JP2005110529A - マイクロバイオアッセイシステム - Google Patents

Abstract

【課題】 バクテリアを利用するアッセイが簡便、かつ効率的に行われ、多サンプルを同時にアッセイすることも容易であって、可搬性とすることも可能な新しい化学物質リスク評価システムを構築することができ、しかも簡便、かつ効率的なバクテリアの同定等も可能とされる、マイクロバイオアッセイシステムを提供する。
【解決手段】 基板上に微細流路を配設したマイクロチップにおいて、微細流路の一部にバクテリアの培養槽を配設し、微細流路より試薬もしくは試料を導入して培養槽内のバクテリアの応答を検出してバイオアッセイを行うようにしたことを特徴とするマイクロバイオアッセイシステム。
【選択図】 図１

Description

この出願の発明はマイクロバイオアッセイシステムに関するものであって、化学物質のリスク評価や病原性のバクテリアの同定等に有用な、簡便で、多サンプルの同時アッセイも可能で、短い時間でのアッセイが可能とされる、新しいマイクロバイオアッセイシステムに関するものである。

人口の集中や生活の高度化、利便性の追求により、様々な化学物質が利用されている。産業に使用されているものを含めると５万種を数え、さらに毎年数万の新規化学物質が製造され続けていると言われている。

これらの極めて多数の化学物質に対する安全性は未知な場合が多いことから、より簡便、かつ迅速に化学物質のリスクを評価することのできるシステムの開発が望まれている。

従来、化学物質の安全性評価のための環境リスク評価システムとしては、代表的には、魚類を利用する方法と、バクテリアを利用する方法（非特許文献１）とが知られている。このうちの魚類を利用する方法は、ＤＮＡの損傷（異常）などを評価する方法であることから結果を得るまでに長時間を要し、煩雑であるという欠点があることから、その適用対象、目的は限られており、汎用のものとはなっていない。一方、バクテリアを利用する方法としては、発光性細菌（非特許文献２）を利用するシステムがすでに実用化されており、欧米を中心に利用されており、また、消化細菌（非特許文献３）を利用する方法が検討されてもいる。
D.J.W.Blum, R.E.Speece, Research J.WPCF, 63, 193(1991). http://www.cgr.mlit.go.jp/ctc/Topics/News/h 0007/h 000702.htm 田中良春，田中宏明，用水と排水，40，16(1998)．

しかしながら、従来のバクテリアを利用しての化学物質の環境リスク評価システムにおいては、たとえば以下のような問題点があった。

１）アッセイが煩雑である。

２）多サンプルを同時にアッセイするのは困難である。

３）アッセイの結果を得るまでに長時間必要である。

４）可搬性がない。

５）システム内に培養槽を構築することが困難である。

また、バクテリアの利用に関連して、従来、バクテリアの同定においてはシャーレ上に培養してバッチ処理しているため同定に時間がかかり、操作が煩雑であるという点が大きな問題としてあった。

そこで、この出願の発明においては、以上のような問題点を解消して、バクテリアを利用するアッセイが簡便、かつ効率的に行われ、多サンプルを同時にアッセイすることも容易であって、可搬性とすることも可能な、新しい化学物質リスク評価システムを構築することができ、しかも簡便、かつ効率的ばバクテリアの同定等も可能とされる、マイクロバイオアッセイシステムを提供することを課題としている。

この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、基板上に微細流路を配設したマイクロチップにおいて、微細流路の一部にバクテリアの培養槽を配設し、微細流路より試薬もしくは試料を導入して培養槽内のバクテリアの応答を検出してバイオアッセイを行うようにしたことを特徴とするマイクロバイオアッセイシステムを提供する。

また、第２には、複数の培養槽を各々異なる微細流路に配設したことを特徴とする上記ののマイクロバイオアッセイシステム、第３には、多孔質隔壁が配設された培養槽が構成されていることを特徴とするマイクロバイオアッセイシステムを、第４には、非接着性で１μｍ以下のサイズのバクテリアが培養槽内にトラップされるマイクロバイオアッセイシステムを、第５には、熱レンズ顕微鏡によりバクテリアの応答を検出するマイクロバイオアッセイシステムを提供する。

そして、この出願の発明は、第６には、化学物質の安全性評価が行われることを特徴とする上記いずれかのマイクロバイオアッセイシステムを、第７には、バクテリアの同定が行われることを特徴とする上記いずれかのマイクロバイオアッセイシステムを提供する。

以上のとおりのこの出願の第１の発明によれば、従来の問題点を解消して、バクテリアを利用するアッセイが簡便、かつ効率的に行われ、多サンプルを同時にアッセイすることも容易であって、可搬性とすることも可能な、新しい化学物質リスク評価システムを構築することができ、しかも簡便、かつ効率的なバクテリアの同定等も可能とされる、マイクロバイオアッセイシステムが提供される。

そして、第２の発明によれば、多サンプルの同時アッセイが効率的に、簡便に実現される。また、第３および第４の発明によれば、非接着性でそのサイズが１μｍ以下のバクテリアにおいて、これを培養槽にトラップしてのアッセイが可能になる。

また、第５の発明によれば、高精度で、簡便な検出が可能になる。

さらに、第６および第７の発明によれば、より具体的に、化学物質の安定性評価のためのシステムと、バクテリアの同定のためのシステムが提供される。

この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。

この出願の発明におけるマイクロバイオアッセイシステムでは、従来より、この出願の発明者らが様々な形態として提案してきている微細流路（マイクロチャンネル）を有するマイクロチップの技術を前提とし、かつ利用している。たとえば、この出願の発明におけるマイクロチップでは、ガラス、セラミックス、シリコン、ポリマー、あるいは金属（合金）、それらの複合体等の各種の基板に対し、微細加工手段、たとえば液相パターンエッチング等の手段によって微細流路を形成したものとすることができる。一般的には、これらの微細流路は、幅５００μｍ程度までで、深さが１００μｍ程度までのものとして考慮される。

そして、この出願の発明においては、このような微細流路の一部として、つまり微細流路に連通するものとしてバクテリアの培養槽を配設する。この場合の培養槽については、微細流路の場合と同様にエッチング等によって基板に形成することができ、その大きさも各種であってよい。たとえば、その最大幅は微細流路幅の３倍程度まで、その最大深さは、微細流路深さの２倍程度までも一般的には考慮することができる。

また、対象とするバクテリアの性質やその大きさに応じて、培養槽には、多孔質隔壁を設けてもよい。多孔質隔壁は、たとえば、微細流路に導入した重合性物質を光照射等の手段によって所定の部位で重合させて形成することができる。この際の孔径を制御することで、たとえば、非接着性で、サイズが１μｍ以下のバクテリアの培養槽内へのトラップが可能になる。

微細流路については、培養槽に試料や試薬を導入するために、上流域において分枝している等の各種のパターン形態のものであってよく、また培養槽下流域においても検出や排液のための各種のパターン配置を有していてもよい。また、微細流路には、この出願の発明者らがすでに提案しているガイド突条やピラー構造、さらにはバルブ構造等の流体制御のための各種の手段が適宜に採用されてもよい。

この出願の発明のマイクロバイオアッセイシステムによって、化学物質のリスク評価システムやバクテリアの同定システムが構築されることになる。病原性大腸菌の同定も容易となる。もちろん、各種の試験手法が採用されてよく、たとえば、Voges-Proskauer試験、尿素分解試験、メチルレッド試験、オキシダーゼ試験等の手法が例示される。

そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。

＜実施例１＞
ガラス基板の表面に、マスクパターンエッチングにより微細流路と培養槽域を形成した。この培養槽域においては、次式

で表わされる３−（トリメトキシシリル）−プロピルメタクリレートを、光重合開始剤としての次式

のビス（２，４，６−トリメチルベンゾイル）−フェニルホスフィンオキシドとともに導入してＵＶランプとフォトマスクを用いて光硬化させ、マイクロチャネルの一部に多孔質隔壁（フィルター）を作製し、その上流部分を培養槽とした。作製した培養槽でEscherichene coli(E.coli)を培養した。

添付した図面の図１は、培養槽を配設したマイクロチップと、培養液Ehrlich試薬の導入並びに検出部位とを例示した概要図である。４個の培養槽が各々独立して配置されている。また、図２は、実際に作製されたマイクロチップの外観と、培養槽における多孔質フィルター（隔壁）の流路の流れ方向に直交する断面のＳＥＭ像を例示したものである。さらに図３は、流路の流れ方向の断面を示した像である。

培養したE.coliの活性は、インドール法で評価した。すなわち、培養（３７℃、２時間）後、Ehrlich試薬を添加し、フィルター下流で熱レンズ顕微鏡（励起波長：５３２ｎｍ）を用いてインドールを検出した。

なお、作製した培養槽を評価するために、螢光染色したE.coliを培養槽に導入し、螢光観察したところフィルター下流では螢光が観察されないことから、作製した多孔質フィルターが培養槽として機能することが確認できた。

これまでに細胞を利用したマイクロシステムの研究は多数報告されていが、これらは接着性の細胞を利用してマイクロチャネルの特定の領域を培養槽として、培養槽の下流で分析するものである。これに対し、この出願の発明のシステムによれば細胞の場合とは異って、非接着性でサイズが１μｍ以下のバクテリアをトラップできる培養領域を構築することができる。インドール試験を行なった結果を図４に示した。図４（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）においては、図１および図２の各々異なる培養槽での観察結果を示している。なお、検出は熱レンズ顕微鏡によって行なった。

この図４の結果から、E. coli由来のインドールを検出できていることがわかる。
＜実施例２＞
実施例と同様にしてE. coliの培養を行い、インドール試験を行って、図５に示した結果を得た。わずか３分でインドールが検出されていることがわかる。

次いで、ｍ−クロロフェノールの異なる濃度を培養槽に導入した。その結果を図６に示した。この図６では、E. coliのActivity １００％の場合は、ｍ−クロロフェノールが導入されていない状態を示している。また、Activity ０％は、E. coliの死滅の状態を示し、ｍ−クロロフェノール濃度は２００μｇ／ｍｌ以上である。

このように、培養時にクロロフェノールなどの有害化学物質を含む培養液を導入し、その後同様にアッセイを行うと、明らかに信号強度に差が見られた。このことからこの出願の発明のシステムが簡易型の化学物質安全評価システムとして機能することが確認されてきた。

たとえば、次の表１は、この出願の発明によって化学物質の安全性リスクが評価された結果の一部を例示したものであって、ＥＣ５０（μｇ／ｍｌ）、すなわち半数影響濃度でアッセイの結果の信号値が半分になった値を示している。短時間でのアッセイが可能とされている。

この出願の発明によって、簡便な化学物質リスク評価システムが構築でき、病原性バクテリアの迅速同定も可能であって、小型、迅速、安価なバイオアッセイシステムを構築できる。

これらによって、環境や食物、健康などの簡易検査システムを実現することができる。

実施例のシステムの概要を示した図である。 実際のシステムのマイクロチップ外観と培養槽の多孔質フィルターの断面ＳＥＭ像を示した図である。 多孔質フィルターの流路流れ方向の断面像を示した図である。 実施例１のインドール試験の結果を例示した図である。 実施例２のインドール試験の結果を例示した図である。 ｍ−クロロフェノールのリスク評価の試験結果を例示した図である。

Claims (7)

1. 基板上に微細流路を配設したマイクロチップにおいて、微細流路の一部にバクテリアの培養槽を配設し、微細流路より試薬もしくは試料を導入して培養槽内のバクテリアの応答を検出してバイオアッセイを行うようにしたことを特徴とするマイクロバイオアッセイシステム。
2. 複数の培養槽を各々異なる微細流路に配設したことを特徴とする請求項１のマイクロバイオアッセイシステム。
3. 多孔質隔壁が配設された培養槽が構成されていることを特徴とする請求項１または２のマイクロバイオアッセイシステム。
4. 非接着性で１μｍ以下のサイズのバクテリアが培養槽内にトラップされる請求項１ないし３のいずれかのマイクロバイオアッセイシステム。
5. 熱レンズ顕微鏡によりバクテリアの応答を検出する請求項１ないし４のいずれかのマイクロバイオアッセイシステム。
6. 化学物質の安全性評価が行われることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかのマイクロバイオアッセイシステム。
7. バクテリアの同定が行われることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかのマイクロバイオアッセイシステム。