファーを使用する場合(図22-23参照)よりも効果的に減少させるという概念に基づく。T細胞に特異的に結合する磁気ビーズに基づく分離と組み合わせて使用すると、DLDは、かかるビーズを単独またはFicoll遠心分離と組み合わせてのどちらかで使用する場合よりも迅速に増殖できる細胞の調製物をもたらす(図24を参照)。この効果は、部分的に、血小板数の減少、および存在する血小板の数とは無関係の要因による(図24を参照)。さらに、DLD/磁気ビーズ手順を使用して取得される結果はより一貫性があり(図25を参照)、この手順からの増殖されたT細胞は、Ficoll/磁気ビーズアプローチを使用して調製される集団と比較した場合、セントラルメモリー表現型を有するT細胞のパーセンテージが高い(図26を参照)。a)より早いT細胞の増殖およびb)セントラルメモリー細胞のより高いパーセンテージと組み合わされる、DLDからの高い初期の細胞回収率は、治療的に有効なレベルのT細胞がより迅速に患者に利用可能にされることができることを意味する。
1つの態様において、本発明は、遠心分離またはエルトリエーションの非存在下で試料に決定論的側方変位を行い、白血球に対する血小板の比が、DLDの代わりに遠心分離(勾配遠心分離または向流遠心分離を含む)またはエルトリエーションを使用して同じ手順が行われる時に取得される比よりも少なくとも20%(好ましくは50%または70%)低い産物を取得することにより、アフェレーシス試料中の白血球に対する血小板の比を減少させる方法に向けられる。好ましくは、この手順は、DLDの前にアフェレーシス試料上で行われる分離工程を含まず、DLDは、インターカレーターまたは血小板のサイズを変更し、血小板凝集を促進しない他の手段を含まないバッファー中で行われる。避けるべき薬剤は、デキストランおよびその他の高電荷ポリマーを含む。白血球に対する血小板の比を下げることに加えて、DLD由来の産物中の血小板の総数は、アフェレーシス試料中より少なくとも70%低い、好ましくは少なくとも90%低いはずである。
別の態様において、本発明は、試料上でDLDを実施し、続いて親和性分離工程およびアクチベーターの存在下で培養することによるT細胞の増殖を行うことにより、アフェレーシス試料からT細胞を精製する方法に向けられる。このプロセスは、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実行される同じ手順で作製される数の少なくとも2倍の数のT細胞をもたらすはずである。好ましい親和性方法は、少なくともCD3を認識する抗体によってT細胞に特異的に結合する磁気ビーズの使用を含み、CD3をCD28または他の共刺激分子と一緒に含んでもよい。培養において14日後に取得されるT細胞の数は、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実行される同じ手順によって作製される数よりも少なくとも2倍(好ましくは少なくとも4倍または6倍)高いはずである。この方法で作製される産物中のメモリーT細胞のパーセンテージは、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用する同じ手順を使用して作製されるパーセンテージよりも少なくとも10%(好ましくは少なくとも20%)高いはずである。
該方法は、CAR T細胞療法のためのT細胞の生成に特に適する。患者を処理するのに十分な数の細胞を生成するのに必要な時間は、Ficoll遠心分離の代わりにDLDを使用して、少なくとも5%(好ましくは少なくとも10%または少なくとも20%)減少し、CAR T細胞は凍結することなく調製することができる。好ましい方法において、細胞が患者から収集され、DLD、所望により同じ場所での親和性方法によって処理される。遺伝的形質転換もその場所で起こってもよく、好ましくは、アフェレーシスが完了されてからDLDが開始されるまで1時間以内が経過する。
本発明はまた、試料上で決定論的側方変位(DLD)を実行することにより、アフェレーシス試料中の白血球に対する血小板の比を減少させる方法を包含する。DLDは、遠心分離またはエルトリエーションを行わずに、血小板の総数がアフェレーシス試料中よりも少なくとも70%(好ましくは少なくとも90%)低い産物を取得するために行われる。好ましくは、DLDは、インターカレーターを含まず、血小板凝集を促進しないバッファー中で行われるべきである。好ましくは、バッファーはデキストランまたは他の高電荷ポリマーを含まない。
本発明は、白血球に限定されず、他の治療的に価値のある細胞、特に循環幹細胞を含むアフェレーシス調製物中に存在してもよい細胞も含む。不要な血小板の除去による利益を含むDLDの利益は、さまざまなプロセスに適用するべきである。
大容量の白血球アフェレーシス材料についてDLDを用いる方法
DLDの一つの利点は、それが、相対的に大量の材料だけでなく、少量の材料も、ほとんど容量を増加せずに処理するために用いられ得ることである。その手順は、大容量の材料を処理することにおいてだけでなく、遠心分離による白血球の濃縮により小容量である白血球アフェレーシス産物にも用いられ得る。
DLDの一つの利点は、それが、相対的に大量の材料だけでなく、少量の材料も、ほとんど容量を増加せずに処理するために用いられ得ることである。その手順は、大容量の材料を処理することにおいてだけでなく、遠心分離による白血球の濃縮により小容量である白血球アフェレーシス産物にも用いられ得る。
したがって、別の態様において、本発明は、大容量白血球アフェレーシスプロセスから細胞を精製するためのシステムであって、そのシステムにおいて、材料をDLDにより分離する少なくとも1つのマイクロ流体デバイスが用いられる、システムに向けられる。その目的は、治療的に用いられ得、または治療的に用いられ得る作用物質を分泌する白血球を得ることである。特に重要なことには、本発明は、DLD分離を促進し、およびまた、適宜、補完するように、特定の型の白血球に1つまたは複数の担体を結合させ、その後、その複合体にDLDを実施することを含む。このようにして、特定の型の白血球は、およそ同じサイズであり、かつ、複合体形成の非存在下では、DLDにより分割することができなかった細胞から、分離され得る。この点において、一つのDLD手順が、結合していない白血球をより小さい材料から分離し、もう一つのDLD手順が、担体-白血球複合体を非複合体化細胞から分離する、上記で論じられているような2段階手順が有利である場合がある。本質的に同じ技術が、細胞特異的担体が利用可能であるという条件で、他の関連において同様に、例えば培養細胞に、用いられ得る。全ての場合において、細胞は、それらの遺伝子の1つまたは複数の発現を変化させるように組換え的に遺伝子操作され得る。
白血球アフェレーシス材料について、マイクロ流体デバイスは、試料注入口から、白血球(WBC)または特定の白血球-担体複合体を回収するための「収集出口」と、WBCとは異なるサイズ(一般的には、より小さい)の材料または非複合体化白血球が流れる「廃棄物出口」の両方へと延びる少なくとも1つのチャネルを有しなければならない。チャネルは、第1の壁およびその第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれており、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み、各連続する行が前の行に対して横方向へシフトしている。障害物は、白血球アフェレーシス材料がデバイスの注入口にアプライされ、流体的にチャネルを通過する時、細胞または細胞複合体が、濃縮された産物が収集される収集出口(または複数の出口)へ偏向され、異なる(一般的には、より小さい)サイズの材料は、1つまたは複数の切り離された廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている。
大容量の出発材料の迅速な処理を促すために、マイクロ流体デバイスにおける障害物は、菱形または三角形の形にデザインされ得、各デバイスは6~40個のチャネルを有し得る。加えて、マイクロ流体デバイスは、2~20個のマイクロ流体デバイスを含むシステムの一部であり得る(図7参照)。個々のデバイスは、14ml/時の流速で作動され得るが、少なくとも25ml/時(好ましくは、少なくとも40ml/時、60ml/時、80ml/時、または100ml/時)の流速が好ましく、大きい試料容量(少なくとも200ml、好ましくは400~600ml)が、1時間以内に処理されることを可能にする。
生存細胞の分離
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、生存細胞を非生存細胞から分離する方法に向けられる:(a)生存細胞および非生存細胞を含む試料を取得する工程であって、前記生存細胞が第1の既定のサイズを有し得、かつ前記非生存細胞が第2の既定サイズを有し得、および前記第1の既定サイズが臨界サイズ以上であり得、かつ前記第2の既定サイズが前記臨界サイズより小さくてもよい、工程;(b)前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み得、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ得、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズより小さい粒子を第2の方向へ偏向させるように構成され得る、工程;ならびに(c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記生存細胞が前記障害物により前記第1の方向に偏向され得、前記非生存細胞が前記第2の方向に偏向され得、それにより、前記生存細胞を前記非生存細胞から分離する、工程。臨界サイズは、第2の既定サイズの約1.1倍であり得、いくつかの実施形態において、生存細胞は、活発に分裂する細胞であり得る。いくつかの実施形態において、デバイスは、徐々により小さい障害物および間隙を有する少なくとも3つのゾーンを含み得る。
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、生存細胞を非生存細胞から分離する方法に向けられる:(a)生存細胞および非生存細胞を含む試料を取得する工程であって、前記生存細胞が第1の既定のサイズを有し得、かつ前記非生存細胞が第2の既定サイズを有し得、および前記第1の既定サイズが臨界サイズ以上であり得、かつ前記第2の既定サイズが前記臨界サイズより小さくてもよい、工程;(b)前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み得、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ得、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズより小さい粒子を第2の方向へ偏向させるように構成され得る、工程;ならびに(c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記生存細胞が前記障害物により前記第1の方向に偏向され得、前記非生存細胞が前記第2の方向に偏向され得、それにより、前記生存細胞を前記非生存細胞から分離する、工程。臨界サイズは、第2の既定サイズの約1.1倍であり得、いくつかの実施形態において、生存細胞は、活発に分裂する細胞であり得る。いくつかの実施形態において、デバイスは、徐々により小さい障害物および間隙を有する少なくとも3つのゾーンを含み得る。
接着細胞の分離
本発明はまた、以下により、接着性標的細胞、好ましくは治療上価値のある細胞、例えば、接着性幹細胞を取得する方法を含む:a)接着性標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程、およびb)決定論的横置換(DLD)を実施して、接着性標的細胞が濃縮された組成物を得る工程。このプロセスの間、接着性標的細胞に、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させ得る。例えば、担体は、接着性標的細胞と特異性(上記で定義されているような)を以て結合する親和性物質(例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマー)を表面上に有し得、所望の表現型をその細胞に付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、より高い治療上の価値がある細胞にするタンパク質)を発現するように、設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入され得る。
本発明はまた、以下により、接着性標的細胞、好ましくは治療上価値のある細胞、例えば、接着性幹細胞を取得する方法を含む:a)接着性標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程、およびb)決定論的横置換(DLD)を実施して、接着性標的細胞が濃縮された組成物を得る工程。このプロセスの間、接着性標的細胞に、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させ得る。例えば、担体は、接着性標的細胞と特異性(上記で定義されているような)を以て結合する親和性物質(例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマー)を表面上に有し得、所望の表現型をその細胞に付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、より高い治療上の価値がある細胞にするタンパク質)を発現するように、設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入され得る。
担体は、粗流体組成物が収集されている最中の時点で、または代替として、収集が完了した後だが、DLDが初めて実施される前に、添加され得る。第2の代替において、DLDは、担体が添加される前に、初めて実施され得る。例えば、接着細胞が臨界サイズ未満のサイズを有する場合には、粗流体組成物が、担体が添加される前に、デバイスにアプライされ得、接着細胞が回収され得、その後、その細胞を1つまたは複数の担体に付着させて、デバイスの臨界サイズより大きい複合体を形成し得、その後、第2のDLD段階が実施され得、担体接着細胞の複合体が収集され得る。
好ましくは、患者からの粗流体組成物の取得が完了した時点から、接着細胞に担体を初めて結合させるまで、3時間より長く(より好ましくは、2時間より長く、または1時間より長く)経過しない。別の好ましい実施形態において、患者からの粗流体組成物の取得が完了した時点から、接着細胞または担体接着細胞複合体がデバイスから初めて回収される時点まで、4時間より長く(好ましくは、3時間より長く、または2時間より長く)経過しない。
上記の方法論は、接着性標的細胞、例えば、接着性幹細胞を複数の他の細胞から分離するために用いられ得る。その方法は以下を含む:a)接着性標的細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を接触させる工程であって、前記接着性標的細胞が、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体と少なくとも部分的に会合し、担体会合化接着性標的細胞複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の他の細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化接着細胞複合体のサイズが、好ましくは、臨界サイズより少なくとも50%大きく、かつ他の非複合体化細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;b)前記担体会合化接着細胞複合体を含有する粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、臨界サイズ以上の細胞または複合体を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の細胞または複合体を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;c)前記担体会合化接着性標的細胞複合体を含む前記粗流体組成物を前記デバイスに流す工程であって、前記複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ非複合体化細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記担体会合化接着細胞複合体を前記他の非複合体化細胞から分離する、工程;d)分離された担体会合化接着性標的細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。
接着性標的細胞と1つまたは複数の担体との間に形成された複合体の直径は、好ましくは、非複合体化細胞より少なくとも20%長く、好ましくは、少なくとも50%長く、少なくとも2倍の長さ、または少なくとも10倍の長さであるべきである。このサイズの増加は、単一の大きい担体の接着性標的細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。結合は、a)接着性標的細胞の直径と少なくとも同じ(または他の実施形態において、少なくとも2倍、もしくは少なくとも10倍の)長さの直径を有する担体のみ;b)接着性標的細胞の直径の50%以下(または他の実施形態において、25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体のみ;またはc)これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物(例えば、接着性標的細胞と少なくとも同じ(または少なくとも2倍もしくは10倍の)長さの直径を有する担体の1つの群および接着性標的細胞の直径の50%以下(または25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体の第2の群が存在し得る)を用いることを含み得る。典型的には、担体は、1~1000μm(多くの場合、5~600μmまたは5~400μmの範囲)の直径を有する。
担体は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ガラス、ゼラチン、コラーゲン、多糖、プラスチック、アクリルアミド、およびアルギン酸塩を含む、接着細胞の培養のための、当技術分野において知られている材料のいずれかで作られ得る。それらは、コーティングされなくてもよいし、接着および成長を促進する材料(例えば、血清、コラーゲン、タンパク質、またはポリマー)でコーティングされてもよく、表面に付着した作用物質(例えば、抗体、抗体断片、基質、アクチベーター、または他の材料)を有し得る。いくつかの実施形態において、希釈剤は、成長培地であり得、前記工程は逐次的に実施され得、工程(e)の後に、バッファー交換を実施することができる。
上記の方法において単離され得る特定の接着細胞の例には以下が挙げられる:MRC-5細胞;HeLa細胞;Vero細胞;NIH 3T3細胞;L929細胞;Sf21細胞;Sf9細胞;A549細胞;A9細胞;AtT-20細胞;BALB/3T3細胞;BHK-21細胞;BHL-100細胞;BT細胞;Caco-2細胞;Chang細胞;Clone 9細胞;Clone M-3細胞;COS-1細胞;COS-3細胞;COS-7細胞;CRFK細胞;CV-1細胞;D-17細胞;Daudi細胞;GH1細胞;GH3細胞;HaK細胞;HCT-15細胞;HL-60細胞;HT-1080細胞;HEK細胞、HT-29細胞;HUVEC細胞;I-10細胞;IM-9細胞;JEG-2細胞;Jensen細胞;Jurkat細胞;K-562細胞;KB細胞;KG-1細胞;L2細胞;LLC-WRC 256細胞;McCoy細胞;MCF7細胞;WI-38細胞;WISH細胞;XC細胞;Y-1細胞;CHO細胞;Raw 264.7細胞;HEP G2細胞;BAE-1細胞;SH-SY5Y細胞、およびそれらの任意の誘導体。
アクチベーターと結合した細胞の分離
本発明はまた、上記の手順を用いて、活性化の能力がある細胞を精製する方法を含む。好ましい実施形態において、本発明は、以下により、活性化細胞を複数の他の細胞から分離する方法に向けられる:a)活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、前記担体の1つまたは複数が、細胞アクチベーターを含み、1つまたは複数の担体が、接触により、または接触後、細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞に少なくとも部分的に会合して、担体会合化細胞を生成し、少なくとも部分的な、前記細胞アクチベーターの前記活性化の能力がある細胞との会合が、前記活性化の能力がある細胞を活性化し、前記担体会合化細胞複合体が、他の細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化細胞複合体のサイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が、前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;b)前記粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記活性化細胞を前記複数の他の細胞から分離する、工程。その後、分離された担体会合化細胞複合体を含む流体組成物が収集され得る。このプロセスの間、その細胞は、適宜、その細胞に所望の表現型を付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、より高い治療上の価値がある細胞にするタンパク質)を発現するように、設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入され得る。
本発明はまた、上記の手順を用いて、活性化の能力がある細胞を精製する方法を含む。好ましい実施形態において、本発明は、以下により、活性化細胞を複数の他の細胞から分離する方法に向けられる:a)活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、前記担体の1つまたは複数が、細胞アクチベーターを含み、1つまたは複数の担体が、接触により、または接触後、細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞に少なくとも部分的に会合して、担体会合化細胞を生成し、少なくとも部分的な、前記細胞アクチベーターの前記活性化の能力がある細胞との会合が、前記活性化の能力がある細胞を活性化し、前記担体会合化細胞複合体が、他の細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化細胞複合体のサイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が、前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;b)前記粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記活性化細胞を前記複数の他の細胞から分離する、工程。その後、分離された担体会合化細胞複合体を含む流体組成物が収集され得る。このプロセスの間、その細胞は、適宜、その細胞に所望の表現型を付与するように、例えば、キメラ分子(好ましくは、より高い治療上の価値がある細胞にするタンパク質)を発現するように、設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入され得る。
活性化の能力がある細胞は、T細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞(innate lymphoid cell)、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞、β細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、DE3溶原化細胞、酵母細胞、植物細胞、および幹細胞からなる群から選択され得る。
細胞アクチベーターは、抗体または抗体断片、CD3、CD28、抗原、ヘルパーT細胞、受容体、サイトカイン、糖タンパク質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。他の実施形態において、アクチベーターは、低分子化合物であり得、インスリン、IPTG、ラクトース、アロラクトース、脂質、グリコシド、テルペン、ステロイド、アルカロイド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
好ましい実施形態において、活性化の能力がある細胞は、活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、患者からの粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く(好ましくは、3時間より長く、2時間より長く、または1時間より長く)経過しない。患者からの粗流体組成物の取得が完了した時点から、工程c)が完了するまで、4時間より長く経過しないこともまた好ましい。あるいは、方法は、細胞の収集が始まる前にアクチベーターを結合させることにより、変更され得る。
好ましくは、活性化の能力がある細胞と1つまたは複数の担体との間で形成された複合体の直径は、非複合体化細胞より少なくとも20%長く、より好ましくは、少なくとも50%長く、少なくとも2倍の長さ、または少なくとも10倍の長さであるべきである。このサイズの増加は、単一の大きい担体の活性化の能力がある細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。結合は、a)活性化の能力がある細胞の直径と少なくとも同じ(または他の実施形態において、少なくとも2倍、もしくは少なくとも10倍の)長さの直径を有する担体のみ;b)活性化の能力がある細胞の直径の50%以下(または他の実施形態において、25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体のみ;またはc)これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物(例えば、活性化の能力がある細胞と少なくとも同じ(または少なくとも2倍もしくは10倍の)長さの直径を有する担体の1つの群および活性化の能力がある細胞の直径の50%以下(または25%以下もしくは15%以下)の長さの直径を有する担体の第2の群が存在し得る)を用いることを含み得る。典型的には、担体は、1~1000μm(多くの場合、5~600μmまたは5~400μmの範囲)の直径を有する。
化合物の細胞からの分離
別の実施形態において、本発明は、以下を含む、化合物を細胞から除去する方法を含む:(a)細胞および化合物を含む流体組成物を取得する工程であって、前記細胞が、前記化合物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、および前記細胞の既定サイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記化合物の既定サイズが前記臨界サイズ未満である、工程;(b)前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに(c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、その間、前記細胞が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、前記化合物が前記第2の方向に偏向され得、それにより、前記細胞から前記化合物を除去する、工程。いくつかの実施形態において、方法はさらに、工程(c)後に細胞を培養すること、または工程(a)の流体組成物が取得された培養物へ前記細胞をリサイクルすることを含み得る。
別の実施形態において、本発明は、以下を含む、化合物を細胞から除去する方法を含む:(a)細胞および化合物を含む流体組成物を取得する工程であって、前記細胞が、前記化合物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、および前記細胞の既定サイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記化合物の既定サイズが前記臨界サイズ未満である、工程;(b)前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに(c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、その間、前記細胞が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、前記化合物が前記第2の方向に偏向され得、それにより、前記細胞から前記化合物を除去する、工程。いくつかの実施形態において、方法はさらに、工程(c)後に細胞を培養すること、または工程(a)の流体組成物が取得された培養物へ前記細胞をリサイクルすることを含み得る。
前記化合物は、毒性化合物であり得、抗生物質、抗真菌剤、毒性代謝産物、アジ化ナトリウム、金属イオン、内毒素、可塑剤、殺虫剤、およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。他の実施形態において、前記化合物は、使用済の化学成分であり得る。
分泌性細胞産物の連続的精製
本発明はまた、以下を含む、細胞から分泌性産物を連続的に精製する方法を含む:(a)細胞を含む流体組成物(細胞培養組成物であり得る)を取得する工程であって、前記細胞が、前記流体組成物中に懸濁しており(または前記細胞に、DLD分離を促進し、かつ担体-細胞の複合体を形成するように、1つまたは複数の担体を結合させ)、前記細胞が、分泌性産物を前記流体組成物へ分泌し、前記細胞(または前記担体-細胞複合体)が、前記分泌性産物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、前記細胞(または前記担体-細胞複合体)の既定サイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが前記臨界サイズ未満である、工程;(b)前記細胞(または前記担体-細胞複合体)を含む流体組成物を、DLD用デバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに(c)前記細胞または前記担体-細胞複合体を含む流体組成物を前記デバイスに流す工程であって、前記細胞または担体-細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、前記分泌性産物が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記分泌性産物を前記細胞から分離する、工程;(d)前記分泌性産物を収集する工程であって、それにより、精製されている前記分泌性産物の流体組成物を生じる、工程;(e)分離された細胞または担体-細胞複合体を含む回収された流体組成物を収集する工程;(f)前記細胞(または前記担体-細胞複合体)を前記流体組成物に再びアプライする工程;ならびに工程(a)~(e)を繰り返す工程であって、それにより、分泌性産物を細胞から連続的に精製する、工程。
本発明はまた、以下を含む、細胞から分泌性産物を連続的に精製する方法を含む:(a)細胞を含む流体組成物(細胞培養組成物であり得る)を取得する工程であって、前記細胞が、前記流体組成物中に懸濁しており(または前記細胞に、DLD分離を促進し、かつ担体-細胞の複合体を形成するように、1つまたは複数の担体を結合させ)、前記細胞が、分泌性産物を前記流体組成物へ分泌し、前記細胞(または前記担体-細胞複合体)が、前記分泌性産物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、前記細胞(または前記担体-細胞複合体)の既定サイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが前記臨界サイズ未満である、工程;(b)前記細胞(または前記担体-細胞複合体)を含む流体組成物を、DLD用デバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに(c)前記細胞または前記担体-細胞複合体を含む流体組成物を前記デバイスに流す工程であって、前記細胞または担体-細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、前記分泌性産物が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記分泌性産物を前記細胞から分離する、工程;(d)前記分泌性産物を収集する工程であって、それにより、精製されている前記分泌性産物の流体組成物を生じる、工程;(e)分離された細胞または担体-細胞複合体を含む回収された流体組成物を収集する工程;(f)前記細胞(または前記担体-細胞複合体)を前記流体組成物に再びアプライする工程;ならびに工程(a)~(e)を繰り返す工程であって、それにより、分泌性産物を細胞から連続的に精製する、工程。
分泌性産物は、タンパク質、抗体、バイオ燃料、ポリマー、小分子、およびそれらの任意の組合せであり得、細胞は、細菌細胞、藻類細胞、哺乳類細胞、および腫瘍細胞であり得る。一つの好ましい実施形態において、分泌性産物は、治療上価値の高いタンパク質、抗体、ポリマー、または小分子である。加えて、工程(a)の流体組成物は、細胞が、担体およびその細胞において成長している培養物から取得され得る。
マイクロ流体サイジングデバイスの使用
より広義には、本発明は、任意のサイズに基づいたマイクロ流体分離方法によって調製される標的細胞の集団を操作する方法に向けられる。サイズに基づく細胞の並べ替えの違いは、本明細書中で議論されるバンプアレイを使用した結果、または分離中の流量を制御することによって生成された慣性力の結果、またはマイクロ流体デバイス自体の設計によるものである(全体が参照により本明細書中に組み込まれるUS 9,895,694およびUS 9,610,582を参照)。使用される分離手順は1つだけでも、複数でもよい。たとえば、標的細胞は、1つのマイクロ流体手順を使用して小さな粒子および細胞から、第2の手順を使用して大きな粒子および細胞から分離される。
より広義には、本発明は、任意のサイズに基づいたマイクロ流体分離方法によって調製される標的細胞の集団を操作する方法に向けられる。サイズに基づく細胞の並べ替えの違いは、本明細書中で議論されるバンプアレイを使用した結果、または分離中の流量を制御することによって生成された慣性力の結果、またはマイクロ流体デバイス自体の設計によるものである(全体が参照により本明細書中に組み込まれるUS 9,895,694およびUS 9,610,582を参照)。使用される分離手順は1つだけでも、複数でもよい。たとえば、標的細胞は、1つのマイクロ流体手順を使用して小さな粒子および細胞から、第2の手順を使用して大きな粒子および細胞から分離される。
標的細胞が単離されると、それらは所望の表現型を有するように遺伝子操作される。これは、細胞をトランスフェクトまたは形質転換するための標準的な組換え方法論を使用して達成することができる。例えば、細胞をベクターでトランスフェクトして、組換え表現型を発現させることができる。遺伝子操作の前の遠心分離を回避することにより、所望の特性を有する細胞が少なくとも20%増加するはずである。
好ましい標的細胞は、白血球(特にT細胞)または幹細胞であり、好ましい粗液組成物は、患者から取得される血液またはアフェレーシス調製物である。中心的な目的は、これらの調製物中の標的細胞に対する血小板の比を少なくとも50%、好ましくは少なくとも80%または90%減少させることである。標的細胞の単離は、産物が取得されるように血小板の総数が開始アフェレーシス調製物より少なくとも70%(好ましくは少なくとも90%)少ない条件で行われるべきである。
遺伝子操作中または遺伝子操作後、細胞は細胞培養中で増殖される。上記の手順を使用すると、培養において14日後に取得されるT細胞の数は、遠心分離を使用して細胞が単離される手順より少なくとも2倍(好ましくは少なくとも5または10倍)高いはずである。さらに、T細胞の総数に対する培養におけるメモリーT細胞のパーセンテージは、遠心分離によりT細胞が単離される手順よりも少なくとも10%(好ましくは20%または30%)高いはずである。
アフェレーシス収集が完了される時点からDLDが実行されるまで1時間以内、アフェレーシス試料の取得が完了される時点から標的細胞が単離され、遺伝子操作されるまで4時間以内が経過するべきである。
特に好ましい実施形態において、上記の方法はCAR T細胞の産生に使用される。これは、最初にアフェレーシスによってT細胞を含有する粗液組成物を取得し、次いでサイズの違いに基づいてT細胞を血小板から分離する1つ以上の手順を使用して、マイクロ流体デバイス上で細胞を単離することを含む。結果として、T細胞中で濃縮され、血小板が枯渇する産物が、取得されるはずである。次の工程において、単離されるT細胞は、遺伝子操作され、キメラ抗原受容体(CAR)を表面上に発現する。これらの細胞は、それらの数を増やすために培養され、次いで収集される。T細胞は、遺伝子操作される前のどの段階でも遠心分離または水処理されるべきでなく、好ましい実施形態において、遺伝子操作に使用される試薬は、マイクロ流体デバイスを使用してサイズによって細胞から分離される。追加の好ましい実施形態において、T細胞は、患者に投与するための医薬組成物中に移すことによって収集される。
T細胞は、収集または医薬組成物中に移される前に凍結されるべきでなく、好ましくは、血小板の少なくとも90%は除去される。培養前または培養中に、細胞は、T細胞アクチベーターまたは担体にさらされてもよい。これは、細胞の安定化に役立ち、サイズに基づいたマイクロ流体分離を促進してもよい。しかしながら、アクチベーターも担体も必ずしも磁気ビーズまたは粒子に結合される必要はないことに注意すべきである。
細胞が遠心分離により単離されるかまたは濃縮される手順と比較して、マイクロ流体分離によって取得されるCAR T細胞は、少なくとも1日(好ましくは、少なくとも3日、5日または10日)早く、患者による使用のために利用可能であるべきである。全体として、処理のために十分な数のCAR T細胞を生成するのに必要な時間は、Ficoll遠心分離を使用して同じ方法で細胞を分離する場合よりも少なくとも10%(好ましくは少なくとも20%または30%)短いべきである。これは、部分的に、サイズに基づいたマイクロ流体分離を使用することにより、培養において14日後に取得されるCAR T細胞の数は典型的に、Ficoll遠心分離により取得される細胞を使用する培養における数より少なくとも2倍(好ましくは4倍または8倍)高くなるためである。さらに、本方法で調製される細胞が患者に投与される場合、それらは、遠心分離によりアフェレーシス組成物から単離される細胞よりも少なくとも10%少ない老化を示すはずである。
本発明はまた、上記の議論される方法によって調製される治療的に有効な量の細胞を投与することにより疾患または状態について患者を処理することを包含する。これは、操作される白血球または幹細胞に反応する任意の疾患または状態を含み、少なくともCAR T細胞の場合、癌は処理されてもよい疾患のうちにある。
ワークフロー図の概要:図25-32はすべて概念を図解するように含まれ、実際に実施される実験には関係ない。図は、次いで処理され、治療的に使用される患者からの細胞を取得し、典型的に細胞が取得されたのと同じ患者を処理することに典型的に関与する基本的なワークフローを図解する。図は、ほとんどの部分について、CAR T細胞の作製に特異的に言及しているが、プロセスは、治療的目的のための白血球および他の細胞の作製に一般的に適用できることが理解される。CAR T細胞などを含む多くのかかるプロセスの場合、患者から収集される細胞は、治療的な目的の遺伝子を発現するように組換え的に操作される。かかる操作のいかなる型も、図解されるプロセスの一部であってもよい。図は、工程を診療所で実施される工程および、図解の目的で「製造現場」と呼ばれている別の場所で実施される工程に分ける。図25は、例えばCAR T細胞の作製において使用される典型的なプロセスに期待されるワークフローを示す。凍結保存された試料が解凍され、洗浄され、デバルキングされ、濃縮された後、細胞の形質転換は典型的には製造現場で生じる。図26は、同じ基本的なワークフローを維持しながらDLDが使用されてもよいプロトタイプCAR T細胞プロセスにおけるいくつかの場所(小さな斑点で覆われた箱)を示す。次いで、図27-32は、ワークフローを変更してプロトタイププロセスを改善するためにDLDが使用されてもよい方法の多数の例示的な例を示す。主な目的は、全体的な質がより良い細胞を産生すること、患者を処理するのに十分な数の細胞を取得するために必要な時間を短縮すること、および現在より労働集約的な工程を自動化することである。
定義
アフェレーシス:本明細書で用いられる場合、この用語は、患者またはドナー由来の血液がそれの成分、例えば、血漿、白血球、および赤血球へ分離される手順を指す。より具体的な用語は、「血小板アフェレーシス」(血小板の分離を指す)および「白血球アフェレーシス」(白血球の分離を指す)である。この関連において、用語「分離」は、全血と比較して、特定の成分が濃縮されている産物の取得を指し、絶対的純粋が達成されていることを意味しない。
アフェレーシス:本明細書で用いられる場合、この用語は、患者またはドナー由来の血液がそれの成分、例えば、血漿、白血球、および赤血球へ分離される手順を指す。より具体的な用語は、「血小板アフェレーシス」(血小板の分離を指す)および「白血球アフェレーシス」(白血球の分離を指す)である。この関連において、用語「分離」は、全血と比較して、特定の成分が濃縮されている産物の取得を指し、絶対的純粋が達成されていることを意味しない。
CAR T細胞:用語「CAR」は、「キメラ抗原受容体」の頭字語である。したがって、「CAR T細胞」は、キメラ受容体を発現するように遺伝子操作されているT細胞である。
CAR T細胞治療:この用語は、疾患がCAR T細胞で処置される任意の手順を指す。処置され得る疾患には、血液学的および固形腫瘍癌、自己免疫疾患、ならびに感染性疾患が挙げられる。
担体:本明細書で用いられる場合、用語「担体」は、存在する化合物または細胞の一部または全部と直接的に、または間接的に(すなわち、1つまたは複数の中間の細胞、粒子、または化合物を通して)結合することを目的として調製物に加えられる、生物学的かまたは合成的かのいずれかの材料で作られた作用物質、例えば、ビーズまたは粒子を指す。担体は、DEAE-デキストラン、ガラス、ポリスチレン、プラスチック、アクリルアミド、コラーゲン、およびアルギン酸塩を含む、様々な異なる材料から作製され得、典型的には、1~1000μmのサイズを有する。それらは、コーティングされている場合もされていない場合もあり、細胞の表面上の抗原または他の分子を認識する親和性物質(例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、アプタマー、粒子、または他の化合物)を含むように改変されている表面を有し得る。担体はまた、磁化され得、これは、DLDを補完するための精製の追加の手段を提供し得、それらは、細胞または細胞複合体に、サイズに関係しない二次的性質を与える粒子(例えば、ヤヌスまたはイチゴ様粒子)を含み得る。例えば、その粒子は、結果として、磁気分離、エレクトロポレーション、遺伝子移入、および/または特定の分析化学プロセスなどの下流プロセスに用いることができる化学的、電気化学的、または磁気的性質を生じ得る。粒子はまた、細胞における代謝変化を引き起こし、細胞を活性化し、または細胞分裂を促進し得る。
「DLD分離を促進するように」結合する担体:この用語は、状況に依存して、細胞、タンパク質、または粒子がDLD中に挙動する仕方に影響する、担体、および担体を結合する方法を指す。具体的には、「DLD分離を促進するように結合すること」とは、a)その結合することが、特定の標的細胞型、タンパク質、または粒子に対する特異性を示さなければならず、かつb)結合していない細胞、タンパク質、または粒子と比べて、複合体のサイズの増加を提供する複合体を生じなければならないことを意味する。標的細胞との結合の場合、少なくとも2μm(あるいは、パーセンテージとして表現された場合、少なくとも20%、50%、100%、200%、500%、または1000%)の増加がなければならない。治療または他の用途が、標的細胞、タンパク質、または他の粒子が、それらの意図された用途を満たすために複合体から放出されることを必要とする場合、用語「DLD分離を促進するように」はまた、その複合体が、そのような放出を、例えば、化学的もしくは酵素的切断、化学的溶解、消化により、他の結合剤との競合により、または物理的剪断(例えばピペットを用いて、ずり応力を生じること)により可能にし、かつその解放された標的細胞、タンパク質、または他の粒子が、活性を維持しなければならない;例えば、複合体からの放出後の治療用細胞は、それらを治療的に有用にさせる生物学的活性をなお維持しなければならないことを必要とする。
担体はまた「DLD分離を補完するように」結合し得る:この用語は、DLD分離を促進するのに十分にサイズを増加させるかどうかに関わらず、細胞もしくは細胞複合体の化学的、電気化学的、もしくは磁気的性質を変化させ、または細胞の1つもしくは複数の生物学的活性を変化させる、担体、および担体を結合する方法を指す。DLD分離を補完する担体はまた、必ずしも標的細胞と特異性を以て結合するとは限らない、すなわち、それらは、それらを特異性にさせる何かの他の作用物質と組み合わされなければならない場合もあるし、またはそれらは単に、細胞調製物に加えられて、非特異的に結合してもよい。用語「DLD分離を補完するように」および「DLD分離を促進するように」は、お互いに排他的ではない。結合は、DLD分離を補完すること、およびまたDLD分離を促進することの両方であり得る。例えば、多糖担体は、それの表面上に、細胞成長速度を増加させるアクチベーターを有し得、これらの担体の1つまたは複数の結合はまた、DLD分離を促進し得る。あるいは、結合は、DLD分離をただ促進するだけ、またはDLD分離をただ補完するだけであり得る。
標的細胞:本明細書で用いられる場合、「標的細胞」は、本明細書に記載された様々な手順が必要とする細胞、または精製し、収集し、操作するなどのために設計される細胞である。その特定の細胞が何であるかは、その用語が用いられる文脈に依存する。例えば、手順の目的が特定の種類の幹細胞を単離することである場合には、その細胞は、その手順の標的細胞である。
単離する、精製する:他の指示がない限り、これらの用語は、本明細書で用いられる場合、同意語であり、望まれない材料に対しての所望の産物の濃縮を指す。その用語は必ずしも、その産物が完全に単離され、または完全に純粋であることを意味するわけではない。例えば、出発試料が、試料中細胞の2%を構成する標的細胞を有し、そして、手順が実施され、結果として、その標的細胞が、存在する細胞の60%である組成を生じたならば、その手順は、標的細胞を単離または精製することに成功しただろう。
バンプ(bump)アレイ:用語「バンプアレイ」および「障害物アレイ」は、本明細書では同意語として用いられ、細胞または粒子を有する流体を通過させることができるフローチャネルに配置されている障害物の規則正しいアレイを記載する。
決定論的横置換:本明細書で用いられる場合、用語「決定論的横置換」または「DLD」は、粒子が、アレイのパラメータの一部に関係したそれらのサイズに基づいて、決定論的に、アレイを通る経路において偏向されるプロセスを指す。このプロセスは、細胞を分離するため用いることができ、そのことが、このプロセスが本明細書で論じられる一般的な背景にある。しかしながら、DLDがまた、細胞を濃縮するために、およびバッファー交換のために用いられ得ることを認識することは重要である。プロセスは、一般的に、連続フロー(DC状態、すなわち、単一の方向のみでのバルク流体フロー)に関して本明細書で記載されている。しかしながら、DLDはまた、振動フロー(AC状態、すなわち、2つの方向の間を交互に変換するバルク流体フロー)で機能することもできる。
臨界サイズ:障害物アレイを通過する粒子の「臨界サイズ」または「既定サイズ」は、流体の層流に従うことができる粒子のサイズ限界を記載する。臨界サイズより大きい粒子は、流体のフロー経路から「バンピング」され得、一方、臨界サイズ(または既定サイズ)より小さいサイズを有する粒子は、必ずしもそのように外されるとは限らない。間隙を通る流体フローのプロフィールが、バルク流体フローの方向にその間隙を二等分する平面に関して対称である場合、臨界サイズは、間隙の両側について同一であり得る;しかしながら、そのプロフィールが非対称である場合、間隙の2つの側面の臨界サイズは異なり得る。
流体フロー:DLDとの関連において本明細書で用いられる場合、用語「流体フロー」および「バルク流体フロー」は、障害物アレイに渡る全般的な方向における巨視的な動きを指す。これらの用語は、流体が全般的な方向で移動し続けるために流体が障害物の周りを動く、流体の流れの一時的変位を考慮しない。
傾斜角ε:バンプアレイデバイスにおいて、傾斜角は、バルク流体フローの方向と、アレイにおける連続的(バルク流体フローの方向における)障害物の行の整列により定義される方向との間の角度である。
アレイ方向:バンプアレイデバイスにおいて、「アレイ方向」は、アレイにおける連続的障害物の行の整列により定義される方向である。粒子は、間隙を通過し、かつ下流の障害物に遭遇した時、粒子の全体的な軌道が、バンプアレイのアレイ方向に従う(すなわち、バルク流体フローに対して傾斜角εで動く)場合には、バンプアレイにおいて「バンピング」されている。粒子は、それの全体的な軌道が、それらの状況下で、バルク流体フローの方向に従う場合には、バンピングされていない。
本発明は、主として、治療上、価値のある細胞を調製することにおけるDLDの使用に関係している。下記の本文は、本明細書に開示された方法に関するガイダンス、ならびにそれらの方法を行うことに関与するデバイスの作製および使用に役立ち得る情報を提供する。
1.マイクロ流体プレートの設計
細胞、特に、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスにより調製された組成物における細胞は、流体が、デバイスの1つの端における注入口から反対側の端の出口へ流れるチャネルを含有するマイクロ流体デバイスを用いてDLDを実施することにより単離され得る。サイズに基づいたマイクロ流体分離の基本原理、および細胞を分離するための障害物アレイの設計は、他の所(US 2014/0342375;US 2016/0139012;7,318,902、およびUS 7,150,812参照。それらは、全体として参照により本明細書に組み入れられている)で提供されており、また、下記のセクションで要約されている。
細胞、特に、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスにより調製された組成物における細胞は、流体が、デバイスの1つの端における注入口から反対側の端の出口へ流れるチャネルを含有するマイクロ流体デバイスを用いてDLDを実施することにより単離され得る。サイズに基づいたマイクロ流体分離の基本原理、および細胞を分離するための障害物アレイの設計は、他の所(US 2014/0342375;US 2016/0139012;7,318,902、およびUS 7,150,812参照。それらは、全体として参照により本明細書に組み入れられている)で提供されており、また、下記のセクションで要約されている。
DLDの間、細胞を含有する流体試料は、デバイスへ注入口において導入され、デバイスを通って出口へ流れる流体と共に運ばれる。試料中の細胞がデバイスを横切る時、それらは、いくつもの行をなして位置づけられており、かつ、細胞が通過しなければならない間隙または細孔を形成するポストまたは他の障害物に遭遇する。障害物のそれぞれの連続する行は、フローチャネルにおいて流体フローの方向とは異なるアレイ方向を形成するように前の行に対してずらされる。障害物間の間隙の幅、障害物の形、および間隙を形成する障害物の配向と共に、これらの2つの方向により定義される「傾斜角」は、アレイについての「臨界サイズ」を決定することにおける主要な因子である。臨界サイズより大きいサイズを有する細胞は、バルク流体フローの方向よりむしろ、アレイ方向に動き、臨界サイズより小さいサイズを有する粒子は、バルク流体フローの方向に動く。白血球アフェレーシスにより引き出された組成物に用いられるデバイスにおいて、結果として、白血球がアレイ方向にそらされることを生じ、一方、赤血球および血小板がバルク流体フローの方向を保ち続ける、アレイ特徴が選択され得る。白血球の選択された型を、類似したサイズを有する他のものから分離するために、その時、DLD分離を促進するように、その細胞と結合し、それにより、非複合体化白血球より大きい複合体を生じる、担体が用いられ得る。その時、複合体より小さいが、非複合体化細胞より大きい臨界サイズを有するデバイス上で分離を行うことが可能であり得る。
デバイスに用いられる障害物は、円柱の形状をとり得、または三角形、四角形、長方形、菱形、台形、六角形、もしくは涙滴形であり得る。加えて、隣接障害物は、間隙を定義する障害物の部分が、バルク流体フローの方向に延びる間隙の軸に関して対称または非対称のいずれかであるような幾何学的配置を有し得る。
II.マイクロ流体デバイスの作製および操作
サイズに基づいて細胞を分離する能力があるマイクロ流体デバイスを作製および使用するための一般的な手順は、当技術分野において周知されている。そのようなデバイスには、US 5,837,115;US 7,150,812;US 6,685,841;US 7,318,902;7,472,794;およびUS 7,735,652(それらの全ては、全体として参照により本明細書に組み入れられている)に記載されたものが挙げられる。本発明のためのデバイスの作製および使用に役立ち得るガイダンスを提供する他の参考文献には以下が挙げられる:US 5,427,663;US 7,276,170;US 6,913,697;US 7,988,840;US 8,021,614;US 8,282,799;US8,304,230;US 8,579,117;US 2006/0134599;US 2007/0160503;US 20050282293;US 2006/0121624;US 2005/0266433;US 2007/0026381;US 2007/0026414;US 2007/0026417;US 2007/0026415;US 2007/0026413;US 2007/0099207;US 2007/0196820;US 2007/0059680;US 2007/0059718;US 2007/005916;US 2007/0059774;US 2007/0059781;US 2007/0059719;US 2006/0223178;US 2008/0124721;US 2008/0090239;US 2008/0113358;およびWO2012094642(それらの全ては全体として参照により本明細書に組み入れられている)。デバイスの作製および使用を記載する様々な参考文献のうちで、US 7,150,812は、特に良いガイダンスを提供し、7,735,652は、血液中に見出される細胞を含む試料に実施される分離のためのマイクロ流体デバイス(この点において、US 2007/0160503も参照されたい)に関して、特に興味深い。
サイズに基づいて細胞を分離する能力があるマイクロ流体デバイスを作製および使用するための一般的な手順は、当技術分野において周知されている。そのようなデバイスには、US 5,837,115;US 7,150,812;US 6,685,841;US 7,318,902;7,472,794;およびUS 7,735,652(それらの全ては、全体として参照により本明細書に組み入れられている)に記載されたものが挙げられる。本発明のためのデバイスの作製および使用に役立ち得るガイダンスを提供する他の参考文献には以下が挙げられる:US 5,427,663;US 7,276,170;US 6,913,697;US 7,988,840;US 8,021,614;US 8,282,799;US8,304,230;US 8,579,117;US 2006/0134599;US 2007/0160503;US 20050282293;US 2006/0121624;US 2005/0266433;US 2007/0026381;US 2007/0026414;US 2007/0026417;US 2007/0026415;US 2007/0026413;US 2007/0099207;US 2007/0196820;US 2007/0059680;US 2007/0059718;US 2007/005916;US 2007/0059774;US 2007/0059781;US 2007/0059719;US 2006/0223178;US 2008/0124721;US 2008/0090239;US 2008/0113358;およびWO2012094642(それらの全ては全体として参照により本明細書に組み入れられている)。デバイスの作製および使用を記載する様々な参考文献のうちで、US 7,150,812は、特に良いガイダンスを提供し、7,735,652は、血液中に見出される細胞を含む試料に実施される分離のためのマイクロ流体デバイス(この点において、US 2007/0160503も参照されたい)に関して、特に興味深い。
デバイスは、マイクロスケールおよびナノスケールの流体ハンドリングデバイスが典型的に製作される材料のいずれかを用いて作製することができ、その材料には、シリコン、ガラス、プラスチック、およびハイブリッド材料が挙げられる。マイクロ流体製作に適した様々な熱可塑性材料が、利用可能であり、強化し、かつさらに特定の適用に合わせて調整することができる、機械的および化学的性質の幅広い選択を提供する。
デバイスを作製するための技術には、レプリカ成形、PDMSを用いたソフトリソグラフィ、熱硬化性ポリエステル、エンボス加工、射出成形、レーザー切断、およびそれらの組合せが挙げられる。さらなる詳細は、「Disposable microfluidic devises: fabrication, function and application」、Fiorini, et al. (BioTechniques 38:429-446 (March 2005))(それは、全体として参照により本明細書に組み入れられている)に見出すことができる。書籍「Lab on a Chip Technology」Keith E.編 Herold and Avraham Rasooly, Caister Academic Press Norfolk UK (2009)は、製作の方法についてのもう一つのリソースであり、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
熱可塑性プラスチックのオープンリール式処理などのハイスループットエンボス加工方法は、工業用マイクロ流体チップ製造についての魅力的な方法である。単一チップ熱エンボス加工の使用は、プロトタイプ製造段階中に高品質マイクロ流体デバイスを実現するための費用効果の高い技術であり得る。2つの熱可塑性プラスチックである、ポリメチルメタクリレート(PMMA)および/またはポリカーボネート(PC)におけるマイクロスケールのフィーチャーの複製のための方法は、「Microfluidic device fabrication by thermoplastic hot-embossing」、Yang, et al. (Methods Mol. Biol. 949: 115-23 (2013))(それは、全体として参照により本明細書に組み入れられている)に記載されている。
フローチャネルは、組み立てられた時、それの内に配置された障害物を有する、閉キャビティ(好ましくは、流体を加え、または抜き取るための開口部を有するもの)を形成する2つ以上の部品を用いて構築することができる。障害物は、組み立てられてフローチャネルを形成する1つ以上の部品において製作することができ、またはそれらは、フローチャネルの境界を定義する2つ以上の部品の間に挟まれている挿入物の形をとって製作することができる。
障害物は、フローチャネルに渡って、場合によっては、フローチャネルの1つの面からフローチャネルの反対側の面へ、延びる固形物であり得る。障害物が、その障害物の一端でフローチャネルの面の1つと一体になっている(またはそれの延長部である)場合、その障害物の他方の端は、フローチャネルの反対側の面に対して、塞がれ、または押しつけられ得る。小さい(好ましくは、意図された用途についての目的の任意の粒子を収容するには小さすぎる)空間が、その空間が、障害物の構造的安定性またはデバイスの関連したフロー性質に悪影響を及ぼさないという条件で、障害物の一端とフローチャネルの面との間で許容される。
存在する障害物の数は、アレイの粒子を分離する性質を実現するのに十分であるべきである。障害物は、一般的に、行および列(注:用語「行および列」の使用は、行および列がお互いに垂直であることを意味または含意しない)へ組織化することができる。全般的にフローチャネルにおいて流体フローに対して横切る方向に整列する障害物は、列における障害物と呼ぶことができる。列においてお互いに隣接した障害物は、流体が流れる間隙を定義し得る。
隣接した列における障害物は、ε(イプシロン)と名付けられた傾斜角により特徴づけられる角度だけ、お互いから斜めであり得る。したがって、お互いに隣接した数個の列について(すなわち、一般的にその列に対して横切る単一の方向に流体フローにより連続的に通過される障害物の数個の列)、列における対応する障害物は、その対応する障害物が、その列を通過する流体フローの方向に対して角度εで延びる障害物の行を形成するように、お互いから斜めであり得る。傾斜角が選択され得、1/ε(ラジアンで表示された場合)が整数であるように、列はお互いから相隔たることができ、障害物の列は周期的に繰り返す。単一の列における障害物もまた、同じ、または異なる傾斜角だけ、お互いから斜めであり得る。例として、行および列を、お互いに対して90度の角度で配列することができ、行と列の両方が、εの同じ角度で、フローチャネルを通るバルク流体フローの方向に対して傾斜している。
表面は、それらの性質、およびデバイスを製作するために使用されるポリマー材料を改変するためにコーティングすることができ、多くの方法で改変することができる。ある場合では、天然のポリマー中にあるか、または湿式化学またはプラズマ処理を用いて付加されるかのいずれかであるアミンまたはカルボン酸などの官能基が、タンパク質または他の分子を架橋するために用いられる。DNAを、表面アミン基を用いて、COCおよびPMMA基質へ付着させることができる。Pluronic(登録商標)などの界面活性剤は、Pluronic(登録商標)をPDMS製剤へ加えることにより、表面を親水性およびタンパク質忌避性にするために用いることができる。場合によっては、PMMAの層が、デバイス上でスピンコーティングされ、例えば、マイクロ流体チップおよびPMMAが、それの接触角度を変化させるために、ヒドロキシプロピルセルロースで「ドープ」される。
例えば溶解した細胞により放出された、または生物学的試料に見出される、細胞または化合物のチャネル壁への非特異的吸着を低下させるために、1つまたは複数の壁は、非接着性または反発性であるように化学的に改変され得る。壁は、ヒドロゲルを形成するために用いられるものなどの市販の汚れ防止試薬の薄膜コーティング(例えば、単層)でコーティングされ得る。チャネル壁を改変するために用いられ得る化学種の追加の例には、オリゴエチレングリコール、フッ素化ポリマー、オルガノシラン、チオール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、ウシ血清アルブミン、ポリビニルアルコール、ムチン、ポリ-HEMA、メタクリル化PEG、およびアガロースが挙げられる。荷電ポリマーもまた、逆荷電種を反発させるために使用され得る。反発させるために用いられる化学種の型、およびチャネル壁への付着の方法は、反発させることになっている種の性質、ならびに壁および付着されることになっている種の性質に依存し得る。そのような表面改変技術は、当技術分野において周知されている。壁は、デバイスが組み立てられる前または後に機能性付与され得る。
III.CAR T細胞
CAR T細胞を作製および使用するための方法は、当技術分野において周知されている。手順は、例えば、US 9,629,877;US 9,328,156;US 8,906,682;US 2017/0224789;US 2017/0166866;US 2017/0137515;US 2016/0361360;US 2016/0081314;US 2015/0299317;およびUS 2015/0024482(それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている)に記載されている。
CAR T細胞を作製および使用するための方法は、当技術分野において周知されている。手順は、例えば、US 9,629,877;US 9,328,156;US 8,906,682;US 2017/0224789;US 2017/0166866;US 2017/0137515;US 2016/0361360;US 2016/0081314;US 2015/0299317;およびUS 2015/0024482(それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている)に記載されている。
IV.DLDを用いる分離プロセス
本明細書に記載されたDLDデバイスは、細胞、細胞断片、細胞付加体、または核酸を精製するために用いることができる。本明細書で論じられているように、これらのデバイスはまた、目的の細胞集団を複数の他の細胞から分離するために用いることができる。デバイスを用いる血液成分の分離および精製は、例えば、米国特許出願公開第2016/0139012号に見出すことができ、それの教示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。少数の実例となる分離の簡単な議論は下記に提供されている。
本明細書に記載されたDLDデバイスは、細胞、細胞断片、細胞付加体、または核酸を精製するために用いることができる。本明細書で論じられているように、これらのデバイスはまた、目的の細胞集団を複数の他の細胞から分離するために用いることができる。デバイスを用いる血液成分の分離および精製は、例えば、米国特許出願公開第2016/0139012号に見出すことができ、それの教示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。少数の実例となる分離の簡単な議論は下記に提供されている。
A.生存細胞
一実施形態において、デバイスは、生存細胞を非生存細胞から分離するように設計された手順に用いられる。用語「生存細胞」は、成長の能力があり、活発に分裂しており、再生の能力があるなどの細胞を指す。生存細胞が、非生存細胞より大きいサイズを有する場合、DLDデバイスは、非生存細胞の既定サイズより大きく、かつ生存細胞の既定サイズより小さい臨界サイズを含むように設計することができる。臨界サイズは、非生存細胞の既定サイズの1.1倍大きい(または小さい)などの小規模であり得るが、一般的に、より大きい(またはより小さい)程度が好ましく、例えば、約1.2倍~2倍、好ましくは3~10倍である。
一実施形態において、デバイスは、生存細胞を非生存細胞から分離するように設計された手順に用いられる。用語「生存細胞」は、成長の能力があり、活発に分裂しており、再生の能力があるなどの細胞を指す。生存細胞が、非生存細胞より大きいサイズを有する場合、DLDデバイスは、非生存細胞の既定サイズより大きく、かつ生存細胞の既定サイズより小さい臨界サイズを含むように設計することができる。臨界サイズは、非生存細胞の既定サイズの1.1倍大きい(または小さい)などの小規模であり得るが、一般的に、より大きい(またはより小さい)程度が好ましく、例えば、約1.2倍~2倍、好ましくは3~10倍である。
B.接着細胞
別の実施形態において、DLDデバイスは、接着細胞を分離するための手順に用いることができる。本明細書で用いられる場合、用語「接着細胞」は、表面に接着する能力がある細胞を指す。接着細胞には、細胞培養に用いられる不死化細胞が挙げられ、哺乳類宿主に由来し得る。場合によっては、接着細胞は、精製の前にトリプシン処理され得る。接着細胞の例には、MRC-5細胞;HeLa細胞;Vero細胞;NIH 3T3細胞;L929細胞;Sf21細胞;Sf9細胞;A549細胞;A9細胞;AtT-20細胞;BALB/3T3細胞;BHK-21細胞;BHL-100細胞;BT細胞;Caco-2細胞;Chang細胞;Clone 9細胞;Clone M-3細胞;COS-1細胞;COS-3細胞;COS-7細胞;CRFK細胞;CV-1細胞;D-17細胞;Daudi細胞;GH1細胞;GH3細胞;HaK細胞;HCT-15細胞;HL-60細胞;HT-1080細胞;HT-29細胞;HUVEC細胞;I-10細胞;IM-9細胞;JEG-2細胞;Jensen細胞;Jurkat細胞;K-562細胞;KB細胞;KG-1細胞;L2細胞;LLC-WRC 256細胞;McCoy細胞;MCF7細胞;WI-38細胞;WISH細胞;XC細胞;Y-1細胞; CHO細胞;Raw 264.7;BHK-21細胞;293A、293Tなどを含むHEK 293細胞;HEP G2細胞;BAE-1細胞;SH-SY5Y細胞;ならびに、操作された株および組換え株を含む、それらの任意の誘導体が挙げられる。
別の実施形態において、DLDデバイスは、接着細胞を分離するための手順に用いることができる。本明細書で用いられる場合、用語「接着細胞」は、表面に接着する能力がある細胞を指す。接着細胞には、細胞培養に用いられる不死化細胞が挙げられ、哺乳類宿主に由来し得る。場合によっては、接着細胞は、精製の前にトリプシン処理され得る。接着細胞の例には、MRC-5細胞;HeLa細胞;Vero細胞;NIH 3T3細胞;L929細胞;Sf21細胞;Sf9細胞;A549細胞;A9細胞;AtT-20細胞;BALB/3T3細胞;BHK-21細胞;BHL-100細胞;BT細胞;Caco-2細胞;Chang細胞;Clone 9細胞;Clone M-3細胞;COS-1細胞;COS-3細胞;COS-7細胞;CRFK細胞;CV-1細胞;D-17細胞;Daudi細胞;GH1細胞;GH3細胞;HaK細胞;HCT-15細胞;HL-60細胞;HT-1080細胞;HT-29細胞;HUVEC細胞;I-10細胞;IM-9細胞;JEG-2細胞;Jensen細胞;Jurkat細胞;K-562細胞;KB細胞;KG-1細胞;L2細胞;LLC-WRC 256細胞;McCoy細胞;MCF7細胞;WI-38細胞;WISH細胞;XC細胞;Y-1細胞; CHO細胞;Raw 264.7;BHK-21細胞;293A、293Tなどを含むHEK 293細胞;HEP G2細胞;BAE-1細胞;SH-SY5Y細胞;ならびに、操作された株および組換え株を含む、それらの任意の誘導体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、手順は、成長培地などの希釈剤から細胞を分離することを含み得、その分離することは、接着細胞の培養物の効率的な維持を提供し得る。例えば、成長培地における接着細胞の培養物は、トランスフェクション試薬を含むトランスフェクション培地へ、幹細胞の分化などの接着細胞内の変化を誘発するように設計された第2の成長培地へ、またはその培養物から化合物を除去するように設計された連続洗浄バッファーへ交換することができる。
特に好ましい手順において、接着細胞は、DLD分離を促進するように結合する1つまたは複数の担体との会合を通して精製される。担体は、本明細書に記載された型であり得、結合は、細胞を安定化および/または活性化し得る。担体は、典型的には、1~1000μmの範囲であるが、この範囲外である場合もあり得る。
担体と細胞の間の会合は、担体と会合していない他の材料に対して増加したサイズの複合体を生じるはずである。細胞および担体の特定のサイズ、ならびに存在する細胞および担体の数に依存して、複合体は、非複合体化細胞より数パーセント大きくから、非複合体化細胞のサイズの多数倍までの範囲であり得る。分離を容易にするために、少なくとも20%の増加が望ましく、より高いパーセンテージ(50;100;1000またはそれ以上)が好ましい。
C.活性化細胞
DLDデバイスはまた、活性化細胞または活性化の能力がある細胞を、複数の他の細胞から分離するための手順に用いることができる。活性化を受けた細胞は、ラージスケールで成長し得るが、好ましい実施形態において、その細胞は、単一の患者に由来し、DLDが、収集から少なくとも数時間以内に実施される。用語「活性化細胞」または「活性化の能力がある細胞」は、細胞アクチベーターとの会合、インキュベーション、または接触を通して、それぞれ、活性化されている、または活性化され得る細胞を指す。活性化の能力がある細胞の例には、免疫または炎症応答において役割を果たす細胞、例えば、T細胞、B細胞;制御性T細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞など;代謝において役割を果たす細胞、例えば、β細胞、肝臓細胞、および膵臓細胞;ならびに誘導性タンパク質発現の能力がある組換え細胞、例えば、DE3溶原化E.コリ(E. coli)細胞、酵母細胞、植物細胞などが挙げられ得る。
DLDデバイスはまた、活性化細胞または活性化の能力がある細胞を、複数の他の細胞から分離するための手順に用いることができる。活性化を受けた細胞は、ラージスケールで成長し得るが、好ましい実施形態において、その細胞は、単一の患者に由来し、DLDが、収集から少なくとも数時間以内に実施される。用語「活性化細胞」または「活性化の能力がある細胞」は、細胞アクチベーターとの会合、インキュベーション、または接触を通して、それぞれ、活性化されている、または活性化され得る細胞を指す。活性化の能力がある細胞の例には、免疫または炎症応答において役割を果たす細胞、例えば、T細胞、B細胞;制御性T細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞など;代謝において役割を果たす細胞、例えば、β細胞、肝臓細胞、および膵臓細胞;ならびに誘導性タンパク質発現の能力がある組換え細胞、例えば、DE3溶原化E.コリ(E. coli)細胞、酵母細胞、植物細胞などが挙げられ得る。
典型的には、1つまたは複数の担体は、表面上にアクチベーターを有する。細胞アクチベーターの例には、タンパク質、抗体、サイトカイン、CD3、CD28、特定のタンパク質に対する抗原、ヘルパーT細胞、受容体、および糖タンパク質;ホルモン、例えば、インスリン、グルカゴンなど;IPTG、ラクトース、アロラクトース、脂質、グリコシド、テルペン、ステロイド、およびアルカロイドが挙げられる。活性化可能細胞は、活性化可能細胞と担体の表面上の細胞アクチベーターとの間の相互作用を通して、担体と少なくとも部分的に会合するべきである。形成された複合体は、非複合体化細胞よりほんの数パーセントだけ大きい場合もあるし、または非複合体化細胞のサイズの多数倍である場合もある。分離を容易にするために、少なくとも20%の増加が望ましく、より高いパーセンテージ(40、50、100、1000、またはそれ以上)が好ましい。
D.細胞の毒性材料からの分離
DLDはまた、細胞にとって毒性であり得る化合物を除去するように、または細胞を毒性化合物による汚染を含まないようにしておくように設計された精製に用いることができる。例には、抗生物質、凍結保存剤、抗真菌剤、毒性代謝産物、アジ化ナトリウム、金属イオン、金属イオンキレート化剤、内毒素、可塑剤、殺虫剤、およびそれらの組合せが挙げられる。デバイスは、細胞から毒性化合物を除去して、細胞から材料の一貫した生産を保証するために用いることができる。場合によっては、細胞は、対数期細胞であり得る。用語「対数期細胞」は、指数関数的対数成長により特徴づけられる成長の時期における活発に分裂する細胞を指す。対数期において、細胞集団は、時間に対して細胞数の自然対数をプロットすることにより直線が生じるような、一定速度で倍増することができる。
DLDはまた、細胞にとって毒性であり得る化合物を除去するように、または細胞を毒性化合物による汚染を含まないようにしておくように設計された精製に用いることができる。例には、抗生物質、凍結保存剤、抗真菌剤、毒性代謝産物、アジ化ナトリウム、金属イオン、金属イオンキレート化剤、内毒素、可塑剤、殺虫剤、およびそれらの組合せが挙げられる。デバイスは、細胞から毒性化合物を除去して、細胞から材料の一貫した生産を保証するために用いることができる。場合によっては、細胞は、対数期細胞であり得る。用語「対数期細胞」は、指数関数的対数成長により特徴づけられる成長の時期における活発に分裂する細胞を指す。対数期において、細胞集団は、時間に対して細胞数の自然対数をプロットすることにより直線が生じるような、一定速度で倍増することができる。
毒性材料を分離する能力は、幅広い種類の細胞にとって重要であり得、その細胞には、細菌株、例えば、BL21、Tuner、Origami、Origami B、Rosetta、C41、C43、DH5α、DH10β、またはXL1Blue;酵母株、例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア属(Pichia)、クリベロマイセス属(Kluyveromyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、およびヤロウイア属(Yarrowia)の株;藻類;ならびにMRC-5細胞;HeLa細胞;Vero細胞;NIH 3T3細胞;L929細胞;Sf21細胞;Sf9細胞;A549細胞;A9細胞;AtT-20細胞;BALB/3T3細胞;BHK-21細胞;BHL-100細胞;BT細胞;Caco-2細胞;Chang細胞;Clone 9細胞;Clone M-3細胞;COS-1細胞;COS-3細胞;COS-7細胞;CRFK細胞;CV-1細胞;D-17細胞;Daudi細胞;GH1細胞;GH3細胞;HaK細胞;HCT-15細胞;HL-60細胞;HT-1080細胞;HT-29細胞;HUVEC細胞;I-10細胞;IM-9細胞;JEG-2細胞;Jensen細胞;Jurkat細胞;K-562細胞;KB細胞;KG-1細胞;L2細胞;LLC-WRC 256細胞;McCoy細胞;MCF7細胞;WI-38細胞;WISH細胞;XC細胞;Y-1細胞; CHO細胞;Raw 264.7;BHK-21細胞;293A、293Tなどを含むHEK 293細胞;HEP G2細胞;BAE-1細胞;SH-SY5Y細胞の培養物を含む、哺乳類細胞培養物;幹細胞、ならびに操作された株および組換え株を含むそれらの任意の誘導体が挙げられる。
E.細胞から分泌された材料の精製
DLD分離はまた、細胞から分泌された材料の精製に用いられ得る。そのような分泌性材料の例には、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、燃料、藻類に由来したものなどのバイオ燃料、ポリマー、単純な有機分子などの小分子、複雑な有機分子、薬物およびプロドラッグ、糖質、ならびにそれらの組合せが挙げられる。分泌性産物には、インスリン、イマチニブ、T細胞、T細胞受容体、Fc融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質スキャフォールド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解剤などの治療上有用なタンパク質が挙げられ得る。
DLD分離はまた、細胞から分泌された材料の精製に用いられ得る。そのような分泌性材料の例には、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、燃料、藻類に由来したものなどのバイオ燃料、ポリマー、単純な有機分子などの小分子、複雑な有機分子、薬物およびプロドラッグ、糖質、ならびにそれらの組合せが挙げられる。分泌性産物には、インスリン、イマチニブ、T細胞、T細胞受容体、Fc融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質スキャフォールド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解剤などの治療上有用なタンパク質が挙げられ得る。
図15は、分泌性産物の精製におけるDLDの使用を描く概略図である。場合によっては、細胞は、細胞が産物を懸濁液へ分泌するように、バッファー、成長培地などの水性懸濁液中にあり得る。そのような分泌性産物の例には、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、燃料、藻類に由来したものなどのバイオ燃料、ポリマー、単純な有機分子などの小分子、複雑な有機分子、薬物およびプロドラッグ、糖質、ならびにそれらの組合せが挙げられる。分泌性産物には、インスリン、イマチニブ、T細胞、T細胞受容体、Fc融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質スキャフォールド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解剤などの治療上有用なタンパク質が挙げられ得る。
精製は、例えば、細胞が、分泌性化合物の既定サイズより大きい既定サイズを有する状況において、行われ得、前記細胞の既定サイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが臨界サイズ未満である。そのような構成において、DLDデバイスにアプライされた時、細胞は、第1の方向に偏向され得、一方、分泌性化合物は第2の方向に偏向され得、それにより、分泌性化合物を細胞から分離する。また、分泌性タンパク質は、DLD分離を促進するように結合する大きな担体により捕獲され得る。その後、DLDが実施され得、その後、担体-タンパク質複合体は、そのタンパク質をさらに精製し、または放出するために処理され得る。
そのようなプロセスは、分離された粒子の集団が、さらなる分離のために、連続的にデバイスへループバックされ得るように反復様式で行われ得る。この点において、図16および17は、分離された細胞が、分離後、DLDデバイスへループバックされる、反復プロセスの概略図である。場合によっては、細胞は、第1のデバイスから、異なる臨界サイズを含む障害物を有する第2の異なるデバイスへループされ得る。そのようなシステムは、臨界サイズの範囲を操作することにより、複数のサイズ範囲の系統的分離を可能にすることができる。他の場合では、細胞は、その分離された粒子を分離するのに前に用いられた同じデバイスへループバックされ得る。このシステムは、活発に分裂する細胞、または活発に発現している最中の化合物の連続的精製について有利であり得る。例えば、そのような方法は、1つのフロー流由来の分泌性産物と、別のフロー流由来の分泌性産物を産生する細胞の両方を収集する分泌性産物を精製する方法と組み合わせることができた。細胞は分泌性産物を連続的に産生することができるため、精製された細胞は、その細胞からの分泌性産物を連続的に収集するためにデバイスへ再アプライされ得る。
F.純度および収率
本明細書で論じられたDLD方法により産生された細胞の純度、収率、および生存率は、出発材料の性質、使用される厳密な手順、およびDLDデバイスの特徴を含むいくつかの因子に基づいて変動する。好ましくは、少なくとも60%の精製、収率、および生存率が、得られるべきであり、より高いパーセンテージの、少なくとも70%、80%、または90%がより好ましい。好ましい実施形態において、方法は、全血、アフェレーシス産物、または白血球アフェレーシス産物から白血球を少なくとも70%の純度、収率、および生存率で単離するために用いられ得、より高いパーセンテージ(少なくとも80%、85%、または90%)が好ましい。
本明細書で論じられたDLD方法により産生された細胞の純度、収率、および生存率は、出発材料の性質、使用される厳密な手順、およびDLDデバイスの特徴を含むいくつかの因子に基づいて変動する。好ましくは、少なくとも60%の精製、収率、および生存率が、得られるべきであり、より高いパーセンテージの、少なくとも70%、80%、または90%がより好ましい。好ましい実施形態において、方法は、全血、アフェレーシス産物、または白血球アフェレーシス産物から白血球を少なくとも70%の純度、収率、および生存率で単離するために用いられ得、より高いパーセンテージ(少なくとも80%、85%、または90%)が好ましい。
V.技術的背景
いかなる特定の理論にも捕らわれずに、マイクロ流体のいくつかの技術的側面の一般的な議論は、この分野において行われる分離に影響する因子を理解することにおいて助けとなり得る。様々な微細加工ふるいマトリックスが、粒子を分離するために開示されている(Chou, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:13762 (1999); Han, et al., Science 288:1026 (2000); Huang, et al., Nat. Biotechnol. 20:1048 (2002); Turner et al., Phys. Rev. Lett. 88(12):128103 (2002); Huang, et al., Phys. Rev. Lett. 89:178301 (2002); 米国特許第5,427,663号;米国特許第7,150,812号;米国特許第6,881,317号)。バンプアレイ(別名「障害物アレイ」)デバイスが記載されており、それらの基本的な動作は、例えば、米国特許第7,150,812号(全体として参照により本明細書に組み入れられている)に説明されている。バンプアレイは、本質的に、障害物のアレイ(一般的に、周期的に順序づけられたアレイ)を通過する粒子を分離する(segregate)ことにより、動作し、分離は、バルク流体フローの方向から、または印加電場の方向から斜めである「アレイ方向」に従う粒子間で起こる(U.S. 7,150,812)。
いかなる特定の理論にも捕らわれずに、マイクロ流体のいくつかの技術的側面の一般的な議論は、この分野において行われる分離に影響する因子を理解することにおいて助けとなり得る。様々な微細加工ふるいマトリックスが、粒子を分離するために開示されている(Chou, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:13762 (1999); Han, et al., Science 288:1026 (2000); Huang, et al., Nat. Biotechnol. 20:1048 (2002); Turner et al., Phys. Rev. Lett. 88(12):128103 (2002); Huang, et al., Phys. Rev. Lett. 89:178301 (2002); 米国特許第5,427,663号;米国特許第7,150,812号;米国特許第6,881,317号)。バンプアレイ(別名「障害物アレイ」)デバイスが記載されており、それらの基本的な動作は、例えば、米国特許第7,150,812号(全体として参照により本明細書に組み入れられている)に説明されている。バンプアレイは、本質的に、障害物のアレイ(一般的に、周期的に順序づけられたアレイ)を通過する粒子を分離する(segregate)ことにより、動作し、分離は、バルク流体フローの方向から、または印加電場の方向から斜めである「アレイ方向」に従う粒子間で起こる(U.S. 7,150,812)。
A.バンプアレイ
いくつかのアレイにおいて、隣接障害物の幾何学的配置は、間隙を定義する障害物の部分が、バルク流体フローの方向に延びる間隙の軸に関して対称であるような配置である。そのような間隙を通る流体フローの速度または容量プロフィールは、間隙に渡って、およそ放物線であり、流体速度および流量は、間隙を定義する各障害物の表面においてゼロであり(すべり流なしの状態を仮定した場合)、間隙の中心点で最大値に達する。プロフィールが放物線である場合、間隙を定義する障害物の1つに隣接する所定の幅の流体層が、間隙を定義するその他の障害物に隣接した同じ幅の流体層と等しい割合の流体流量を含有し、間隙の通過中に「バンピング」される粒子の臨界サイズが、粒子がどの障害物の近くを移動するかに関わらず、等しいことを意味する。
いくつかのアレイにおいて、隣接障害物の幾何学的配置は、間隙を定義する障害物の部分が、バルク流体フローの方向に延びる間隙の軸に関して対称であるような配置である。そのような間隙を通る流体フローの速度または容量プロフィールは、間隙に渡って、およそ放物線であり、流体速度および流量は、間隙を定義する各障害物の表面においてゼロであり(すべり流なしの状態を仮定した場合)、間隙の中心点で最大値に達する。プロフィールが放物線である場合、間隙を定義する障害物の1つに隣接する所定の幅の流体層が、間隙を定義するその他の障害物に隣接した同じ幅の流体層と等しい割合の流体流量を含有し、間隙の通過中に「バンピング」される粒子の臨界サイズが、粒子がどの障害物の近くを移動するかに関わらず、等しいことを意味する。
場合によっては、障害物アレイの粒子サイズによる分離性能は、障害物間の間隙へ流体フローを偏向させる隣接障害物の部分が、バルク流体フローの方向に延びる間隙の軸に関して対称ではないように、障害物を形作り、かつ配置することにより向上することができる。そのような、間隙へのフロー対称性の欠如は、間隙内の非対称流体フロープロフィールをもたらし得る。間隙の一方の側への流体フローの濃縮(すなわち、間隙を通る非対称流体フロープロフィールの結果)は、バルク流体フローの方向よりむしろ、アレイ方向に移動するように誘導される粒子の臨界サイズを低下させ得る。これは、フロープロフィールの非対称性が、間隙を通る選択された割合の流体流量を含有する1つの障害物に隣接したフロー層の幅と、同じ割合の流体流量を含有し、かつ間隙を定義する他の障害物に隣接するフロー層の幅との差を引き起こすからである。障害物に隣接した流体層の異なる幅が、2つの異なる臨界粒子サイズを示す間隙を定義する。間隙を横切る粒子は、それが運ばれる流体層の臨界サイズをそれが超える場合には、バンピングされ得る(すなわち、バルク流体フロー方向よりむしろ、アレイ方向に移動し得る)。したがって、非対称フロープロフィールを有する間隙を横切る粒子が、その粒子が、1つの障害物に隣接した流体層で移動する場合には、バンピングされるが、それが間隙を定義する他の障害物に隣接した流体層で移動する場合には、バンピングされないことが可能である。
別の態様において、間隙を定義する障害物のエッジの丸みを減少させることは、障害物アレイの粒子サイズによる分離性能を向上させ得る。例として、とがった頂点がある三角形の横断面を有する障害物のアレイは、丸みのある頂点を有する同一のサイズおよび同一の間隔の三角形障害物のアレイが示すより低い臨界粒子サイズを示し得る。
したがって、障害物アレイにおいて間隙を定義する障害物のエッジをとがらせることにより、バルク流体フローの影響下でアレイ方向に偏向した粒子の臨界サイズは、障害物のサイズを必ずしも低下させなくても、減少させることができる。逆に、よりとがったエッジを有する障害物は、よりとがりが少ないエッジを有する同一サイズの障害物より、より離れた間隔を置くことができるが、それでもなお、よりとがりが少ないエッジを有する障害物と等価の粒子分離性質を生じ得る。
B.分画範囲
マイクロ流体デバイスにおいてサイズにより分離される物体には、細胞、生体分子、無機ビーズ、および他の物体が挙げられる。分画される典型的なサイズは、100ナノメートルから50マイクロメートルまでの範囲である。しかしながら、より大きい、およびより小さい粒子もまた、分画され得る場合もあり得る。
マイクロ流体デバイスにおいてサイズにより分離される物体には、細胞、生体分子、無機ビーズ、および他の物体が挙げられる。分画される典型的なサイズは、100ナノメートルから50マイクロメートルまでの範囲である。しかしながら、より大きい、およびより小さい粒子もまた、分画され得る場合もあり得る。
C.容量
デザインに依存して、デバイス、またはデバイスの組合せは、試料の約10μlから少なくとも500μlの間、試料の約500μlから約40mLの間、試料の約500μlから約20mLの間、試料の約20mLから約200mLの間、試料の約40mLから約200mLの間、または少なくとも試料の200mLを処理するために用いられ得る。
デザインに依存して、デバイス、またはデバイスの組合せは、試料の約10μlから少なくとも500μlの間、試料の約500μlから約40mLの間、試料の約500μlから約20mLの間、試料の約20mLから約200mLの間、試料の約40mLから約200mLの間、または少なくとも試料の200mLを処理するために用いられ得る。
D.チャネル
デバイスは、1つまたは複数の注入口および1つまたは複数の出口を有する1つまたは複数のチャネルを含み得る。注入口は、試料または粗(すなわち、非精製)流体組成物用に、バッファー用に、または試薬を導入するために、用いられ得る。出口は、産物を収集するために用いられ得、または廃棄物用の出口として用いられ得る。チャネルは、幅が約0.5~100mm、長さが約2~200mmであり得るが、異なる幅および長さもまた可能である。深さは、1~1000μmであり得、1個から100個までの範囲、またはそれ以上のチャネルが存在し得る。容量は、数μlから何mlまでもの非常に幅広い範囲に渡って変動し得、デバイスは、障害物の異なる立体配置での複数のゾーン(ステージまたはセクション)を有し得る。
デバイスは、1つまたは複数の注入口および1つまたは複数の出口を有する1つまたは複数のチャネルを含み得る。注入口は、試料または粗(すなわち、非精製)流体組成物用に、バッファー用に、または試薬を導入するために、用いられ得る。出口は、産物を収集するために用いられ得、または廃棄物用の出口として用いられ得る。チャネルは、幅が約0.5~100mm、長さが約2~200mmであり得るが、異なる幅および長さもまた可能である。深さは、1~1000μmであり得、1個から100個までの範囲、またはそれ以上のチャネルが存在し得る。容量は、数μlから何mlまでもの非常に幅広い範囲に渡って変動し得、デバイスは、障害物の異なる立体配置での複数のゾーン(ステージまたはセクション)を有し得る。
E.間隙サイズ(ポスト間または障害物間のエッジからエッジまでの距離)
障害物のアレイにおける間隙サイズ(ポスト間または障害物間のエッジからエッジまでの距離)は、約数(例えば、1~500)マイクロメートルから変動し得、または1ミリメートルより大きくてもよい。いくつかの実施形態において、障害物は、1~3000マイクロメートルの直径を有し、様々な形(球形、三角形、涙滴形、菱形、四角形、長方形など)を有し得る。ポストの第1行は、注入口の近くに(例えば、5μm以内に)位置し得、または1mmより遠く離れてあり得る。
障害物のアレイにおける間隙サイズ(ポスト間または障害物間のエッジからエッジまでの距離)は、約数(例えば、1~500)マイクロメートルから変動し得、または1ミリメートルより大きくてもよい。いくつかの実施形態において、障害物は、1~3000マイクロメートルの直径を有し、様々な形(球形、三角形、涙滴形、菱形、四角形、長方形など)を有し得る。ポストの第1行は、注入口の近くに(例えば、5μm以内に)位置し得、または1mmより遠く離れてあり得る。
(F)積み重ね可能なチップ
デバイスは、複数の積み重ね可能なチップを含み得る。デバイスは、約1~50個のチップを含み得る。場合によっては、デバイスは、直列に、または並列に、または両方で置かれた複数のチップを有し得る。
デバイスは、複数の積み重ね可能なチップを含み得る。デバイスは、約1~50個のチップを含み得る。場合によっては、デバイスは、直列に、または並列に、または両方で置かれた複数のチップを有し得る。
VI.発明の概念
以下の番号付きの段落は、本願の一部である発明の概念を提示する。これらの概念は、クレーム例E1-E234の形式で表される。
E1. 以下の工程を含む、標的細胞の集団を操作する方法:
a)標的細胞を粗流体組成物から単離する工程であって、単離手順が、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含み、前記デバイスが、
i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含む、工程;
b)前記収集出口から得られた標的細胞を、所望の表現型を有するように遺伝子操作する工程。
E2. 前記遺伝子操作する工程が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、遺伝子操作された標的細胞が、それらをインビトロで(in vitro)培養することにより増殖される、請求項1に記載の方法。
E3. 前記所望の表現型を示す標的細胞の収率が、Ficoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていない同一の細胞より少なくとも10%高い、請求項2に記載の方法。
E4. 前記粗流体組成物が、血液、または血液にアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスを実施することにより取得されている組成物である、請求項1に記載の方法。
E5. 前記標的細胞が白血球である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
E6. 前記標的細胞が、B細胞、T細胞、NK細胞、単球、または前駆細胞である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
E7. 前記標的細胞が樹状細胞である、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。
E8. 前記粗流体組成物が患者から取得される、請求項1~7のいずれか一項記載の方法。
E9. 前記粗流体組成物における標的細胞が、形質導入またはトランスフェクションされる前に担体と結合していない、請求項8に記載の方法。
E10. 標的細胞に、DLDを実施する前に、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項8に記載の方法。
E11. 標的細胞に、DLDを実施した後で、かつそれらを形質導入またはトランスフェクションする前かまたは後のいずれかで、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項9に記載の方法。
E12. 前記1つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する親和性物質を表面上に含む、請求項10または11に記載の方法。
E13. 前記物質が、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマーである、請求項12に記載の方法。
E14. 前記担体の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E15. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の50%以下の長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E16. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E17. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の25%以下の長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E18. 担体の1つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E19. 担体の1つの群が、標的細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E20. 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項10~19のいずれか一項に記載の方法。
E21. 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項10~20のいずれか一項に記載の方法。
E22. 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、標的細胞に初めて担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項10~21のいずれか一項に記載の方法。
E23. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から標的細胞に初めて担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項10~21のいずれか一項に記載の方法。
E24. 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
E25. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
E26. 初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項24または25に記載の方法。
E27. 以下の工程を含む、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を作製する方法:
a)T細胞を含む粗流体組成物を取得する工程;
b)i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記T細胞とは異なるサイズである細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイスを用いて、前記粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施する工程;
c)工程b)において取得された濃縮産物中のT細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を産生するように遺伝子操作する工程。
E28. 前記粗流体組成物が、患者由来の血液から取得されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であり、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ異なるサイズである赤血球、血小板、または他の粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる、請求項27に記載の方法。
E29. 前記遺伝子操作が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、遺伝子操作された標的細胞が、インビトロで前記細胞を成長させることにより、さらに増殖される、請求項27または28に記載の方法。
E30. 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも10%高い、請求項27~29のいずれか一項に記載の方法。
E31. 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも20%高い、請求項30に記載の方法。
E32. 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも50%高い、請求項30に記載の方法。
E33. 前記CARが、a)抗原結合ドメインを含む細胞外領域;b)膜貫通領域;c)細胞内領域を含み、前記CAR T細胞が、トリガーされた時、CAR T細胞の数または活性を低下させる分子スイッチを前記細胞に提供する1つまたは複数の組換え配列を含んでもよい、請求項27~32のいずれか一項に記載の方法。
E34. 前記抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の、一本鎖可変断片(scFv)である、請求項33に記載の方法。
E35. 前記CARが、細胞外領域と膜貫通領域を接続する2~20個のアミノ酸のヒンジ領域を含む、請求項33または34に記載の方法。
E36. 前記膜貫通領域が、CD8またはCD28タンパク質配列を含む、請求項35に記載の方法。
E37. 前記細胞内領域が、CD3ζ、CD137、またはCD28細胞内ドメインに由来したシグナル伝達ドメインを含む、請求項33~36のいずれか一項に記載の方法。
E38. 前記T細胞を含む粗流体組成物が、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患を有する患者から取得される、請求項27~37のいずれか一項に記載の方法。
E39. T細胞を含む粗流体組成物を取得した後、前記流体組成物中のT細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項38に記載の方法。
E40. T細胞に、DLDを実施する前に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項39に記載の方法。
E41. T細胞に、DLDを実施した後で、かつそれらが遺伝子操作される前かまたは後のいずれかで、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項39に記載の方法。
E42. 前記1つまたは複数の担体が、前記T細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項39~41のいずれか一項に記載の方法。
E43. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E44. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の50%以下の長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E45. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E46. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の25%以下の長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E47. 担体の1つの群が、T細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E48. 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E49. 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項39~48のいずれか一項に記載の方法。
E50. 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項39~49のいずれか一項に記載の方法。
E51. T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記T細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項39~50のいずれか一項に記載の方法。
E52. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項39~50のいずれか一項に記載の方法。
E53. T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項27~50のいずれか一項に記載の方法。
E54. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項27~50のいずれか一項に記載の方法。
E55. 初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項53または54に記載の方法。
E56. CAR T細胞を作製することにおける全工程が、T細胞を含む粗流体組成物が取得される同じ施設で実施され、全工程が、合計4時間以内に完了する、請求項27~55のいずれか一項に記載の方法。
E57. 請求項27~55のいずれか一項に記載の方法により作製されたCAR T細胞。
E58. 癌、自己免疫疾患、または感染性疾患について患者を処置する方法であって、前記患者由来の癌細胞、自己免疫細胞、または感染細胞上の抗原を認識するキメラ抗原受容体を発現するように操作されたCAR T細胞を前記患者に投与することを含み、前記CAR T細胞が、以下の工程を含むプロセスにより作製されている、方法:
a)T細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程;
b)i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記T細胞とは異なるサイズである細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイスを用いて、前記粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施する工程;
c)工程b)において取得された前記T細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子操作する工程;
d)操作されたT細胞の数を、前記細胞をインビトロで成長させることにより増加させる工程;ならびに
e)前記粗流体組成物が取得された患者へ前記操作されたT細胞を投与する工程。
E59. 前記粗流体組成物が、前記患者由来の血液から取得されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であり、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ異なるサイズである赤血球、血小板、または他の粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる、請求項58に記載の方法。
E60. 遺伝子操作が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含む、請求項58または59に記載の方法。
E61. 表面上にキメラ受容体を発現する細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも10%高い、請求項60に記載の方法。
E62. 表面上にキメラ受容体を発現する標的細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも50%高い、請求項60に記載の方法。
E63. 前記CARが、a)抗原結合ドメインを含む細胞外領域;b)膜貫通領域;およびc)細胞内領域を含み、前記CAR T細胞が、トリガーされた時、CAR T細胞の数または活性を低下させる分子スイッチを前記細胞に提供する1つまたは複数の組換え配列を含んでもよい、請求項58~62のいずれか一項に記載の方法。
E64. 前記抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の、一本鎖可変断片(scFv)である、請求項63に記載の方法。
E65. 前記CARが、細胞外領域と膜貫通領域を接続する2~20個のアミノ酸のヒンジ領域を含む、請求項63または64に記載の方法。
E66. 前記膜貫通領域が、CD8またはCD28タンパク質配列を含む、請求項63~65のいずれか一項に記載の方法。
E67. 前記細胞内領域が、CD3ζ、CD137、またはCD28細胞内ドメインに由来したシグナル伝達ドメインを含む、請求項63~66のいずれか一項に記載の方法。
E68. 前記患者が白血病を有する、請求項58~67のいずれか一項に記載の方法。
E69. 前記白血病が急性リンパ芽球性白血病である、請求項68に記載の方法。
E70. 前記CARが抗原CD19またはCD20を認識する、請求項68または69に記載の方法。
E71. 前記患者が固形腫瘍を有する、請求項58~67のいずれか一項に記載の方法。
E72. 前記CARが、CD22;RORI;メゾテリン;CD33/IL3Ra;c-Met;PSMA;糖脂質F77;EGFRvIII;GD-2;NY-ESO-l TCR;MAGE A3 TCR;およびそれらの組合せからなる群から選択される抗原を認識する、請求項71に記載の方法。
E73. T細胞を含む粗流体組成物を取得した後に、前記流体中のT細胞に、DLD分離を促進するように、担体を結合させる、請求項58~72のいずれか一項に記載の方法。
E74. DLDを実施する前に、T細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項73に記載の方法。
E75. DLDを実施した後で、かつT細胞が、キメラ受容体を発現するように遺伝子操作される前かまたは後のいずれかで、T細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項73に記載の方法。
E76. 前記1つまたは複数の担体が、前記T細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項73~75のいずれか一項に記載の方法。
E77. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
E78. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の50%以下の長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
E79. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
E80. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の25%以下の長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
E81. 担体の1つの群が、T細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項80に記載の方法。
E82. 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項73~81のいずれか一項に記載の方法。
E83. 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項73~82のいずれか一項に記載の方法。
E84. 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項73~83のいずれか一項に記載の方法。
E85. T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記T細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
E86. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
E87. T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
E88. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
E89. 初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項87または88に記載の方法。
E90. T細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも1日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
E91. 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも3日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
E92. a)標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程;
b)マイクロ流体デバイスを用いて、前記標的細胞を含む粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施して、標的細胞が濃縮された組成物を得る工程;
を含み、DLDの前かまたは後のいずれかに、標的細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させ、前記標的細胞を含む粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、5時間より長く経過していない、患者から標的細胞を収集する方法。
E93. 前記1つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項92に記載の方法。
E94. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項92または93に記載の方法。
E95. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の50%以下の長さである、請求項92または93に記載の方法。
E96. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項92または93に記載の方法。
E97. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の25%以下の長さである、請求項92または93に記載の方法。
E98. 担体の1つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項92または93に記載の方法。
E99. 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項92または93に記載の方法。
E100. 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項92~99のいずれか一項に記載の方法。
E101. 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項92~100のいずれか一項に記載の方法。
E102. 標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92~101のいずれか一項に記載の方法。
E103. 標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項92~101のいずれか一項に記載の方法。
E104. 前記標的細胞を含む粗流体組成物が、患者由来の血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施することにより、取得される、請求項92~103のいずれか一項に記載の方法。
E105. DLDにより標的細胞が濃縮された組成物中の標的細胞が、ウイルスベクターを用いて形質導入される、請求項92~104のいずれか一項に記載の方法。
E106. 標的細胞が、電気的に、化学的に、またはナノ粒子を用いて、トランスフェクションされる、請求項105に記載の方法。
E107. 前記マイクロ流体デバイスが
a)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
b)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記標的細胞を含む粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含む、請求項92~106のいずれか一項に記載の方法。
E108. 前記標的細胞がT細胞である、請求項92~107のいずれか一項に記載の方法。
E109. 前記T細胞が、ナチュラルキラーT細胞、セントラルメモリーT細胞、ヘルパーT細胞、および制御性T細胞からなる群から選択される、請求項108に記載の方法。
E110. 前記標的細胞が幹細胞である、請求項92~107のいずれか一項に記載の方法。
E111. 前記標的細胞が、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、または顆粒球である、請求項92~107のいずれか一項に記載の方法。
E112. 前記標的細胞を含む粗流体組成物が、抗凝固剤として働き、または血小板の活性化を防ぐ1つまたは複数の添加物を含む、請求項92~111のいずれか一項に記載の方法。
E113. 前記添加物が、チクロピジン、イノシン、プロトカテキュ酸、アセチルサリチル酸、およびチロフィバンからなる群から選択される、請求項112に記載の方法。
E114. 工程a)およびb)がどちらも、標的細胞を含む粗流体組成物が患者から取得される現地で行われる、請求項92~113のいずれか一項に記載の方法。
E115. 標的細胞を含む粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92~114のいずれか一項に記載の方法。
E116. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92~114のいずれか一項に記載の方法。
E117. c)細胞を遺伝子操作し、および/もしくは数を増加させる工程;ならびに/または
d)前記標的細胞が取得された同じ患者を、収集された標的細胞で処置する工程
をさらに含む、請求項92~116のいずれか一項に記載の方法。
E118. 工程e)後に、前記標的細胞が凍結保存される、請求項117に記載の方法。
E119. 工程c)において培養される標的細胞が、アクチベーターの存在下で培養されるT細胞である、請求項117または118に記載の方法。
E120. 前記アクチベーターが担体に結合している、請求項119に記載の方法。
E121. 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも1日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
E122. 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも3日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
E123. 請求項92~122のいずれか一項に記載の方法により作製された標的細胞。
E124. 請求項123に記載の標的細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または状態について患者を処置する方法。
E125. 以下の工程を含む、接着細胞を複数の他の細胞から分離する方法:
a)複数の他の細胞および接着細胞を含む粗流体組成物を、DLD分離を促進するように結合する1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、前記接着細胞が、接触により、または接触後に担体と少なくとも部分的に会合して、担体会合化接着細胞複合体を生成し、前記担体会合化接着細胞複合体が、前記複数の他の細胞における細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化接着細胞複合体のサイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;
b)前記粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに
c)前記担体会合化接着細胞複合体を含む前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化接着細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記担体会合化接着細胞複合体を前記複数の他の細胞から分離する、工程;
d)分離された担体会合化接着細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。
E126. 前記接着細胞が、前記接着細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
E127. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、2時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
E128. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、1時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
E129. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞または前記担体接着細胞複合体が初めて前記デバイスから収集されるまで、4時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
E130. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞または前記担体接着細胞複合体が初めて前記デバイスから収集されるまで、4時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
E131. 前記担体が、前記接着細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項125~130のいずれか一項に記載の方法。
E132. 前記担体の直径が、前記接着細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
E133. 前記担体の全部の直径が、前記接着細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
E134. 前記担体の全部の直径が、前記接着細胞の直径の少なくとも10倍の長さである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
E135. 前記担体の全部の直径が、10~600μmである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
E136. 前記接着細胞が、MRC-5細胞;HeLa細胞;Vero細胞;NIH 3T3細胞;L929細胞;Sf21細胞;Sf9細胞;A549細胞;A9細胞;AtT-20細胞;BALB/3T3細胞;BHK-21細胞;BHL-100細胞;BT細胞;Caco-2細胞;Chang細胞;Clone 9細胞;Clone M-3細胞;COS-1細胞;COS-3細胞;COS-7細胞;CRFK細胞;CV-1細胞;D-17細胞;Daudi細胞;GH1細胞;GH3細胞;HaK細胞;HCT-15細胞;HL-60細胞;HT-1080細胞;HEK細胞、HT-29細胞;HUVEC細胞;I-10細胞;IM-9細胞;JEG-2細胞;Jensen細胞;Jurkat細胞;K-562細胞;KB細胞;KG-1細胞;L2細胞;LLC-WRC 256細胞;McCoy細胞;MCF7細胞;WI-38細胞;WISH細胞;XC細胞;Y-1細胞;CHO細胞;Raw 264.7細胞;HEP G2細胞;BAE-1細胞;SH-SY5Y細胞、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項125~135のいずれか一項に記載の方法。
E137. 前記接着細胞が幹細胞である、請求項125~135のいずれか一項に記載の方法。
E138. 以下の工程を含む、活性化細胞を複数の他の細胞から分離する方法:
a)活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を、1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、少なくとも1つの担体が細胞アクチベーターを含み、前記細胞アクチベーターが、接触により、または接触後に、前記細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞と少なくとも部分的に会合して、担体会合化細胞複合体を生成し、前記細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞との前記細胞アクチベーターの会合が、前記活性化の能力がある細胞を少なくとも部分的に活性化し、前記担体会合化細胞複合体が、前記複数の他の細胞における細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化細胞複合体のサイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;
b)前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに
c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記活性化細胞を前記複数の他の細胞から分離する、工程;
d)分離された担体会合化細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。
E139. 前記活性化の能力がある細胞が、T細胞、B細胞、制御性T細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞、β細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、DE3溶原化細胞、酵母細胞、植物細胞、および幹細胞からなる群から選択される、請求項0に記載の方法。
E140. 細胞アクチベーターがタンパク質である、請求項138または139に記載の方法。
E141. 前記タンパク質が抗体である、請求項140に記載の方法。
E142. 前記タンパク質が、CD3、CD28、抗原、ヘルパーT細胞、受容体、サイトカイン、糖タンパク質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項140に記載の方法。
E143. 前記細胞アクチベーターが、インスリン、IPTG、ラクトース、アロラクトース、脂質、グリコシド、テルペン、ステロイド、アルカロイド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項138に記載の方法。
E144. 前記活性化の能力がある細胞が、前記活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
E145. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
E146. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、2時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
E147. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、工程c)が完了するまで、4時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
E148. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、工程c)が完了するまで、3時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
E149. 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞と少なくとも同じ長さである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
E150. 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
E151. 前記担体の全部の直径が、138~148の直径の少なくとも10倍の長さである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
E152. 前記担体の直径が、10~600μmである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
E153. 以下の工程を含む、細胞から分泌性産物を連続的に精製する方法:
a)細胞を含む流体組成物を取得する工程であって、前記細胞が、前記流体組成物中に懸濁しており、前記細胞が分泌性産物を前記懸濁液へ分泌し、前記細胞が前記分泌性産物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、前記細胞の既定サイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが、前記臨界サイズ未満である、工程;
b)前記細胞を含む流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;
b)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記細胞が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記分泌性産物が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記分泌性産物を前記細胞から分離する、工程;
c)前記分泌性産物を収集する工程であって、それにより、実質的に純粋である前記分泌性産物の試料を生じる、工程;
d)分離された細胞を含む回収された流体組成物を収集する工程;ならびに
e)分離された細胞を含む回収された流体組成物を、前記デバイスに再アプライし、工程(a)~(e)を繰り返す工程であって、それにより、分泌性産物を細胞から連続的に精製する、工程。
E154. 前記分泌性産物が、タンパク質、抗体、バイオ燃料、ポリマー、小分子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項153に記載の方法。
E155. 前記細胞が、細菌細胞、藻類細胞、哺乳類細胞、および腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項153に記載の方法。
E156. 遠心分離または水簸の非存在下で、試料上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含む、アフェレーシス試料中の血小板と白血球の比率を減少させる方法であって、産物が、血小板と白血球の比率がDLDの代わりに遠心分離または水簸を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも20%低くで得られる、方法。
E157. 産物が、血小板と白血球の比率が密度勾配遠心分離または向流遠心分離を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも20%低くで得られる、請求項156に記載の方法。
E158. 産物が、血小板と白血球の比率が水簸を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも20%低くで得られる、請求項156に記載の方法。
E159. 産物が、血小板と白血球の比率がDLDの代わりに遠心分離または水簸を使用して得られる比率よりも少なくとも50%低くで得られる、請求項156に記載の方法。
E160. DLDの前に、アフェレーシス試料に対して実施される分離工程がない、請求項156-159のいずれか一項に記載の方法。
E161. DLDが、血小板のサイズを変えるインターカレーションを含まず、血小板凝集を促進しないバッファーにおいて実施される、請求項156-160のいずれか一項に記載の方法。
E162. DLDが、デキストランまたは他の高電荷ポリマーを含まないバッファーにおいて実施される、請求項156-159のいずれか一項に記載の方法。
E163. 産物中の血小板の総数が、アフェレーシス試料中よりも少なくとも70%低い、請求項156-162のいずれか一項に記載の方法。
E164. 産物中の血小板の総数が、アフェレーシス試料中よりも少なくとも90%低い、請求項156-163のいずれか一項に記載の方法。
E165. 試料上でDLD、次にアフィニティー分離工程およびアクチベーターの存在下で培養することによるT細胞の拡張を実施することを含む、アフェレーシス試料からT細胞を精製するための方法であって、得られるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも2倍である、方法。
E166. アフィニティー分離工程が、CD3に結合する抗体を含む磁気ビーズまたは粒子の使用を含む、請求項165に記載の方法。
E167. 培養14日後に得られるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも2倍である、請求項165に記載の方法。
E168. 培養14日後に得られるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも4倍である、請求項165に記載の方法。
E169. DLD産物中の細胞が組換え表現型を発現するようにベクターで形質転換されているとき、所望の表現型を示す細胞の収量は、Ficoll遠心分離により単離され、DLDに付されない同一の細胞よりも少なくとも10%高い、請求項156-168のいずれか一項に記載の方法。
E170. DLD産物中の細胞が組換え表現型を発現するようにベクターで形質転換されているとき、所望の表現型を示すT細胞の収量は、Ficoll遠心分離により単離され、DLDに付されない同一の細胞よりも少なくとも20%高い、請求項156-169のいずれか一項に記載の方法。
E171. T細胞の総数に対するDLD産物中のメモリーT細胞の割合が、DLDの代わりにFicoll遠心分離で同じ手順を使用して産生される割合よりも少なくとも10%高い、請求項163-165のいずれか一項に記載の方法。
E172. 方法が、CAR T細胞療法のためのT細胞を産生するために使用され、患者を処置するために十分な数の細胞を産生するために必要な時間がFicoll遠心分離の代わりにDLDを使用して少なくとも20%減少される、請求項156-171のいずれか一項に記載の方法。
E173. CAR T細胞を産生するためのプロセスが、細胞が凍結される工程を含まない、請求項172に記載の方法。
E174. T細胞の処理が、アフェレーシスが実施されるのと同じ部位で実施される、請求項172または請求項173のいずれかに記載の方法。
E175. T細胞が、アフェレーシスが実施されるのと同じ部位で遺伝的に形質転換される、請求項172-174のいずれか一項に記載の方法。
E176. 1時間未満が、アフェレーシス試料収集が完了される時間からDLDが実施される時間までで経過する、請求項156-169のいずれか一項に記載の方法。
E177. 遠心分離または水簸の非存在下で、試料上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含む、アフェレーシス試料中の白血球に対する血小板の比率を減少させる方法であって、産物が、産物中の血小板の総数がアフェレーシス試料中よりも少なくとも90%低くで得られる、方法。
E178. DLDが、血小板のサイズを変えるインターカレーションを含まず、血小板凝集を促進しないバッファーにおいて実施される、請求項177に記載の方法。
E179. DLDが、デキストランまたは他の高電荷ポリマーを含まないバッファーにおいて実施される、請求項177に記載の方法。
E180. 以下の工程を含む、CAR T細胞を操作する方法:
a)アフェレーシスにより患者から試料組成物を取得する工程であって、前記試料組成物がT細胞を含む、工程;
b)存在する血小板の総数を少なくとも70%減少させるように試料組成物上でDLDを実施する工程であって、DLDは、
i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、組成物中のT細胞が、濃縮産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、血小板およびT細胞より小さい他の物質が、収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイス上で実施される、工程;
c)工程b)において取得された濃縮産物中のT細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を産生するように遺伝子操作する工程;
d)それらの数を拡張するようにT細胞を培養する工程;
e)患者への投与のための医薬組成物にT細胞を移す工程。
E181. 血小板の少なくとも90%が工程b)において除去される、請求項180に記載の方法。
E182. 全ての単離工程および濃縮工程がDLDを使用して実施される、請求項180または請求項181のいずれかに記載の方法。
E183. 培養前または培養中に、細胞がT細胞アクチベーターに曝露される、請求項180-182のいずれか一項に記載の方法。
E184. 工程b)中および工程c)の前に、細胞が、T細胞アクチベーターが存在または添加されている培地に移される、請求項180-183のいずれか一項に記載の方法。
E185. アクチベーターを含む培地をDLDにより処理し、アクチベーターを細胞から分離し、細胞が、細胞を組み換え的に操作するためのベクターが存在または添加されている培地に移される、請求項184に記載の方法。
E186. 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで細胞が凍結されない、請求項180-185のいずれか一項に記載の方法。
E187. 細胞があらゆる工程で凍結されない、請求項180-185のいずれか一項に記載の方法。
E188. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも1日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
E189. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
E190. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
E191. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも10日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
E192. 工程d)において、培養14日後に取得されるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して行われる同じ手順によって産生される数よりも少なくとも2倍高い、請求項180-191のいずれか一項に記載の方法。
E193. 工程d)において、培養14日後に取得されるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して行われる同じ手順によって産生される数よりも少なくとも4倍高い、請求項180-191のいずれか一項に記載の方法。
E194. 以下の工程を含む、CAR T細胞を調製する方法:
a)アフェレーシスにより患者から細胞を収集する;
b)工程a)で得られた細胞にDLDを実施して、白血球を他の細胞および粒子から分離し、白血球を、それらの増殖をサポートし、T細胞活性化因子を含むかまたは補充した培地に移す;
c)DLDを実施して、工程b)の培地から、その表面にキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように組換え操作されたT細胞を分離し、培地に移す;
d)DLDを実施してT細胞を試薬から分離し、増殖培地に移す;
e)細胞を培養して細胞数を増やす;
f)DLDを実施して、増やしたT細胞を患者に投与するための培地に移す。
E195. 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、請求項194に記載の方法。
E196. 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、請求項194に記載の方法。
E197. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項194~196のいずれか一項に記載の方法。
E198. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項194~196のいずれか一項に記載の方法。
E199. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも10日早く完了する、請求項194~196のいずれか一項に記載の方法。
E200. 以下の工程を含む、患者の治療のためのCAR T細胞を調製する方法:
a)アフェレーシスによって患者から細胞を収集すること;
b)工程a)で得られた細胞にDLDを実施して、白血球を他の細胞および粒子から分離し、白血球を、それらの増殖をサポートし、T細胞活性化因子を含むかまたは補充した培地に移す;
c)工程b)の培地からT細胞を、キメラ抗原受容体(CAR)を表面に生成するようにT細胞を遺伝子操作するためのベクターを含む培地に分離する;
d)DLDを実施して、T細胞を試薬から分離し、患者に投与するための培地に移す。
E201. 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、請求項200に記載の方法。
E202. 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、請求項200に記載の方法。
E203. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項200~202のいずれか一項に記載の方法。
E204. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項200~202のいずれか一項に記載の方法。
E205. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも10日早く完了する、請求項200~202のいずれか一項に記載の方法。
E206. 工程b)において、白血球に対する血小板の比が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション(elutriation)を用いて得られる比よりも少なくとも50%低い生成物が得られる、請求項180~205のいずれか一項に記載の方法。
E207. 所望のCAR T表現型を示すT細胞の収量が、フィコール遠心分離によって単離され、DLDに供されていない同一の細胞よりも少なくとも10%高い、請求項180~205のいずれか一項に記載の方法。
E208. 所望のCAR T表現型を示すT細胞の収量が、フィコール遠心分離によって単離され、DLDに供されていない同一の細胞よりも少なくとも20%高い、請求項180~205のいずれか一項に記載の方法。
E209. 患者の治療のために十分な数のT細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法がアフェレーシス開始材料から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも5%短い、請求項180~208のいずれか一項に記載の方法。
E210. 患者の治療のために十分な数のT細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法がアフェレーシス開始材料から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも10%短い、請求項180~209のいずれか一項に記載の方法。
E211. 前記方法によって調製された細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも10%少ない老化を示す、請求項180~209のいずれか一項に記載の方法。
E212. 前記方法によって調製された細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも増大した効力を示す、請求項180~209のいずれか一項に記載の方法。
E213. 請求項180~209のいずれか一項に記載の方法によって調製された治療有効量の細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または症状について患者を治療する方法。
E214. 前記疾患または症状ががんである、請求項213に記載の方法。
E215. 以下の工程を含む、治療的に活性な細胞を製造する方法:
a)前記細胞を含む患者から試料組成物を得る;
b)試料に対してDLDを実施して、治療的に活性な細胞が濃縮された組成物を製造する、ここで、DLDは、以下を含むマイクロ流体デバイスで実施される:
i)試料入口から1つまたは複数の流体出口まで延びる少なくとも1つのチャネルであって、第1の壁および第1の壁の反対側の第2の壁によって境界付けられている、チャネル;
ii)チャネル内の列に配置された障害物の配列、後続の各列の障害物は前の列に対して横方向にシフトされ、前記障害物は、粗流体組成物が装置の入口にアプライされ、流体的にチャネルを通過するときに、組成物中の治療的に活性な細胞は、濃縮生成物が収集される1つまたは複数の収集出口に流れ、ここで治療的に活性な細胞よりも小さい細胞および材料は、収集出口から分離される1つまたは複数の廃棄出口に流れる;
c)任意に、工程b)で得られた濃縮生成物中の治療活性細胞を遺伝子操作する;
d)任意に、治療的に活性な細胞を培養してその数を増やす;
e)治療的に活性な細胞を患者への投与のための医薬組成物に移す。
E216. 治療的に活性な細胞が幹細胞である、請求項215に記載の方法。
E217. 幹細胞が循環中に見出され、試料組成物がアフェレーシスによって調製される、請求項216に記載の方法
E218. 血小板の少なくとも70%が工程b)の濃縮生成物から除去される、請求項217に記載の方法。
E219. 血小板の少なくとも90%が工程b)の濃縮生成物から除去される、請求項217に記載の方法。
E220. すべての単離工程および濃縮工程がDLDを使用して実施される、請求項215~219のいずれか一項に記載の方法。
E221. 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、請求項215~220のいずれか一項に記載の方法。
E222. 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、請求項215~220のいずれか一項に記載の方法。
E223. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも1日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E224. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E225. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E226. 試料組成物から得られる治療的に活性な細胞の収量が、細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順によって得られる場合よりも少なくとも25%高い、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E227. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E228. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E229. 患者の治療のために十分な数の治療的に活性な細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法が試料組成物から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも5%短い、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E230. 患者の治療のために十分な数の治療的に活性な細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法が試料組成物から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも10%短い、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E231. 前記方法によって調製された治療的に活性な細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも10%少ない老化を示す、請求項215~230のいずれか一項に記載の方法。
E232. 前記方法によって調製された治療的に活性な細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用して試料組成物から処理された細胞よりも増大した効力を示す、請求項215~230のいずれか一項に記載の方法。
E233. 請求項215~230のいずれか一項に記載の方法によって調製された治療有効量の治療的に活性な細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または症状について患者を治療する方法。
E234. 前記治療的に活性な細胞が幹細胞であり、前記疾患または症状が遺伝性疾患である、請求項233に記載の方法。
E235. 標的細胞の集団を操作する方法であって、
a)粗液体組成物から標的細胞を単離すること、ここに単離は、細胞のサイズの相違に基づいて粗液体組成物中の他の細胞から標的細胞を分離する1つまたは複数の手段を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離プロセスにより標的細胞豊富な組成物が得られるものであり、
b)工程a)から得られた標的細胞を、所望の表現形を有するように遺伝子操作すること
を含み、
標的細胞が遺伝子操作される前に遠心分離されないか、あるいは溶出処理されない、方法。
E236. 該標的細胞が白血球または幹細胞である、請求項235記載の方法。
E237. 該標的細胞がT細胞である、請求項235記載の方法。
E238. 該粗液体組成物が患者から得られた血液またはアフェレーシス調製物である、請求項235~237のいずれか1項記載の方法。
E239. 標的細胞の単離が、標的細胞に富む組成物がアフェレーシス調製物よりも少なくとも70%少ない血小板の総数を有するような条件下で行われる、請求項238記載の方法。
E240. 標的細胞に富む組成物中の血小板の総数がアフェレーシス調製物よりも少なくとも90%少ない、請求項239記載の方法。
E241. 標的細胞に対する血小板の割合が、成分除去製剤よりも少なくとも50%低い、請求項240記載の方法。
E242. 該標的細胞が、単離後に再簿培養にて拡大されるT細胞である、請求項238記載の方法。
E243. 培養14日後に得られるT細胞の数が、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも2倍多い、請求項242記載の方法。
E244. 培養14日後に得られるT細胞の数が、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも4倍多い、請求項242記載の方法。
E245. 培養中のT細胞の総数に対するメモリーT細胞のパーセンテージが、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも10%高い、請求項244記載の方法。
E246. 培養中のT細胞の総数に対するメモリーT細胞のパーセンテージが、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも20%高い、請求項244記載の方法。
E247. 標的細胞が富化された組成物中の細胞がベクターにて形質転換されて組換え表現形を示す場合、所望の表現形を示す標的細胞の収量が、遠心分離により単離された同じ細胞よりも少なくとも20%高い、請求項235~246のいずれか1項記載の方法。
E248. アフェレーシス試料の収集が完了した時から、マイクロ流体デバイスを用いる分離が行われるまでに1時間以内が経過する、請求項238~247のいずれか1項記載の方法。
E249. 患者からのアフェレーシス試料の取得が完了してから標的細胞の単離が完了するまでの経過時間が4時間以内である、請求項238~247のいずれか1項記載の方法。
E250. 患者からのアフェレーシス試料の取得が完了してから細胞が遺伝子操作されるまでの経過時間が4時間以内である、請求項238~247のいずれか1項記載の方法。
E251. CAR T細胞の調製方法であって、
a)アフェレーシスにより患者から粗液体組成物を得ること、ここに該試料はT細胞を含むものであり、
b)該粗液体組成部物からT細胞を単離すること、ここに該単離は、サイズの相違に基づいてT細胞を粗液体組成物中の血小板および他の細胞から分子する1つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離によりT細胞が豊富化され血小板が減少した組成物が得られるものであり、
c)工程a)で得られた標的細胞を遺伝子操作して、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CARs)を生成させること、ここに遺伝子操作前のいかなる工程においてもT細胞が遠心分離されないか、あるいは溶出処理されず、
d)遺伝子操作されたT細胞の数を増大させること、
e)工程d)で得られた培養細胞を収集すること
を含む方法。
E252. 工程c)において、患者に投与するための医薬組成物中に移されることによりT細胞が収集される、請求項251記載の方法。
E253. 収集前に細胞が凍結されない、請求項251または252記載の方法。
E254. 血小板の少なくとも90%が工程b)で除去される、請求項251~253のいずれか1項記載の方法。
E255. 培養前または培養中に細胞がT細胞活性化因子または担体に曝露される、請求項251~254のいずれか1項記載の方法。
E256. 該活性化剤も該担体も、磁気ビーズにまたは粒子に結合されていまい、請求項255記載の方法。
E257. マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも1日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項251~256のいずれか1項記載の方法。
E258. マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも3日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項251~256のいずれか1項記載の方法。
E259. 工程d)において、培養14日後に得られるCAR T細胞の数が、フィコール遠心分離を用いて得られる数よりも少なくとも2倍多い、請求項251~258のいずれか1項記載の方法。
E260. 工程d)において、培養14日後に得られるCAR T細胞の数が、フィコール遠心分離を用いて得られる数よりも少なくとも4倍多い、請求項251~258のいずれか1項記載の方法。
E261. T細胞およびCAR T細胞が、患者に投与される前に決して凍結されない、請求項251~260のいずれか1項記載の方法。
E262. 患者の治療のためのCAR T細胞を調製する方法であって、
a)アフェレーシスにより患者から粗液体組成物を得ること、ここに該試料はT細胞を含むものであり、
b)該粗液体組成部物からT細胞を単離すること、ここに該単離は、サイズの相違に基づいてT細胞を粗液体組成物中の血小板および他の細胞から分子する1つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離によりT細胞が豊富化され血小板が減少した組成物が得られるものであり、
c)工程a)で得られた標的細胞を遺伝子操作して、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CARs)を生成させること、ここに遺伝子操作前のいかなる工程においてもT細胞が遠心分離されないか、あるいは溶出処理されず、
d)遺伝子操作されたT細胞の数を増大させること、
e)サイズの相違に基づいてT細胞を試薬から分離する1つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上でT細胞を分離すること
を含む方法。
E263. 細胞が、患者への投与のために医薬組成物中に移されるまで凍結されない、請求項262記載の方法。
E264. 細胞がいかなる工程においても凍結されない、請求項262記載の方法。
E265. マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項262~264のいずれか1項記載の方法。
E266. マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも1日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項262~265のいずれか1項記載の方法。
E267. マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも3日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項262~265のいずれか1項記載の方法。
E268. 工程b)において、白血球に対する血小板の割合が、遠心分離または溶出処理を用いて得られる割合よりも少なくとも50%低い生成物組成物が得られる、請求項262~267のいずれか1項記載の方法。
E269. 患者の治療のための十分な数のCAR T細胞を産生時間するのに必要な時間が、フィコール遠心分離により単離された細胞を用いて同じ方法が行われる場合よりも少なくとも5%短い、請求項262~268のいずれか1項記載の方法。
E270. 患者の治療のための十分な数のCAR T細胞を産生時間するのに必要な時間が、アフェレーシス出発材料から細胞を単離するためにフィコール遠心分離を用いて同じ方法が行われる場合よりも少なくとも10%短い、請求項262~269のいずれか1項記載の方法。
E271. 該方法によって調製された細胞が患者に投与されるとき、それらの細胞が、遠心分離または溶出処理を用いてアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも10%少ない老化を示す、請求項262~270のいずれか1項記載の方法。
E272. 請求項235~271のいずれか1項記載の方法によって調製された治療上有効量の細胞を患者に投与することを含む、疾病または症状について患者を治療する方法。
E273. 該疾病または症状ががんである、請求項272記載の方法。
以下の番号付きの段落は、本願の一部である発明の概念を提示する。これらの概念は、クレーム例E1-E234の形式で表される。
E1. 以下の工程を含む、標的細胞の集団を操作する方法:
a)標的細胞を粗流体組成物から単離する工程であって、単離手順が、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含み、前記デバイスが、
i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含む、工程;
b)前記収集出口から得られた標的細胞を、所望の表現型を有するように遺伝子操作する工程。
E2. 前記遺伝子操作する工程が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、遺伝子操作された標的細胞が、それらをインビトロで(in vitro)培養することにより増殖される、請求項1に記載の方法。
E3. 前記所望の表現型を示す標的細胞の収率が、Ficoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていない同一の細胞より少なくとも10%高い、請求項2に記載の方法。
E4. 前記粗流体組成物が、血液、または血液にアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスを実施することにより取得されている組成物である、請求項1に記載の方法。
E5. 前記標的細胞が白血球である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
E6. 前記標的細胞が、B細胞、T細胞、NK細胞、単球、または前駆細胞である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
E7. 前記標的細胞が樹状細胞である、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。
E8. 前記粗流体組成物が患者から取得される、請求項1~7のいずれか一項記載の方法。
E9. 前記粗流体組成物における標的細胞が、形質導入またはトランスフェクションされる前に担体と結合していない、請求項8に記載の方法。
E10. 標的細胞に、DLDを実施する前に、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項8に記載の方法。
E11. 標的細胞に、DLDを実施した後で、かつそれらを形質導入またはトランスフェクションする前かまたは後のいずれかで、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項9に記載の方法。
E12. 前記1つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する親和性物質を表面上に含む、請求項10または11に記載の方法。
E13. 前記物質が、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマーである、請求項12に記載の方法。
E14. 前記担体の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E15. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の50%以下の長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E16. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E17. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の25%以下の長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E18. 担体の1つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E19. 担体の1つの群が、標的細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
E20. 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項10~19のいずれか一項に記載の方法。
E21. 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項10~20のいずれか一項に記載の方法。
E22. 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、標的細胞に初めて担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項10~21のいずれか一項に記載の方法。
E23. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から標的細胞に初めて担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項10~21のいずれか一項に記載の方法。
E24. 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
E25. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
E26. 初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項24または25に記載の方法。
E27. 以下の工程を含む、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を作製する方法:
a)T細胞を含む粗流体組成物を取得する工程;
b)i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記T細胞とは異なるサイズである細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイスを用いて、前記粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施する工程;
c)工程b)において取得された濃縮産物中のT細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を産生するように遺伝子操作する工程。
E28. 前記粗流体組成物が、患者由来の血液から取得されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であり、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ異なるサイズである赤血球、血小板、または他の粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる、請求項27に記載の方法。
E29. 前記遺伝子操作が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、遺伝子操作された標的細胞が、インビトロで前記細胞を成長させることにより、さらに増殖される、請求項27または28に記載の方法。
E30. 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも10%高い、請求項27~29のいずれか一項に記載の方法。
E31. 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも20%高い、請求項30に記載の方法。
E32. 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも50%高い、請求項30に記載の方法。
E33. 前記CARが、a)抗原結合ドメインを含む細胞外領域;b)膜貫通領域;c)細胞内領域を含み、前記CAR T細胞が、トリガーされた時、CAR T細胞の数または活性を低下させる分子スイッチを前記細胞に提供する1つまたは複数の組換え配列を含んでもよい、請求項27~32のいずれか一項に記載の方法。
E34. 前記抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の、一本鎖可変断片(scFv)である、請求項33に記載の方法。
E35. 前記CARが、細胞外領域と膜貫通領域を接続する2~20個のアミノ酸のヒンジ領域を含む、請求項33または34に記載の方法。
E36. 前記膜貫通領域が、CD8またはCD28タンパク質配列を含む、請求項35に記載の方法。
E37. 前記細胞内領域が、CD3ζ、CD137、またはCD28細胞内ドメインに由来したシグナル伝達ドメインを含む、請求項33~36のいずれか一項に記載の方法。
E38. 前記T細胞を含む粗流体組成物が、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患を有する患者から取得される、請求項27~37のいずれか一項に記載の方法。
E39. T細胞を含む粗流体組成物を取得した後、前記流体組成物中のT細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項38に記載の方法。
E40. T細胞に、DLDを実施する前に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項39に記載の方法。
E41. T細胞に、DLDを実施した後で、かつそれらが遺伝子操作される前かまたは後のいずれかで、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項39に記載の方法。
E42. 前記1つまたは複数の担体が、前記T細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項39~41のいずれか一項に記載の方法。
E43. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E44. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の50%以下の長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E45. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E46. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の25%以下の長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E47. 担体の1つの群が、T細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E48. 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
E49. 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項39~48のいずれか一項に記載の方法。
E50. 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項39~49のいずれか一項に記載の方法。
E51. T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記T細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項39~50のいずれか一項に記載の方法。
E52. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項39~50のいずれか一項に記載の方法。
E53. T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項27~50のいずれか一項に記載の方法。
E54. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項27~50のいずれか一項に記載の方法。
E55. 初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項53または54に記載の方法。
E56. CAR T細胞を作製することにおける全工程が、T細胞を含む粗流体組成物が取得される同じ施設で実施され、全工程が、合計4時間以内に完了する、請求項27~55のいずれか一項に記載の方法。
E57. 請求項27~55のいずれか一項に記載の方法により作製されたCAR T細胞。
E58. 癌、自己免疫疾患、または感染性疾患について患者を処置する方法であって、前記患者由来の癌細胞、自己免疫細胞、または感染細胞上の抗原を認識するキメラ抗原受容体を発現するように操作されたCAR T細胞を前記患者に投与することを含み、前記CAR T細胞が、以下の工程を含むプロセスにより作製されている、方法:
a)T細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程;
b)i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記T細胞とは異なるサイズである細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイスを用いて、前記粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施する工程;
c)工程b)において取得された前記T細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子操作する工程;
d)操作されたT細胞の数を、前記細胞をインビトロで成長させることにより増加させる工程;ならびに
e)前記粗流体組成物が取得された患者へ前記操作されたT細胞を投与する工程。
E59. 前記粗流体組成物が、前記患者由来の血液から取得されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であり、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ異なるサイズである赤血球、血小板、または他の粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる、請求項58に記載の方法。
E60. 遺伝子操作が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含む、請求項58または59に記載の方法。
E61. 表面上にキメラ受容体を発現する細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも10%高い、請求項60に記載の方法。
E62. 表面上にキメラ受容体を発現する標的細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも50%高い、請求項60に記載の方法。
E63. 前記CARが、a)抗原結合ドメインを含む細胞外領域;b)膜貫通領域;およびc)細胞内領域を含み、前記CAR T細胞が、トリガーされた時、CAR T細胞の数または活性を低下させる分子スイッチを前記細胞に提供する1つまたは複数の組換え配列を含んでもよい、請求項58~62のいずれか一項に記載の方法。
E64. 前記抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の、一本鎖可変断片(scFv)である、請求項63に記載の方法。
E65. 前記CARが、細胞外領域と膜貫通領域を接続する2~20個のアミノ酸のヒンジ領域を含む、請求項63または64に記載の方法。
E66. 前記膜貫通領域が、CD8またはCD28タンパク質配列を含む、請求項63~65のいずれか一項に記載の方法。
E67. 前記細胞内領域が、CD3ζ、CD137、またはCD28細胞内ドメインに由来したシグナル伝達ドメインを含む、請求項63~66のいずれか一項に記載の方法。
E68. 前記患者が白血病を有する、請求項58~67のいずれか一項に記載の方法。
E69. 前記白血病が急性リンパ芽球性白血病である、請求項68に記載の方法。
E70. 前記CARが抗原CD19またはCD20を認識する、請求項68または69に記載の方法。
E71. 前記患者が固形腫瘍を有する、請求項58~67のいずれか一項に記載の方法。
E72. 前記CARが、CD22;RORI;メゾテリン;CD33/IL3Ra;c-Met;PSMA;糖脂質F77;EGFRvIII;GD-2;NY-ESO-l TCR;MAGE A3 TCR;およびそれらの組合せからなる群から選択される抗原を認識する、請求項71に記載の方法。
E73. T細胞を含む粗流体組成物を取得した後に、前記流体中のT細胞に、DLD分離を促進するように、担体を結合させる、請求項58~72のいずれか一項に記載の方法。
E74. DLDを実施する前に、T細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項73に記載の方法。
E75. DLDを実施した後で、かつT細胞が、キメラ受容体を発現するように遺伝子操作される前かまたは後のいずれかで、T細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項73に記載の方法。
E76. 前記1つまたは複数の担体が、前記T細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項73~75のいずれか一項に記載の方法。
E77. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
E78. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の50%以下の長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
E79. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
E80. 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の25%以下の長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
E81. 担体の1つの群が、T細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項80に記載の方法。
E82. 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項73~81のいずれか一項に記載の方法。
E83. 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項73~82のいずれか一項に記載の方法。
E84. 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項73~83のいずれか一項に記載の方法。
E85. T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記T細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
E86. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
E87. T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
E88. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
E89. 初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項87または88に記載の方法。
E90. T細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも1日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
E91. 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも3日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
E92. a)標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程;
b)マイクロ流体デバイスを用いて、前記標的細胞を含む粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施して、標的細胞が濃縮された組成物を得る工程;
を含み、DLDの前かまたは後のいずれかに、標的細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させ、前記標的細胞を含む粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、5時間より長く経過していない、患者から標的細胞を収集する方法。
E93. 前記1つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項92に記載の方法。
E94. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項92または93に記載の方法。
E95. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の50%以下の長さである、請求項92または93に記載の方法。
E96. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項92または93に記載の方法。
E97. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の25%以下の長さである、請求項92または93に記載の方法。
E98. 担体の1つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項92または93に記載の方法。
E99. 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項92または93に記載の方法。
E100. 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項92~99のいずれか一項に記載の方法。
E101. 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項92~100のいずれか一項に記載の方法。
E102. 標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92~101のいずれか一項に記載の方法。
E103. 標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項92~101のいずれか一項に記載の方法。
E104. 前記標的細胞を含む粗流体組成物が、患者由来の血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施することにより、取得される、請求項92~103のいずれか一項に記載の方法。
E105. DLDにより標的細胞が濃縮された組成物中の標的細胞が、ウイルスベクターを用いて形質導入される、請求項92~104のいずれか一項に記載の方法。
E106. 標的細胞が、電気的に、化学的に、またはナノ粒子を用いて、トランスフェクションされる、請求項105に記載の方法。
E107. 前記マイクロ流体デバイスが
a)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
b)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記標的細胞を含む粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含む、請求項92~106のいずれか一項に記載の方法。
E108. 前記標的細胞がT細胞である、請求項92~107のいずれか一項に記載の方法。
E109. 前記T細胞が、ナチュラルキラーT細胞、セントラルメモリーT細胞、ヘルパーT細胞、および制御性T細胞からなる群から選択される、請求項108に記載の方法。
E110. 前記標的細胞が幹細胞である、請求項92~107のいずれか一項に記載の方法。
E111. 前記標的細胞が、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、または顆粒球である、請求項92~107のいずれか一項に記載の方法。
E112. 前記標的細胞を含む粗流体組成物が、抗凝固剤として働き、または血小板の活性化を防ぐ1つまたは複数の添加物を含む、請求項92~111のいずれか一項に記載の方法。
E113. 前記添加物が、チクロピジン、イノシン、プロトカテキュ酸、アセチルサリチル酸、およびチロフィバンからなる群から選択される、請求項112に記載の方法。
E114. 工程a)およびb)がどちらも、標的細胞を含む粗流体組成物が患者から取得される現地で行われる、請求項92~113のいずれか一項に記載の方法。
E115. 標的細胞を含む粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92~114のいずれか一項に記載の方法。
E116. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92~114のいずれか一項に記載の方法。
E117. c)細胞を遺伝子操作し、および/もしくは数を増加させる工程;ならびに/または
d)前記標的細胞が取得された同じ患者を、収集された標的細胞で処置する工程
をさらに含む、請求項92~116のいずれか一項に記載の方法。
E118. 工程e)後に、前記標的細胞が凍結保存される、請求項117に記載の方法。
E119. 工程c)において培養される標的細胞が、アクチベーターの存在下で培養されるT細胞である、請求項117または118に記載の方法。
E120. 前記アクチベーターが担体に結合している、請求項119に記載の方法。
E121. 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも1日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
E122. 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも3日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
E123. 請求項92~122のいずれか一項に記載の方法により作製された標的細胞。
E124. 請求項123に記載の標的細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または状態について患者を処置する方法。
E125. 以下の工程を含む、接着細胞を複数の他の細胞から分離する方法:
a)複数の他の細胞および接着細胞を含む粗流体組成物を、DLD分離を促進するように結合する1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、前記接着細胞が、接触により、または接触後に担体と少なくとも部分的に会合して、担体会合化接着細胞複合体を生成し、前記担体会合化接着細胞複合体が、前記複数の他の細胞における細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化接着細胞複合体のサイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;
b)前記粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに
c)前記担体会合化接着細胞複合体を含む前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化接着細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記担体会合化接着細胞複合体を前記複数の他の細胞から分離する、工程;
d)分離された担体会合化接着細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。
E126. 前記接着細胞が、前記接着細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
E127. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、2時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
E128. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、1時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
E129. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞または前記担体接着細胞複合体が初めて前記デバイスから収集されるまで、4時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
E130. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞または前記担体接着細胞複合体が初めて前記デバイスから収集されるまで、4時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
E131. 前記担体が、前記接着細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項125~130のいずれか一項に記載の方法。
E132. 前記担体の直径が、前記接着細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
E133. 前記担体の全部の直径が、前記接着細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
E134. 前記担体の全部の直径が、前記接着細胞の直径の少なくとも10倍の長さである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
E135. 前記担体の全部の直径が、10~600μmである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
E136. 前記接着細胞が、MRC-5細胞;HeLa細胞;Vero細胞;NIH 3T3細胞;L929細胞;Sf21細胞;Sf9細胞;A549細胞;A9細胞;AtT-20細胞;BALB/3T3細胞;BHK-21細胞;BHL-100細胞;BT細胞;Caco-2細胞;Chang細胞;Clone 9細胞;Clone M-3細胞;COS-1細胞;COS-3細胞;COS-7細胞;CRFK細胞;CV-1細胞;D-17細胞;Daudi細胞;GH1細胞;GH3細胞;HaK細胞;HCT-15細胞;HL-60細胞;HT-1080細胞;HEK細胞、HT-29細胞;HUVEC細胞;I-10細胞;IM-9細胞;JEG-2細胞;Jensen細胞;Jurkat細胞;K-562細胞;KB細胞;KG-1細胞;L2細胞;LLC-WRC 256細胞;McCoy細胞;MCF7細胞;WI-38細胞;WISH細胞;XC細胞;Y-1細胞;CHO細胞;Raw 264.7細胞;HEP G2細胞;BAE-1細胞;SH-SY5Y細胞、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項125~135のいずれか一項に記載の方法。
E137. 前記接着細胞が幹細胞である、請求項125~135のいずれか一項に記載の方法。
E138. 以下の工程を含む、活性化細胞を複数の他の細胞から分離する方法:
a)活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を、1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、少なくとも1つの担体が細胞アクチベーターを含み、前記細胞アクチベーターが、接触により、または接触後に、前記細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞と少なくとも部分的に会合して、担体会合化細胞複合体を生成し、前記細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞との前記細胞アクチベーターの会合が、前記活性化の能力がある細胞を少なくとも部分的に活性化し、前記担体会合化細胞複合体が、前記複数の他の細胞における細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化細胞複合体のサイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;
b)前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに
c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記活性化細胞を前記複数の他の細胞から分離する、工程;
d)分離された担体会合化細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。
E139. 前記活性化の能力がある細胞が、T細胞、B細胞、制御性T細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞、β細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、DE3溶原化細胞、酵母細胞、植物細胞、および幹細胞からなる群から選択される、請求項0に記載の方法。
E140. 細胞アクチベーターがタンパク質である、請求項138または139に記載の方法。
E141. 前記タンパク質が抗体である、請求項140に記載の方法。
E142. 前記タンパク質が、CD3、CD28、抗原、ヘルパーT細胞、受容体、サイトカイン、糖タンパク質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項140に記載の方法。
E143. 前記細胞アクチベーターが、インスリン、IPTG、ラクトース、アロラクトース、脂質、グリコシド、テルペン、ステロイド、アルカロイド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項138に記載の方法。
E144. 前記活性化の能力がある細胞が、前記活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
E145. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
E146. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、2時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
E147. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、工程c)が完了するまで、4時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
E148. 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、工程c)が完了するまで、3時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
E149. 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞と少なくとも同じ長さである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
E150. 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
E151. 前記担体の全部の直径が、138~148の直径の少なくとも10倍の長さである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
E152. 前記担体の直径が、10~600μmである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
E153. 以下の工程を含む、細胞から分泌性産物を連続的に精製する方法:
a)細胞を含む流体組成物を取得する工程であって、前記細胞が、前記流体組成物中に懸濁しており、前記細胞が分泌性産物を前記懸濁液へ分泌し、前記細胞が前記分泌性産物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、前記細胞の既定サイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが、前記臨界サイズ未満である、工程;
b)前記細胞を含む流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;
b)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記細胞が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記分泌性産物が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記分泌性産物を前記細胞から分離する、工程;
c)前記分泌性産物を収集する工程であって、それにより、実質的に純粋である前記分泌性産物の試料を生じる、工程;
d)分離された細胞を含む回収された流体組成物を収集する工程;ならびに
e)分離された細胞を含む回収された流体組成物を、前記デバイスに再アプライし、工程(a)~(e)を繰り返す工程であって、それにより、分泌性産物を細胞から連続的に精製する、工程。
E154. 前記分泌性産物が、タンパク質、抗体、バイオ燃料、ポリマー、小分子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項153に記載の方法。
E155. 前記細胞が、細菌細胞、藻類細胞、哺乳類細胞、および腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項153に記載の方法。
E156. 遠心分離または水簸の非存在下で、試料上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含む、アフェレーシス試料中の血小板と白血球の比率を減少させる方法であって、産物が、血小板と白血球の比率がDLDの代わりに遠心分離または水簸を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも20%低くで得られる、方法。
E157. 産物が、血小板と白血球の比率が密度勾配遠心分離または向流遠心分離を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも20%低くで得られる、請求項156に記載の方法。
E158. 産物が、血小板と白血球の比率が水簸を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも20%低くで得られる、請求項156に記載の方法。
E159. 産物が、血小板と白血球の比率がDLDの代わりに遠心分離または水簸を使用して得られる比率よりも少なくとも50%低くで得られる、請求項156に記載の方法。
E160. DLDの前に、アフェレーシス試料に対して実施される分離工程がない、請求項156-159のいずれか一項に記載の方法。
E161. DLDが、血小板のサイズを変えるインターカレーションを含まず、血小板凝集を促進しないバッファーにおいて実施される、請求項156-160のいずれか一項に記載の方法。
E162. DLDが、デキストランまたは他の高電荷ポリマーを含まないバッファーにおいて実施される、請求項156-159のいずれか一項に記載の方法。
E163. 産物中の血小板の総数が、アフェレーシス試料中よりも少なくとも70%低い、請求項156-162のいずれか一項に記載の方法。
E164. 産物中の血小板の総数が、アフェレーシス試料中よりも少なくとも90%低い、請求項156-163のいずれか一項に記載の方法。
E165. 試料上でDLD、次にアフィニティー分離工程およびアクチベーターの存在下で培養することによるT細胞の拡張を実施することを含む、アフェレーシス試料からT細胞を精製するための方法であって、得られるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも2倍である、方法。
E166. アフィニティー分離工程が、CD3に結合する抗体を含む磁気ビーズまたは粒子の使用を含む、請求項165に記載の方法。
E167. 培養14日後に得られるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも2倍である、請求項165に記載の方法。
E168. 培養14日後に得られるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも4倍である、請求項165に記載の方法。
E169. DLD産物中の細胞が組換え表現型を発現するようにベクターで形質転換されているとき、所望の表現型を示す細胞の収量は、Ficoll遠心分離により単離され、DLDに付されない同一の細胞よりも少なくとも10%高い、請求項156-168のいずれか一項に記載の方法。
E170. DLD産物中の細胞が組換え表現型を発現するようにベクターで形質転換されているとき、所望の表現型を示すT細胞の収量は、Ficoll遠心分離により単離され、DLDに付されない同一の細胞よりも少なくとも20%高い、請求項156-169のいずれか一項に記載の方法。
E171. T細胞の総数に対するDLD産物中のメモリーT細胞の割合が、DLDの代わりにFicoll遠心分離で同じ手順を使用して産生される割合よりも少なくとも10%高い、請求項163-165のいずれか一項に記載の方法。
E172. 方法が、CAR T細胞療法のためのT細胞を産生するために使用され、患者を処置するために十分な数の細胞を産生するために必要な時間がFicoll遠心分離の代わりにDLDを使用して少なくとも20%減少される、請求項156-171のいずれか一項に記載の方法。
E173. CAR T細胞を産生するためのプロセスが、細胞が凍結される工程を含まない、請求項172に記載の方法。
E174. T細胞の処理が、アフェレーシスが実施されるのと同じ部位で実施される、請求項172または請求項173のいずれかに記載の方法。
E175. T細胞が、アフェレーシスが実施されるのと同じ部位で遺伝的に形質転換される、請求項172-174のいずれか一項に記載の方法。
E176. 1時間未満が、アフェレーシス試料収集が完了される時間からDLDが実施される時間までで経過する、請求項156-169のいずれか一項に記載の方法。
E177. 遠心分離または水簸の非存在下で、試料上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含む、アフェレーシス試料中の白血球に対する血小板の比率を減少させる方法であって、産物が、産物中の血小板の総数がアフェレーシス試料中よりも少なくとも90%低くで得られる、方法。
E178. DLDが、血小板のサイズを変えるインターカレーションを含まず、血小板凝集を促進しないバッファーにおいて実施される、請求項177に記載の方法。
E179. DLDが、デキストランまたは他の高電荷ポリマーを含まないバッファーにおいて実施される、請求項177に記載の方法。
E180. 以下の工程を含む、CAR T細胞を操作する方法:
a)アフェレーシスにより患者から試料組成物を取得する工程であって、前記試料組成物がT細胞を含む、工程;
b)存在する血小板の総数を少なくとも70%減少させるように試料組成物上でDLDを実施する工程であって、DLDは、
i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、組成物中のT細胞が、濃縮産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、血小板およびT細胞より小さい他の物質が、収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイス上で実施される、工程;
c)工程b)において取得された濃縮産物中のT細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を産生するように遺伝子操作する工程;
d)それらの数を拡張するようにT細胞を培養する工程;
e)患者への投与のための医薬組成物にT細胞を移す工程。
E181. 血小板の少なくとも90%が工程b)において除去される、請求項180に記載の方法。
E182. 全ての単離工程および濃縮工程がDLDを使用して実施される、請求項180または請求項181のいずれかに記載の方法。
E183. 培養前または培養中に、細胞がT細胞アクチベーターに曝露される、請求項180-182のいずれか一項に記載の方法。
E184. 工程b)中および工程c)の前に、細胞が、T細胞アクチベーターが存在または添加されている培地に移される、請求項180-183のいずれか一項に記載の方法。
E185. アクチベーターを含む培地をDLDにより処理し、アクチベーターを細胞から分離し、細胞が、細胞を組み換え的に操作するためのベクターが存在または添加されている培地に移される、請求項184に記載の方法。
E186. 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで細胞が凍結されない、請求項180-185のいずれか一項に記載の方法。
E187. 細胞があらゆる工程で凍結されない、請求項180-185のいずれか一項に記載の方法。
E188. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも1日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
E189. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
E190. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
E191. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも10日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
E192. 工程d)において、培養14日後に取得されるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して行われる同じ手順によって産生される数よりも少なくとも2倍高い、請求項180-191のいずれか一項に記載の方法。
E193. 工程d)において、培養14日後に取得されるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して行われる同じ手順によって産生される数よりも少なくとも4倍高い、請求項180-191のいずれか一項に記載の方法。
E194. 以下の工程を含む、CAR T細胞を調製する方法:
a)アフェレーシスにより患者から細胞を収集する;
b)工程a)で得られた細胞にDLDを実施して、白血球を他の細胞および粒子から分離し、白血球を、それらの増殖をサポートし、T細胞活性化因子を含むかまたは補充した培地に移す;
c)DLDを実施して、工程b)の培地から、その表面にキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように組換え操作されたT細胞を分離し、培地に移す;
d)DLDを実施してT細胞を試薬から分離し、増殖培地に移す;
e)細胞を培養して細胞数を増やす;
f)DLDを実施して、増やしたT細胞を患者に投与するための培地に移す。
E195. 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、請求項194に記載の方法。
E196. 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、請求項194に記載の方法。
E197. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項194~196のいずれか一項に記載の方法。
E198. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項194~196のいずれか一項に記載の方法。
E199. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも10日早く完了する、請求項194~196のいずれか一項に記載の方法。
E200. 以下の工程を含む、患者の治療のためのCAR T細胞を調製する方法:
a)アフェレーシスによって患者から細胞を収集すること;
b)工程a)で得られた細胞にDLDを実施して、白血球を他の細胞および粒子から分離し、白血球を、それらの増殖をサポートし、T細胞活性化因子を含むかまたは補充した培地に移す;
c)工程b)の培地からT細胞を、キメラ抗原受容体(CAR)を表面に生成するようにT細胞を遺伝子操作するためのベクターを含む培地に分離する;
d)DLDを実施して、T細胞を試薬から分離し、患者に投与するための培地に移す。
E201. 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、請求項200に記載の方法。
E202. 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、請求項200に記載の方法。
E203. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項200~202のいずれか一項に記載の方法。
E204. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項200~202のいずれか一項に記載の方法。
E205. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも10日早く完了する、請求項200~202のいずれか一項に記載の方法。
E206. 工程b)において、白血球に対する血小板の比が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション(elutriation)を用いて得られる比よりも少なくとも50%低い生成物が得られる、請求項180~205のいずれか一項に記載の方法。
E207. 所望のCAR T表現型を示すT細胞の収量が、フィコール遠心分離によって単離され、DLDに供されていない同一の細胞よりも少なくとも10%高い、請求項180~205のいずれか一項に記載の方法。
E208. 所望のCAR T表現型を示すT細胞の収量が、フィコール遠心分離によって単離され、DLDに供されていない同一の細胞よりも少なくとも20%高い、請求項180~205のいずれか一項に記載の方法。
E209. 患者の治療のために十分な数のT細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法がアフェレーシス開始材料から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも5%短い、請求項180~208のいずれか一項に記載の方法。
E210. 患者の治療のために十分な数のT細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法がアフェレーシス開始材料から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも10%短い、請求項180~209のいずれか一項に記載の方法。
E211. 前記方法によって調製された細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも10%少ない老化を示す、請求項180~209のいずれか一項に記載の方法。
E212. 前記方法によって調製された細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも増大した効力を示す、請求項180~209のいずれか一項に記載の方法。
E213. 請求項180~209のいずれか一項に記載の方法によって調製された治療有効量の細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または症状について患者を治療する方法。
E214. 前記疾患または症状ががんである、請求項213に記載の方法。
E215. 以下の工程を含む、治療的に活性な細胞を製造する方法:
a)前記細胞を含む患者から試料組成物を得る;
b)試料に対してDLDを実施して、治療的に活性な細胞が濃縮された組成物を製造する、ここで、DLDは、以下を含むマイクロ流体デバイスで実施される:
i)試料入口から1つまたは複数の流体出口まで延びる少なくとも1つのチャネルであって、第1の壁および第1の壁の反対側の第2の壁によって境界付けられている、チャネル;
ii)チャネル内の列に配置された障害物の配列、後続の各列の障害物は前の列に対して横方向にシフトされ、前記障害物は、粗流体組成物が装置の入口にアプライされ、流体的にチャネルを通過するときに、組成物中の治療的に活性な細胞は、濃縮生成物が収集される1つまたは複数の収集出口に流れ、ここで治療的に活性な細胞よりも小さい細胞および材料は、収集出口から分離される1つまたは複数の廃棄出口に流れる;
c)任意に、工程b)で得られた濃縮生成物中の治療活性細胞を遺伝子操作する;
d)任意に、治療的に活性な細胞を培養してその数を増やす;
e)治療的に活性な細胞を患者への投与のための医薬組成物に移す。
E216. 治療的に活性な細胞が幹細胞である、請求項215に記載の方法。
E217. 幹細胞が循環中に見出され、試料組成物がアフェレーシスによって調製される、請求項216に記載の方法
E218. 血小板の少なくとも70%が工程b)の濃縮生成物から除去される、請求項217に記載の方法。
E219. 血小板の少なくとも90%が工程b)の濃縮生成物から除去される、請求項217に記載の方法。
E220. すべての単離工程および濃縮工程がDLDを使用して実施される、請求項215~219のいずれか一項に記載の方法。
E221. 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、請求項215~220のいずれか一項に記載の方法。
E222. 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、請求項215~220のいずれか一項に記載の方法。
E223. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも1日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E224. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E225. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E226. 試料組成物から得られる治療的に活性な細胞の収量が、細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順によって得られる場合よりも少なくとも25%高い、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E227. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E228. 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E229. 患者の治療のために十分な数の治療的に活性な細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法が試料組成物から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも5%短い、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E230. 患者の治療のために十分な数の治療的に活性な細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法が試料組成物から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも10%短い、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
E231. 前記方法によって調製された治療的に活性な細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも10%少ない老化を示す、請求項215~230のいずれか一項に記載の方法。
E232. 前記方法によって調製された治療的に活性な細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用して試料組成物から処理された細胞よりも増大した効力を示す、請求項215~230のいずれか一項に記載の方法。
E233. 請求項215~230のいずれか一項に記載の方法によって調製された治療有効量の治療的に活性な細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または症状について患者を治療する方法。
E234. 前記治療的に活性な細胞が幹細胞であり、前記疾患または症状が遺伝性疾患である、請求項233に記載の方法。
E235. 標的細胞の集団を操作する方法であって、
a)粗液体組成物から標的細胞を単離すること、ここに単離は、細胞のサイズの相違に基づいて粗液体組成物中の他の細胞から標的細胞を分離する1つまたは複数の手段を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離プロセスにより標的細胞豊富な組成物が得られるものであり、
b)工程a)から得られた標的細胞を、所望の表現形を有するように遺伝子操作すること
を含み、
標的細胞が遺伝子操作される前に遠心分離されないか、あるいは溶出処理されない、方法。
E236. 該標的細胞が白血球または幹細胞である、請求項235記載の方法。
E237. 該標的細胞がT細胞である、請求項235記載の方法。
E238. 該粗液体組成物が患者から得られた血液またはアフェレーシス調製物である、請求項235~237のいずれか1項記載の方法。
E239. 標的細胞の単離が、標的細胞に富む組成物がアフェレーシス調製物よりも少なくとも70%少ない血小板の総数を有するような条件下で行われる、請求項238記載の方法。
E240. 標的細胞に富む組成物中の血小板の総数がアフェレーシス調製物よりも少なくとも90%少ない、請求項239記載の方法。
E241. 標的細胞に対する血小板の割合が、成分除去製剤よりも少なくとも50%低い、請求項240記載の方法。
E242. 該標的細胞が、単離後に再簿培養にて拡大されるT細胞である、請求項238記載の方法。
E243. 培養14日後に得られるT細胞の数が、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも2倍多い、請求項242記載の方法。
E244. 培養14日後に得られるT細胞の数が、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも4倍多い、請求項242記載の方法。
E245. 培養中のT細胞の総数に対するメモリーT細胞のパーセンテージが、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも10%高い、請求項244記載の方法。
E246. 培養中のT細胞の総数に対するメモリーT細胞のパーセンテージが、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも20%高い、請求項244記載の方法。
E247. 標的細胞が富化された組成物中の細胞がベクターにて形質転換されて組換え表現形を示す場合、所望の表現形を示す標的細胞の収量が、遠心分離により単離された同じ細胞よりも少なくとも20%高い、請求項235~246のいずれか1項記載の方法。
E248. アフェレーシス試料の収集が完了した時から、マイクロ流体デバイスを用いる分離が行われるまでに1時間以内が経過する、請求項238~247のいずれか1項記載の方法。
E249. 患者からのアフェレーシス試料の取得が完了してから標的細胞の単離が完了するまでの経過時間が4時間以内である、請求項238~247のいずれか1項記載の方法。
E250. 患者からのアフェレーシス試料の取得が完了してから細胞が遺伝子操作されるまでの経過時間が4時間以内である、請求項238~247のいずれか1項記載の方法。
E251. CAR T細胞の調製方法であって、
a)アフェレーシスにより患者から粗液体組成物を得ること、ここに該試料はT細胞を含むものであり、
b)該粗液体組成部物からT細胞を単離すること、ここに該単離は、サイズの相違に基づいてT細胞を粗液体組成物中の血小板および他の細胞から分子する1つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離によりT細胞が豊富化され血小板が減少した組成物が得られるものであり、
c)工程a)で得られた標的細胞を遺伝子操作して、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CARs)を生成させること、ここに遺伝子操作前のいかなる工程においてもT細胞が遠心分離されないか、あるいは溶出処理されず、
d)遺伝子操作されたT細胞の数を増大させること、
e)工程d)で得られた培養細胞を収集すること
を含む方法。
E252. 工程c)において、患者に投与するための医薬組成物中に移されることによりT細胞が収集される、請求項251記載の方法。
E253. 収集前に細胞が凍結されない、請求項251または252記載の方法。
E254. 血小板の少なくとも90%が工程b)で除去される、請求項251~253のいずれか1項記載の方法。
E255. 培養前または培養中に細胞がT細胞活性化因子または担体に曝露される、請求項251~254のいずれか1項記載の方法。
E256. 該活性化剤も該担体も、磁気ビーズにまたは粒子に結合されていまい、請求項255記載の方法。
E257. マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも1日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項251~256のいずれか1項記載の方法。
E258. マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも3日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項251~256のいずれか1項記載の方法。
E259. 工程d)において、培養14日後に得られるCAR T細胞の数が、フィコール遠心分離を用いて得られる数よりも少なくとも2倍多い、請求項251~258のいずれか1項記載の方法。
E260. 工程d)において、培養14日後に得られるCAR T細胞の数が、フィコール遠心分離を用いて得られる数よりも少なくとも4倍多い、請求項251~258のいずれか1項記載の方法。
E261. T細胞およびCAR T細胞が、患者に投与される前に決して凍結されない、請求項251~260のいずれか1項記載の方法。
E262. 患者の治療のためのCAR T細胞を調製する方法であって、
a)アフェレーシスにより患者から粗液体組成物を得ること、ここに該試料はT細胞を含むものであり、
b)該粗液体組成部物からT細胞を単離すること、ここに該単離は、サイズの相違に基づいてT細胞を粗液体組成物中の血小板および他の細胞から分子する1つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離によりT細胞が豊富化され血小板が減少した組成物が得られるものであり、
c)工程a)で得られた標的細胞を遺伝子操作して、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CARs)を生成させること、ここに遺伝子操作前のいかなる工程においてもT細胞が遠心分離されないか、あるいは溶出処理されず、
d)遺伝子操作されたT細胞の数を増大させること、
e)サイズの相違に基づいてT細胞を試薬から分離する1つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上でT細胞を分離すること
を含む方法。
E263. 細胞が、患者への投与のために医薬組成物中に移されるまで凍結されない、請求項262記載の方法。
E264. 細胞がいかなる工程においても凍結されない、請求項262記載の方法。
E265. マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項262~264のいずれか1項記載の方法。
E266. マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも1日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項262~265のいずれか1項記載の方法。
E267. マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも3日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項262~265のいずれか1項記載の方法。
E268. 工程b)において、白血球に対する血小板の割合が、遠心分離または溶出処理を用いて得られる割合よりも少なくとも50%低い生成物組成物が得られる、請求項262~267のいずれか1項記載の方法。
E269. 患者の治療のための十分な数のCAR T細胞を産生時間するのに必要な時間が、フィコール遠心分離により単離された細胞を用いて同じ方法が行われる場合よりも少なくとも5%短い、請求項262~268のいずれか1項記載の方法。
E270. 患者の治療のための十分な数のCAR T細胞を産生時間するのに必要な時間が、アフェレーシス出発材料から細胞を単離するためにフィコール遠心分離を用いて同じ方法が行われる場合よりも少なくとも10%短い、請求項262~269のいずれか1項記載の方法。
E271. 該方法によって調製された細胞が患者に投与されるとき、それらの細胞が、遠心分離または溶出処理を用いてアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも10%少ない老化を示す、請求項262~270のいずれか1項記載の方法。
E272. 請求項235~271のいずれか1項記載の方法によって調製された治療上有効量の細胞を患者に投与することを含む、疾病または症状について患者を治療する方法。
E273. 該疾病または症状ががんである、請求項272記載の方法。
以下の実施例は、本発明を例証することを意図されるが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例1
この研究は、CAR-T細胞製造に欠かせないアフェレーシス試料に焦点を合わせている。ドナーの健康、疾患状態、および過去の化学療法に関連した固有の可変性は全て、白血球アフェレーシス収集の品質、およびおそらく、製造プロトコールにおける様々な工程の効率に影響を及ぼす(Levine, et al., Mol. Therapy: Meth. Clin. Dev. 4:92-101 (2017))。自動化DLD白血球濃縮をストレス試験するために、残留白血球(LRSチャンバー画分)を、血小板アフェレーシス献血から収集し、その血小板アフェレーシスは、一般的に、正常に近い赤血球カウント数、10~20倍のリンパ球および単球を有し、顆粒球をほとんど有しない。それらはまた、正常な末梢血と比較して、約10倍の血小板カウント数を有する。
この研究は、CAR-T細胞製造に欠かせないアフェレーシス試料に焦点を合わせている。ドナーの健康、疾患状態、および過去の化学療法に関連した固有の可変性は全て、白血球アフェレーシス収集の品質、およびおそらく、製造プロトコールにおける様々な工程の効率に影響を及ぼす(Levine, et al., Mol. Therapy: Meth. Clin. Dev. 4:92-101 (2017))。自動化DLD白血球濃縮をストレス試験するために、残留白血球(LRSチャンバー画分)を、血小板アフェレーシス献血から収集し、その血小板アフェレーシスは、一般的に、正常に近い赤血球カウント数、10~20倍のリンパ球および単球を有し、顆粒球をほとんど有しない。それらはまた、正常な末梢血と比較して、約10倍の血小板カウント数を有する。
12個のドナーを処理し、DLD対Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離(「ゴールドスタンダード」)による主要な血液細胞型および処理能力について、収率を比較した。これらのドナーのうちの4個をまた、「T細胞増殖能力」について15日間にわたって評価した。各ドナー試料を、DLDとFicollの両方により処理し、T細胞増殖能力について研究された4個のドナーについて、試料を、直接的磁気抽出を用いて処理した。
材料および方法
マイクロチップデザインおよび製作:この研究に用いられるDLDアレイは、単一ゾーンの鏡映型菱形ポストのデザインからなった(D'Silva, J., 「Throughout Microfluidic Capture of Rare Cells from Large Volumes of Blood」; A Dissertation Presented to the Faculty of Princeton University in Candidacy for the Degree of Doctor of Philosophy (2016)参照)。14レーンのDLDデバイスを生じる、チップあたり14個の並列アレイがあった(図1D)。デバイスは、ポスト間の16μmの間隙、および1/42傾斜を有するようにデザインされ、結果として、約4μmの臨界直径を生じた。プラスチックDLDデバイスを、ソフトエンボス加工と呼ばれるプロセスを用いて作製した。まず、プラスチックDLDマイクロチップについてのシリコン(Si)マスターを、標準フォトリソグラフィの深掘り反応性イオンエッチング技術を用いて作製した(Princeton University、PRISM)。その後、シリコンマスター上のフィーチャーを、Siフィーチャーの上にエラストマーを流し込み、硬化させることにより、ソフト弾性鋳型(Edge Embossing、Medford、MA)へ転写した。エラストマーを剥がして、シリコンマスターの再利用可能なネガティブインプリントが生じた。プラスチックブランクシートをエラストマー鋳型の間に置き、その後、圧力と温度の組合せを用いて、そのプラスチックを、ソフトエラストマーネガティブ鋳型のフィーチャー(ウェル)へ押し出し成形して、オリジナルのシリコンマスターのポジティブフィーチャーおよび深さを複製した。その後、そのソフトツールを、プラスチックデバイスから剥がして、マイクロポストのアレイの周りのフローチャネルおよび溝のパターンを有する、深さ約100μmまで表面エンボス加工されたプラスチックの平らな一片を生成した(図1D、挿入図)。マイクロチップの注入口末端および出口末端への流体アクセスのためにポートを作製した。超音波処理によるクリーニング後、デバイスを、感熱性で親水性の接着材(ARFlow Adhesives Research、Glen Rock、PA)で覆った。チップ全体は40×75mm、厚さ1mmであり、クレジットカードのサイズより小さかった。
マイクロチップデザインおよび製作:この研究に用いられるDLDアレイは、単一ゾーンの鏡映型菱形ポストのデザインからなった(D'Silva, J., 「Throughout Microfluidic Capture of Rare Cells from Large Volumes of Blood」; A Dissertation Presented to the Faculty of Princeton University in Candidacy for the Degree of Doctor of Philosophy (2016)参照)。14レーンのDLDデバイスを生じる、チップあたり14個の並列アレイがあった(図1D)。デバイスは、ポスト間の16μmの間隙、および1/42傾斜を有するようにデザインされ、結果として、約4μmの臨界直径を生じた。プラスチックDLDデバイスを、ソフトエンボス加工と呼ばれるプロセスを用いて作製した。まず、プラスチックDLDマイクロチップについてのシリコン(Si)マスターを、標準フォトリソグラフィの深掘り反応性イオンエッチング技術を用いて作製した(Princeton University、PRISM)。その後、シリコンマスター上のフィーチャーを、Siフィーチャーの上にエラストマーを流し込み、硬化させることにより、ソフト弾性鋳型(Edge Embossing、Medford、MA)へ転写した。エラストマーを剥がして、シリコンマスターの再利用可能なネガティブインプリントが生じた。プラスチックブランクシートをエラストマー鋳型の間に置き、その後、圧力と温度の組合せを用いて、そのプラスチックを、ソフトエラストマーネガティブ鋳型のフィーチャー(ウェル)へ押し出し成形して、オリジナルのシリコンマスターのポジティブフィーチャーおよび深さを複製した。その後、そのソフトツールを、プラスチックデバイスから剥がして、マイクロポストのアレイの周りのフローチャネルおよび溝のパターンを有する、深さ約100μmまで表面エンボス加工されたプラスチックの平らな一片を生成した(図1D、挿入図)。マイクロチップの注入口末端および出口末端への流体アクセスのためにポートを作製した。超音波処理によるクリーニング後、デバイスを、感熱性で親水性の接着材(ARFlow Adhesives Research、Glen Rock、PA)で覆った。チップ全体は40×75mm、厚さ1mmであり、クレジットカードのサイズより小さかった。
DLDマイクロチップ動作:マイクロ流体デバイスを、流体接続部を有する、光学的に透明で耐圧性のマニフォールドの内側に組み立てた。流体を、一定空気圧制御装置(MFCS-EZ、Fluigent、Lowell、MA)を用いて、DLDマイクロチップへ流した。1つはバッファーについて、1つは試料について、2つの異なる圧力制御を用いた。バッファーラインについてのフロー経路は、バッファーリザーバ(60mLシリンジ)、インラインデガッサー(Biotech DEGASi、Minneapolis、MN)、およびマニフォールドのバッファー注入口ポートを接続する管を含んだ。試料についてのフロー経路は、試料リザーバ(20mLシリンジ)、マイクロチップ公称間隙サイズ(16μm)より大きい凝集物を保持するための直径25mmの20μm PureFlowナイロンフィルター、およびマニフォールドの試料注入口ポートを接続する管を含んだ。マニフォールドの出口ポートを、廃棄物画分および産物画分についての収集リザーバに配管することにより接続した。
マイクロチップ、フィルター、および管の準備をし、試料を負荷する前にランニングバッファーで15分間、ブロッキングした。DLD設定を、ランニングバッファーをバッファーリザーバ(60mLシリンジ)へ負荷し、その後、加圧することにより準備した;その時、流体は、管を通って、マニフォールド「バッファーイン」ポートへと通過した(図1)。マニフォールドポートにおける空気を、その注入口における別のポートを介してベントし、その後、そのポートを密閉した。その後、バッファーをマイクロチップへ流し、産物出口と廃棄物出口の両方から排出して、マイクロポストアレイにおける全ての空気を抜いた。同時に、バッファーを、マニフォールドの「試料イン」ポート、およびインラインフィルターを通して、逆流させ、少しの空気も追い出した。この準備工程は、実際に手を動かす時間が約5分かかり、マイクロチップ、マニフォールド、および管から全空気を除去した。準備工程後、全ての内部表面をブロッキングするためにさらに15分間、バッファーで、装備を洗い流し続けた;この工程は自動化されており、実際に手を動かす必要はなかった。
ブロッキング工程後、システムを減圧し、試料を試料容器(20mLシリンジ)へ負荷した。試料(下記参照)を、DLDへの負荷前に、ランニングバッファー(0.2×)4部あたり試料1部の割合で希釈した。最初にバッファー供給源、その後、試料供給源を、再び加圧し、その結果、バッファーと試料の両方が、マニフォールド上のそれらのそれぞれのポートおよびマイクロチップに入り、並列したマイクロチップの中へ流れた(分離モード、図1Ai)参照)。いったん試料が負荷され、ランニング圧力下に置かれたならば、システムは自動的に、試料容量全体を処理した。産物画分と廃棄物画分の両方を、あらかじめ重量測定された滅菌コニカル50mLチューブに収集し、収集後、重量を測定して、収集された容量を決定した。
バッファー系。以下の3つの異なるEDTAフリーのバッファー製剤をDLDにおいて試験した:リン酸緩衝食塩水[Ca++/Mg++フリー](Quality biological、Gaithersburg、MD)中0.5%F127(Pluronic F-127、Sigma Aldrich、St.Louis、MO)、リン酸緩衝食塩水[Ca++/Mg++フリー]中1%ウシ血清アルブミン(BSA)(Affymetrix、Santa Clara、CA)、ならびにPlasmalyte A(Baxter、Deerfield、IL)の50%と、1.0%BSA(Affymetrix、Santa Clara、CA)、1.0mM N-アセチル-システイン、2%デキストロース、および0.45%NaCl(全てSigma-Aldrich、St. Louis、MO社製)を含有する混合物の50%とで構成される等張性エラトリエーションバッファー(EB)。バッファーを、毎日、新鮮に調製し、DLDでの使用の前に、0.2μmフィルターフラスコに通して、滅菌濾過した。より良いDLD性能はポロキサマーの添加により確立されているが(Johnson, et al., Cancer Cell Res. 27:38-58 (2017))、増殖群における全ての試料を、等張性エラトリエーションバッファーを用いて処理して、本CAR-T細胞製造アプローチを用いて最良に調整した。
生物学的試料。Trimaシステム(Terumo、Tokyo、Japan)を用いての、スクリーニングされた正常なドナーの血小板アフェレーシス献血由来の白血球除去システム(LRS)チャンバー試料を、地方血液バンクから入手した。血液バンクによる収集の時点で、細胞カウントが行われた。カウントは、本発明者らの実験室において、Beckman Coulter AcT2 Diff2臨床血液アナライザを用いて検証され、76~313.3×103WBC/μLの間、および0.8~4.87×106血小板/μLの間の範囲であった。全試料を、一晩の輸送を模倣するために、オービタル振盪機(Biocotek、China)上に、室温で一晩、保ち、その後、次の日に(約24時間後)処理した。各ドナー試料を、DLDとFicollの両方により処理し、T細胞増殖および免疫表現型研究に用いられる4個のドナーについては、試料をまた、直接的磁気抽出を用いて処理した。
Ficoll-Hypaque。末梢血単核球(PBMC)を、LRS試料を、RPMI(Sigma-Aldrich.St Louis、MO)中0.5×に希釈することにより取得し、50mLコニカルチューブにおいて等容量のFicoll-Hypaque(GE、Pittsburgh、PA)の上に層状に重ね、フリースウィングローターを用いて、ブレーキなし、400xgで、35分間、遠心分離した。遠心分離後、最上層を捨て、界面PBMC画分を、新しい50mLチューブに移し、合計を20mLのRPMIに合わせた。PBMCを、400xgで10分間の遠心分離により洗浄し、上清を捨て、ペレットを20mLのRPMIで再懸濁し、200xgで10分間、再び洗浄した。上清を除去し、ペレットを、RPMI-1640 + 10%ウシ胎仔血清(FBS)(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)、加えて、ペニシリン100ユニット/mLおよびストレプトマイシン100μg/mLの抗生物質(Thermo-Fisher、Waltham、MA)を含有する完全培地中に再懸濁した。
細胞単離、カウント、および免疫蛍光染色。上記の方法を用いての単離の前および後に、生じた産物の細胞カウント数を、血液細胞アナライザ(Beckman-Coulter AcT2 Diff2)を用いて決定した。培養中に1回、および活性化後、細胞カウント数を、Scepter(商標)2.0手動細胞カウンター(Millipore、Billerica、MA)を用いて、およびフローサイトメトリを用いる絶対的カウンティングにより、決定した。その後、入力物画分、産物画分、および廃棄物画分由来の細胞を、ポリリジンコーティング化スライド上に10分間、載せ、その後、遠心分離によるPBS中での3回の洗浄前に、PBS中4%p-ホルムアルデヒド + 0.5%Triton X-100中で15分間、固定した。スライドを、コンジュゲート型一次抗体CD41-A647およびCD41-FITC(どちらもBioLegend San Diego、CA社製)と暗所中、60分間、インキュベートし、PBSで3回、洗浄し、その後、DNA染色DAPI(Thermo-Fisher、Waltham、MA)を含有するSlowFade封入剤中に封入した。スライドを、Etaluma(商標)Lumascope 620蛍光倒立顕微鏡(Carlsbad、CA)を用いて観察した。以下の蛍光色素にコンジュゲートした抗体(mAb)は、BioLegend(San Diego、CA)から入手した:CD25-PE、CD25-APC、CD95-FITC、CD45RA-BV605、CD45RO-PECy7、CD197/CCR7 PE、CD279-PE、CD28 PE-Cy5、CD45-PerCP、CD3-FITC、CD3-BV421、CD4-AF700、CD8-APC-AF780、CD61-FITC、CD41-FITC、CD45-Alexa647。DLDにより取得されたWBCおよびFicoll-Hypaqueにより精製されたPBMCの生存率を、トリパンブルー排除法により決定した。
活性化および磁気分離。増殖群におけるT細胞刺激について、DLD産物、Ficoll産物、およびLRS産物を、1×107個のT細胞/mLに希釈し、その後、洗浄し、抗CD3/CD28コンジュゲート化磁気ビーズ(5.0μm)(Thermo-Fisher、Waltham、MA)と3.2:1のビーズ:細胞の比で、60分間、平衡化させることで活性化し、その後、活性化T細胞を、5分間の磁気デプレションにより分離した。結合していない細胞を除去し、ビーズに結合した細胞を、完全培地(下記)中でさらに培養した。直接的磁石プロトコールにおいて、0.5mLのLRS試料(DLDまたはFicollにより処理されたのと同じドナー)を、免疫磁気CD3/CD28ビーズと1時間、インキュベートした。その後、その混合物を、磁石につけて5分間、置いて、T細胞を捕獲した。磁気ビーズに結合した細胞(活性化細胞)を取り出し、その後、上記のように完全培地中での培養のために、0.5×106個/mLに希釈した。
培養における3日間後、組換えヒトIL-2(BioLegend、San Diego、CA)を200IU/mLでウェルに加えた。最長15日間の細胞培養後、ビーズを細胞から除去し、細胞を各時点においてカウントした。ビーズを除去するために、ウェル中の細胞を、その細胞を5mLピペットの中へ10回、通過させることにより、再懸濁した。次に、細胞懸濁液を、1mLピペットに40回、通過させ、続いて、200μLチップを用いる激しいピペッティングを1分間、行った。その後、細胞懸濁液を、磁石の側に5分間、置き、非磁性画分を、新鮮なチューブに移し、カウントした。培養ウェルにおける細胞の数を、Scepter手動細胞カウンターを用いて、およびフローサイトメトリにより、決定した。
細胞培養および細胞活性化。細胞培養へ入れられるT細胞調製物のそれぞれについて、上記の刺激された細胞に加えて、非刺激細胞(対照)を、完全培地(RPMI + 10%FBS + 抗生物質)中に0.5×106個/mLに調整し、6ウェルプレート(Corning、NY)に置き、加湿インキュベータにおいて37℃、5%CO2で培養した。サンプリング、および特に3日目における、信頼できるカウント数のために必要とされる脱ビーズ行動のせいでの増殖中の破壊の可能性を少しでも排除するために、刺激されなかった、ならびにIL2で刺激された、およびIL2なしで刺激された、各条件についての個々のウェルを、各時点における各ドナーに特化させた。
フローサイトメトリ。フローサイトメトリによる洗浄なしの絶対的カウンティングを、全ての時点におけるCD3+細胞カウント数に用いた。最初の0日目のカウント数は、TruCountチューブ(BD Biosciences、San Jose、CA)を用いて、回収され、かつカウントされた細胞の数を正確に決定した。その後の日は、内部対照としてのTruCountチューブにインデックスを付けた25,000個の123ビーズ(Affymetrix、Santa Clara、CA)を用いた。TruCountチューブにおいてか、または25,000個の123ビーズ(Affymetrix、Santa Clara、CA)の添加によるかのいずれかで、100μLの細胞懸濁液を、CD3 FITC、CD25 PE、およびCD45 PerCPのコンジュゲート型抗体で暗所中、30分間、染色した。その後、細胞を、1.0mMの最終DRAQ5(商標)DNA色素(Thermo-Fisher、Waltham、MA)濃度を含む250μLのPBSへ希釈した。次に、染色された細胞を、獲得前に、PBS中1.2%p-ホルムアルデヒドの追加の250μLで、一晩、固定した。絶対カウント数サイトメトリについて、最低限の25,000個の事象または2500個のビーズ事象が、蛍光閾値(CD45 PerCP)を用いて、BD FACSCalibur(BD Biosciences、San Jose、CA)において獲得された。表現型分析もまた、全時点において、CD3、CD45RA、CD95、CD279、CD25、CD4、およびCD8からなる7色の活性化/アネルギーパネルを用いて、実施した。15日目において、パネルを改変して、CD45RO PE-Cy7、CD28 PE-Cy5を加え、かつCD279/PD1 PEの代わりにCD197/CCR7 PEを用いる、セントラルメモリーT細胞に焦点を合わせた9色パネルを作製した。多色染色について、100μlの細胞懸濁液を上記のように染色し、750μL PBS中に再懸濁し、400xgでの遠心分離により洗浄し、その後、250μL 1.2%p-ホルムアルデヒド中に再懸濁し、一晩固定し、その後、4レーザーBD FACSAria II(BD Biosciences、San Jose、CA)において前方散乱閾値を用いて20,000個の事象を獲得した。全てのデータ分析は、Flowlogicソフトウェア(Inivai、Melbourne、Australia)を用いて実施された。
結果
アフェレーシス産物のDLDマイクロチップおよびFicoll処理
DLDおよびFicoll分離方法を用いて、12人の異なる正常なドナーから得られた12個のLRS試料を処理した。受け取られ、かつ処理されたそれらの12個の試料のうち、11個の試料は、それぞれ、およそ148.7×103個/μLのWBCカウント数および2.52×106個/μLの血小板カウント数の平均値に密集した(図2A、2B)。313.3×103個/μLのWBCカウント数および4.87×106個/μLの血小板カウント数を有する12番目の試料は、散布図において赤色三角形として見ることができる(図2A)。この試料は、処理の時点で、十分凝集しており、急速に20μmプレフィルターを詰まらせ、したがって、DLDに十分には流入しなかった。入力試料の顕微鏡検査により、この試料が、25~50μmのサイズの範囲である血小板-WBC凝集体が充満していることが示され、250μm直径の規模の大きさの多数の凝集体が観察された(図2C、2D)。さらに、WBCカウント数と血小板カウント数の両方は、平均WBCカウント数および平均血小板カウント数より3標準偏差、高かった。四分位方法を用いて、この試料を、軽度の異常値として分類した;異常値についてのGrubbs検定および0.05のαレベルを用いて、この試料をまた、異常値として分類した20。結果として、このドナーを、極めて高いWBCカウント数および血小板カウント数、ならびに凝集が過度にひどく、かつ損傷していることに基づいて、本研究から排除した。
アフェレーシス産物のDLDマイクロチップおよびFicoll処理
DLDおよびFicoll分離方法を用いて、12人の異なる正常なドナーから得られた12個のLRS試料を処理した。受け取られ、かつ処理されたそれらの12個の試料のうち、11個の試料は、それぞれ、およそ148.7×103個/μLのWBCカウント数および2.52×106個/μLの血小板カウント数の平均値に密集した(図2A、2B)。313.3×103個/μLのWBCカウント数および4.87×106個/μLの血小板カウント数を有する12番目の試料は、散布図において赤色三角形として見ることができる(図2A)。この試料は、処理の時点で、十分凝集しており、急速に20μmプレフィルターを詰まらせ、したがって、DLDに十分には流入しなかった。入力試料の顕微鏡検査により、この試料が、25~50μmのサイズの範囲である血小板-WBC凝集体が充満していることが示され、250μm直径の規模の大きさの多数の凝集体が観察された(図2C、2D)。さらに、WBCカウント数と血小板カウント数の両方は、平均WBCカウント数および平均血小板カウント数より3標準偏差、高かった。四分位方法を用いて、この試料を、軽度の異常値として分類した;異常値についてのGrubbs検定および0.05のαレベルを用いて、この試料をまた、異常値として分類した20。結果として、このドナーを、極めて高いWBCカウント数および血小板カウント数、ならびに凝集が過度にひどく、かつ損傷していることに基づいて、本研究から排除した。
入力材料(0.2×に希釈されたLRS産物)の代表的な画像が図2Aに示されている。同じ入力物ドナー由来のDLD細胞産物(図2E)およびFicoll細胞産物(図2C)の典型的な顕微鏡写真より、Ficollと比較してDLDにおいて、バックグラウンドの血小板レベル(緑色のCD41-FITC)が有意により低いことが見出された。チューブに収集された時のそれぞれの細胞産物もまた示されている(図2G、H)。DLD処理は、WBCをRBCおよび血小板から取り出すプロセスを自動化し、産物についての1つのチューブおよび廃棄物についての1つのチューブを生じるが、一方、Ficoll試料はまだ、上方の血漿層と下方のFicoll層の操作上規定された界面におけるPMBC層をピペッティングするさらなる手作業での処理を必要とする(図2H);加えて、追加の最低限2回の遠心洗浄が、混入血小板の大部分を除去するために必要とされる。
11個の試料のWBCの回収、ならびにRBCデプレションおよび血小板デプレションは、表2に要約されている。DLDからのPBMCの平均細胞回収率は約80%であり、Ficoll(63%)より17%高く、DLD試料と磁気試料の両方におけるCD3細胞の数を計上すると、DLD産物は、直接的磁石(44%)より36%高かった。DLDによる平均血小板デプレション(83%)は、Ficoll(56.5%)と直接的磁石(77%)のどちらよりも優れていた。これらの24時間経過した試料における平均赤血球デプレションは、DLDとFicollの両方について97%、直接的磁石アプローチについて94%であった。DLDにより取得された細胞の平均生存率は、97%であったFicollと比較して、96%であった。
Ficoll技術による50mLコニカルチューブにおける単一試料の等価アリコートを処理するのにかかる平均の合計時間は、約90分の所要時間であり、およそ30分間の熟練者が実際に手を動かす時間が必要とされた。本発明者らの単一マイクロチップ層ブレッドボードシステムを用いる時限実行(timed run)は、はるかに短い時間、50分間で処理し、25分間の実際に手を動かす時間を必要とし、およそ20分間は単に流体工学部品の組立によるものであり、その理由は、デバイスが、プロトタイプの性質をもつからであり、そうでなければ、介入する必要はない。
細胞増殖および特徴づけ
DLDまたはFicoll濃縮後、細胞を、CD3/CD28磁気ビーズを用いて、CD3+細胞あたり3.2個のビーズの目安で、60分間、活性化し、分離し、その後、プレーティングの前にカウントした。フローサイトメーターへのアクセスの制限および産物細胞カウント数における潜在的ビーズ干渉に関する懸念により、本発明者らは、入力物画分と非磁気画分の両方をカウントし、90%の効率での磁気分離(製造会社が報告した効率に基づいた)の仮定を用いて、引き算により磁石に結合したT細胞の数を得ることにより、T細胞カウント数を推定した。正確なT細胞カウント数を、培養へのプレーティング後に、フローサイトメトリにより、およびコールターカウンターによる絶対カウント数×%CD3陽性細胞を用いて、決定した;これらのカウント数は、最初の磁気CD3+細胞デプレションプロセスがたった44%効率であったことを確立した(表2)。これは、CD3+細胞あたり3.2個のビーズという目安に関係する最初の計算が、実際、DLD画分とFicoll画分の両方について平均して2.3個であり(目安とされた数よりT細胞あたり少ないビーズ)、直接的磁石画分においては5:1比(目安とされた数よりT細胞あたり有意に多いビーズ)であることを意味し、DLDアームとFicollアームの両方と比較して、直接的磁石画分に、さらにより高い増殖倍率を生じさせた可能性がある。
DLDまたはFicoll濃縮後、細胞を、CD3/CD28磁気ビーズを用いて、CD3+細胞あたり3.2個のビーズの目安で、60分間、活性化し、分離し、その後、プレーティングの前にカウントした。フローサイトメーターへのアクセスの制限および産物細胞カウント数における潜在的ビーズ干渉に関する懸念により、本発明者らは、入力物画分と非磁気画分の両方をカウントし、90%の効率での磁気分離(製造会社が報告した効率に基づいた)の仮定を用いて、引き算により磁石に結合したT細胞の数を得ることにより、T細胞カウント数を推定した。正確なT細胞カウント数を、培養へのプレーティング後に、フローサイトメトリにより、およびコールターカウンターによる絶対カウント数×%CD3陽性細胞を用いて、決定した;これらのカウント数は、最初の磁気CD3+細胞デプレションプロセスがたった44%効率であったことを確立した(表2)。これは、CD3+細胞あたり3.2個のビーズという目安に関係する最初の計算が、実際、DLD画分とFicoll画分の両方について平均して2.3個であり(目安とされた数よりT細胞あたり少ないビーズ)、直接的磁石画分においては5:1比(目安とされた数よりT細胞あたり有意に多いビーズ)であることを意味し、DLDアームとFicollアームの両方と比較して、直接的磁石画分に、さらにより高い増殖倍率を生じさせた可能性がある。
培養物のフローサイトメトリ特徴づけを各時点において実施して、細胞活性化の一貫性を評価した。Ficoll、DLD、および直接的磁石についての、8日目に測定された場合の、CD3+細胞のCD25発現の変化(図3)。IL-2受容体陽性(CD25)CD3細胞は、青色(CD4+プロット)および赤色(CD8+プロット)で示されている。DLD調製細胞は、Ficoll調製物および直接的磁石調製物のどちらと比較しても、CD25(CD3/CD28刺激に対する応答の指標)について、4個のドナーに渡って、より一貫した表現型発現を示す。DLD調製CD3+細胞は、51%におけるFicollと比較して、共刺激に対して平均73%応答を生じ(どちらも、2.3個のビーズ/細胞において刺激された)、一方、より高い5:1比で刺激された、直接的磁石画分は、54%応答だけ生じた。
FicollおよびDLDについての非刺激対照は、顕著な差を示し、DLD調製細胞は、Ficollと比較して、CD25陰性のままであった(図9)。興味深いことに、直接的磁石画分におけるドナー37は、8日目まで応答しなかったが、より後の時点において増殖し(図5Aにも示された)、直接的磁気アプローチに対するいくつかの試料の応答の潜在的遅延を示している。
CD25を評価することに加えて、メモリー細胞表現型への変換を、CD45RA-およびCD25+であるCD3+細胞のパーセンテージを用いて、追跡した。8日目において、平均して、CD3+細胞の58%が、Ficollアームにおける36%および直接的磁石アームにおける439%と比較して、DLDにおいてCD45RA- CD25+であった(図4)。これらの結果は、DLDにより生成された場合、培養細胞のより高いパーセンテージが、Ficollおよび直接的磁石により処理された細胞と比較して、共刺激に対して応答性であったことを示す。さらに、CD25- CD45RA-であったCD3細胞のパーセントは、Ficollおよび直接的磁石、それぞれについての33%および29%と比較してDLD画分において12%と最も低く、DLD CD3細胞に関して、CD25+ CD45RA-集団へのより完全な変換を示している。DLDについての8日目におけるCD45RA- CD25+集団の標準偏差は、Ficollについての24.8%および直接的磁石についての53.4%と比較して10.1%であった。
個々の培養物の増殖倍率を、3日目、8日目、および15日目において決定した;そのデータは図5Aに示されている。そのプロットは、各方法に渡る、各ドナー試料の増殖を示す。直接的磁石アプローチは、より高い増殖を示すように思われるが、そのカウント数は、異なるビーズ対細胞比(および対応するプレーティング密度の差)により有意に影響された可能性が高い。とにかく、4個のドナーは、増殖倍率において有意な生存率を示している。加えて、直接的磁石アームのドナー#21についての15日目の培養物は、抗生物質を存在させていたにも関わらず、汚染され、廃棄されなければならなかった。ドナー#21についての8日目の増殖データがその汚染により影響されたかどうかを知ることは可能ではない。
FicollとDLDの比較は、妥当であり、かつはるかに直接的であった:これらの細胞を、同じ密度でプレーティングし、同じビーズ:細胞比で刺激した。DLD細胞の平均増殖倍率はFicoll細胞のそれより有意には高くはないが、4個のドナーのセットに渡っての、および調査された全ての日における、増殖の一貫性は顕著である。さらに、セントラルメモリー表現型である培養中の細胞のパーセントは、DLDアームについて平均74%であり、Ficollアームおよび直接的磁石アームについて、それぞれ、47%および48%と対照をなす。図5Aにおける増殖倍率にパーセント収率(表1)およびパーセントメモリー(図5B)を掛けることにより、ビーズ:細胞比での準最適比較にも関わらず、Ficollアームまたは直接的磁石アームのいずれと比較しても、平均して2倍のメモリー細胞がDLDアームから産生されたことが示される。
図6は、この研究に用いられたメモリー細胞を同定することへの表現型アプローチを示し、そのアプローチは、CD62Lなどの抗原が脱落するいかなる問題も排除するように設計されている(Mahnke, et al., Eur. J. of Immunol. 43:2797-2809 (2013))。セントラルメモリー細胞は、逐次的にゲーティングされ、その後、CD3+ T細胞が、その培養物中の全ての他のCD3+細胞に対して、CD45R0+、CD95+、CD28+、およびCD197/CCR7+について陽性であることを示すためにバックゲーティングされる。培養物の任意の50%より高くがセントラルメモリー表現型であることを変換測定基準として用いて、DLDアームは、100%(4/4)のドナーがセントラルメモリー変換を達成したことを示し、細胞の平均74%がメモリー表現型であり、13%のドナーに渡る変動係数であった。対照的に、Ficollアームは、50%(2/4)変換を示し、平均47%のメモリー細胞、および29%の変動係数であった。直接的磁石アームは、33%(1/3)変換を達成し、平均48%のメモリー細胞および関連した79%変動係数であった。
実施例2:血小板付加バック(Back)実験
原理
以前に、DLD単離および精製に由来するWBCは、健常であり、CD3/CD28抗体による活性化に応答し、それらのTcm(Tセントラルメモリー)表現型に分化することが見いだされている(doi.org/10.1177/2472630317751214にオンライン公開された、Campos-Gonzalez, et al., SLAS, January 23, 2018)。さらに、IL-2の存在下で、Tcm細胞は、Ficollのように、他の方法に由来する細胞にしたがっておよび同様に、拡張および増殖する。
原理
以前に、DLD単離および精製に由来するWBCは、健常であり、CD3/CD28抗体による活性化に応答し、それらのTcm(Tセントラルメモリー)表現型に分化することが見いだされている(doi.org/10.1177/2472630317751214にオンライン公開された、Campos-Gonzalez, et al., SLAS, January 23, 2018)。さらに、IL-2の存在下で、Tcm細胞は、Ficollのように、他の方法に由来する細胞にしたがっておよび同様に、拡張および増殖する。
DLD細胞精製の重要な特徴は、高度に精製された白血球(WBC)産物を提供するための、赤血球および血小板の十分な除去である。比較すると、Ficoll由来白血球(PBMC)は、試料の質に依存して、より汚染された赤血球および血小板を示す。平均して、Ficoll由来細胞中の血小板「汚染」は約22%の変動範囲を有する44%であるが、DLD細胞は+/-12%の変動で17%のみの血小板汚染を示す。
Ficoll分離アフェレーシス血液と比較したとき、DLD処理アフェレーシス血液における血小板枯渇の顕著な違いのため、DLD精製白血球への自己血小板の添加が期間にわたって増殖およびTcm産生に影響するか否かについて調査が行われた。
実験の詳細
2つの異なる白血球除去システムアフェレーシス(「LRS-アフェレーシス」)試料は、コントロールとして、または2.0mM EDTA中のいずれかでローカルの血液バンクから収集された。全4つの試料を、DLD処理およびFicoll勾配遠心分離という2つの異なる方法で並行して同じように処理した。血液バンクによって提供された元の血小板:WBC比に注釈が付けられ、コールターカウンター測定によって確認された。
2つの異なる白血球除去システムアフェレーシス(「LRS-アフェレーシス」)試料は、コントロールとして、または2.0mM EDTA中のいずれかでローカルの血液バンクから収集された。全4つの試料を、DLD処理およびFicoll勾配遠心分離という2つの異なる方法で並行して同じように処理した。血液バンクによって提供された元の血小板:WBC比に注釈が付けられ、コールターカウンター測定によって確認された。
3.0mlの各LRS血液を、PBS中の1.0% BSA/5.0mM EDTAで0.2Xに血液を希釈することによって、我々の前述のプロトコールにしたがってDLDにより処理した。試料を、各試料について個々のDLD-14レーンチップを使用して標準圧力および条件下で、1.0% BSA/PBSバッファーで実施した。産物および廃棄物を回収し、細胞充実性をコールターカウンターを使用して測定した。
(2.0mM EDTAまたはコントロールにおいて回収された)2つの異なるドナーおよび条件からの3.0mlの各LRS血液産物を、3.0mlのリン酸緩衝生理食塩水(カルシウムとマグネシウムを差し引いたもの)で1:1に希釈し、50mlコニカルチューブ中で6.0mlのFicoll-Paque上に層状にした。PBMCの末梢単核細胞を、ブレーキをかけずに35分間400xgでの遠心分離によって得た。上層または血漿富画分を取り出し、別のチューブに移し、PBS/1.0%BSAで1:1に希釈した。1回目は400xg10分間および2回目は200xg10分間の遠心分離により、PBMCを過剰なPBSで洗浄した。両方の上清を新しい50mlコニカルチューブに移し、PBS/1.0% BSAで1:1に希釈した。希釈された血漿富画分および2つの上清を15分間1,200xgで遠心し、上清を廃棄し、ペレットをPBS/1.0% BSAに再懸濁し、混合し、15分間1,200xgでもう一度遠心した。上清を廃棄し、ペレットまたは血小板画分を穏やかなピペッティングにより1.0mlのPBS/1.0% BSAに再懸濁した。血小板をコールターカウンターを使用して測定した。対応する血小板を、所望の比率(0、0.1、0.5および1.0x 元の血小板数)でDLD由来のWBCにバック付加し、CD3/CD28磁気ビーズでの活性化の前に1時間インキュベートした(Thermo Fisher)。
活性化後、細胞を完全なRPMI培地+10% FBS+抗生物質に置き、37℃および5% CO2で加湿インキュベーターで一定時間培養した。図に示されている抗体の組み合わせを使用して、マルチカラーフローサイトメトリーによって、細胞アリコートを3、7および14日に分析した。細胞培養アリコットを異なる日に得て、フローサイトメトリーの調製前に、前述のように細胞のビーズを外した。また、細胞増殖を、セプター手動細胞カウンターを使用することによって測定した。
我々は、次に、Ficoll由来の細胞とコントロール条件下でおよび異なる比率で血小板をDLD細胞にバック付加したときのDLD処理から得られたものとの違いを比較した。我々が使用したパラメーターは、異なる時点での細胞数およびフローサイトメトリーによる表現型に応じたTcm細胞数であった。
以下のスキームは、上から下に進むステップでこの実験中に続く全体的な実験計画を説明する。
結果および結論
DLDを使用して得た白血球は、Ficollを使用して得た白血球よりも一貫して少ない血小板を示した(図19-21参照)。結果はまた、Ficollからの対応物と比較して、DLDに由来するT細胞の明らかに優れた増殖を証明する(図22)。さらに、DLD単離細胞への血小板のバック付加は、血小板を含まないDLD細胞と同じレベルまで拡大する能力が低下した(図22)。これらの結果は、血液産物のDLD処理中のより効率的な血小板減少が、CD3/CD28による活性化およびIL-2による拡大により応答する白血球を生産するという仮説をサポートする。
DLDを使用して得た白血球は、Ficollを使用して得た白血球よりも一貫して少ない血小板を示した(図19-21参照)。結果はまた、Ficollからの対応物と比較して、DLDに由来するT細胞の明らかに優れた増殖を証明する(図22)。さらに、DLD単離細胞への血小板のバック付加は、血小板を含まないDLD細胞と同じレベルまで拡大する能力が低下した(図22)。これらの結果は、血液産物のDLD処理中のより効率的な血小板減少が、CD3/CD28による活性化およびIL-2による拡大により応答する白血球を生産するという仮説をサポートする。
参考文献
本明細書に引用された全ての参考文献は、参照により完全に組み入れられている。今、本発明を完全に記載したが、本発明が、本発明またはその任意の実施形態の精神または範囲に影響することなく、条件、パラメータなどの幅広くかつ等価の範囲内で実施され得ることは当業者により理解されているだろう。
Claims (273)
- 以下の工程を含む、標的細胞の集団を操作する方法:
a)標的細胞を粗流体組成物から単離する工程であって、単離手順が、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含み、前記デバイスが、
i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含む、工程;
b)前記収集出口から得られた標的細胞を、所望の表現型を有するように遺伝子操作する工程。 - 前記遺伝子操作する工程が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、遺伝子操作された標的細胞が、それらをインビトロで(in vitro)培養することにより増殖される、請求項1に記載の方法。
- 前記所望の表現型を示す標的細胞の収率が、Ficoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていない同一の細胞より少なくとも10%高い、請求項2に記載の方法。
- 前記粗流体組成物が、血液、または血液にアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスを実施することにより取得されている組成物である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的細胞が白血球である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が、B細胞、T細胞、NK細胞、単球、または前駆細胞である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が樹状細胞である、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。
- 前記粗流体組成物が患者から取得される、請求項1~7のいずれか一項記載の方法。
- 前記粗流体組成物における標的細胞が、形質導入またはトランスフェクションされる前に担体と結合していない、請求項8に記載の方法。
- 標的細胞に、DLDを実施する前に、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項8に記載の方法。
- 標的細胞に、DLDを実施した後で、かつそれらを形質導入またはトランスフェクションする前かまたは後のいずれかで、DLD分離を促進または補完するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項9に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する親和性物質を表面上に含む、請求項10または11に記載の方法。
- 前記物質が、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマーである、請求項12に記載の方法。
- 前記担体の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の50%以下の長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の25%以下の長さである、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
- 担体の1つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
- 担体の1つの群が、標的細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項10~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項10~20のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、標的細胞に初めて担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項10~21のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から標的細胞に初めて担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項10~21のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
- 初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項24または25に記載の方法。
- 以下の工程を含む、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を作製する方法:
a)T細胞を含む粗流体組成物を取得する工程;
b)i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記T細胞とは異なるサイズである細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイスを用いて、前記粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施する工程;
c)工程b)において取得された濃縮産物中のT細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を産生するように遺伝子操作する工程。 - 前記粗流体組成物が、患者由来の血液から取得されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であり、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ異なるサイズである赤血球、血小板、または他の粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる、請求項27に記載の方法。
- 前記遺伝子操作が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、遺伝子操作された標的細胞が、インビトロで前記細胞を成長させることにより、さらに増殖される、請求項27または28に記載の方法。
- 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも10%高い、請求項27~29のいずれか一項に記載の方法。
- 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも20%高い、請求項30に記載の方法。
- 表面上にキメラ受容体を発現するT細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも50%高い、請求項30に記載の方法。
- 前記CARが、a)抗原結合ドメインを含む細胞外領域;b)膜貫通領域;c)細胞内領域を含み、前記CAR T細胞が、トリガーされた時、CAR T細胞の数または活性を低下させる分子スイッチを前記細胞に提供する1つまたは複数の組換え配列を含んでもよい、請求項27~32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の、一本鎖可変断片(scFv)である、請求項33に記載の方法。
- 前記CARが、細胞外領域と膜貫通領域を接続する2~20個のアミノ酸のヒンジ領域を含む、請求項33または34に記載の方法。
- 前記膜貫通領域が、CD8またはCD28タンパク質配列を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記細胞内領域が、CD3ζ、CD137、またはCD28細胞内ドメインに由来したシグナル伝達ドメインを含む、請求項33~36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞を含む粗流体組成物が、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患を有する患者から取得される、請求項27~37のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物を取得した後、前記流体組成物中のT細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項38に記載の方法。
- T細胞に、DLDを実施する前に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項39に記載の方法。
- T細胞に、DLDを実施した後で、かつそれらが遺伝子操作される前かまたは後のいずれかで、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項39に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の担体が、前記T細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項39~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の50%以下の長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の25%以下の長さである、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
- 担体の1つの群が、T細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
- 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項39~42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項39~48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項39~49のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記T細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項39~50のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項39~50のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項27~50のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項27~50のいずれか一項に記載の方法。
- 初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項53または54に記載の方法。
- CAR T細胞を作製することにおける全工程が、T細胞を含む粗流体組成物が取得される同じ施設で実施され、全工程が、合計4時間以内に完了する、請求項27~55のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項27~55のいずれか一項に記載の方法により作製されたCAR T細胞。
- 癌、自己免疫疾患、または感染性疾患について患者を処置する方法であって、前記患者由来の癌細胞、自己免疫細胞、または感染細胞上の抗原を認識するキメラ抗原受容体を発現するように操作されたCAR T細胞を前記患者に投与することを含み、前記CAR T細胞が、以下の工程を含むプロセスにより作製されている、方法:
a)T細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程;
b)i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記T細胞とは異なるサイズである細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイスを用いて、前記粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施する工程;
c)工程b)において取得された前記T細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子操作する工程;
d)操作されたT細胞の数を、前記細胞をインビトロで成長させることにより増加させる工程;ならびに
e)前記粗流体組成物が取得された患者へ前記操作されたT細胞を投与する工程。 - 前記粗流体組成物が、前記患者由来の血液から取得されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であり、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のT細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ異なるサイズである赤血球、血小板、または他の粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる、請求項58に記載の方法。
- 遺伝子操作が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含む、請求項58または59に記載の方法。
- 表面上にキメラ受容体を発現する細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも10%高い、請求項60に記載の方法。
- 表面上にキメラ受容体を発現する標的細胞の収率が、粗流体組成物からFicoll遠心分離により単離され、かつDLDに供されていないT細胞より少なくとも50%高い、請求項60に記載の方法。
- 前記CARが、a)抗原結合ドメインを含む細胞外領域;b)膜貫通領域;およびc)細胞内領域を含み、前記CAR T細胞が、トリガーされた時、CAR T細胞の数または活性を低下させる分子スイッチを前記細胞に提供する1つまたは複数の組換え配列を含んでもよい、請求項58~62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の、一本鎖可変断片(scFv)である、請求項63に記載の方法。
- 前記CARが、細胞外領域と膜貫通領域を接続する2~20個のアミノ酸のヒンジ領域を含む、請求項63または64に記載の方法。
- 前記膜貫通領域が、CD8またはCD28タンパク質配列を含む、請求項63~65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞内領域が、CD3ζ、CD137、またはCD28細胞内ドメインに由来したシグナル伝達ドメインを含む、請求項63~66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者が白血病を有する、請求項58~67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記白血病が急性リンパ芽球性白血病である、請求項68に記載の方法。
- 前記CARが抗原CD19またはCD20を認識する、請求項68または69に記載の方法。
- 前記患者が固形腫瘍を有する、請求項58~67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CARが、CD22;RORI;メゾテリン;CD33/IL3Ra;c-Met;PSMA;糖脂質F77;EGFRvIII;GD-2;NY-ESO-l TCR;MAGE A3 TCR;およびそれらの組合せからなる群から選択される抗原を認識する、請求項71に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物を取得した後に、前記流体中のT細胞に、DLD分離を促進するように、担体を結合させる、請求項58~72のいずれか一項に記載の方法。
- DLDを実施する前に、T細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項73に記載の方法。
- DLDを実施した後で、かつT細胞が、キメラ受容体を発現するように遺伝子操作される前かまたは後のいずれかで、T細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させる、請求項73に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の担体が、前記T細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項73~75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の50%以下の長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、T細胞の直径の25%以下の長さである、請求項73~76のいずれか一項に記載の方法。
- 担体の1つの群が、T細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項80に記載の方法。
- 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項73~81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項73~82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項73~83のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記T細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、5時間より長く経過していない、請求項73~84のいずれか一項に記載の方法。
- 初めてT細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、4時間より長く経過していない、請求項87または88に記載の方法。
- T細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも1日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも3日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
- a)標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程;
b)マイクロ流体デバイスを用いて、前記標的細胞を含む粗流体組成物に決定論的横置換(DLD)を実施して、標的細胞が濃縮された組成物を得る工程;
を含み、DLDの前かまたは後のいずれかに、標的細胞に、DLD分離を促進するように、1つまたは複数の担体を結合させ、前記標的細胞を含む粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、5時間より長く経過していない、患者から標的細胞を収集する方法。 - 前記1つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項92に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項92または93に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の50%以下の長さである、請求項92または93に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項92または93に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の25%以下の長さである、請求項92または93に記載の方法。
- 担体の1つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第2の群が、標的細胞の直径の50%以下の長さの直径を有する、請求項92または93に記載の方法。
- 担体の1つの群が、T細胞の少なくとも2倍の長さの直径を有し、担体の第2の群が、T細胞の25%以下の長さの直径を有する、請求項92または93に記載の方法。
- 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項92~99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項92~100のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92~101のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項92~101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞を含む粗流体組成物が、患者由来の血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施することにより、取得される、請求項92~103のいずれか一項に記載の方法。
- DLDにより標的細胞が濃縮された組成物中の標的細胞が、ウイルスベクターを用いて形質導入される、請求項92~104のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞が、電気的に、化学的に、またはナノ粒子を用いて、トランスフェクションされる、請求項105に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスが
a)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
b)前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記標的細胞を含む粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含む、請求項92~106のいずれか一項に記載の方法。 - 前記標的細胞がT細胞である、請求項92~107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞が、ナチュラルキラーT細胞、セントラルメモリーT細胞、ヘルパーT細胞、および制御性T細胞からなる群から選択される、請求項108に記載の方法。
- 前記標的細胞が幹細胞である、請求項92~107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、または顆粒球である、請求項92~107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞を含む粗流体組成物が、抗凝固剤として働き、または血小板の活性化を防ぐ1つまたは複数の添加物を含む、請求項92~111のいずれか一項に記載の方法。
- 前記添加物が、チクロピジン、イノシン、プロトカテキュ酸、アセチルサリチル酸、およびチロフィバンからなる群から選択される、請求項112に記載の方法。
- 工程a)およびb)がどちらも、標的細胞を含む粗流体組成物が患者から取得される現地で行われる、請求項92~113のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞を含む粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92~114のいずれか一項に記載の方法。
- 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項92~114のいずれか一項に記載の方法。
- c)細胞を遺伝子操作し、および/もしくは数を増加させる工程;ならびに/または
d)前記標的細胞が取得された同じ患者を、収集された標的細胞で処置する工程
をさらに含む、請求項92~116のいずれか一項に記載の方法。 - 工程e)後に、前記標的細胞が凍結保存される、請求項117に記載の方法。
- 工程c)において培養される標的細胞が、アクチベーターの存在下で培養されるT細胞である、請求項117または118に記載の方法。
- 前記アクチベーターが担体に結合している、請求項119に記載の方法。
- 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも1日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞が、DLDを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも3日早く、患者への投与に利用可能である、請求項58~89のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項92~122のいずれか一項に記載の方法により作製された標的細胞。
- 請求項123に記載の標的細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または状態について患者を処置する方法。
- 以下の工程を含む、接着細胞を複数の他の細胞から分離する方法:
a)複数の他の細胞および接着細胞を含む粗流体組成物を、DLD分離を促進するように結合する1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、前記接着細胞が、接触により、または接触後に担体と少なくとも部分的に会合して、担体会合化接着細胞複合体を生成し、前記担体会合化接着細胞複合体が、前記複数の他の細胞における細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化接着細胞複合体のサイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;
b)前記粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに
c)前記担体会合化接着細胞複合体を含む前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化接着細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記担体会合化接着細胞複合体を前記複数の他の細胞から分離する、工程;
d)分離された担体会合化接着細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。 - 前記接着細胞が、前記接着細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、2時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、1時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞または前記担体接着細胞複合体が初めて前記デバイスから収集されるまで、4時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞または前記担体接着細胞複合体が初めて前記デバイスから収集されるまで、4時間より長く経過していない、請求項125に記載の方法。
- 前記担体が、前記接着細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、請求項125~130のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の直径が、前記接着細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、前記接着細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、前記接着細胞の直径の少なくとも10倍の長さである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、10~600μmである、請求項125~131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接着細胞が、MRC-5細胞;HeLa細胞;Vero細胞;NIH 3T3細胞;L929細胞;Sf21細胞;Sf9細胞;A549細胞;A9細胞;AtT-20細胞;BALB/3T3細胞;BHK-21細胞;BHL-100細胞;BT細胞;Caco-2細胞;Chang細胞;Clone 9細胞;Clone M-3細胞;COS-1細胞;COS-3細胞;COS-7細胞;CRFK細胞;CV-1細胞;D-17細胞;Daudi細胞;GH1細胞;GH3細胞;HaK細胞;HCT-15細胞;HL-60細胞;HT-1080細胞;HEK細胞、HT-29細胞;HUVEC細胞;I-10細胞;IM-9細胞;JEG-2細胞;Jensen細胞;Jurkat細胞;K-562細胞;KB細胞;KG-1細胞;L2細胞;LLC-WRC 256細胞;McCoy細胞;MCF7細胞;WI-38細胞;WISH細胞;XC細胞;Y-1細胞;CHO細胞;Raw 264.7細胞;HEP G2細胞;BAE-1細胞;SH-SY5Y細胞、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項125~135のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接着細胞が幹細胞である、請求項125~135のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、活性化細胞を複数の他の細胞から分離する方法:
a)活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を、1つまたは複数の担体と接触させる工程であって、少なくとも1つの担体が細胞アクチベーターを含み、前記細胞アクチベーターが、接触により、または接触後に、前記細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞と少なくとも部分的に会合して、担体会合化細胞複合体を生成し、前記細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞との前記細胞アクチベーターの会合が、前記活性化の能力がある細胞を少なくとも部分的に活性化し、前記担体会合化細胞複合体が、前記複数の他の細胞における細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化細胞複合体のサイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程;
b)前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;ならびに
c)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化細胞複合体が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記活性化細胞を前記複数の他の細胞から分離する、工程;
d)分離された担体会合化細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。 - 前記活性化の能力がある細胞が、T細胞、B細胞、制御性T細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞、β細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、DE3溶原化細胞、酵母細胞、植物細胞、および幹細胞からなる群から選択される、請求項0に記載の方法。
- 細胞アクチベーターがタンパク質である、請求項138または139に記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体である、請求項140に記載の方法。
- 前記タンパク質が、CD3、CD28、抗原、ヘルパーT細胞、受容体、サイトカイン、糖タンパク質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項140に記載の方法。
- 前記細胞アクチベーターが、インスリン、IPTG、ラクトース、アロラクトース、脂質、グリコシド、テルペン、ステロイド、アルカロイド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項138に記載の方法。
- 前記活性化の能力がある細胞が、前記活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、4時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、3時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、2時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、工程c)が完了するまで、4時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、工程c)が完了するまで、3時間より長く経過していない、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞と少なくとも同じ長さである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞の直径の少なくとも2倍の長さである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の全部の直径が、138~148の直径の少なくとも10倍の長さである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体の直径が、10~600μmである、請求項138~148のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、細胞から分泌性産物を連続的に精製する方法:
a)細胞を含む流体組成物を取得する工程であって、前記細胞が、前記流体組成物中に懸濁しており、前記細胞が分泌性産物を前記懸濁液へ分泌し、前記細胞が前記分泌性産物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、前記細胞の既定サイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが、前記臨界サイズ未満である、工程;
b)前記細胞を含む流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第1の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第2の方向へ偏向させるように構成される、工程;
b)前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記細胞が前記障害物により前記第1の方向に偏向され、かつ前記分泌性産物が前記第2の方向に偏向され、それにより、前記分泌性産物を前記細胞から分離する、工程;
c)前記分泌性産物を収集する工程であって、それにより、実質的に純粋である前記分泌性産物の試料を生じる、工程;
d)分離された細胞を含む回収された流体組成物を収集する工程;ならびに
e)分離された細胞を含む回収された流体組成物を、前記デバイスに再アプライし、工程(a)~(e)を繰り返す工程であって、それにより、分泌性産物を細胞から連続的に精製する、工程。 - 前記分泌性産物が、タンパク質、抗体、バイオ燃料、ポリマー、小分子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項153に記載の方法。
- 前記細胞が、細菌細胞、藻類細胞、哺乳類細胞、および腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項153に記載の方法。
- 遠心分離または水簸の非存在下で、試料上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含む、アフェレーシス試料中の血小板と白血球の比率を減少させる方法であって、産物が、血小板と白血球の比率がDLDの代わりに遠心分離または水簸を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも20%低くで得られる、方法。
- 産物が、血小板と白血球の比率が密度勾配遠心分離または向流遠心分離を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも20%低くで得られる、請求項156に記載の方法。
- 産物が、血小板と白血球の比率が水簸を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも20%低くで得られる、請求項156に記載の方法。
- 産物が、血小板と白血球の比率がDLDの代わりに遠心分離または水簸を使用して得られる比率よりも少なくとも50%低くで得られる、請求項156に記載の方法。
- DLDの前に、アフェレーシス試料に対して実施される分離工程がない、請求項156-159のいずれか一項に記載の方法。
- DLDが、血小板のサイズを変えるインターカレーションを含まず、血小板凝集を促進しないバッファーにおいて実施される、請求項156-160のいずれか一項に記載の方法。
- DLDが、デキストランまたは他の高電荷ポリマーを含まないバッファーにおいて実施される、請求項156-159のいずれか一項に記載の方法。
- 産物中の血小板の総数が、アフェレーシス試料中よりも少なくとも70%低い、請求項156-162のいずれか一項に記載の方法。
- 産物中の血小板の総数が、アフェレーシス試料中よりも少なくとも90%低い、請求項156-163のいずれか一項に記載の方法。
- 試料上でDLD、次にアフィニティー分離工程およびアクチベーターの存在下で培養することによるT細胞の拡張を実施することを含む、アフェレーシス試料からT細胞を精製するための方法であって、得られるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも2倍である、方法。
- アフィニティー分離工程が、CD3に結合する抗体を含む磁気ビーズまたは粒子の使用を含む、請求項165に記載の方法。
- 培養14日後に得られるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも2倍である、請求項165に記載の方法。
- 培養14日後に得られるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも4倍である、請求項165に記載の方法。
- DLD産物中の細胞が組換え表現型を発現するようにベクターで形質転換されているとき、所望の表現型を示す細胞の収量は、Ficoll遠心分離により単離され、DLDに付されない同一の細胞よりも少なくとも10%高い、請求項156-168のいずれか一項に記載の方法。
- DLD産物中の細胞が組換え表現型を発現するようにベクターで形質転換されているとき、所望の表現型を示すT細胞の収量は、Ficoll遠心分離により単離され、DLDに付されない同一の細胞よりも少なくとも20%高い、請求項156-169のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞の総数に対するDLD産物中のメモリーT細胞の割合が、DLDの代わりにFicoll遠心分離で同じ手順を使用して産生される割合よりも少なくとも10%高い、請求項163-165のいずれか一項に記載の方法。
- 方法が、CAR T細胞療法のためのT細胞を産生するために使用され、患者を処置するために十分な数の細胞を産生するために必要な時間がFicoll遠心分離の代わりにDLDを使用して少なくとも20%減少される、請求項156-171のいずれか一項に記載の方法。
- CAR T細胞を産生するためのプロセスが、細胞が凍結される工程を含まない、請求項172に記載の方法。
- T細胞の処理が、アフェレーシスが実施されるのと同じ部位で実施される、請求項172または請求項173のいずれかに記載の方法。
- T細胞が、アフェレーシスが実施されるのと同じ部位で遺伝的に形質転換される、請求項172-174のいずれか一項に記載の方法。
- 1時間未満が、アフェレーシス試料収集が完了される時間からDLDが実施される時間までで経過する、請求項156-169のいずれか一項に記載の方法。
- 遠心分離または水簸の非存在下で、試料上で決定論的横置換(DLD)を実施することを含む、アフェレーシス試料中の白血球に対する血小板の比率を減少させる方法であって、産物が、産物中の血小板の総数がアフェレーシス試料中よりも少なくとも90%低くで得られる、方法。
- DLDが、血小板のサイズを変えるインターカレーションを含まず、血小板凝集を促進しないバッファーにおいて実施される、請求項177に記載の方法。
- DLDが、デキストランまたは他の高電荷ポリマーを含まないバッファーにおいて実施される、請求項177に記載の方法。
- 以下の工程を含む、CAR T細胞を操作する方法:
a)アフェレーシスにより患者から試料組成物を取得する工程であって、前記試料組成物がT細胞を含む、工程;
b)存在する血小板の総数を少なくとも70%減少させるように試料組成物上でDLDを実施する工程であって、DLDは、
i)試料注入口から1つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも1個のチャネルであって、前記チャネルが第1の壁および前記第1の壁と反対側の第2の壁によって囲まれている、チャネル;
ii)前記チャネルにおいて、いくつもの行(row)をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、組成物中のT細胞が、濃縮産物が収集される1つまたは複数の収集出口へ流れ、血小板およびT細胞より小さい他の物質が、収集出口から切り離されているもう1つの廃棄物出口へ流れる様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイス上で実施される、工程;
c)工程b)において取得された濃縮産物中のT細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を産生するように遺伝子操作する工程;
d)それらの数を拡張するようにT細胞を培養する工程;
e)患者への投与のための医薬組成物にT細胞を移す工程。 - 血小板の少なくとも90%が工程b)において除去される、請求項180に記載の方法。
- 全ての単離工程および濃縮工程がDLDを使用して実施される、請求項180または請求項181のいずれかに記載の方法。
- 培養前または培養中に、細胞がT細胞アクチベーターに曝露される、請求項180-182のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)中および工程c)の前に、細胞が、T細胞アクチベーターが存在または添加されている培地に移される、請求項180-183のいずれか一項に記載の方法。
- アクチベーターを含む培地をDLDにより処理し、アクチベーターを細胞から分離し、細胞が、細胞を組み換え的に操作するためのベクターが存在または添加されている培地に移される、請求項184に記載の方法。
- 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで細胞が凍結されない、請求項180-185のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞があらゆる工程で凍結されない、請求項180-185のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも1日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも10日早く完了する、請求項180-187のいずれか一項に記載の方法。
- 工程d)において、培養14日後に取得されるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して行われる同じ手順によって産生される数よりも少なくとも2倍高い、請求項180-191のいずれか一項に記載の方法。
- 工程d)において、培養14日後に取得されるT細胞の数が、DLDの代わりにFicoll遠心分離を使用して行われる同じ手順によって産生される数よりも少なくとも4倍高い、請求項180-191のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、CAR T細胞を調製する方法:
a)アフェレーシスにより患者から細胞を収集する;
b)工程a)で得られた細胞にDLDを実施して、白血球を他の細胞および粒子から分離し、白血球を、それらの増殖をサポートし、T細胞活性化因子を含むかまたは補充した培地に移す;
c)DLDを実施して、工程b)の培地から、その表面にキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように組換え操作されたT細胞を分離し、培地に移す;
d)DLDを実施してT細胞を試薬から分離し、増殖培地に移す;
e)細胞を培養して細胞数を増やす;
f)DLDを実施して、増やしたT細胞を患者に投与するための培地に移す。 - 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、請求項194に記載の方法。
- 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、請求項194に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項194~196のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項194~196のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも10日早く完了する、請求項194~196のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、患者の治療のためのCAR T細胞を調製する方法:
a)アフェレーシスによって患者から細胞を収集すること;
b)工程a)で得られた細胞にDLDを実施して、白血球を他の細胞および粒子から分離し、白血球を、それらの増殖をサポートし、T細胞活性化因子を含むかまたは補充した培地に移す;
c)工程b)の培地からT細胞を、キメラ抗原受容体(CAR)を表面に生成するようにT細胞を遺伝子操作するためのベクターを含む培地に分離する;
d)DLDを実施して、T細胞を試薬から分離し、患者に投与するための培地に移す。 - 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、請求項200に記載の方法。
- 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、請求項200に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項200~202のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項200~202のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも10日早く完了する、請求項200~202のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)において、白血球に対する血小板の比が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション(elutriation)を用いて得られる比よりも少なくとも50%低い生成物が得られる、請求項180~205のいずれか一項に記載の方法。
- 所望のCAR T表現型を示すT細胞の収量が、フィコール遠心分離によって単離され、DLDに供されていない同一の細胞よりも少なくとも10%高い、請求項180~205のいずれか一項に記載の方法。
- 所望のCAR T表現型を示すT細胞の収量が、フィコール遠心分離によって単離され、DLDに供されていない同一の細胞よりも少なくとも20%高い、請求項180~205のいずれか一項に記載の方法。
- 患者の治療のために十分な数のT細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法がアフェレーシス開始材料から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも5%短い、請求項180~208のいずれか一項に記載の方法。
- 患者の治療のために十分な数のT細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法がアフェレーシス開始材料から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも10%短い、請求項180~209のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって調製された細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも10%少ない老化を示す、請求項180~209のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって調製された細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも増大した効力を示す、請求項180~209のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項180~209のいずれか一項に記載の方法によって調製された治療有効量の細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または症状について患者を治療する方法。
- 前記疾患または症状ががんである、請求項213に記載の方法。
- 以下の工程を含む、治療的に活性な細胞を製造する方法:
a)前記細胞を含む患者から試料組成物を得る;
b)試料に対してDLDを実施して、治療的に活性な細胞が濃縮された組成物を製造する、ここで、DLDは、以下を含むマイクロ流体デバイスで実施される:
i)試料入口から1つまたは複数の流体出口まで延びる少なくとも1つのチャネルであって、第1の壁および第1の壁の反対側の第2の壁によって境界付けられている、チャネル;
ii)チャネル内の列に配置された障害物の配列、後続の各列の障害物は前の列に対して横方向にシフトされ、前記障害物は、粗流体組成物が装置の入口にアプライされ、流体的にチャネルを通過するときに、組成物中の治療的に活性な細胞は、濃縮生成物が収集される1つまたは複数の収集出口に流れ、ここで治療的に活性な細胞よりも小さい細胞および材料は、収集出口から分離される1つまたは複数の廃棄出口に流れる;
c)任意に、工程b)で得られた濃縮生成物中の治療活性細胞を遺伝子操作する;
d)任意に、治療的に活性な細胞を培養してその数を増やす;
e)治療的に活性な細胞を患者への投与のための医薬組成物に移す。 - 治療的に活性な細胞が幹細胞である、請求項215に記載の方法。
- 幹細胞が循環中に見出され、試料組成物がアフェレーシスによって調製される、請求項216に記載の方法
- 血小板の少なくとも70%が工程b)の濃縮生成物から除去される、請求項217に記載の方法。
- 血小板の少なくとも90%が工程b)の濃縮生成物から除去される、請求項217に記載の方法。
- すべての単離工程および濃縮工程がDLDを使用して実施される、請求項215~219のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、請求項215~220のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、請求項215~220のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも1日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
- 試料組成物から得られる治療的に活性な細胞の収量が、細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順によって得られる場合よりも少なくとも25%高い、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がDLD以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも5日早く完了する、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
- 患者の治療のために十分な数の治療的に活性な細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法が試料組成物から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも5%短い、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
- 患者の治療のために十分な数の治療的に活性な細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法が試料組成物から細胞を単離するためにDLDではなくフィコール遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも10%短い、請求項215~222のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって調製された治療的に活性な細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも10%少ない老化を示す、請求項215~230のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって調製された治療的に活性な細胞が患者に投与される場合に、細胞が、DLDの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用して試料組成物から処理された細胞よりも増大した効力を示す、請求項215~230のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項215~230のいずれか一項に記載の方法によって調製された治療有効量の治療的に活性な細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または症状について患者を治療する方法。
- 前記治療的に活性な細胞が幹細胞であり、前記疾患または症状が遺伝性疾患である、請求項233に記載の方法。
- 標的細胞の集団を操作する方法であって、
a)粗液体組成物から標的細胞を単離すること、ここに単離は、細胞のサイズの相違に基づいて粗液体組成物中の他の細胞から標的細胞を分離する1つまたは複数の手段を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離プロセスにより標的細胞豊富な組成物が得られるものであり、
b)工程a)から得られた標的細胞を、所望の表現形を有するように遺伝子操作すること
を含み、
標的細胞が遺伝子操作される前に遠心分離されないか、あるいは溶出処理されない、方法。 - 該標的細胞が白血球または幹細胞である、請求項235記載の方法。
- 該標的細胞がT細胞である、請求項235記載の方法。
- 該粗液体組成物が患者から得られた血液またはアフェレーシス調製物である、請求項235~237のいずれか1項記載の方法。
- 標的細胞の単離が、標的細胞に富む組成物がアフェレーシス調製物よりも少なくとも70%少ない血小板の総数を有するような条件下で行われる、請求項238記載の方法。
- 標的細胞に富む組成物中の血小板の総数がアフェレーシス調製物よりも少なくとも90%少ない、請求項239記載の方法。
- 標的細胞に対する血小板の割合が、成分除去製剤よりも少なくとも50%低い、請求項240記載の方法。
- 該標的細胞が、単離後に再簿培養にて拡大されるT細胞である、請求項238記載の方法。
- 培養14日後に得られるT細胞の数が、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも2倍多い、請求項242記載の方法。
- 培養14日後に得られるT細胞の数が、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも4倍多い、請求項242記載の方法。
- 培養中のT細胞の総数に対するメモリーT細胞のパーセンテージが、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも10%高い、請求項244記載の方法。
- 培養中のT細胞の総数に対するメモリーT細胞のパーセンテージが、遠心分離工程を含むプロセスによってT細胞が単離される手順よりも少なくとも20%高い、請求項244記載の方法。
- 標的細胞が富化された組成物中の細胞がベクターにて形質転換されて組換え表現形を示す場合、所望の表現形を示す標的細胞の収量が、遠心分離により単離された同じ細胞よりも少なくとも20%高い、請求項235~246のいずれか1項記載の方法。
- アフェレーシス試料の収集が完了した時から、マイクロ流体デバイスを用いる分離が行われるまでに1時間以内が経過する、請求項238~247のいずれか1項記載の方法。
- 患者からのアフェレーシス試料の取得が完了してから標的細胞の単離が完了するまでの経過時間が4時間以内である、請求項238~247のいずれか1項記載の方法。
- 患者からのアフェレーシス試料の取得が完了してから細胞が遺伝子操作されるまでの経過時間が4時間以内である、請求項238~247のいずれか1項記載の方法。
- CAR T細胞の調製方法であって、
a)アフェレーシスにより患者から粗液体組成物を得ること、ここに該試料はT細胞を含むものであり、
b)該粗液体組成部物からT細胞を単離すること、ここに該単離は、サイズの相違に基づいてT細胞を粗液体組成物中の血小板および他の細胞から分子する1つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離によりT細胞が豊富化され血小板が減少した組成物が得られるものであり、
c)工程a)で得られた標的細胞を遺伝子操作して、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CARs)を生成させること、ここに遺伝子操作前のいかなる工程においてもT細胞が遠心分離されないか、あるいは溶出処理されず、
d)遺伝子操作されたT細胞の数を増大させること、
e)工程d)で得られた培養細胞を収集すること
を含む方法。 - 工程c)において、患者に投与するための医薬組成物中に移されることによりT細胞が収集される、請求項251記載の方法。
- 収集前に細胞が凍結されない、請求項251または252記載の方法。
- 血小板の少なくとも90%が工程b)で除去される、請求項251~253のいずれか1項記載の方法。
- 培養前または培養中に細胞がT細胞活性化因子または担体に曝露される、請求項251~254のいずれか1項記載の方法。
- 該活性化剤も該担体も、磁気ビーズにまたは粒子に結合されていない、請求項255記載の方法。
- マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも1日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項251~256のいずれか1項記載の方法。
- マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも3日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項251~256のいずれか1項記載の方法。
- 工程d)において、培養14日後に得られるCAR T細胞の数が、フィコール遠心分離を用いて得られる数よりも少なくとも2倍多い、請求項251~258のいずれか1項記載の方法。
- 工程d)において、培養14日後に得られるCAR T細胞の数が、フィコール遠心分離を用いて得られる数よりも少なくとも4倍多い、請求項251~258のいずれか1項記載の方法。
- T細胞およびCAR T細胞が、患者に投与される前に決して凍結されない、請求項251~260のいずれか1項記載の方法。
- 患者の治療のためのCAR T細胞を調製する方法であって、
a)アフェレーシスにより患者から粗液体組成物を得ること、ここに該試料はT細胞を含むものであり、
b)該粗液体組成部物からT細胞を単離すること、ここに該単離は、サイズの相違に基づいてT細胞を粗液体組成物中の血小板および他の細胞から分子する1つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離によりT細胞が豊富化され血小板が減少した組成物が得られるものであり、
c)工程a)で得られた標的細胞を遺伝子操作して、それらの表面上にキメラ抗原受容体(CARs)を生成させること、ここに遺伝子操作前のいかなる工程においてもT細胞が遠心分離されないか、あるいは溶出処理されず、
d)遺伝子操作されたT細胞の数を増大させること、
e)サイズの相違に基づいてT細胞を試薬から分離する1つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上でT細胞を分離すること
を含む方法。 - 細胞が、患者への投与のために医薬組成物中に移されるまで凍結されない、請求項262記載の方法。
- 細胞がいかなる工程においても凍結されない、請求項262記載の方法。
- マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも3日早く完了する、請求項262~264のいずれか1項記載の方法。
- マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも1日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項262~265のいずれか1項記載の方法。
- マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも3日前にCAR T細胞が患者への投与に利用可能である、請求項262~265のいずれか1項記載の方法。
- 工程b)において、白血球に対する血小板の割合が、遠心分離または溶出処理を用いて得られる割合よりも少なくとも50%低い生成物組成物が得られる、請求項262~267のいずれか1項記載の方法。
- 患者の治療のための十分な数のCAR T細胞を産生時間するのに必要な時間が、フィコール遠心分離により単離された細胞を用いて同じ方法が行われる場合よりも少なくとも5%短い、請求項262~268のいずれか1項記載の方法。
- 患者の治療のための十分な数のCAR T細胞を産生時間するのに必要な時間が、アフェレーシス出発材料から細胞を単離するためにフィコール遠心分離を用いて同じ方法が行われる場合よりも少なくとも10%短い、請求項262~269のいずれか1項記載の方法。
- 該方法によって調製された細胞が患者に投与されるとき、それらの細胞が、遠心分離または溶出処理を用いてアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも10%少ない老化を示す、請求項262~270のいずれか1項記載の方法。
- 請求項235~271のいずれか1項記載の方法によって調製された治療上有効量の細胞を患者に投与することを含む、疾病または症状について患者を治療する方法。
- 該疾病または症状ががんである、請求項272記載の方法。
Applications Claiming Priority (12)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762553723P | 2017-09-01 | 2017-09-01 | |
US62/553,723 | 2017-09-01 | ||
US201762567553P | 2017-10-03 | 2017-10-03 | |
US62/567,553 | 2017-10-03 | ||
PCT/US2017/057876 WO2018080997A1 (en) | 2016-10-24 | 2017-10-23 | Deterministic lateral displacement in the preparation of cells and compositions for therapeutic uses |
USPCT/US2017/057876 | 2017-10-23 | ||
US201862635304P | 2018-02-26 | 2018-02-26 | |
US62/635,304 | 2018-02-26 | ||
US201862656939P | 2018-04-12 | 2018-04-12 | |
US62/656,939 | 2018-04-12 | ||
PCT/US2018/047426 WO2019046052A1 (en) | 2017-09-01 | 2018-08-22 | METHODS FOR PREPARING THERAPEUTICALLY ACTIVE CELLS USING MICROFLUIDIC |
JP2020512450A JP7393328B2 (ja) | 2017-09-01 | 2018-08-22 | マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020512450A Division JP7393328B2 (ja) | 2017-09-01 | 2018-08-22 | マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023159105A true JP2023159105A (ja) | 2023-10-31 |
Family
ID=65518436
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020512450A Active JP7393328B2 (ja) | 2017-09-01 | 2018-08-22 | マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 |
JP2023122659A Pending JP2023159105A (ja) | 2017-09-01 | 2023-07-27 | マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020512450A Active JP7393328B2 (ja) | 2017-09-01 | 2018-08-22 | マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US10844353B2 (ja) |
EP (1) | EP3675876A4 (ja) |
JP (2) | JP7393328B2 (ja) |
CN (1) | CN111065399B (ja) |
AU (1) | AU2018323875A1 (ja) |
CA (1) | CA3074495A1 (ja) |
WO (1) | WO2019046052A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2971279B1 (en) | 2013-03-15 | 2019-11-13 | The Trustees of Princeton University | Methods and devices for high throughput purification |
US20150064153A1 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-05 | The Trustees Of Princeton University | High efficiency microfluidic purification of stem cells to improve transplants |
US11493428B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-11-08 | Gpb Scientific, Inc. | On-chip microfluidic processing of particles |
US10976232B2 (en) | 2015-08-24 | 2021-04-13 | Gpb Scientific, Inc. | Methods and devices for multi-step cell purification and concentration |
JP7393328B2 (ja) | 2017-09-01 | 2023-12-06 | ジーピービー・サイエンティフィック・インコーポレイテッド | マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 |
AU2019270934A1 (en) * | 2018-05-13 | 2020-11-26 | Gpb Scientific, Inc. | Combined purification and concentration by deterministic lateral displacement with recirculation product |
CN115209996A (zh) | 2019-12-28 | 2022-10-18 | Gpb科学有限公司 | 用于处理颗粒和细胞的微流体盒 |
WO2021202892A1 (en) * | 2020-04-02 | 2021-10-07 | The Trustees Of Princeton University | Deterministic lateral displacement array with a single column of bumping obstacles |
TR202014391A1 (tr) * | 2020-09-10 | 2022-03-21 | Corlam Nano Ve Biyoteknoloji Biyomedikal Arastirma Gelistirme Sanayi Ve Ticaret As | Nano yapilari saflaştirmak i̇çi̇n bi̇r mi̇kroakişkan ci̇hazi |
EP4222473A1 (en) * | 2020-10-01 | 2023-08-09 | Carina Biotech Pty Ltd | Methods for purifying t cells |
CN116783283A (zh) * | 2020-11-13 | 2023-09-19 | Gpb科学有限公司 | 产生具有增加的核酸摄取的细胞群体的方法 |
CA3198232A1 (en) * | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Anthony Ward | Methods for producing cell populations with increased nucleic acid uptake |
CN112675935B (zh) * | 2021-01-22 | 2022-03-25 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 用于单细胞冷冻的液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用 |
CN113462522B (zh) * | 2021-08-09 | 2023-04-25 | 江西中医药大学 | 一种从体外血液分离磁珠的确定性侧向位移微流控芯片 |
CN113814010B (zh) * | 2021-08-30 | 2022-10-11 | 复旦大学 | 多细胞、多组织共培养仿生微流控芯片及其制备方法 |
WO2023114919A1 (en) * | 2021-12-15 | 2023-06-22 | Gpb Scientific, Inc. | Label-free cell isolation |
Family Cites Families (117)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4675286A (en) | 1985-01-28 | 1987-06-23 | Aspen Diagnostics, Inc. | Fetal cell separation and testing |
US5427663A (en) | 1993-06-08 | 1995-06-27 | British Technology Group Usa Inc. | Microlithographic array for macromolecule and cell fractionation |
US5707799A (en) | 1994-09-30 | 1998-01-13 | Abbott Laboratories | Devices and methods utilizing arrays of structures for analyte capture |
US5662813A (en) | 1994-10-21 | 1997-09-02 | Bioseparations, Inc. | Method for separation of nucleated fetal erythrocytes from maternal blood samples |
AU2438497A (en) | 1996-04-05 | 1997-10-29 | Johns Hopkins University, The | A method of enriching rare cells |
EP0987325B1 (en) * | 1997-01-24 | 2011-05-11 | Asahi Kasei Kuraray Medical Co., Ltd. | Method for separating cells |
US5968820A (en) | 1997-02-26 | 1999-10-19 | The Cleveland Clinic Foundation | Method for magnetically separating cells into fractionated flow streams |
US6241894B1 (en) | 1997-10-10 | 2001-06-05 | Systemix | High gradient magnetic device and method for cell separation or purification |
ATE239801T1 (de) | 1998-01-22 | 2003-05-15 | Luminex Corp | Mikropartikel mit multiplen fluoreszenz-signalen |
DE10035433C2 (de) | 2000-07-20 | 2002-07-18 | Tuma Wolfgang | Schonende Hochanreicherung von fetalen Zellen aus pripherem Blut und Verwendung derselben |
AU2002230979A1 (en) | 2000-12-18 | 2002-07-01 | Trustees Of Princeton University | Fractionation of macro-molecules using asymmetric pulsed field electrophoresis |
AU2002251946A1 (en) | 2001-02-14 | 2002-08-28 | Science And Technology Corporation @ Unm | Nanostructured devices for separation and analysis |
US6913697B2 (en) | 2001-02-14 | 2005-07-05 | Science & Technology Corporation @ Unm | Nanostructured separation and analysis devices for biological membranes |
CA2396408C (en) | 2001-08-03 | 2006-03-28 | Nec Corporation | Fractionating apparatus having colonies of pillars arranged in migration passage at interval and process for fabricating pillars |
WO2003018757A2 (en) | 2001-08-23 | 2003-03-06 | Immunivest Corporation | Stabilization of cells and biological specimens for analysis |
US7863012B2 (en) | 2004-02-17 | 2011-01-04 | Veridex, Llc | Analysis of circulating tumor cells, fragments, and debris |
EP2156879A3 (en) | 2001-10-11 | 2010-07-07 | Aviva Biosciences Corporation | Methods, compositions and automated systems for separating rare cells from fluid samples |
US7166443B2 (en) | 2001-10-11 | 2007-01-23 | Aviva Biosciences Corporation | Methods, compositions, and automated systems for separating rare cells from fluid samples |
WO2003050532A1 (fr) | 2001-12-11 | 2003-06-19 | Netech Inc. | Systeme de separation de cellules sanguines |
WO2003106693A2 (en) | 2002-01-01 | 2003-12-24 | Princeton University | Gradient structures interfacing microfluidics and nanofluidics, methods for fabrication and uses thereof |
WO2003066191A1 (en) | 2002-02-04 | 2003-08-14 | Colorado School Of Mines | Laminar flow-based separations of colloidal and cellular particles |
US20040019300A1 (en) | 2002-07-26 | 2004-01-29 | Leonard Leslie Anne | Microfluidic blood sample separations |
US20040043506A1 (en) | 2002-08-30 | 2004-03-04 | Horst Haussecker | Cascaded hydrodynamic focusing in microfluidic channels |
ATE531257T1 (de) | 2002-09-27 | 2011-11-15 | Gen Hospital Corp | Mikrofluidische vorrichtung zur zelltrennung und verwendungen davon |
AU2003299553A1 (en) | 2002-10-23 | 2004-05-13 | The Trustees Of Princeton University | Method for continuous particle separation using obstacle arrays asymmetrically aligned to fields |
WO2004104185A1 (en) | 2003-05-08 | 2004-12-02 | Xcyte Therapies, Inc. | Generation and isolation of antigen-specific t cells |
CA2529285A1 (en) | 2003-06-13 | 2004-12-29 | The General Hospital Corporation | Microfluidic systems for size based removal of red blood cells and platelets from blood |
US7906345B2 (en) | 2003-11-12 | 2011-03-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Magnetic nanoparticles, magnetic detector arrays, and methods for their use in detecting biological molecules |
WO2005084374A2 (en) | 2004-03-03 | 2005-09-15 | The General Hospital Corporation | Magnetic device for isolation of cells and biomolecules in a microfluidic environment |
US20060121624A1 (en) | 2004-03-03 | 2006-06-08 | Huang Lotien R | Methods and systems for fluid delivery |
EP1765503A2 (en) | 2004-03-03 | 2007-03-28 | The General Hospital Corporation | System for delivering a diluted solution |
WO2006078470A2 (en) | 2005-01-18 | 2006-07-27 | Biocept, Inc. | Cell separation using microchannel having patterned posts |
US20070026417A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Martin Fuchs | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US20070026413A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Mehmet Toner | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US20070026414A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Martin Fuchs | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US20070196820A1 (en) | 2005-04-05 | 2007-08-23 | Ravi Kapur | Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles |
US20070026418A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Martin Fuchs | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
JP2008538282A (ja) | 2005-04-05 | 2008-10-23 | セルポイント ダイアグノスティクス, インコーポレイテッド | 装置および循環腫瘍細胞および他の粒子の濃縮および変更のための方法 |
US20060223178A1 (en) | 2005-04-05 | 2006-10-05 | Tom Barber | Devices and methods for magnetic enrichment of cells and other particles |
US20070026415A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Martin Fuchs | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
EP1871870B1 (en) | 2005-04-08 | 2010-12-01 | Medical Discovery Partners LLC | Method for enriching rare cell subpopulations from blood |
US8354075B1 (en) | 2005-04-21 | 2013-01-15 | California Institute Of Technology | Streamline-based microfluidic device |
TWI273484B (en) | 2005-06-15 | 2007-02-11 | Inventec Corp | Method for increasing system performance |
US20070026416A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Martin Fuchs | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US20070059680A1 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-15 | Ravi Kapur | System for cell enrichment |
US8921102B2 (en) | 2005-07-29 | 2014-12-30 | Gpb Scientific, Llc | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US7993821B2 (en) | 2005-08-11 | 2011-08-09 | University Of Washington | Methods and apparatus for the isolation and enrichment of circulating tumor cells |
US20070059774A1 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-15 | Michael Grisham | Kits for Prenatal Testing |
US20070059719A1 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-15 | Michael Grisham | Business methods for prenatal Diagnosis |
CA2622745A1 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-29 | Artemis Health, Inc. | Systems and methods for enrichment of analytes |
US20070059718A1 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-15 | Mehmet Toner | Systems and methods for enrichment of analytes |
US20070059781A1 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-15 | Ravi Kapur | System for size based separation and analysis |
US20070059716A1 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-15 | Ulysses Balis | Methods for detecting fetal abnormality |
US7837944B2 (en) | 2006-05-05 | 2010-11-23 | Wayne State University | Device for separating and concentrating microfluidic particles |
WO2008016414A2 (en) | 2006-06-01 | 2008-02-07 | The Trustees Of Princeton University | Apparatus and method for continuous particle separation |
WO2007147018A1 (en) | 2006-06-14 | 2007-12-21 | Cellpoint Diagnostics, Inc. | Analysis of rare cell-enriched samples |
WO2008014516A2 (en) | 2006-07-28 | 2008-01-31 | Living Microsystems, Inc. | Selection of cells using biomarkers |
US7807454B2 (en) | 2006-10-18 | 2010-10-05 | The Regents Of The University Of California | Microfluidic magnetophoretic device and methods for using the same |
EP2142279A2 (en) | 2007-04-16 | 2010-01-13 | The General Hospital Corporation d/b/a Massachusetts General Hospital | Systems and methods for particle focusing in microchannels |
WO2008131048A2 (en) | 2007-04-16 | 2008-10-30 | Cellpoint Diagnotics, Inc. | Devices and methods for diagnosing, prognosing, or theranosing a condition by enriching rare cells |
US20110213288A1 (en) | 2007-04-23 | 2011-09-01 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Device And Method For Transfecting Cells For Therapeutic Uses |
EP2227334B1 (en) | 2007-12-07 | 2011-10-12 | Miltenyi Biotec GmbH | A centrifuge for separating a sample into at least two components |
WO2009076560A2 (en) | 2007-12-12 | 2009-06-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method and apparatus for magnetic separation of cells |
US8008032B2 (en) | 2008-02-25 | 2011-08-30 | Cellective Dx Corporation | Tagged ligands for enrichment of rare analytes from a mixed sample |
GB0803730D0 (en) | 2008-02-29 | 2008-04-09 | Airbus Uk Ltd | Shock bump array |
FR2931141B1 (fr) | 2008-05-13 | 2011-07-01 | Commissariat Energie Atomique | Systeme microfluidique et procede pour le tri d'amas de cellules et de preference pour leur encapsulation en continu suite a leur tri |
US9427688B2 (en) | 2008-07-10 | 2016-08-30 | Steven H. Reichenbach | Method and apparatus for sorting particles using asymmetrical particle shifting |
US8579117B2 (en) | 2008-07-24 | 2013-11-12 | The Trustees Of Princeton University | Bump array device having asymmetric gaps for segregation of particles |
EP2350652A2 (en) | 2008-10-10 | 2011-08-03 | Cnrs-Dae | Cell sorting device |
US9090663B2 (en) | 2009-04-21 | 2015-07-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Systems and methods for the capture and separation of microparticles |
US20120037544A1 (en) | 2009-04-23 | 2012-02-16 | Logos Energy, Inc. | Lateral displacement array for microfiltration |
WO2010129441A2 (en) | 2009-05-04 | 2010-11-11 | Gpb Scientific, Llc | Method for separating stem cells from their more differentiated progeny using microfluidic devices |
US8801922B2 (en) | 2009-06-24 | 2014-08-12 | State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Dialysis system |
WO2011063416A2 (en) | 2009-11-23 | 2011-05-26 | The General Hospital Corporation | Microfluidic devices for the capture of biological sample components |
CN102791616B (zh) | 2009-12-23 | 2015-07-29 | 西托维拉公司 | 用于粒子过滤的系统和方法 |
WO2011119962A2 (en) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | The General Hospital Corporation | Microfluidic enrichment of selected cell populations |
WO2012012801A2 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | The Johns Hopkins University | Device for capture, enumeration, and profiling of circulating tumor cells |
US9422517B2 (en) | 2010-07-30 | 2016-08-23 | The General Hospital Corporation | Microscale and nanoscale structures for manipulating particles |
US8480978B2 (en) * | 2010-08-12 | 2013-07-09 | University Of Southern California | Microfluidic fluid separator and related methods |
US20130143197A1 (en) | 2010-08-15 | 2013-06-06 | Gpb Scientific, Llc | Microfluidic Cell Separation in the Assay of Blood |
SG10201510092QA (en) | 2010-12-09 | 2016-01-28 | Univ Pennsylvania | Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer |
US20140154703A1 (en) | 2011-01-06 | 2014-06-05 | Alison Skelley | Circulating tumor cell capture on a microfluidic chip incorporating both affinity and size |
EP2760993A4 (en) | 2011-09-30 | 2015-06-03 | Massachusetts Inst Technology | CELL SORTING THROUGH 3D RIVER AND HAIR ROLLING |
US9149806B2 (en) * | 2012-01-10 | 2015-10-06 | Biopico Systems Inc | Microfluidic devices and methods for cell sorting, cell culture and cells based diagnostics and therapeutics |
EP2817318A4 (en) | 2012-02-22 | 2016-04-27 | Univ Pennsylvania | COMPOSITIONS AND METHOD FOR GENERATING A PERSISTENT POPULATION OF T CELLS FOR CANCER TREATMENT |
WO2013126774A2 (en) * | 2012-02-24 | 2013-08-29 | President And Fellows Of Harvard College | Microfluidic devices for capture of target species |
US9278353B2 (en) | 2012-06-25 | 2016-03-08 | The General Hospital Corporation | Sorting particles using high gradient magnetic fields |
AU2013335180B2 (en) | 2012-10-24 | 2018-07-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | M971 chimeric antigen receptors |
US20150362413A1 (en) | 2013-01-24 | 2015-12-17 | National University Of Singapore | Microdevices for separation of non-spherical particles and applications thereof |
US20150064153A1 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-05 | The Trustees Of Princeton University | High efficiency microfluidic purification of stem cells to improve transplants |
US20140342375A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-11-20 | University Of Maryland | Microfluidic processing of leukocytes for molecular diagnostic testing |
EP2971279B1 (en) * | 2013-03-15 | 2019-11-13 | The Trustees of Princeton University | Methods and devices for high throughput purification |
WO2016019393A1 (en) * | 2014-08-01 | 2016-02-04 | Gpb Scientific, Llc | Methods and systems for processing particles |
US11493428B2 (en) * | 2013-03-15 | 2022-11-08 | Gpb Scientific, Inc. | On-chip microfluidic processing of particles |
US20170209864A1 (en) | 2013-03-15 | 2017-07-27 | Gpb Scientific, Llc | Methods and systems for processing particles |
US9629877B2 (en) | 2013-05-14 | 2017-04-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Human application of engineered chimeric antigen receptor (CAR) T-cells |
CN105518464B (zh) * | 2013-07-05 | 2019-12-03 | 华盛顿大学商业中心 | 微流体分析的方法、组合物和系统 |
EP3560591B1 (en) | 2013-10-18 | 2021-02-17 | The General Hospital Corporation | Microfluidic sorting using high gradient magnetic fields |
SG2013090790A (en) | 2013-12-04 | 2015-07-30 | Clearbridge Mfluidics Pte Ltd | A microfluidic device |
WO2015116990A1 (en) | 2014-01-30 | 2015-08-06 | The General Hospital Corporation | Inertio-elastic focusing of particles in microchannels |
US10131876B2 (en) * | 2014-04-24 | 2018-11-20 | Miltenyi Biotec Gmbh | Method for automated generation of genetically modified T cells |
RU2741899C2 (ru) | 2014-04-25 | 2021-01-29 | Блубёрд Био, Инк. | Улучшенные способы производства средств адоптивной клеточной терапии |
WO2015179801A1 (en) | 2014-05-23 | 2015-11-26 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Car based immunotherapy |
US10982189B2 (en) | 2014-07-11 | 2021-04-20 | Celgene Corporation | Methods of improving vector transduction efficiency into T lymphocytes |
JP6687601B2 (ja) * | 2014-08-07 | 2020-04-22 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 全血サンプルの安定化 |
EP3193592A1 (en) | 2014-09-19 | 2017-07-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric antigen receptors |
US20170224789A1 (en) | 2014-10-16 | 2017-08-10 | Piramal Enterprises Limited | Stable injectable composition of bivalirudin and process for its preparation |
CA2966623C (en) | 2014-11-03 | 2024-02-20 | The General Hospital Corporation | Concentrating particles in a microfluidic device |
CN107250343B (zh) * | 2015-02-27 | 2020-12-29 | 凸版印刷株式会社 | 分离细胞的方法及用于该方法的器件 |
JP2018522833A (ja) | 2015-06-12 | 2018-08-16 | イミューノメディクス、インコーポレイテッドImmunomedics, Inc. | キメラ抗原受容体(car)コンストラクト、及びcarコンストラクトを発現するt細胞(car−t)またはnk細胞(car−nk)による疾患治療 |
US10976232B2 (en) | 2015-08-24 | 2021-04-13 | Gpb Scientific, Inc. | Methods and devices for multi-step cell purification and concentration |
EP3341893A4 (en) * | 2015-08-24 | 2019-03-06 | GPB Scientific, LLC | METHODS AND DEVICES FOR PURIFICATION AND CONCENTRATION OF MULTI-STEP CELLS |
AU2016344745A1 (en) * | 2015-10-28 | 2018-05-17 | Life Technologies As | Selective expansion of different subpopulations of T cells by the alteration of cell surfacing signals and signal ratio |
WO2018080997A1 (en) | 2016-10-24 | 2018-05-03 | Gpb Scientific, Llc | Deterministic lateral displacement in the preparation of cells and compositions for therapeutic uses |
JP7393328B2 (ja) | 2017-09-01 | 2023-12-06 | ジーピービー・サイエンティフィック・インコーポレイテッド | マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 |
AU2019270934A1 (en) | 2018-05-13 | 2020-11-26 | Gpb Scientific, Inc. | Combined purification and concentration by deterministic lateral displacement with recirculation product |
WO2020014538A1 (en) | 2018-07-12 | 2020-01-16 | Gpb Scientific, Llc | Microfluidic methods for the preparation of cells |
-
2018
- 2018-08-22 JP JP2020512450A patent/JP7393328B2/ja active Active
- 2018-08-22 US US16/108,365 patent/US10844353B2/en active Active
- 2018-08-22 CN CN201880056966.3A patent/CN111065399B/zh active Active
- 2018-08-22 CA CA3074495A patent/CA3074495A1/en active Pending
- 2018-08-22 WO PCT/US2018/047426 patent/WO2019046052A1/en unknown
- 2018-08-22 AU AU2018323875A patent/AU2018323875A1/en not_active Abandoned
- 2018-08-22 EP EP18851908.6A patent/EP3675876A4/en active Pending
-
2019
- 2019-10-24 US US16/662,033 patent/US10988734B2/en active Active
-
2020
- 2020-09-02 US US17/009,797 patent/US11149251B2/en active Active
-
2021
- 2021-03-04 US US17/192,691 patent/US11306288B2/en active Active
- 2021-09-06 US US17/467,385 patent/US20220041985A1/en active Pending
-
2023
- 2023-07-27 JP JP2023122659A patent/JP2023159105A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7393328B2 (ja) | 2023-12-06 |
US11306288B2 (en) | 2022-04-19 |
US10844353B2 (en) | 2020-11-24 |
WO2019046052A1 (en) | 2019-03-07 |
US10988734B2 (en) | 2021-04-27 |
EP3675876A1 (en) | 2020-07-08 |
US20190071639A1 (en) | 2019-03-07 |
CA3074495A1 (en) | 2019-03-07 |
US20220041985A1 (en) | 2022-02-10 |
CN111065399A (zh) | 2020-04-24 |
US20210207094A1 (en) | 2021-07-08 |
JP2020532298A (ja) | 2020-11-12 |
US20200399600A1 (en) | 2020-12-24 |
CN111065399B (zh) | 2023-11-28 |
US11149251B2 (en) | 2021-10-19 |
EP3675876A4 (en) | 2021-06-02 |
US20200056153A1 (en) | 2020-02-20 |
AU2018323875A1 (en) | 2020-04-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7393328B2 (ja) | マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 | |
AU2017350739B2 (en) | Deterministic lateral displacement in the preparation of cells and compositions for therapeutic uses | |
US20210115401A1 (en) | Methods and Materials for the Generation of Regulatory T Cells | |
JP2020532298A5 (ja) | ||
US20150017721A1 (en) | Method for inducing proliferation of natural killer cells by mobile nanomatrices | |
JP2004129550A (ja) | 単球の分離回収方法 | |
CA3127261A1 (en) | Cell populations with improved production and therapeutic characteristics | |
US20220267726A1 (en) | Ordered processing of blood products to produce therapeutically active cells | |
JP4318234B2 (ja) | 単球を分化誘導せしめる方法 | |
JP2023550050A (ja) | 核酸取込み量が増加した細胞集団を生成する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230825 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230825 |