JP6326582B2 - 微粒子分離用マイクロ流路チップ、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法 - Google Patents

Description

本発明は、液体中に混在するサイズの異なる微粒子を分離するための微粒子分離用マイクロ流路チップ、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法に関するもので、特に、血液中の循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ、以下「ＣＴＣ」と略記することもある。）を選択的に捕捉するためのＣＴＣ分離用マイクロ流路チップ、該チップを用いたＣＴＣ分離用システム及びＣＴＣ分離方法に関する。

ＣＴＣはがん患者の末梢血流を循環する腫瘍細胞と定義され、原発腫瘍又は転移腫瘍から血管中へ浸潤した腫瘍細胞である。このＣＴＣの検出は、転移性悪性腫瘍の早期発見の方法の一つとして近年注目されている。その理由は、Ｘ線写真や血清中の腫瘍マーカー検出よりも低侵襲かつ正確に転移性悪性腫瘍の診断を行え、患者の予後予測や治療効果の指標として利用できる点にある。

ＣＴＣは非常に稀少な細胞であり、転移性がん患者の血液に含まれる１０⁸〜１０⁹個の血液細胞の内、わずか１細胞程度しか存在しないことが知られている。そのため、末梢血から稀少なＣＴＣを正確に検出するための技術開発に多大な努力が注がれている。これまでに開発されてきた主要な検出方法には、免疫組織化学法、ＰＣＲ法、フローサイトメトリー法などがある。しかしながら、前述したようにＣＴＣは非常に稀少な細胞であるため、血液をそのままこれらの検出方法に供することは出来ないので、通常は前処理として、ＣＴＣの濃縮操作が必須であり、検出法に則したレベルまでＣＴＣ存在比を濃縮させる必要がある。

ＣＴＣの濃縮方法として開発されてきた様々な手法の中で、最も広く利用されているのは、細胞表面の特異的抗原を標的とした腫瘍細胞の濃縮である。その多くは、上皮細胞接着分子（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体を固定化した磁気微粒子を血液と混合した後、磁石を用いて腫瘍細胞を濃縮する方法をとっている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、ＥｐＣＡＭの発現量は腫瘍のタイプに依存し大きく変動することが知られている。

その他の濃縮方法としては、細胞のサイズなどの形態を基準として濃縮する手法がある。白血球に比べてサイズが大きな上皮性腫瘍細胞をフィルトレーションによって選別する方法は、ＩＳＥＴ法（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｚｅ ｏｆ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれている。ＩＳＥＴは、孔径８μｍのポリカーボネートメンブレンフィルターを用いて血液をフィルトレーションするという簡便な手法であり、安価かつユーザーフレンドリーな手法である。ここで用いられているポリカーボネートメンブレンフィルターは、重イオンを照射した後、エッチングを行うトラックエッチングという手法によって、孔が形成されている。しかし、孔が比較的低密度であり、二つ又はそれ以上の孔が重なりあったりする問題があるため、ＣＴＣの捕捉に利用した場合、その捕捉効率は５０〜６０％とされており、濃縮法が簡便かつ効率も良い手法は未だ開発されていない。

ＣＴＣの検出を効率的かつ正確なものにするためには、濃縮と検出といった技術を首尾一貫して行うことが必要である。多段階のハンドリング操作、例えば細胞の染色、洗浄、分離、分注などの操作はＣＴＣのロスを引き起こすため、可能な限りこれらの操作を避け、一体の検出装置中で分析が一貫して行える形が好ましい。Ｃｅｌｌｓｅａｒｃｈ（ＶｅｒｉｄｅｘＴＭ，Ｗａｒｒｅｎ，ＰＡ）はＣＴＣ検出装置として唯一ＦＤＡの認可を受けた装置である。この装置では、全血に対し抗ＥｐＣＡＭ抗体固定化磁気微粒子によるＣＴＣの濃縮を行い、腫瘍細胞に対して免疫染色を行った後、自動化蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、当該装置を用いる場合、一般的に大型の装置導入と訓練されたオペレーターの確保が必要であり、ベッドサイドで短時間且つ正確に検査をすることは困難である。

一方で、ＣＴＣ検出のための小型のマイクロ流体デバイスも知られている。例えば、Ｔｏｎｅｒらが開発したＣＴＣ検出用マイクロ流体デバイスはＣＴＣ−ｃｈｉｐと呼ばれ、フォトリソグラフィーによって形成されたシリコン製の流路内に、円筒状構造物（マイクロポスト）が７８０００個構成されている。このマイクロポストには、抗ＥｐＣＡＭ抗体がコーティングされており、本流路に血液を送液すると、血液中のＣＴＣがマイクロポスト上に捕捉される。捕捉されたＣＴＣに対して、上皮細胞マーカー（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）をターゲットとした蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる。本装置は、手のひらに乗る小型デバイスでありながら、５ｍＬ以上の血液をそのまま分析に供することができるという大きな利点を持っている。実際に転移性がん患者血液からＣＴＣ検出を行っており、回収したＣＴＣからチロシンキナーゼ阻害薬に対する耐性を生む変異を検出することが出来る。しかしながら、ＣｅｌｌｓｅａｒｃｈやＣＴＣ−ｃｈｉｐを用いたＣＴＣ検出は、転移性がん患者血液などの実サンプルを用いた実験が精力的に行われ実績を挙げているが、これらの手法は抗ＥｐＣＡＭ抗体でＣＴＣを濃縮するという原理になっている。そのため、ＥｐＣＡＭ陰性又は弱陽性の腫瘍細胞は検出できないという問題点が挙げられる。

その他の方法としては、腫瘍細胞のサイズと形態を指標として、ＣＴＣを検出するマイクロ流体デバイスが開発されている。これらのデバイスでは、その流路構造内にメンブレンマイクロフィルター、三日月型の細胞捕捉ウェル（非特許文献３参照）、４段階の細さの流路（非特許文献４参照）を配して、血液中の血球細胞と腫瘍細胞をサイズによって選別し、腫瘍細胞を選択的に濃縮している。また、その流路を利用して、濃縮後の細胞に対して溶解などの操作を連続的に行うことが出来る。これらのデバイスを用いたモデル腫瘍細胞の回収効率の評価実験においては、８０％以上のＣＴＣ回収効率を得ている。しかしながら、この評価はあくまでモデル細胞を用いた実験で行われており、実際にＣＴＣ検出時に必要となる細胞の染色操作や洗浄操作といった要素技術項目については検討されていない。さらに、がん患者血液などの実サンプルを用いた実験は行われておらず、実際にＣＴＣ検出に利用できるかどうかは明らかにされていない。

更に、抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用しない小型のデバイスとしては、マイクロ流路内にマイクロキャビティアレイ（微細貫通孔）を設け、ＣＴＣを捕捉することができるマイクロ流体デバイスが知られている（特許文献１参照）。しかしながら、前記マイクロ流体デバイスは、微細貫通孔にＣＴＣを捕捉するタイプであるので、ＣＴＣの目詰まりによる作業効率の低下、更には分離したＣＴＣの回収が困難であるという問題がある。

特開２０１１−１６３８３０号公報

Ａｌｌａｒｄ ＷＪ， Ｍａｔｅｒａ Ｊ， Ｍｉｌｌｅｒ ＭＣ， Ｒｅｐｏｌｌｅｔ Ｍ， Ｃｏｎｎｅｌｌｙ ＭＣ， Ｒａｏ Ｃ， Ｔｉｂｂｅ ＡＧ， Ｕｈｒ ＪＷ， Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ ＬＷ． ２００４． Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ａｌｌ ｍａｊｏｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０（２０）：６８９７−９０４． Ｒｉｅｔｈｄｏｒｆ Ｓ， Ｆｒｉｔｓｃｈｅ Ｈ， Ｍｕｌｌｅｒ Ｖ， Ｒａｕ Ｔ， Ｓｃｈｉｎｄｌｂｅｃｋ Ｃ， Ｒａｃｋ Ｂ， Ｊａｎｎｉ Ｗ， Ｃｏｉｔｈ Ｃ， Ｂｅｃｋ Ｋ， Ｊａｎｉｃｋｅ Ｆ ａｎｄ ｏｔｈｅｒｓ． ２００７． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ｓｙｓｔｅｍ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３（３）：９２０−８． Ｔａｎ ＳＪ， Ｙｏｂａｓ Ｌ， Ｌｅｅ ＧＹ， Ｏｎｇ ＣＮ， Ｌｉｍ ＣＴ． ２００９． Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ １１（４）：８８３−９２． Ｍｏｈａｍｅｄ Ｈ， Ｍｕｒｒａｙ Ｍ， Ｔｕｒｎｅｒ ＪＮ， Ｃａｇｇａｎａ Ｍ． ２００９． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １２１６（４７）：８２８９−９５．

本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（１）複数の主流路、及び該主流路の幅より大きな捕捉部位が各々の主流路に１以上設けられていることを特徴とする微粒子分離用マイクロ流路チップ、又は（２）複数の主流路、該主流路から分岐し再び主流路に接続する複数の分岐流路、及び該分岐流路に分岐流路の幅より大きな捕捉部位が設けられている微粒子分離用マイクロ流路チップ、を用い、気液界面のメニスカスで生じる力を利用して微粒子をチップに施したマイクロ流路に沈降させ、目的とする微粒子のみをマイクロ流路に設けられた捕捉部位で捕捉できることを新たに見出した。

更に、微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル液用薄板及びシース液用薄板を相対移動させることでメニスカスを発生させる場合は、サンプルとして全血を用いてもＣＴＣのみを連続的に分離・回収ができること、及び、微粒子分離用マイクロ流路チップとカバー板を相対移動させずサンプルを吸引することでメニスカスを発生させる場合は、操作性よくＣＴＣのみを連続的に分離・回収ができることを新たに見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の目的は、微粒子分離用マイクロ流路チップ、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法を提供することである。

本発明は、以下に示す、微粒子分離用マイクロ流路チップ、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法に関する。

（１）複数の主流路、及び該主流路の幅より大きな捕捉部位が各々の主流路に１以上設けられていることを特徴とする微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（２）前記捕捉部位で捕捉される微粒子の大きさをＸ、分離・除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記主流路の幅ＡはＹ＜Ａ＜Ｘ、前記捕捉部位の幅Ｂは１Ｘ＜Ｂ＜１０Ｘであり、前記捕捉部位の深さＣは１Ｘ＜Ｃ＜１０Ｘ、前記捕捉部位における主流路の深さＤはＹ＜Ｄであり、前記捕捉部位以外の主流路の深さＥはＥ＝Ｃ＋Ｄであることを特徴とする上記（１）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（３）前記捕捉部位の幅Ｂが１Ｘ＜Ｂ＜２Ｘであり、前記捕捉部位の深さＣが１Ｘ＜Ｃ＜２Ｘであることを特徴とする上記（２）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（４）前記主流路の幅ＡがＹ＜Ａ＜０．８Ｘであることを特徴とする上記（２）又は（３）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（５）複数の主流路、該主流路から分岐し再び主流路に接続する１以上の分岐流路、及び該分岐流路に分岐流路の幅より大きな捕捉部位が設けられていることを特徴とする微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（６）前記捕捉部位で捕捉される微粒子の大きさをＸ、分離・除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記主流路及び分岐流路の幅ＦはＹ＜Ｆ＜Ｘ、前記捕捉部位の幅Ｇは１Ｘ＜Ｇ＜１０Ｘ、前記主流路、前記分岐流路及び前記捕捉部位の深さＨは１Ｘ＜Ｈ＜１０Ｘであることを特徴とする上記（５）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（７）前記捕捉部位の幅Ｇが１Ｘ＜Ｇ＜２Ｘ、前記主流路、前記分岐流路及び前記捕捉部位の深さＨが１Ｘ＜Ｈ＜２Ｘであることを特徴とする上記（６）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（８）前記主流路及び分岐流路の幅ＦがＹ＜Ｆ＜０．８Ｘであることを特徴とする上記（６）又は（７）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（９）前記主流路、前記分岐流路及び前記捕捉部位の下方に、幅がＦ、深さＪがＹ＜Ｊの流路が更に設けられていることを特徴とする上記（６）〜（８）の何れか一に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（１０）前記複数の主流路の一端に連結する排出路を含むことを特徴とする上記（１）〜（９）の何れか一に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（１１）前記捕捉部位で捕捉される微粒子がＣＴＣで、除去される微粒子が血球細胞であることを特徴とする上記（１）〜（１０）の何れか一に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（１２）上記（１）〜（１１）の何れか一に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、サンプル液用薄板、シース液用薄板、シース液を吸引する吸引手段及び／又は吸引装置を含むことを特徴とする微粒子分離用システム。
（１３）上記（１）〜（１１）の何れか一に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、カバー板、吸引手段及び／又は吸引装置を含むことを特徴とする微粒子分離用システム。
（１４）横溝及び該横溝に連通する吸引孔を含む吸引ユニットを更に含むことを特徴とする上記（１２）又は（１３）に記載の微粒子分離用システム。
（１５）前記微粒子分離用マイクロ流路チップの捕捉部位に磁場発生装置及び／又は電場発生装置を設けることを特徴とする上記（１２）〜（１４）の何れか一に記載の微粒子分離用システム。
（１６）上記（１）〜（１１）の何れか一に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル液用薄板の間にサンプル液を注入し、微粒子分離用マイクロ流路チップとシース液用薄板の間にシース液を注入し、微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル液用薄板及びシース液用薄板を相対移動させることで発生するメニスカスにより、目的とする微粒子は前記微粒子分離用マイクロ流路チップに設けられた捕捉部位に捕捉され、除去される微粒子は吸引手段及び／又は吸引装置により吸引されたシース液により微粒子分離用マイクロ流路チップから除去されることを特徴とする微粒子分離方法。
（１７）上記（１）〜（１１）の何れか一に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップとカバー板の間にサンプル液を注入し、吸引手段及び／又は吸引装置で前記サンプル液を吸引することで発生するメニスカスにより、目的とする微粒子を前記微粒子分離用マイクロ流路チップに設けられた捕捉部位に捕捉することを特徴とする微粒子分離方法。
（１８）前記サンプル液を吸引した後に、微粒子分離用マイクロ流路チップとカバー板の間にシース液を注入し、吸引手段及び／又は吸引装置で前記シース液を吸引することで、残存している除去される微粒子を洗い流すことを特徴とする上記（１７）に記載の微粒子分離方法。

本発明の微粒子分離用システムは、液体中のサイズの異なる微粒子、例えば、赤血球、白血球等が混在している全血中から前処理なしにＣＴＣのみを短時間で高精度に分離することができるので、簡便な操作によるベッドサイド型がん診断が可能となる。

本発明の微粒子分離用システムに用いられる微粒子分離用マイクロ流路チップは抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用していないので、ＣＴＣ陰性又は弱陽性の腫瘍細胞であっても確実に検出することができる。また、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップは、赤血球、白血球等のサイズの小さい細胞はシース液によりチップの外に流し、ＣＴＣ等のサイズが大きな細胞は流路に設けた捕捉部位で捕捉することができるので、従来のフィルタタイプのデバイスと異なり、デバイスの目詰まりが無く、連続的に処理することが可能となる。

更に、本発明の微粒子分離用システムに用いられる微粒子分離用マイクロ流路チップは、半導体形成プロセスを用いて量産が可能であることから、ＣＴＣ検査のコストを大幅に削減することができる。

また、微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル液用薄板及びシース液用薄板を相対移動させることでメニスカスを発生させる場合は、全血を用いてもＣＴＣのみを連続的に分離・回収ができる。

一方、微粒子分離用マイクロ流路チップとカバー板を相対移動させずサンプルを吸引することでメニスカスを発生させる場合は、微粒子分離用マイクロ流路チップとカバー板の間隔を保持した状態で相対移動操作をする必要が無いことから、微粒子分離用システムの操作性を向上することができる。更に、カバー板を微粒子分離用マイクロ流路チップに形成した主流路の全てを覆う大きさで形成すると、相対移動させる場合と比較して、一度に多くの主流路にメニスカスを発生することができるので、処理効率を向上することができる。

図１は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップの一例を示す概略図である。 図２は、図１の主流路２の断面を示す図である。 図３は、微粒子分離用マイクロ流路チップを作製する手順を示したフローチャートである。 図４は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップの他の例の概略を示す図である。 図５は、本発明の微粒子分離用システムの概略及び使用形態を示す図で、微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル液用薄板及びシース液用薄板を相対移動させることでメニスカスを発生させる実施形態を示している。 図６は、メニスカスの発生原理を説明する図である。 図７は、本発明の微粒子分離用システムの概略及び使用形態を示す図で、微粒子分離用マイクロ流路チップとカバー板を相対移動させずサンプルを吸引することでメニスカスを発生させる実施形態を示している。 図８（１）〜（５）は、図７のＡ−Ａ′断面図で、本実施形態におけるメニスカスの発生原理を説明する図である。 図９（１）は吸引ユニット３５の概略を示す上面図で、図９（２）は吸引ユニット３５のＢ−Ｂ′断面図を示している。 図１０は、図面代用写真で、実施例１で得られた微粒子分離用マイクロ流路チップの外観を示す写真である。 図１１は、図面代用写真で、実施例２で得られた微粒子分離用マイクロ流路チップの外観を示す写真である。 図１２は、図面代用写真で、実施例４で得られた微粒子分離用マイクロ流路チップの外観を示す写真である。 図１３、実施例１〜４で得られた微粒子分離用マイクロ流路チップを用いて血液サンプルからＣＴＣを分離した際の捕捉率を示す図である。 図１４は、図面代用写真で、実施例１２において、サンプル液を吸引することで、メニスカスが発生する位置がずれていることを示す写真である。 図１５は、図面代用写真で、実施例１３において、サンプル液を吸引することでメニスカスが発生する位置がずれること、及び直径２０μｍのビーズが捕捉部位で捕捉されていることを示す写真である。

以下に、微粒子分離用マイクロ流路チップ、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離方法について詳しく説明する。

図１は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップの一例を示しており、微粒子分離用マイクロ流路チップ１は、主流路２、主流路２に設けられた複数の捕捉部位３、複数の主流路２の一端に連結する排出路４、排出路４から排出される流体の排出口５を有している。なお、本発明において、「微粒子」とは、液体に分散できる粒子であって、粒子の形態は単独又は凝集状態のものを意味する。微粒子の大きさは、メニスカスの原理が適用できる範囲であれば特に制限はなく、約１ｍｍ以下の大きさであればよい。また、「複数の主流路」とは主流路が少なくとも２本以上であることを意味する。

図２は、図１の主流路２の断面を示す図で、（１）は主流路２の捕捉部位３が設けられていない位置ａ−ａの断面図、（２）は主流路２の捕捉部位３が設けられている位置ｂ−ｂの断面図である。主流路２の幅及び深さ、捕捉部位３の幅及び深さは、分離する対象物の大きさに応じて適宜設定すればよいが、図２（２）の下段部分の流路で除去すべき微粒子を後述するシース液を用いてチップから排出し、上段の捕捉部位で目的の微粒子を捕捉することから、前記捕捉部位で捕捉される微粒子の大きさをＸ、分離・除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記主流路２の幅ＡはＹ＜Ａ＜Ｘ、前記捕捉部位３の幅Ｂは１Ｘ＜Ｂ＜１０Ｘ、前記捕捉部位３の深さＣは１Ｘ＜Ｃ＜１０Ｘ、前記捕捉部位３における流路の深さＤはＹ＜Ｄとすることが望ましく、前記捕捉部位３以外の流路の深さＥはＥ＝Ｃ＋Ｄとすることが好ましい。Ｂ及びＣを１０Ｘ以上にすると、捕捉部位３の大きさに対する主流路２の幅が小さくなりすぎ、微粒子の分離・除去の処理能力が低下するので好ましくない。なお、前記の１Ｘ＜Ｂ＜１０Ｘ、１Ｘ＜Ｃ＜１０Ｘは、捕捉部位３の下段の主流路２が一本の例であるが、捕捉部位３の下段に複数本の主流路２を設けて微粒子分離の処理能力を上げれば、Ｂ及びＣは１０Ｘ以上であってもよい。

また、前記の数値は目的の微粒子の濃縮等、捕捉部位で複数個の微粒子を捕捉する場合の範囲であるが、捕捉した微粒子を分析等するために個々の捕捉部位３で捕捉する微粒子を１個とする場合は、１Ｘ＜Ｂ＜２Ｘ、１Ｘ＜Ｃ＜２Ｘとすればよい。更に、捕捉部位３で捕捉される目的の微粒子が生体細胞等、形状が変化し易い場合は、流体力により細胞が変形して捕捉部位３をすり抜けてしまう可能性がある。そのため、主流路の幅Ａは目的の微粒子の形状の変化割合に応じて適宜選択すればよく、例えば、ＣＴＣの場合は、前記主流路２の幅ＡをＹ＜Ａ＜０．８Ｘとすることが好ましい。

全血から、ＣＴＣを捕捉し、ＣＴＣ以外の赤血球、白血球等の血球細胞を除去する場合、主流路２の幅Ａは、ＣＴＣの直径（１５〜３０μｍ）よりは小さく、赤血球、白血球等の血球細胞（約７μｍ）より大きくすればよく、８〜１２μｍが好ましい。一方、捕捉部位３は、ＣＴＣを捕捉できる形状であれば特に制限はなく、円形、略正方形、６、８等の多角形が挙げられ、捕捉部位３でＣＴＣを捕捉する必要があることから、捕捉部位３の幅Ｂ及び深さＣは、ＣＴＣの直径より大きい必要があり、１６〜３６μｍが好ましい。なお、捕捉部位３の幅とは、捕捉部位３の形状が円形の場合は直径、正方形の場合は１辺、６、８等の多角形の場合は多角形の中心を通る最短となる長さを意味する。

また、捕捉部位３においては、（２）で示される上段部分でＣＴＣを捕捉し、下段部分の主流路２で、後述するシース液で血球細胞を除去することから、主流路２の深さＤは、少なくとも血球細胞の直径より大きい必要があり、また、１以上の血球細胞を同時に除去できることが好ましいことから、深さＤは、８〜２０μｍが好ましい。捕捉部位３が設けられていない主流路２の深さＥはＣ＋Ｄとすればよい。

上記の例は、全血からＣＴＣを分離する場合の大きさであるが、例えば、腹腔洗浄液において血球細胞または中皮細胞（約７〜１５μｍ）から胃がん細胞塊（２５〜５０μｍ）を分離する場合は、主流路２の深さＤは８〜２４μｍとすればよく、捕捉部位３の幅Ｂ及び深さＣは２６μｍ〜６０μｍとすればよい。

前記微粒子分離用マイクロ流路チップは、フォトリソグラフィー技術を用いて作製することができる。図３は作製手順の一例を示したフローチャートで、図１及び２に示す微粒子分離用マイクロ流路チップは２段形状になっているため、２段露光技術を用いて作製する。

先ず、シリコン基板を超音波洗浄機により有機洗浄し、ベイクする。次いで、図３に示す以下の手順で作製する。
１．ネガティブフォトレジスト（ＳＵ−８）をＳｉの基板上にスピンコートし、ホットプレート上でプリベイクする。
２．クロムマスク等のフォトマスクを用い露光する。
３．ホットプレート上でポストエクスポージャーベイクを行い、現像液（ＰＭシンナー等）を用い現像した後、超純水を用いリンスし、スピンドライヤー等で水分をとばし乾燥させる。
４．２段目のＳＵ−８のネガティブフォトレジストをスピンコートし、プリベイクする。
５．クロムマスク等を用い露光する。
６．ポストエクスポージャーベイク、現像、リンスを行い、パターンを形成する。
７．形成されたパターンを、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に転写する。
８．形成されたパターンからＰＤＭＳを分離する。
９．ＰＤＭＳ表面を親水化する。

有機洗浄は、アセトン、エタノール等、半導体製造分野で一般的に用いられている洗浄剤であれば特に制限はされない。また、上記の手順では、基板としてＳｉを用いた例を示したが、フォトリソグラフィー技術分野で一般的に用いられている材料であれば基板の材料は特に限定はされず、例えば、シリコンカーバイド、サファイア、リン化ガリウム、ヒ化ガリウム、リン化ガリウム、窒化ガリウム等が挙げられる。ネガティブフォトレジストもＳＵ−８に限定されず、例えば、ＫＭＰＲ等、また、ポジティブフォトレジストであれば、例えば、ＰＭＥＲ、ＡＺ等一般的に使用されているレジストを用いることもできる。

また、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップの材料としては、上記手順ではＰＤＭＳを用いたが、例えば、ＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ＰＣ、硬質ポリエチレン製等のプラスチック、ハイドロゲル、ガラス等を用いてもよい。

チップ表面は親水化処理されることで、マイクロチップに液体を注入した際、溝に気泡が入ることを防止できる。親水化処理方法としては、プラズマ処理、界面活性剤処理、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）処理、光触媒等が挙げられ、例えば、チップ表面を１０〜３０秒間プラズマ処理することで、チップ表面に水酸基を導入することができる。また、チップ表面の浸水化処理は、主流路、後述する分岐流路及び捕捉部位のみを親水化処理してもよい。主流路、分岐流路及び捕捉部位以外の部分は親水化処理されていないので、サンプル液やシース液は主流路、分岐流路及び捕捉部位に流れやすくなり、微粒子の捕捉効率を向上することができる。主流路、分岐流路及び捕捉部位の親水化処理は、他の部分をマスク等で多い、上記と同様の方法で親水化処理すればよい。あるいは、上記マスクをポジネガ反転させてフッ素樹脂等を蒸着させて、疎水処理を行ってもよい。

図４は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップの他の例の概略を示す図である。図４の（１）〜（３）に示す例は、いずれも、主流路１１から分岐する分岐流路１２を設け、該分岐流路１２中に捕捉部位１３が設けられ、そして、分岐流路１２は、再び主流路１１と接続している。なお、分岐流路１２に設けられる捕捉部位１３は図４の（１）〜（３）に示されるように、主流路１１と接触していてもよい。（１）は分岐流路１２に設けられた捕捉部位１３が円形状の例を示しており、（２）は主流路１１の流れ方向の鉛直方向に、角が滑らかな略正方形の捕捉部位１３が設けられた例を示しており、（３）は主流路１１の流れ方向に角を滑らかにした略正方形の捕捉部位１３が設けられるとともに主流路１１の流れ方向を約９０度変化させた例を示している。

主流路１１及び分岐流路１２の幅・深さ、捕捉部位１３の大きさは、分離する対象物の大きさに応じて適宜設定すればよいが、図２に示す微粒子分離用マイクロ流路チップと同様、捕捉部位１３で捕捉される微粒子の大きさをＸ、分離・除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記主流路１１及び分岐流路１２の幅ＦはＹ＜Ｆ＜Ｘが好ましく、前記捕捉部位１３の幅Ｇ、並びに前記主流路１１、分岐流路１２及び捕捉部位１３の深さＨは、１Ｘ＜Ｇ＜１０Ｘ、１Ｘ＜Ｈ＜１０Ｘとすることが好ましいが、捕捉部位１３に連結する分岐流路１２の数を複数本設ける場合、Ｇ及びＨは１０Ｘ以上であってもよい。また、捕捉部位１３で捕捉する微粒子を１個とする場合は、１Ｘ＜Ｇ＜２Ｘ、１Ｘ＜Ｈ＜２Ｘとすることが好ましい。更に、捕捉部位１３で捕捉される目的の微粒子が生体細胞等、形状が変化し易い場合は、Ｙ＜Ｆ＜０．８Ｘとすることが好ましい。捕捉部位１３の下方にも更に流路を設ける場合は、主流路１１、分岐流路１２及び捕捉部位１３の下方に、幅がＦ、深さＪがＹ＜Ｊの流路を更に設ければよい。

例えば、全血から、ＣＴＣを捕捉し、ＣＴＣ以外の赤血球、白血球等の細胞を除去する場合、主流路１１の幅は、ＣＴＣの直径（１５〜３０μｍ）よりは小さく、血球細胞（約７μｍ）より大きくすればよく、８〜１２μｍが好ましい。一方、捕捉部位１３は、ＣＴＣを捕捉する必要があることから、捕捉部位１３の大きさは、ＣＴＣの直径より大きい必要がある。例えば、図４（１）の捕捉部位１３が円形状の場合は、直径１４が１６〜３６μｍであることが好ましく、（２）及び（３）の捕捉部位１３が略正方形の場合は、辺１５、１６が、１６〜３６μｍであることが好ましい。なお、捕捉部位１３の形状は、ＣＴＣが捕捉できる形状であれば特に制限はなく、６，８角形等の多角形でもよく、多角形の場合は上記のとおり、中心を通る最短となる線の長さが１６〜３６μｍとすればよい。

図４（１）〜（３）に示される形状の微粒子分離用マイクロ流路チップの場合、ＣＴＣは捕捉部位１３にトラップされるが、後述するシース液は主流路１１を流れるため、ＣＴＣはシース液の流体力を受けることがない。さらに、ＣＴＣ以外の血球細胞の多くは、後述するシース液と共に主流路１１を流れ、捕捉部位１３に流入してしまった血球細胞は、捕捉部位１３から更に伸びている分岐流路１２を通り再び主流路１１に戻すことができる。したがって、図１及び２に示される微粒子分離用マイクロ流路チップと違い、図４に示される微粒子分離用マイクロ流路チップでは、ＣＴＣとＣＴＣ以外の細胞の主要な流れが異なることから、捕捉部位１３の下方に流路を形成することは必須ではない。下方に流路を設けない場合、主流路１１、分岐流路１２及び捕捉部位１３の深さは１６〜３６μｍが好ましい。捕捉部位１３の下方に流路を設ける場合は、図２に示されている場合と同様、捕捉部位１３の下方の流路の深さは８〜２０μｍが好ましく、捕捉部位１３以外の部分については、捕捉部位１３と流路の深さを合計した深さとすればよい。

図４に示される形状の微粒子分離用マイクロ流路チップは、段差を設けない場合、図４に示される形状のマスクを用い、上記手順「４．〜６．」の２段目のレジスト層を設ける手順を省略する以外は、上記と同様の手順で作製することができる。また、段差を設ける場合は、図４に示される形状のマスクを用いる以外は、上記と同様の手順で作製することができる。

次に、上記の微粒子分離用マイクロ流路チップを用いた微粒子分離用システム及び使用方法について説明する。

図５は、本発明の微粒子分離用システムの概略及び使用形態を示す図で、微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル液用薄板及びシース液用薄板を相対移動させることでメニスカスを発生させる実施形態を示している。本実施形態の微粒子分離用システムは、微粒子分離用マイクロ流路チップ、サンプル液用薄板２１、シース液用薄板２２、シース液を吸引する図示しない吸引装置を含んでいる。

サンプル液用薄板２１、シース液用薄板２２は、ガラス、プラスチック等、サンプルやシース液と反応しないものであれば特に制限はない。シース液としては、分離すべき微粒子に損傷等を与えないものであれば特に制限はなく、全血をサンプルとして用いる場合は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等各種緩衝液、疑似体液（ＳＢＦ）、一般的な細胞培養液等、一般的に使用されているシース液であれば特に制限はない。

図５は、サンプルとして全血を用いた例が示されており、全血２３を微粒子分離用マイクロ流路チップ１とサンプル液用薄板２１の間に注入し、微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル用薄板２１を相対的に移動させることで、メニスカス２５が発生する。

図６は、メニスカスの発生原理を説明する図で、本発明では、移流集積法と呼ばれる、気液界面に存在する微粒子間の毛管力（とくに横毛管力：ｌａｔｅｒａｌ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｏｒｃｅと呼ばれる）を利用して、微粒子同士を細密充填構造に配列する手法を用いている。微粒子が溶液に分散した懸濁液のメニスカスを基板上に形成すると、メニスカスの先端において、図に示すように微粒子が溶液から頭を出す箇所が形成される。この頭が出ている箇所では、界面張力及び重力により下に押し付けられる力が微粒子に発生しながらメニスカスと共に移動し、微粒子はチップに設けられたマイクロ流路に捕捉される。また、シース液も同様にメニスカスを発生させることで、シース液が微細な主流路内に入り易くなる。

ここで、図１のｂ−ｂ断面図である図２（２）に示すように、マイクロ流路は２段形状になっており、ＣＴＣは上段の捕捉部位３にトラップされ、サイズの小さな血球細胞は下段の流路に落ちる。さらに、流路の上流側に、微粒子分離用マイクロ流路チップ１とシース液用薄板２２の間にシース液２４を注入しておき、そして、微粒子分離用マイクロ流路チップ１とシース液用薄板２２を相対移動させながら図示しない吸引装置で下流側から吸引することによりシース液を上流から下流に流し、ＣＴＣを捕捉部位３にトラップしたまま血球細胞を洗い流すことで、ＣＴＣを効率的に分離することができる。また、図４に示す形状の微粒子分離用マイクロ流路チップを用いた場合は、ＣＴＣは捕捉部位１３にトラップされるが、他の血球細胞等はシース液と共に、主流路１１及び／又は分岐流路１２を通って洗い流すことができる。なお、メニスカスを発生させるためには、微粒子分離用マイクロ流路チップを固定してサンプル液用薄板２１及びシース液用薄板２２を移動させてもよいし、サンプル液用薄板２１及びシース液用薄板２２を固定し微粒子分離用マイクロ流路チップを移動させてもよい。

微粒子分離用マイクロ流路チップと、サンプル液用薄板２１及びシース液用薄板２２との間隔は、７００〜１０００μｍとすることが好ましい。７００μｍより小さいとサンプル液の導入量が減少し処理能力が低下し、１０００μｍより大きいとメニスカス力が低下し十分な分離が得られない。なお、上記間隔は、マイクロステージで調整することができる。また、微粒子分離用マイクロ流路チップと、サンプル液用薄板２１及びシース液用薄板２２との相対移動速度は、２０〜５０μｍ／ｓが好ましい。２０μｍ／ｓより遅いと、処理時間が長くなり処理能力が低下し、５０μｍ／ｓより速いと微粒子が捕捉されずに分離効率が低減する。

シース液の流速は、２０〜５００μｍ／ｓが好ましい。２０μｍ／ｓより遅いと血球細胞を洗浄する能力の低下により分離効率が低減し、５００μｍ／ｓより速いと一旦捕捉されたＣＴＣが吸引され分離効率が低減する。シース液の流速は、吸引装置の吸引力により調整すればよい。吸引装置は吸引ポンプ、マイクロシリンジ等、液体を吸引できるものであれば特に制限はない。なお、図５に示す例は、微粒子分離用マイクロ流路チップとシース液用薄板２２との間にシース液２４を必要に応じて注入する形式であるが、シース液用薄板２２の一端に、シース液容器又はシース液容器から伸長しているチューブ等を連結することで、シース液を自動的に供給できるようにしてもよい。

図７は、本発明の微粒子分離用システムの概略及び使用形態を示す図で、微粒子分離用マイクロ流路チップとカバー板を相対移動させずサンプル液を吸引することでメニスカスを発生させる実施形態を示している。本実施形態の微粒子分離用システムは、微粒子分離用マイクロ流路チップ１、該微粒子分離用マイクロ流路チップ１に重ねサンプル液及びシース液を吸引することでメニスカスを発生させるためのカバー板３１、図示しない吸引手段及び／又は吸引装置を少なくとも含んでいる。図７に示す実施形態では、微粒子分離用マイクロ流路チップ１に排出口５を設ける必要は無く、複数の主流路２の一端に連結する排出路４から、サンプル液及びシース液を吸引できるようにすればよい。サンプル液及びシース液は、後述する吸引手段及び／又は吸引装置を用いて、排出路４から直接吸引・排出してもよいし、長手方向に形成した横溝３３と該横溝３３に連通する吸引孔３４を含む吸引ユニット３５を介して吸引手段及び／又は吸引装置により吸引してもよい。本実施形態では、後述する吸引手段及び／又は吸引装置を微粒子分離用マイクロ流路チップに密着して、主流路２から直接サンプル液及びシース液を吸引することもでき、その場合は、排出路４を設けなくてもよい。なお、本実施形態の吸引手段及び／又は吸引装置を用いて、必要に応じて吸引ユニット３５を介してサンプル液及びシース液３２を排出路４又は主流路２から直接吸引・排出する形態は、図５に示す実施形態にも適用することができる。また、本実施形態では、吸引手段及び／又は吸引装置を用いてサンプル液を吸引することでサンプル液中に含まれる微粒子を分離することから、希釈したサンプル液を使用すればサンプル液自体がシース液の役割をするので、サンプル液を流した後にシース液を流すことは必須ではない。目的微粒子の高純度な分離の場合はシース液を流すことで残存している除去する微粒子を洗い流す等、分離の目的に応じてシース液を流すか否かの選択を行えばよい。

図８は、図７のＡ−Ａ′断面図で、本実施形態におけるメニスカスの発生原理を説明する図である。図８（１）に示すように、微粒子分離用マイクロ流路チップ１とカバー板３１の間にサンプル液、シース液３２を注入し、図示しない吸引手段及び／又は吸引装置で吸引すると、サンプル液、シース液３２は主流路２から排出路４を経由して排出される。その際、微粒子分離用マイクロ流路チップ１及びカバー板３１との間のサンプル液、シース液３２には、毛細管力が発生するため、図８（２）に示すようなメニスカスが発生する。

なお、図８（２）に示すサンプル液及びシース液３２の移動方向は、微粒子分離用マイクロ流路チップ１に対してカバー板３１を平行に配置した場合であり、例えば、図８（３）に示すように、排出路４側のカバー板３１を微粒子分離用マイクロ流路チップ１に近付けるように傾斜して配置すると、サンプル液及びシース液３２に係る圧力のため、サンプル液及びシース液３２は排出路４側に移動する。逆に、図８（４）に示すように、微粒子分離用マイクロ流路チップ１の排出路４側とは反対側のカバー板３１を微粒子分離用マイクロ流路チップ１に近付けるように傾斜して配置すると、サンプル液及びシース液３２に係る圧力のため、サンプル液及びシース液３２は排出路４とは反対側に移動する。図８（２）〜（４）の何れの実施形態でも本発明の実施をすることができるが、図８（３）に示す実施形態は、サンプル液及びシース液３２が排出路４側に近付くことから、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力を小さくすることができるので好ましい。微粒子分離用マイクロ流路チップ１とカバー板３１の間隔は、上記のサンプル液用薄板２１と同様に、７００〜１０００μｍの間が好ましく、この間隔の範囲内で、マイクロステージを用いて調整すればよい。カバー板３１を傾斜する場合は、６°〜１８°程度傾けることが好ましい。傾斜角度が６°より小さい場合は、サンプル液及びシース液に係る圧力が不足し、１８°より大きい場合は、微粒子の捕捉に有効なメニスカスの角度より大きくなり過ぎるので好ましくない。図８（５）に示す実施形態は、吸引側にサンプル液及びシース液３２のメニスカスを発生させないように、第２のカバー板３１１を設けたもので、閉じられた流路系を構成できることから安定した吸引を行うことができる。

カバー板３１及び第２のカバー板３１１は、上記のサンプル液用薄板２１と同様の材料で作製すればよい。また、カバー板３１の大きさは特に制限は無いが、本実施形態では、カバー板３１を移動することなくメニスカスを発生することができることから、処理効率を向上させるためには、微粒子分離用マイクロ流路チップ１に形成した主流路２の全てを覆うことができる大きさで形成することが望ましい。また、第２のカバー板３１１の大きさは、主流路２と直交する横方向の長さはカバー板３１と同じ長さにすればよく、幅はメニスカスが発生しない範囲内で適宜調整すればよい。

サンプル液及びシース液３２の吸引手段としては、例えば、布、コットン、スポンジ、セーム皮等の吸引パッドが挙げられ、排出路４又は主流路２に直接吸引パッドを当接してサンプル液及びシース液を吸引・排出すればよい。

サンプル液及びシース液３２の吸引・排出は、吸引ユニット３５を介して行ってもよい。図９（１）は吸引ユニット３５の概略を示す上面図で、図９（２）は吸引ユニット３５のＢ−Ｂ′断面図を示している。吸引ユニット３５は、サンプル液及びシース液３２を毛管力で吸引することができる横溝３３と該横溝３３に連通し図示しない吸引装置と接続するための吸引孔３４が設けられている。横溝３３の幅は、少なくとも除去された微粒子を通過させる必要があることから、サンプルが全血の場合は少なくとも８μｍ以上、処理能力を上げるためには１０μｍ以上とすることがより好ましい。一方、横溝３３の幅は毛管力が発生すれば特に上限は無く、吸引するサンプル液、シース液の量や毛管力等を考慮して適宜調整すればよく、例えば、２００μｍ程度の幅を設けてもよい。吸引ユニット３５を排出路４又は主流路２上に当接させ、毛管力でサンプル液及びシース液３２を横溝３３に吸引することで、サンプル液及びシース液３２を排出路４又は主流路２から排出することができる。また、横溝３３に吸引したサンプル液及びシース液３２を、ポンプ、マイクロシリンジ等の吸引装置を用い、吸引孔３４を通して吸引・排出してもよい。排出するサンプル液、シース液の量が多く、横溝３３のみでは吸引できない場合は、吸引装置を組合せて用いればよい。吸引孔３４の数は特に制限は無く、各主流路２を流れるサンプル液及びシース液３２の流速に大きな差異が発生しない程度の数を設ければよい。

また、横溝３３の幅を大きくし、横溝３３に上記の布、コットン、スポンジ、セーム皮等の吸引手段を挿入し、該吸引手段に吸収したサンプル液及びシース液３２を、吸引孔３４をとおして吸引装置で吸引してもよい。本実施形態においては、主流路２を流れるサンプル液及びシース液の流速は、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力により調整する。そのため、単に吸引手段でサンプル液及びシース液３２を吸引する、又は、毛管力により横溝３３にサンプル液及びシース液３２を吸引するより、吸引手段に吸引したサンプル液及びシース液を更に吸引装置で吸引することで、サンプル液及びシース液の吸引速度を安定に保つことができる。吸引装置と吸引孔３４は、シリコン等のチューブを用いて連結すればよい。

吸引ユニット３５を構成する材料は、アクリル、ナイロン、テフロン（登録商標）等の樹脂、又はガラス等、サンプル液やシース液と反応しないものであれば特に制限はない。吸引ユニット３５は、ドリル及びエンドミル等の切削工具を用いた切削加工、又は吸引ユニット３５の形状のモールドを作製し射出成形により作製することができる。

本実施形態の微粒子分離用システムは、先ず、微粒子分離用マイクロ流路チップ１とカバー板３１の間にサンプル液を入れ、吸引手段及び／又は吸引装置によりサンプル液を吸引し、次に、必要に応じて、シース液を微粒子分離用マイクロ流路チップ１とカバー板３１の間に入れ、シース液を吸引することで、例えば、血液サンプル中のＣＴＣを捕捉部位にトラップし、他の血球細胞等はシース液と共に洗い流すことができる。微粒子分離用マイクロ流路チップ１とカバー板３１の間へのサンプル液又はシース液は、シリンジ等を用いて微粒子分離用マイクロ流路チップ１とカバー板３１の間から注入してもよいし、カバー板３１に孔を設け、該孔からサンプル液及びシース液を注入してもよい。

サンプル液及びシース液３２の流速は、２０〜５００μｍ／ｓが好ましい。２０μｍ／ｓより遅いと血球細胞を分離・洗浄する能力の低下により分離効率が低減し、５００μｍ／ｓより速いと一旦捕捉されたＣＴＣが吸引され分離効率が低減する。サンプル液及びシース液の流速は、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力により調整すればよい。

なお、本実施形態では、サンプル液を先ず流した後に、必要に応じてシース液を流す。したがって、全血等の粘性の高いサンプル液をそのまま吸引すると、大きな吸引力が必要となる。そのため、サンプル液として血液を用いる場合は、シース液等を用いて、２〜１０倍、好ましくは３〜５倍程度に希釈してもよい。本実施形態では、相対移動により複数の主流路２に順番にメニスカスを発生させるのではなく、微粒子分離用マイクロ流路チップ１とカバー板３１が重なっている部分の主流路２に対して同時にメニスカスを発生することができるので、全血を希釈した場合でも、分離に要する時間を十分短くすることができる。

本発明の微粒子分離用システムは、捕捉部位での微粒子の捕捉効率を上げるための磁場発生装置及び／又は電場発生装置等を設けてもよい。例えば、捕捉部位下面に磁場発生装置として永久磁石または電磁石を設置して磁場ポテンシャル場を発生させ、ＥｐＣＡＭ抗体等を標識した磁性粒子を特異的に吸着させたＣＴＣ、又は磁性粒子を非特異的に吸着させたＣＴＣ（エンドサイトーシスから取り込む）等、捕捉したい粒子に磁性を帯びさせた上で、本発明の微粒子分離用システムを用いると、磁性標識されていない他の粒子から精度よく分離することが可能である。

また、捕捉部位下面又は捕捉部位側面に、電場発生装置として電極を設けて電場ポテンシャル場（不均一電場中）を発生させ、ＣＴＣと周囲媒質の分極と電場の勾配により生じる静電気力（クーロン力）を用いてＣＴＣの捕捉をアシストすることも可能である。

捕捉されたＣＴＣの検出方法としては、ＦＩＴＣやＰＥで標識された抗ＥｐＣＡＭ抗体等のＣＴＣ特異的な抗体を用いて蛍光染色して蛍光顕微鏡等により観察することにより行うことができる。また、光学顕微鏡を用いて明視野観察を行う場合には、パパニコロウ染色やギムザ染色を行うことで細胞内の核、細胞質等の形態的特徴を指標としてＣＴＣ検出を行うことが出来る。特に、捕捉したＣＴＣを長期的に観察する際には、光学顕微鏡を用いて明視野観察することが好ましい。

以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

＜実施例１＞
〔微粒子分離用マイクロ流路チップの作製〕
先ず、シリコン基板をアセトン・エタノール・超純水の順に、４５ｋＨｚで５分間ずつ超音波洗浄機により有機洗浄し、１４５℃で２０分間ベイクした。次に、シリコン基板上にＳＵ−８をスピンコートし、ホットプレート上で９５℃で３０分間、プリベイクした。次に、捕捉部位３の形状が略８角形のクロムマスクを用い露光後、ホットプレート上で９５℃で２分間、ポストエクスポージャーベイクを行い、ＰＭシンナーを用い現像した。現像後は、超純水を用いリンスし、スピンドライヤー等で水分をとばし乾燥させ、１段目の処理を行った。次いで、ＳＵ−８をスピンコートし、ホットプレート上で９５℃で３０分間プリベイクした。主流路の形状のクロムマスクを用い露光後、ホットプレート上で９５℃で２分間、ポストエクスポージャーベイクを行い、ＰＭシンナーを用い現像した。現像後は、超純水を用いリンスし、スピンドライヤー等で水分をとばし乾燥させ、２段目の処理を行った。形成されたパターンを、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に転写し、転写後、両者を分離し、ＰＤＭＳ表面をプラズマ処理（周波数５０ｋＨｚ，出力７００Ｗ、３０秒間）により親水化した。

図１０は実施例１で得られた微粒子分離用マイクロ流路チップの外観を示す写真で、微粒子分離用マイクロ流路チップの大きさは縦３０ｍｍ、横３０ｍｍであった。マイクロ流路は、個々の捕捉部位の中心が流路の中心に一致した略８角形の形状で、捕捉部位の中心を通る最短となる線の長さは約３０μｍ、深さは約３０μｍであった。また、流路の幅は約１０μｍ、捕捉部位における流路の深さは約２０μｍ、捕捉部位以外の流路の深さは約５０μｍであった。また、流路と流路の中心間距離は約６０μｍであった。

＜実施例２＞
実施例１のクロムマスクに代え、図４（１）に示される、主流路及び主流路から分岐し再び主流路に接続する分岐流路を配置し、該分岐流路に円形状の捕捉部位を設けたクロムマスクを用い、２段目の処理を行わなかった以外は、実施例１と同様の手順で微粒子分離用マイクロ流路チップを作製した。

図１１は実施例２で得られた微粒子分離用マイクロ流路チップの外観を示す写真で、微粒子分離用マイクロ流路チップの大きさは縦３０ｍｍ、横３０ｍｍであった。捕捉部位は直径約３０μｍの円形状で、１段形成のため、主流路及び分岐流路の何れの箇所でも深さは約３０μｍであった。また、主流路及び分岐流路の幅は約８μｍ、主流路と主流路の中心間距離は約８０μｍであった。

＜実施例３＞
実施例２のクロムマスクに変え、図４（２）に示される形状のマスクに変えた以外は、実施例２と同様の手順で微粒子分離用マイクロ流路チップを作製した。得られた微粒子分離用マイクロ流路チップの捕捉部位は、一辺が約３０μｍの角が滑らかな略正方形で、その他の寸法は、実施例２と同様であった。

＜実施例４＞
実施例２のクロムマスクに変え、図４（３）に示される形状のマスクに変えた以外は、実施例２と同様の手順で微粒子分離用マイクロ流路チップを作製した。

図１２は実施例４で得られた微粒子分離用マイクロ流路チップの外観を示す写真である。写真から明らかなように、実施例２と違い、実施例４（実施例３も同様）では、捕捉部位の上流側と下流側で主流路の位置が変わる。したがって、実施例４では、次の捕捉部位を設ける際に、主流路の位置を一つ上流側の捕捉部位の主流路の位置と一致するようにマスクを設計したが、図４（３）に示す形状と同様の形状のものを繋げ、主流路が階段状になるように配置してもよい。捕捉部位は一辺が約３０μｍの角が滑らかな略正方形で、その他の寸法は、実施例２と同様であった。

〔血液サンプルの作製〕
採取したヒト血液２０μｌに、１．０×１０^４個の胃がん細胞株（ヒト胃がん由来の細胞株（ＧＣＩＹ−ＧＦＰ）をトリプシン処理でバラバラにしたもの）を懸濁し、がん患者の血液を模した血液サンプルを作製した。なお、がん細胞の平均粒径は２５μｍであった。

＜実施例５＞
〔微粒子分離用システムの作製及び血液サンプルからのＣＴＣ分離実験〕
実施例１〜４で作製された微粒子分離用マイクロ流路チップと、ガラスで作製された縦２０ｍｍ、横２０ｍｍのサンプル液用薄板の間に上記血液サンプル２０μｌを注入した。微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル液用薄板との間は、マイクロステージを用いて７００μｍとなるように調整した。また、微粒子分離用マイクロ流路チップと、ガラスで作製された縦１０ｍｍ、横２０ｍｍのシース液用薄板との間にシース液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））１０μｌを注入した。なお、シース液については、適宜補充した。微粒子分離用マイクロ流路チップは、２０μｍ／ｓの一定速度で移動させた。シース液の流速は２０μｍ／ｓとした。

上記〔血液サンプルからのＣＴＣ分離実験〕の結果を図１３に示す。従来の抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いたＣＴＣの捕捉の場合、血中のＣＴＣの１００乃至１０００分の１程度しか捕捉することができないといわれており、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップは、非常に効率よくＣＴＣを捕捉できることが明らかとなった。

また、主流路上に捕捉部位を設けた実施例１と比較し、主流路に分岐流路を設け且つ分岐流路に捕捉部位を設けた実施例２〜４では、ＣＴＣの捕捉効率が格段に向上した。これは、実施例１の主流路上に捕捉部位を設けた場合、捕捉されたＣＴＣがシース液の流体力により変形し、捕捉部位から流出したためと考えられる。

一方、実施例２〜４の場合、ＣＴＣは捕捉部位で捕捉されるが、シース液は主流路を流れるため、ＣＴＣが受けるシース液の流体力は大幅に小さくなり、また、捕捉部位に流入した血球細胞は、分岐流路を通って再び主流路に戻すことができるため、ＣＴＣの捕捉効率が上がったと考えられる。

＜実施例６＞
捕捉部位の中心を通る最短となる線の長さを約２０μｍ、深さを約２０μｍ、捕捉部位における流路の深さを約３０μｍとした以外は、実施例１と同様の手順で、微粒子分離用マイクロ流路チップを作製した。

＜実施例７＞
捕捉部位の直径を約２０μｍ、深さを約２０μｍとした以外は、実施例２と同様の手順で、微粒子分離用マイクロ流路チップを作製した。

＜実施例８＞
捕捉部位の一辺の長さを約２０μｍ、深さを約２０μｍとした以外は、実施例３と同様の手順で、微粒子分離用マイクロ流路チップを作製した。

＜実施例９＞
捕捉部位の一辺の長さを約２０μｍ、深さを約２０μｍとした以外は、実施例４と同様の手順で、微粒子分離用マイクロ流路チップを作製した。

〔ポリスチレンビーズ懸濁液の作製〕
純水２０μｌに、１８μｍのポリスチレンビーズ及び７μｍのポリスチレンビーズを懸濁したサンプル液を作製した。

＜実施例１０＞
〔ポリスチレンビーズ懸濁液からの１８μｍポリスチレンビーズの分離実験〕
実施例６〜９で作製した微粒子分離用マイクロ流路チップ、及びシース液として純水を使用した以外は、上記〔血液サンプルからのＣＴＣ分離実験〕と同様の手順で分離実験を行った。形状が変化し難いビーズを分離した場合、実施例６〜９の何れの形状のチップでも、大多数の１８μｍポリスチレンビーズのトラップが確認された。

＜実施例１１＞
〔微粒子分離用システムの作製〕
吸引ユニットのモールドを作製し、ＰＤＭＳに該モールドの形状を転写して吸引ユニットを作製した。吸引ユニットの幅は６ｍｍ、長さは３０ｍｍ、横溝の幅は１６０μｍ、吸引孔は直径１ｍｍであった。また、吸引孔には、シリコンチューブ（アズワン社製）の一端を接続し、他端をマイクロシリンジ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に接続した。カバー板は、ガラスで縦２２ｍｍ、横３０ｍｍとなるように作製した。そして、実施例２で作製した微粒子分離用マイクロ流路チップと組み合わせることで、微粒子分離用システムを作製した。

＜実施例１２＞
〔血液サンプルの調整〕
上記〔血液サンプルの作製〕の手順で作製した血液サンプルを、シース液を用いて５倍に希釈してサンプル液を作製した。

〔血液サンプル液の吸引実験〕
実施例１１で作製した微粒子分離用マイクロ流路チップの排出路の上に、吸引ユニットを配置した。また、微粒子分離用マイクロ流路チップとカバー板の間隔を、吸引ユニット側は２ｍｍ、吸引ユニットと反対側は２ｍｍとなるようにセットした。次に、作製したサンプル液７５０μｌを、微粒子分離用マイクロ流路チップとカバー板の間に注入し、主流路を流れるサンプル液の速度が、４００μｍ／ｓとなるようにマイクロシリンジを調整した。

図１４は、実施例１２において、サンプル液を吸引することで、メニスカスが発生する位置がずれていることを示す写真で、図１４（２）は、図１４（１）から１５秒経過後の写真である。図１４（１）及び（２）の写真の比較から明らかなように、サンプル液を吸引することで、発生するメニスカスのラインが移動した。また、サンプル液吸引後に蛍光顕微鏡による観察を行ったところ、捕捉部位にＣＴＣが捕捉されたことを確認した。

＜実施例１３＞
〔ポリスチレンビーズ懸濁液の作製〕
純水に、２０μｍのポリスチレンビーズは２．４×１０⁶／ｍｌ、３μｍのポリスチレンビーズは１．１×１０^４／ｍｌの濃度となるように懸濁したサンプル液を作製した。

〔ポリスチレンビーズ懸濁液からの２０μｍポリスチレンビーズの分離実験〕
血液サンプル液に換え、ポリスチレンビーズ懸濁液をサンプル液に用いた以外は、実施例１２と同様の手順で分離実験を行った。図１５は、実施例１３において、サンプル液を吸引することでメニスカスが発生する位置がずれること、及び直径２０μｍのビーズが捕捉部位で捕捉されていることを示す写真で、図１５（２）は、図１５（１）から７秒経過後の写真である。図１５（１）及び（２）の写真の比較から明らかなように、サンプル液を吸引することで、発生するメニスカスのラインが移動した。また、メニスカスラインが通過した後の捕捉部位には、２０μｍのポリスチレンビーズが捕捉されたことを確認した。

以上の結果より、本発明の微粒子分離用システムは、微粒子分離用マイクロ流路チップの流路と捕捉部位の形状を変えることで、形状の変わり易い微粒子、形状の変わり難い微粒子を問わず、幅広い微粒子を効率よく分離できることが確認できた。

本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップを含む微粒子分離用システムを使用することで、サンプル中のサイズの異なる微粒子を、抗体等を用いることなく迅速かつ高効率で分離することができる。したがって、全血からのＣＴＣの分離等、臨床の場において非常に有効であることから、病院や救急センターなどの医療機関や大学医学部などの研究機関、教育機関において、がん診断のシステムとして利用が可能である。

Claims (13)

1. 微粒子分離用マイクロ流路チップであって、
   該微粒子分離用マイクロ流路チップは、前記微粒子分離用マイクロ流路チップの第１面に開口するように形成された複数の主流路を含み、
   前記主流路は、
   微粒子を捕捉する捕捉部位、及び、
   前記捕捉部位が形成されていない流路部分、
   を有し、
   前記流路部分は、
   前記第１面側の上部流路部分、
   前記上部流路部分より下方の下部流路部分、及び、
   前記下部流路部分に連通し、且つ、前記捕捉部位の下方に形成された捕捉部位下方流路部分、
   を有し、
   前記捕捉部位は、前記第１面に開口するように形成され、前記流路部分の幅より大きく、前記上部流路部分と深さが同じで、且つ、前記上部流路部分と連通し、
   前記捕捉部位下方流路部分は、前記捕捉部位の下方で前記捕捉部位に連通するように形成されている、
   ことを特徴とする微粒子分離用マイクロ流路チップ。
2. 前記複数の主流路の一端に連結する排出路を含むことを特徴とする請求項１に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
3. 前記捕捉部位で捕捉される微粒子がＣＴＣで、除去される微粒子が血球細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
4. 請求項１〜３の何れか一項に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、サンプル液用薄板、シース液用薄板、並びに、シース液を吸引する吸引手段及び／又は吸引装置を含み、
   前記サンプル液用薄板は、サンプル液を前記主流路に押し付けるため、前記第１面側に配置され、
   前記シース液用薄板は、前記捕捉部位で捕捉された微粒子以外のものを洗い流すためのシース液を前記主流路に押し付けるため、前記第１面側に配置され、
   前記吸引手段及び／又は吸引装置は、前記シース液を吸引するため、前記第１面側に配置される、
   ことを特徴とする微粒子分離用システム。
5. 請求項１〜３の何れか一項に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、カバー板、並びに、吸引手段及び／又は吸引装置を含み、
   前記カバー板は、サンプル液及び／又はシース液を前記主流路に押し付けるため、前記第１面側に配置され、
   前記吸引手段及び／又は吸引装置は、前記サンプル液及び／又はシース液を吸引するため、前記第１面側に配置される、
   ことを特徴とする微粒子分離用システム。
6. 吸引ユニットを更に含み、該吸引ユニットは、
   基材、
   該基材の一方の面に形成された横溝、及び、
   該横溝に連通し、且つ、前記一方の面から前記基材の反対の面に貫通する吸引孔を含み、
   前記吸引ユニットは、前記第１面側に配置される、
   ことを特徴とする請求項４又は５に記載の微粒子分離用システム。
7. 前記捕捉部位に、磁場発生装置及び／又は電場発生装置が設けられていることを特徴とする請求項４〜６の何れか一項に記載の微粒子分離用システム。
8. 請求項１〜３の何れか一項に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップの前記第１面とサンプル液用薄板の間に前記捕捉部位で捕捉される微粒子を含むサンプル液を注入する工程、
   前記第１面とシース液用薄板の間に前記捕捉部位で捕捉された微粒子以外のものを洗い流すためのシース液を注入する工程、
   前記微粒子分離用マイクロ流路チップと前記サンプル液用薄板及び前記シース液用薄板を相対移動させることで発生するメニスカスにより、前記サンプル液及び前記シース液を前記第１面に押し付ける工程、
   前記捕捉部位に前記微粒子が捕捉された状態で、吸引手段及び／又は吸引装置により前記シース液を吸引することで、前記捕捉部位で捕捉された微粒子以外のものを微粒子分離用マイクロ流路チップから除去する工程、
   を含むことを特徴とする微粒子分離方法。
9. 微粒子分離用マイクロ流路チップを用いた微粒子分離方法であって、
   該微粒子分離用マイクロ流路チップは、前記微粒子分離用マイクロ流路チップの第１面に開口するように形成された複数の主流路を含み、
   前記主流路は、
   微粒子を捕捉する捕捉部位、及び、
   前記捕捉部位が形成されていない流路部分、
   を有し、
   前記流路部分は、
   前記第１面側の上部流路部分、
   前記上部流路部分より下方の下部流路部分、及び、
   前記下部流路部分に連通し、且つ、前記捕捉部位の下方に形成された捕捉部位下方流路部分、
   を有し、
   前記捕捉部位は、前記第１面に開口するように形成され、前記流路部分の幅より大きく、前記上部流路部分と深さが同じで、且つ、前記上部流路部分と連通し、
   前記捕捉部位下方流路部分は、前記捕捉部位の下方で前記捕捉部位に連通するように形成され、
   前記微粒子分離方法は、
   前記第１面とサンプル液用薄板の間に前記捕捉部位で捕捉される微粒子を含むサンプル液を注入する工程、
   前記第１面とシース液用薄板の間に前記捕捉部位で捕捉された微粒子以外のものを洗い流すシース液を注入する工程、
   前記微粒子分離用マイクロ流路チップと前記サンプル液用薄板及び前記シース液用薄板を相対移動させることで発生するメニスカスにより、前記サンプル液及び前記シース液を前記第１面に押し付ける工程、
   前記捕捉部位に前記微粒子が捕捉された状態で、吸引手段及び／又は吸引装置により前記シース液を吸引することで、前記捕捉部位で捕捉された微粒子以外のものを前記微粒子分離用マイクロ流路チップから除去する工程、
   を含むことを特徴とする微粒子分離方法。
10. 請求項１〜３の何れか一項に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップの前記第１面とカバー板の間に前記捕捉部位で捕捉される微粒子を含むサンプル液を注入する工程、
    吸引手段及び／又は吸引装置で前記サンプル液を吸引することで発生するメニスカスにより、前記微粒子を前記捕捉部位に捕捉する工程、
    を含むことを特徴とする微粒子分離方法。
11. 前記サンプル液を吸引した後に、前記微粒子分離用マイクロ流路チップと前記カバー板の間に前記捕捉部位で捕捉された微粒子以外のものを洗い流すためのシース液を注入する工程、
    前記捕捉部位に前記微粒子が捕捉された状態で、前記吸引手段及び／又は吸引装置で前記シース液を吸引することで、前記捕捉部位で捕捉された微粒子以外のものを洗い流す工程、
    を含むことを特徴とする請求項１０に記載の微粒子分離方法。
12. 微粒子分離用マイクロ流路チップを用いた微粒子分離方法であって、
    該微粒子分離用マイクロ流路チップは、前記微粒子分離用マイクロ流路チップの第１面に開口するように形成された複数の主流路を含み、
    前記主流路は、
    微粒子を捕捉する捕捉部位、及び、
    前記捕捉部位が形成されていない流路部分、
    を有し、
    前記流路部分は、
    前記第１面側の上部流路部分、
    前記上部流路部分より下方の下部流路部分、及び、
    前記下部流路部分に連通し、且つ、前記捕捉部位の下方に形成された捕捉部位下方流路部分、
    を有し、
    前記捕捉部位は、前記第１面に開口するように形成され、前記流路部分の幅より大きく、前記上部流路部分と深さが同じで、且つ、前記上部流路部分と連通し、
    前記捕捉部位下方流路部分は、前記捕捉部位の下方で前記捕捉部位に連通するように形成され、
    前記微粒子分離方法は、
    前記第１面とカバー板の間に捕捉部位で捕捉される微粒子を含むサンプル液を注入する工程、
    吸引手段及び／又は吸引装置で前記サンプル液を吸引することで発生するメニスカスにより、前記微粒子を前記捕捉部位に捕捉する工程、
    を含むことを特徴とする微粒子分離方法。
13. 前記サンプル液を吸引した後に、前記微粒子分離用マイクロ流路チップと前記カバー板の間に前記捕捉部位で捕捉された微粒子以外のものを洗い流すためのシース液を注入する工程、
    前記捕捉部位に前記微粒子が捕捉された状態で、前記吸引手段及び／又は吸引装置で前記シース液を吸引することで、前記捕捉部位で捕捉された微粒子以外のものを洗い流す工程、
    を含むことを特徴とする請求項１２に記載の微粒子分離方法。

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