JP6611223B2 - 微粒子分離用チップ、該微粒子分離用チップを用いた微粒子分離用システム、該部粒子分離用システムを用いた微粒子分離方法及び微粒子抽出方法 - Google Patents

微粒子分離用チップ、該微粒子分離用チップを用いた微粒子分離用システム、該部粒子分離用システムを用いた微粒子分離方法及び微粒子抽出方法 Download PDF

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Description

本発明は、液体中に混在するサイズの異なる微粒子を分離するための微粒子分離用チップ（以下、単に「チップ」と記載することがある。）、該チップを用いた微粒子分離用システム該部粒子分離用システムを用いた微粒子分離方法及び微粒子抽出方法に関するもので、特に、血液中の循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ、以下「ＣＴＣ」と略記することもある。）を選択的に捕捉するためのＣＴＣ分離用チップ、該チップを用いたＣＴＣ分離用システム及びＣＴＣ分離方法に関する。
ＣＴＣはがん患者の末梢血流を循環する腫瘍細胞と定義され、原発腫瘍又は転移腫瘍から血管中へ浸潤した腫瘍細胞である。このＣＴＣの検出は、転移性悪性腫瘍の早期発見の方法の一つとして近年注目されている。その理由は、Ｘ線写真や血清中の腫瘍マーカー検出よりも低侵襲かつ正確に転移性悪性腫瘍の診断を行え、患者の予後予測や治療効果の指標として利用できる点にある。
ＣＴＣは非常に稀少な細胞であり、転移性がん患者の血液に含まれる１０8〜１０9個の血液細胞の内、わずか１細胞程度しか存在しないことが知られている。そのため、末梢血から稀少なＣＴＣを正確に検出するための技術開発に多大な努力が注がれている。これまでに開発されてきた主要な検出方法には、免疫組織化学法、ＰＣＲ法、フローサイトメトリー法などがある。しかしながら、前述したようにＣＴＣは非常に稀少な細胞であるため、血液をそのままこれらの検出方法に供することは出来ないので、通常は前処理として、ＣＴＣの濃縮操作が必須であり、検出法に則したレベルまでＣＴＣ存在比を濃縮させる必要がある。
ＣＴＣの濃縮方法として開発されてきた様々な手法の中で、最も広く利用されているのは、細胞表面の特異的抗原を標的とした腫瘍細胞の濃縮である。その多くは、上皮細胞接着分子（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体を固定化した磁気微粒子を血液と混合した後、磁石を用いて腫瘍細胞を濃縮する方法をとっている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、ＥｐＣＡＭの発現量は腫瘍のタイプに依存し大きく変動することが知られている。
その他の濃縮方法としては、細胞のサイズなどの形態を基準として濃縮する手法がある。白血球に比べてサイズが大きな上皮性腫瘍細胞をフィルトレーションによって選別する方法は、ＩＳＥＴ法（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｚｅ ｏｆ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれている。ＩＳＥＴは、孔径８μｍのポリカーボネートメンブレンフィルターを用いて血液をフィルトレーションするという簡便な手法であり、安価かつユーザーフレンドリーな手法である。ここで用いられているポリカーボネートメンブレンフィルターは、重イオンを照射した後、エッチングを行うトラックエッチングという手法によって、孔が形成されている。しかし、孔が比較的低密度であり、二つ又はそれ以上の孔が重なりあったりする問題があるため、ＣＴＣの捕捉に利用した場合、その捕捉効率は５０〜６０％とされており、濃縮法が簡便かつ効率も良い手法は未だ開発されていない。
ＣＴＣの検出を効率的かつ正確なものにするためには、濃縮と検出といった技術を首尾一貫して行うことが必要である。多段階のハンドリング操作、例えば細胞の染色、洗浄、分離、分注などの操作はＣＴＣのロスを引き起こすため、可能な限りこれらの操作を避け、一体の検出装置中で分析が一貫して行える形が好ましい。Ｃｅｌｌｓｅａｒｃｈ（ＶｅｒｉｄｅｘＴＭ，Ｗａｒｒｅｎ，ＰＡ）はＣＴＣ検出装置として唯一ＦＤＡの認可を受けた装置である。この装置では、全血に対し抗ＥｐＣＡＭ抗体固定化磁気微粒子によるＣＴＣの濃縮を行い、腫瘍細胞に対して免疫染色を行った後、自動化蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、当該装置を用いる場合、一般的に大型の装置導入と訓練されたオペレーターの確保が必要であり、ベッドサイドで短時間且つ正確に検査をすることは困難である。
一方で、ＣＴＣ検出のための小型のマイクロ流体デバイスも知られている。例えば、Ｔｏｎｅｒらが開発したＣＴＣ検出用マイクロ流体デバイスはＣＴＣ−ｃｈｉｐと呼ばれ、フォトリソグラフィーによって形成されたシリコン製の流路内に、円筒状構造物（マイクロポスト）が７８０００個構成されている。このマイクロポストには、抗ＥｐＣＡＭ抗体がコーティングされており、本流路に血液を送液すると、血液中のＣＴＣがマイクロポスト上に捕捉される。捕捉されたＣＴＣに対して、上皮細胞マーカー（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）をターゲットとした蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる。本装置は、手のひらに乗る小型デバイスでありながら、５ｍＬ以上の血液をそのまま分析に供することができるという大きな利点を持っている。実際に転移性がん患者血液からＣＴＣ検出を行っており、回収したＣＴＣからチロシンキナーゼ阻害薬に対する耐性を生む変異を検出することが出来る。しかしながら、ＣｅｌｌｓｅａｒｃｈやＣＴＣ−ｃｈｉｐを用いたＣＴＣ検出は、転移性がん患者血液などの実サンプルを用いた実験が精力的に行われ実績を挙げているが、これらの手法は抗ＥｐＣＡＭ抗体でＣＴＣを濃縮するという原理になっている。そのため、ＥｐＣＡＭ陰性又は弱陽性の腫瘍細胞は検出できないという問題点が挙げられる。
その他の方法としては、腫瘍細胞のサイズと形態を指標として、ＣＴＣを検出するマイクロ流体デバイスが開発されている。これらのデバイスでは、その流路構造内にメンブレンマイクロフィルター、三日月型の細胞捕捉ウェル（非特許文献３参照）、４段階の細さの流路（非特許文献４参照）を配して、血液中の血球細胞と腫瘍細胞をサイズによって選別し、腫瘍細胞を選択的に濃縮している。また、その流路を利用して、濃縮後の細胞に対して溶解などの操作を連続的に行うことが出来る。これらのデバイスを用いたモデル腫瘍細胞の回収効率の評価実験においては、８０％以上のＣＴＣ回収効率を得ている。しかしながら、この評価はあくまでモデル細胞を用いた実験で行われており、実際にＣＴＣ検出時に必要となる細胞の染色操作や洗浄操作といった要素技術項目については検討されていない。さらに、がん患者血液などの実サンプルを用いた実験は行われておらず、実際にＣＴＣ検出に利用できるかどうかは明らかにされていない。
更に、抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用しない小型のデバイスとしては、マイクロ流路内にマイクロキャビティアレイ（微細貫通孔）を設け、ＣＴＣを捕捉することができるマイクロ流体デバイスが知られている（特許文献１参照）。しかしながら、前記マイクロ流体デバイスは、微細貫通孔にＣＴＣを捕捉するタイプであるので、ＣＴＣの目詰まりによる作業効率の低下、更には分離したＣＴＣの回収が困難であるという問題がある。
上記問題点を解決するため、本発明者らは、（１）主流路、及び該主流路の幅より大きな捕捉部位が形成された微粒子分離用マイクロ流路チップ、又は（２）主流路、該主流路から分岐し再び主流路に接続する分岐流路、及び該分岐流路に分岐流路の幅より大きな捕捉部位が形成されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、を用いて気液界面のメニスカスで生じる力を利用して微粒子を沈降させ、目的とする微粒子のみを捕捉部位で捕捉することができることを見出し、特許出願を行っている（特許文献２参照）。
また、本発明者らは、（１）捕捉部位を含む主流路が基板の中心から放射状に形成されている微粒子分離用マイクロ流路チップを回転手段上に載置し、（２）前記微粒子分離用マイクロ流路チップの表面に、シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニットを配置し、（３）前記回転手段を回転させながらシース液及びサンプル液を注入することで、サンプルを前記微粒子分離用マイクロ流路チップに連続的に供給することができ、目的とする微粒子を効率よく捕捉・分離できることを新たに見出し、特許出願を行っている（特許文献３参照）。
特開２０１１−１６３８３０号公報 国際公開第２０１４／０６１６３１号 特開２０１４−２２６０６５号公報
Ａｌｌａｒｄ ＷＪ， Ｍａｔｅｒａ Ｊ， Ｍｉｌｌｅｒ ＭＣ， Ｒｅｐｏｌｌｅｔ Ｍ， Ｃｏｎｎｅｌｌｙ ＭＣ， Ｒａｏ Ｃ， Ｔｉｂｂｅ ＡＧ， Ｕｈｒ ＪＷ， Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ ＬＷ． ２００４． Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ａｌｌ ｍａｊｏｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０（２０）：６８９７−９０４． Ｒｉｅｔｈｄｏｒｆ Ｓ， Ｆｒｉｔｓｃｈｅ Ｈ， Ｍｕｌｌｅｒ Ｖ， Ｒａｕ Ｔ， Ｓｃｈｉｎｄｌｂｅｃｋ Ｃ， Ｒａｃｋ Ｂ， Ｊａｎｎｉ Ｗ， Ｃｏｉｔｈ Ｃ， Ｂｅｃｋ Ｋ， Ｊａｎｉｃｋｅ Ｆ ａｎｄ ｏｔｈｅｒｓ． ２００７． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ｓｙｓｔｅｍ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３（３）：９２０−８． Ｔａｎ ＳＪ， Ｙｏｂａｓ Ｌ， Ｌｅｅ ＧＹ， Ｏｎｇ ＣＮ， Ｌｉｍ ＣＴ． ２００９． Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ １１（４）：８８３−９２． Ｍｏｈａｍｅｄ Ｈ， Ｍｕｒｒａｙ Ｍ， Ｔｕｒｎｅｒ ＪＮ， Ｃａｇｇａｎａ Ｍ． ２００９． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １２１６（４７）：８２８９−９５．
しかしながら、上記特許文献２及び３、並びに非特許文献３に記載された発明は、基板上に形成された捕捉部位に捕捉される捕捉対象微粒子の位置はばらばらである。そのため、捕捉した捕捉対象微粒子を顕微鏡等で確認・回収するためには、チップ又は顕微鏡等を少なくともＸ−Ｙの２軸方向に移動させながらチップ上をスキャンする必要があり、検出に時間を要するという問題がある。
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、
基板上に壁流路部とピラーを設け、隣り合う２つの壁流路部でマイクロ流路を形成し、
（１）マイクロ流路の端部から離れた位置に少なくとも２本のピラーで第１捕捉部位を形成し、且つ、該第１捕捉部位を結んだ線が直線状又は円形状となるように第１捕捉部位を配置したチップを作製、又は
（２）隣り合う２個の壁流路部の間又は壁流路部から離れた位置に、捕捉ピラーを直線状又は円形状となるように配置したチップを作製、
することで、チップ上に捕捉された捕捉対象微粒子を一軸直動方向の操作のみで検出・回収することができ、その結果、サンプル分離・回収のスループットを向上できることを新たに見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の目的は、微粒子分離用チップ、該微粒子分離用チップを用いた微粒子分離用システム、該部粒子分離用システムを用いた微粒子分離方法及び微粒子抽出方法を提供することである。
本発明は、以下に示す、微粒子分離用チップ、該微粒子分離用チップを用いた微粒子分離用システム、該部粒子分離用システムを用いた微粒子分離方法及び微粒子抽出方法に関する。
（１）基板、該基板上に形成された少なくとも３個以上の壁流路部及び少なくとも３本以上のピラーを含み、
前記壁流路部は、一端が前記基板上に設けられ他端が上方に開放し、隣り合う２つの壁流路部でマイクロ流路を形成し、
前記ピラーは、一端が前記基板上に設けられ他端が上方に開放するように形成され、２本のピラーで捕捉対象微粒子を捕捉するための第１捕捉部位を形成し、
捕捉対象微粒子の大きさをＸ、除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記壁流路部の壁面と壁面の間隔はＸ以上であり、
前記第１捕捉部位は、前記マイクロ流路から離れた位置に形成され、第１捕捉部位を形成する任意の隣り合うピラー同士の間隔Ｚ1はＹ＜Ｚ1＜Ｘ、０．８Ｙ≦Ｚ1≦０．８Ｘ、Ｙ＜Ｚ1≦０．８Ｘ、又は０．８Ｙ≦Ｚ1＜Ｘから選択される１種であり、隣り合う第１捕捉部位は少なくとも１本のピラーを共有し、更に第１捕捉部位を結んだ線が直線となるように形成されている微粒子分離用チップ。
（２）上記（１）に記載の第１捕捉部位において、２本のピラーに代え、３本以上のピラーで第１捕捉部位を形成し、任意の隣り合うピラーの組み合わせの内、間隔が最も長いピラーの組み合わせが前記マイクロ流路方向に面するように配置され、他の隣り合うピラー同士の間隔は前記Ｚ1と同じである上記（１）に記載の微粒子分離用チップ。
（３）前記第１捕捉部位に隣接して第２捕捉部位が形成され、
前記第２捕捉部位は３本以上のピラーで形成され、任意の隣り合うピラー同士の間隔は前記Ｚ1と同じで、且つ前記第２捕捉部位を形成する３本以上のピラーは、第２捕捉部位に捕捉された捕捉対象微粒子が任意の隣り合うピラーの間から流出しない位置関係に配置され、更に、第１捕捉部位と第２捕捉部位は、少なくとも１本のピラーを共有している上記（１）又は（２）に記載の微粒子分離用チップ。
（４）前記基板が円形で、前記壁流路部が円周に向かって放射状に形成され、前記第１捕捉部位を結んだ線も円形となるように形成されている上記（１）〜（３）の何れか一に記載の微粒子分離用チップ。
（５）基板、該基板上に形成された少なくとも３個以上の壁流路部及び少なくとも２本以上の捕捉ピラーを含み、
前記壁流路部は、一端が前記基板上に設けられ他端が上方に開放し、隣り合う２つの壁流路部でマイクロ流路を形成し、
前記捕捉ピラーは、一端が前記基板上に設けられ、他端が上方に開放するように形成され、
捕捉対象微粒子の大きさをＸ、除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記壁流路部の壁面と壁面の間隔はＸ以上であり、
前記壁面と壁面との間に少なくとも前記捕捉ピラーが形成され、該捕捉ピラーと前記壁面の間隔をＺ2とした場合、前記壁面に対する前記捕捉ピラーの位置及び大きさはＹ＜Ｚ2＜Ｘ、０．８Ｙ≦Ｚ2≦０．８Ｘ、Ｙ＜Ｚ2≦０．８Ｘ、又は０．８Ｙ≦Ｚ2＜Ｘから選択される１種となるように形成され、更に、各捕捉ピラーを結んだ線が直線となるように形成されている微粒子分離用チップ。
（６）前記捕捉ピラーが、前記壁面と壁面との間に代え、前記壁流路部の端部から離れた位置であって、且つ前記端部との間隔が前記Ｚ2となるように形成されている上記（５）に記載の微粒子分離用チップ。
（７）前記捕捉ピラーを共有しながら更に第１捕捉部位が形成されている上記（６）に記載の微粒子分離用チップ。
（８）前記基板が円形で、前記壁流路部が円周に向かって放射状に形成され、前記捕捉ピラーを結んだ線も円形となるように形成されている上記（５）〜（７）の何れか一に記載の微粒子分離用チップ。
（９）前記捕捉対象微粒子がＣＴＣで、除去される微粒子が血球細胞である上記（１）〜（８）の何れか一に記載の微粒子分離用チップ。
（１０）上記（１）〜（３）、（５）〜（７）の何れか一に記載されている微粒子分離用チップ、
チップ１を載置するチップ台、
チップ１に捕捉された捕捉対象微粒子を検出するための検出手段、
前記チップ台又は前記検出手段を一軸直動方向に移動するための駆動手段、
を少なくとも含む微粒子分離用システム。
（１１）上記（４）又は（８）に記載の微粒子分離用チップ、
チップ１を載置して回転させる回転手段、
チップ１に捕捉された捕捉対象微粒子を検出するための検出手段、
を少なくとも含む微粒子分離用システム。
（１２）検出手段で検出した捕捉対象微粒子を抽出する微粒子抽出手段を更に含む上記（１０）又は（１１）に記載の微粒子分離用システム。
（１３）上記（１）〜（３）、（５）〜（７）の何れか一に記載の微粒子分離用チップの壁流路部部分で希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液にメニスカスを発生させ、発生したメニスカスにより希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液を２つの壁流路部で形成したマイクロ流路内に押し込む工程、
チップ１の壁流路部とは反対側から吸引手段及び／又は吸引装置により希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液を吸引することで、サンプル中の捕捉対象微粒子は前記微粒子分離用チップに設けられた第１捕捉部位又は捕捉ピラーと壁流路部の間で捕捉され、除去される微粒子は微粒子分離用チップから除去される工程、
を含む微粒子分離方法。
（１４）上記（１３）に記載の微粒子分離方法により捕捉対象微粒子を分離後に、
微粒子分離用チップを載置するチップ台を一軸直動方向に移動、又は捕捉対象微粒子を検出する検出手段を一軸直動方向に移動することで、前記第１捕捉部位又は捕捉ピラーと壁流路部の間で捕捉された捕捉対象微粒子を検出する工程、
検出した捕捉対象微粒子を微粒子抽出手段で抽出する工程、
を含む微粒子抽出方法。
（１５）上記（４）又は（８）に記載の微粒子分離用チップの壁流路部部分で希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液にメニスカスを発生させ、発生したメニスカスにより希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液を２つの壁流路部で形成したマイクロ流路内に押し込む工程、
吸引手段及び／又は吸引装置により希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液を吸引することで、捕捉対象微粒子は前記微粒子分離用チップに設けられた第１捕捉部位又は捕捉ピラーと壁流路部の間で捕捉され、除去される微粒子は微粒子分離用チップから除去される工程、
を含む微粒子分離方法。
（１６）上記（１５）に記載の微粒子分離方法により捕捉対象微粒子を分離後に、
微粒子分離用チップを回転することで、前記第１捕捉部位又は捕捉ピラーと壁流路部の間で捕捉された捕捉対象微粒子を検出する工程、
検出した捕捉対象微粒子を微粒子抽出手段で抽出する工程、
を含む微粒子抽出方法。
本発明のチップを用いると、サンプル中の捕捉対象微粒子を直線状又は円形状に捕捉することができる。
そのため、捕捉対象微粒子を直線状に補足した場合は、サンプルの分離後にチップ又は顕微鏡等を一軸直動方向に移動するのみで、捕捉された捕捉対象微粒子を検出・回収することができる。また、捕捉対象微粒子を円形状に捕捉する場合も、サンプル分離後にチップを一軸回転させるのみで、捕捉された捕捉対象微粒子を検出・回収することができる。したがって、サンプルの分離・回収のスループットを向上することができる。
更に、本発明のチップを用いるとサンプルの分離・回収に要するチップ１又は検出手段の移動機構は直動軸又は回転軸のみでよいことから、微粒子分離用システムを小型化、低価格化することができる。
また、捕捉対象微粒子が直線状に捕捉されるチップを用いた場合、捕捉対象微粒子が捕捉されている直線の位置が同じとなるようにチップを複数枚並べる又は連続的に供給することで、チップに捕捉された捕捉対象微粒子の連続的な検出・回収が可能である。したがって、サンプル量の関係で複数枚にチップを用いる必要がある場合でも、連続的な分離・回収が可能である。
図１は、本発明のチップ１の第１の実施形態の一例を示している。 図２（１）は図１のＡ−Ａ’断面図で、図２（２）は図１のＢ−Ｂ’断面図である。 図３は、本発明のチップ１の第１の実施形態の壁流路部３と第１捕捉部位の大きさ及び位置関係を示す図で、図３（１）は２本のピラー４で１つの第１捕捉部位６を形成する例、図３（２）は３本のピラー４で１つの第１捕捉部位を形成する例、図３（３）は５本のピラー４で１つの第１捕捉部位を形成する例を示している。 図４（１）及び（２）は、第２捕捉部位７の配置の具体例を示す図である。 図５は、図１に示す第１捕捉部位６と第２捕捉部位７の組み合わせの他の実施形態の例を示す図である。 図６は本発明のチップ１の第２の実施形態を示しており、図６（１）は壁流路部３と壁流路部３の間に捕捉ピラー４が形成されている例、図６（２）はピラー４を複数設ける例、図６（３）は壁流路部３の端部から離れた位置に捕捉ピラー４が形成されている例、図６（４）は図６（３）の捕捉ピラー４を共有する例を示している。 図７は、円形状のチップ１の例を示している。 図８は、本発明のチップの作製手順の一例を示したフローチャートである。 図９、本発明の微粒子分離用システムのチップ１が４角形の場合の、チップ１の周辺部分の概略を示している。 図１０は、メニスカスの発生原理を説明している。 図１１は、本発明の微粒子分離用システムの他の実施形態の概略及び微粒子分離方法を示す図である。 図１２は図１１のＡ−Ａ′断面図で、図１２（１）〜（４）はメニスカスの発生原理を説明する図である。 図１３は、ピラー４を形成していない平面部に当接する場合の吸引ユニット３５の実施形態の一例を示しており、図１３（１）は吸引ユニット３５の概略を示す上面図で、図１３（２）は吸引ユニット３５のＢ−Ｂ′断面図を示している。 図１４は、微粒子分離用システム１００の全体像を示す概略図である。 図１５は、円形状のチップ１を用いた微粒子分離用システム１１０概略図である。 図１６は、図面代用写真で、移流集積ユニットの概略を示している。 図１７は、図面代用写真で、移流集積ユニットを斜め上から拡大撮影した写真である。 図１８は、図面代用写真で、実施例１で作製したチップの外観を示している。 図１９は、実施例１で作製したチップ１の壁流路部３の端部と第１捕捉部位６付近の拡大写真である。 図２０は、比較例１で作製したチップ１の第２捕捉部位の拡大写真である。 図２１は、図面代用写真で、実施例２で作製した微粒子分離システムの写真である。 図２２は、図面代用写真で、実施例２で血液サンプルを流し終えた後、蛍光実態（正立）顕微鏡で撮影したチップ１の写真である。 図２３は、図面代用写真で、比較例２で血液サンプルを流し終えた後、蛍光実態（正立）顕微鏡で撮影したチップ１の写真である。
以下に、本発明の微粒子分離用チップ、該微粒子分離用チップを用いた微粒子分離用システム、該部粒子分離用システムを用いた微粒子分離方法及び微粒子抽出方法について詳しく説明する。なお、明細書中、同じ符号が付された部材は、同じものを意味する。
図１は、本発明のチップ１の第１の実施形態の一例を示している。図１に示すチップ１は、基板２上に形成された少なくとも３個以上の壁流路部３及び少なくとも３本以上のピラー４を含んでいる。なお、本発明において、「ピラー」とは、基板２上に形成された柱を意味し、「壁流路部」とは、基板２上に形成された板状の壁を意味する。また、「微粒子」とは、液体に分散できる粒子であって、粒子の形態は単独又は凝集状態のものを意味する。微粒子の大きさは、メニスカスの原理が適用できる範囲であれば特に制限はなく、約１ｍｍ以下の大きさであればよい。また、本発明において、微粒子の「大きさ」とは、微粒子を任意の方向から２枚の平行な平面で挟んだ際に、平面の間隔が最短となる長さを意味する。例えば、微粒子が球状の場合は直径を意味する。
壁流路部３は、２つの隣り合う壁流路部３でマイクロ流路５を形成している。また、３本のピラー４で第１捕捉部位６を形成し、更に、第１捕捉部位６に隣接し第１捕捉部位のピラーを共有して第２捕捉部位７を形成している。マイクロ流路５から流れてきた捕捉対象微粒子８は、第１捕捉部位６で捕捉される。なお、捕捉対象微粒子８が生体細胞等の形状が変化し易い場合は、流体力により変形して第１捕捉部位６のピラー４の間をすり抜けてしまう可能性がある。第２捕捉部位７を形成することは必須ではないが、捕捉対象微粒子８が生体細胞等の形状が変化し易い場合は、必要に応じて、第１捕捉部位６に隣接して第２捕捉部位７を形成してもよい。
図２（１）は、図１のＡ−Ａ’断面図で、ピラー４の一端は基板２上に設けられ、他端は上方に開放しており、捕捉対象微粒子８は、ピラー４とピラー４の間で捕捉される。図２（２）は、図１のＢ−Ｂ’断面図で、壁流路部３もピラー４と同様に、一端は基板２上に設けられ、他端は上方に開放している。
図３は、本発明のチップ１の第１の実施形態の壁流路部３と第１捕捉部位６の大きさ及び位置関係を示す図である。図３（１）は、２本のピラー４で１つの第１捕捉部位６を形成する例を示している。先ず、壁流路部３について、本発明のチップ１を用いて捕捉される捕捉対象微粒子８の大きさをＸ、除去される微粒子９の大きさをＹとした場合、隣り合う壁流路部３同士の壁面と壁面の間隔Ｌ（マイクロ流路５の幅）はＸ以上であればよい。間隔Ｌの上限は特に制限は無いが、間隔が長すぎると、一つのチップ１に形成できるマイクロ流路５の数が少なくなりスループットが低下すること、また移流の際に用いる毛管力が低下することから、間隔Ｌは２Ｘ以下が好ましく、１．５Ｘ以下がより好ましく、１．１Ｘ以下が更に好ましい。壁流路部３の厚さも特に制限は無いが、製造の容易性の観点から、１μｍ以上が好ましく、２μｍ以上がより好ましい。また、壁流路部３の厚さが厚すぎるとサンプルを流す面積が少なくなりスループットが低下することから、５０μｍ以下が好ましく、３０μｍがより好ましく、２０μｍ以下が特に好ましい。壁流路部３の長さ（マイクロ流路の長さ）は、１０〜２０ｍｍ程度が好ましい。１０ｍｍ以下であるとカバー板３１を配置する十分なスペースが確保できなくなり、２０ｍｍ以上であると全体のチップのサイズが大きくなる。また、壁流路部３の高さは、取り扱いの容易性から後述するピラー４の高さと同じにすればよい。
図３（１）に示す第１捕捉部位６は２本のピラーで形成されており、隣り合うピラー４の間隔Ｚ1は、除去される微粒子９は通過するが、捕捉対象微粒子８を捕捉できればよいので、Ｙ＜Ｚ1＜Ｘとなるように形成されている。なお、本発明において、「間隔」とは、隣り合うピラー４の外周と外周との最短距離を意味する。基板２上に形成されているピラー４の間隔Ｚ1は、Ｙ＜Ｚ1＜Ｘの関係を満たせば、全て同じであっても、第１捕捉部位毎に変化していてもよい。
捕捉対象微粒子８が、生体細胞等の形状が変化し易い場合、流体力により変形して第１捕捉部位６のピラー４の間をすり抜けてしまう可能性がある。また、除去される微粒子９も同様に変化し易い場合、ピラー４の間隔が除去される微粒子９の間隔より狭くても、第１捕捉部位６内に入った除去される微粒子９を第１捕捉部位６から排出することができる、したがって、任意の隣り合うピラー４の間隔Ｚ1は、捕捉対象微粒子８及び／又は除去される微粒子９の形状の変化割合に応じて適宜選択すればよく、例えば、０．８Ｙ≦Ｚ1≦０．８Ｘ、Ｙ＜Ｚ1≦０．８Ｘ、又は０．８Ｙ≦Ｚ1＜Ｘ等、適宜調整すればよい。
ピラー４の断面形状は特に制限は無く、円、多角形等から適宜選択すればよい。ピラー４は、基板２上に貼り付けてもよいが、後述するように、先ず鋳型を作製し、当該鋳型を基板２用の材料に転写することで、効率的にチップ１を作製することができる。転写により作製する場合、加工の容易性等の理由により、ピラー３の断面長（断面が円形の場合は直径、多角形の場合は任意の外周を結んだ線の中で最も長い線の長さ）は、１μｍ以上が好ましく、２μｍ以上がより好ましい。ピラー４の断面長の上限は特に制限は無く、捕捉対象微粒子８及び除去される微粒子９の大きさにより決められる間隔Ｚ1、第１捕捉部位６を形成するピラー４の本数等を考慮し、適宜決定すればよい。
第１捕捉部位６は、前記マイクロ流路５（壁流路部３の端部）から離れた位置に形成されている。壁流路部３の端部と第１捕捉部位６のピラー４との距離Ｍの長さは特に制限は無いが、距離Ｍが短いと第１捕捉部位６で捕捉された捕捉対象微粒子８への流体力が大きくなる。一方、距離Ｍが長くなると、捕捉された捕捉対象微粒子８への流体力が小さくなり、隣り合うピラー４からすり抜ける捕捉対象微粒子８の割合が少なくなるが、マイクロ流路５から流れ出たサンプル液の流れに乱れが生じやすくなる。具体的な距離Ｍは、サンプル液の流速、捕捉対象微粒子８の種類、隣り合うピラー４同士の間隔Ｚ1等を考慮して適宜設定すればよいが、６〜１０μｍが好ましく、６〜７μｍがより好ましい。
図３（２）は３本のピラー４で１つの第１捕捉部位６を形成する例を示しており、図３（３）は５本のピラー４で１つの第１捕捉部位を形成する例を示している。３本以上のピラーで第１捕捉部位６を形成する場合は、何れの場合も、任意の隣り合うピラーの組み合わせの内、最も長い間隔（Ｚ3）のピラー４の組み合わせ（以下、間隔がＺ3の組み合わせのピラー４を「Ｚ3ピラー」と記載することがある。）が、マイクロ流路５の方向に面する（Ｚ3ピラーを結んだ線がマイクロ流路５の流れ方向と略直交する）ように配置されていればよい。Ｚ3は、Ｙより大きければ、Ｘより小さくても大きくてもよい。図３（２）に示すように第１捕捉部位６が３本のピラー４で形成され、Ｚ3がＸより大きい場合、捕捉対象微粒子８はＺ3ピラーの間を通って第１捕捉部位６で捕捉される。なお、Ｚ3がＸより小さい場合、捕捉対象微粒子８はＺ3ピラーの間で捕捉され、仮にＺ3ピラーの間をすり抜けても、他のピラー４の間隔はＺ3より短いことから、第１捕捉部位６で捕捉することができる。また、Ｚ3がＸより大きい場合は、捕捉対象微粒子８はＺ3ピラーの間を通って、第１捕捉部位６で捕捉される。図３（３）に示すように第１捕捉部位６が５本のピラー４で形成されている場合も図３（２）と同様に、Ｚ3がＸより大きい場合は、捕捉対象微粒子８はＺ3ピラーの間を通って第１捕捉部位６で捕捉され、Ｚ3がＸより小さい場合、捕捉対象微粒子８はＺ3ピラーの間で捕捉される。Ｚ3ピラー以外の他の隣り合うピラー同士の間隔は、Ｚ1と同様であればよい。
隣り合う第１捕捉部位６は、少なくとも１本以上のピラー４を共有して連続的に配置されていることが好ましく、特に距離Ｍが０．８Ｘ以上の場合は、特に第１捕捉部位６を連続して設けることが好ましい。一本のマイクロ流路５に複数の捕捉対象微粒子８が流れてきた場合、図３（２）に示すようにマイクロ流路５の前方の第１捕捉部位６に既に捕捉対象微粒子８が捕捉されている場合がある。第１捕捉部位６を連続的に配置することで、捕捉対象微粒子８は、流体力により他の第１捕捉部位６に流れて捕捉することができる。
また、第１捕捉部位で捕捉された捕捉対象微粒子８を１軸の操作で検出・回収するためには、第１捕捉部位を結んだ線が直線となるように第１捕捉部位６が配置されていることが望ましい。なお、本発明において、「第１捕捉部位を結んだ線が直線になる」とは、第１捕捉部位で捕捉された捕捉対象微粒子８が直線状になるような第１捕捉部位の配置を意味する。例えば、第１捕捉部位６が、図３（１）に示すように２本のピラー４、又は図３（２）に示すように３本以上のピラー４で形成され且つＺ3がＸより短い場合は、夫々の第１捕捉部位６の２本のピラー４又は少なくともＺ3ピラーを結んだ線（図３（１）及び（２）中の点線）が直線になればよい。図３（３）に示すように、第１捕捉部位６が３本以上のピラー４で形成され且つＺ3がＸより長い場合は、第１捕捉部位のピラー４の内、少なくとも捕捉対象微粒子８に当接する最も下流側（マイクロ流路５の端部と反対側）のピラー４を結んだ線（図３（３）中の点線）が直線となればよい。捕捉対象微粒子８に対する流体力を同じにし、捕捉対象微粒子８を直線状に補足するためには、第１捕捉部位６は連続した同じ形状にすることが望ましい。
基板２上のピラー４の高さは、捕捉した捕捉対象微粒子８がサンプル液の流体力により流れ出さない高さであればよく、捕捉対象微粒子８の大きさの０．５倍より大きいことが好ましく、１倍以上がより好ましい。一方、高さの上限は特には無いが、サンプル液を流した後、第１捕捉部位６で捕捉された捕捉対象微粒子８をキャピラリー等で吸引・回収する場合、ピラー４が高すぎると、第１捕捉部位で捕捉された捕捉対象微粒子８をキャピラリーで回収し難くなる。そのため、ピラー４の高さは、捕捉対象微粒子８の大きさの１０倍以下が好ましく、２倍以下がより好ましい。
第２捕捉部位７は、少なくとも３本以上のピラー４で形成されている。第２捕捉部位７は、第１捕捉部位６をすり抜けた捕捉対象微粒子８を捕捉する為に配置されることから、第１捕捉部位６を形成するピラー４の少なくとも１本を共有して第１捕捉部位６に隣接配置することが望ましい。第２捕捉部位７を構成するピラー４の形状及び高さは第１捕捉部位６のピラー４と同じでよく、また、任意のピラー４の間隔はＺ1と同様でよい。なお、第1捕捉部位６は、図３（１）に示すように、捕捉対象微粒子８を堰き止めるように捕捉する形態も含まれるが、第２捕捉部位７では、捕捉対象微粒子８をピラー４の中に閉じ込めるように捕捉する必要がある。そのため、第２捕捉部位７を形成するピラー４については、任意のピラー４の組み合わせの間隔がＺ1であることに加え、捕捉対象微粒子８が入る大きさで且つ流れ出さない配置にする必要がある。
図４は第２捕捉部位７の配置の具体例を示している。図４（１）及び（２）は３本のピラー４で形成している例を示しており、捕捉対象微粒子８を任意の方向から２枚の平行な平面で挟んだ際に、平面の間隔が最短となる線（図４（１）の捕捉対象微粒子８の点線）を含むように捕捉対象微粒子８を切断して平面にした場合、当該最短となる線を境界に、両側に少なくとも１本のピラー４が配置されるようにすればよい。第２捕捉部位７は、上記Ｚ1の関係及び捕捉された捕捉対象微粒子８が任意の隣り合うピラー４の間から流出しない位置関係を満たせば形状に限定は無く、４角、５角形、６角形、７角形、８角形、９角形、１０角形等の多角形が挙げられる。前記の多角形は、正多角形であってもよいし、正多角形でなくてもよい。
第１捕捉部位６をすり抜けた捕捉対象微粒子８が、更に第２捕捉部位７をすり抜ける可能性は少ないので、第２捕捉部位７は第１捕捉部位６の下流側に、１〜３列程度配置すればよい。第２捕捉部位７を２列以上設ける場合は、ピラー４を共有しながら隣接して配置することが好ましい。なお、捕捉対象微粒子８の捕捉との観点からは、第２捕捉部位７は上記の１〜３列程度で十分である。しかしながら、チップ１の表面は親水性であるので注入したサンプル液は自然と流れ出すが、基板２にピラーが形成されていない部分が長くなると、後述する吸引手段及び／又は吸引装置にサンプル液を到達させるための毛管力が不足するので好ましくない。また、サンプル液の先端が吸引手段及び／又は吸引装置に到達して連続的にサンプル液を吸引する状態になった後でも、ピラー４が形成されていない部分は毛管力が発生し難くなり、その結果、上流側のマイクロ流路５を流れるサンプル液の流速に乱れが生じる可能性がある。したがって、基板２上には、第１捕捉部位６から、吸引手段及び／又は吸引装置を配置する位置付近までピラー４が形成されていることが好ましい。上記１〜３列の第２捕捉部位７より下流側のピラー４については、サンプル液の流れが一定になれば特に配置に特に制限は無い。所定間隔でピラー４を配置してもよいが、サンプル液がより均一に流れるようにするためには、第２捕捉部位と同形状とすることが望ましい。
図５は、図１に示す第１捕捉部位６と第２捕捉部位７の組み合わせの他の実施形態の例を示す図である。図５（１）に示すチップ１は、２本のピラー４で第１捕捉部位６を形成し、前記２本のピラー４を共有して６本のピラー４で第２捕捉部位７が形成され、更に第２捕捉部位７の２本のピラー４を共有して第２捕捉部位７が形成されている。図５（２）に示すチップ１は、５本のピラー４で第１捕捉部位６を形成し、前記第１捕捉部位６の１本のピラー４を共有して６本のピラー４で第２捕捉部位７が形成され、更に第２捕捉部位７の１本のピラー４を共有して第２捕捉部位７が形成されている。なお、図１及び図５に示す第１捕捉部位６と第２捕捉部位７の組み合わせは単なる例示に過ぎず、他の組み合わせであってもよい。
図６は、本発明のチップ１の第２の実施形態を示している。第２の実施形態のチップ１は、第１捕捉部位６に代え、２個の壁流路部３の壁面と壁面の間又は２個の壁流路部３の端部とピラー４との間隔を調整することで、捕捉対象微粒子８を捕捉している。なお、本発明において、壁流路部３と壁流路部３の間又は壁流路部３と壁流路部３の先端に形成され、捕捉対象微粒子８に当接し且つ２個の壁流路部３と共同して捕捉対象微粒子８を捕捉する為のピラーのことを特に「捕捉ピラー」と記載することがある。第２の実施形態の壁流路部３の大きさ等については、第１の実施形態の壁流路部３と同じでよい。
図６（１）は第２の実施形態のチップ１の例を示しており、壁流路部３と壁流路部３の間に捕捉ピラー４が形成されている。捕捉ピラー４の外周とマイクロ流路５の壁面との最短となる距離をＺ2とした場合、Ｚ2がＺ1と同じ範囲となるように、壁流路部３の壁面と壁面の間隔Ｌ及び捕捉ピラー４の大きさを調整すればよい。なお、捕捉ピラー４を設ける位置によっては、マイクロ流路５を構成する一方の壁面と捕捉ピラー４の間隔Ｚ2と他方の壁面と捕捉ピラー４の間隔Ｚ2が異なる場合があるが、何れもＺ1と同じ範囲内であれば、Ｚ2の値が異なっていてもよい。捕捉ピラー４を直線となるよう配置することで、捕捉対象微粒子８を直線状に補足することができる。なお、壁流路部３と壁流路部３の間に形成するピラーの数は一本の捕捉ピラー４に限定されず、例えば、図６（２）に示すように、ピラー４を複数設けてもよい。その場合、各壁面と該壁面に最も近いピラーの間隔がＺ2となり、ピラー４間の間隔がＺ1となるように配置すればよい。
図６（３）は第２の実施形態のチップ１の他の例を示している。図６（３）に示すチップ１は、壁流路部３と壁流路部３の間ではなく、壁流路部３の端部から離れた位置に捕捉ピラー４が形成されている。捕捉ピラー４と壁流路部３との最短となる距離は、前記Ｚ2と同様にすればよい。図６（３）に示す実施形態は、一本の捕捉ピラー４で２つの壁流路部３との間隔を調整して捕捉対象微粒子８を捕捉する点で、第１の実施形態のチップ１と異なっている。なお、図６（３）に示す位置に捕捉ピラー４を形成した場合は、図６（４）に示すように、図６（３）の捕捉ピラー４を共有しながら、第１捕捉部位６を形成してもよい。図６（３）の隣り合う捕捉ピラー４の間隔Ｚ4（以下、間隔Ｚ4のピラーを「Ｚ4ピラー」と記載することがある）がＺ1の場合は、隣り合うＺ4ピラーで第１捕捉部位６を形成することができる。また、ピラー４の間隔Ｚ4がＺ3の場合は、Ｚ4ピラーの間、又は下流側に間隔がＺ1となるように任意の数のピラー４を形成することで、Ｚ4ピラーを共有しながら第１捕捉部位６を形成することができる。また、図示はしないが、第１の実施形態と同様に、第１捕捉部位６に隣接するように第２捕捉部位７を形成してもよい。
全血から、ＣＴＣを捕捉し、ＣＴＣ以外の赤血球、白血球等の血球細胞を除去する場合、ピラー４の間隔Ｚ1は、ＣＴＣの直径（１５〜３０μｍ）よりは小さく、赤血球、白血球等の血球細胞（約７μｍ）より大きくすればよい。なお、ＣＴＣ及び血球細胞は、上記のとおり、形状が変化し易いので、ピラー４の間隔Ｚ1は、６〜１２μｍ程度であってもよい。また、腹腔洗浄液において血球細胞または中皮細胞（約７〜１５μｍ）から胃がん細胞塊（２５〜５０μｍ）を分離する場合は、間隔Ｚ1は、６〜２４μｍ程度であってもよい。
なお、上記に示したチップ１は長方形の例を示しているが、壁流路部３及びピラー４の関係が上記のとおりであれば、チップ１自体の形状は長方形に限定されず、多角形でもよい。また、後述するように、チップ１を回転させて移流集積を発生する場合は、チップ１の形状を円形にしてもよい。図７は円形状のチップ１の例を示している。なお、図７に示すチップ１では、壁流路部３と第１捕捉部位６は一部省略されているが、壁流路部３と第１捕捉部位６はチップ１の全面に形成されている。チップ１を円形状にする場合、壁流路部３の厚みを円周方向に行くほど厚くすることでマイクロ流路５の間隔Ｌを一定にすればよい。捕捉部位に関しては、上記第１の実施形態と同様に第１捕捉部位６、必要に応じて第２捕捉部位７を形成してもよいし、上記第２の実施形態と同様に捕捉ピラー４を形成してもよい。なお、チップ１の大きさ及びマイクロ流路５の長さ及び間隔Ｌにもよるが、壁流路部３の厚みを一定にしても、チップ１の中心側と円周側のマイクロ流路５の間隔が大きくずれない場合は、円周側に向かってマイクロ流路５の間隔が広くなっていてもよい。また、チップ１の中央には回転手段への取り付けのための中心孔を設けてもよいし、チップ１の外周には、後述する吸引手段及び／又は吸引装置を配置するためのピラー４が無い平面部１０を形成してもよい。なお、図７に示す例では、マイクロ流路５の円周側に第１捕捉部位６等が形成されているが、マイクロ流路５の中心側に第１捕捉部位６等を形成してもよい。
チップ１は、フォトリソグラフィー技術を用いて作製することができる。図８は作製手順の一例を示したフローチャートである。
１．先ず、鋳型用の基板１１を超音波洗浄機により有機洗浄し、ベイクする。次いで、ネガティブフォトレジスト１２を基板１１上にスピンコートし、ホットプレート上でプリベイクする。
２．壁流路部３、第１の実施形態の場合は第１捕捉部位６と必要に応じて第２捕捉部位７、第２の実施形態の場合は捕捉ピラー４と必要に応じて第１捕捉部位及び第２捕捉部位７、の形状をしたフォトマスク１３を用い露光する。
３．ホットプレート上でポストエクスポージャーベイクを行い、現像液を用い現像した後、超純水を用いリンスし、スピンドライヤー等で水分をとばし乾燥させることで、鋳型を作製する。なお、基板１１上のネガティブフォトレジスト１２で作製した凸部と凸部の間が、転写後に壁流路部３とピラー４となる部分である。
４．チップ１の基板２用の材料を、鋳型の上に流し込む。
５．鋳型のパターンが転写した基板２用の材料を鋳型から分離する。必要に応じて、基板２を硬質材料１４に接着する。
６．基板２の表面を、必要に応じて親水化処理する。
有機洗浄は、アセトン、エタノール等、半導体製造分野で一般的に用いられている洗浄剤であれば特に制限はされない。また、鋳型用の基板１１としては、フォトリソグラフィー技術分野で一般的に用いられている材料であれば特に限定はされず、例えば、シリコン、シリコンカーバイド、サファイア、リン化ガリウム、ヒ化ガリウム、リン化ガリウム、窒化ガリウム等が挙げられる。
ネガティブフォトレジスト１２も、フォトリソグラフィー技術分野で一般的に用いられている材料であれば特に制限は無く、例えば、ＳＵ−８、ＫＭＰＲ等が挙げられる。また、ネガティブフォトレジスト１２に代え、ポジティブフォトレジストを用いることもでき、例えば、ＰＭＥＲ、ＡＺ等が挙げられる。また、レジストの除去液としては、ジメチルホルムアミドとアセトン等、半導体分野で一般的な除去液であれば特に制限はない。
また、本発明のチップ１の基板２の材料としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂（アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂）、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）等の熱可塑性樹脂；フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、熱硬化性ポリイミド、シリコーンゴム等の熱硬化性樹脂が挙げられる。なお、捕捉部位４で捕捉した分離対象微粒子５を回収せず、そのまま分析する場合は光透過性があり生体分子と非親和性の材料で基板２を作製することが望ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、硬質ポリエチレン製等のプラスチック、シリコン等が挙げられる。
チップ１は、捕捉対象微粒子８を捕捉した後に、顕微鏡等で観察する場合があるため、基板２は薄くした方が好ましい。しかしながら、後述するように、チップ１を移動する場合、基板２が薄すぎるとチップ１を移動し難いこともある。したがって、チップ１は、硬質材料１４を含んでいてもよい。硬質材料１４としては、ガラス、プラスチップ、シリコン等が挙げられ、基板２を貼着すればよい。
チップ１の表面は親水化処理されることで、液体を注入した際、溝に気泡が入ることを防止できる。親水化処理方法としては、プラズマ処理、界面活性剤処理、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）処理、光触媒等が挙げられ、例えば、チップ１の表面を１０〜３０秒間プラズマ処理することで、表面に水酸基を導入することができる。なお、チップ１の材料がガラス等、親水性が高い材料の場合は、親水化処理をしなくても良い。
次に、チップ１を用いた微粒子分離用システム、該部粒子分離用システムを用いた微粒子分離方法及び微粒子抽出方法について詳しく説明する。
図９は、本発明の微粒子分離用システムのチップ１（以下、「チップ１」と記載した場合、特に断りのない限り第１の実施形態又は第２の実施形態の両方を意味する。）が４角形の場合の、チップ１の周辺部分の概略を示している。本実施形態の微粒子分離用システムは、チップ１、サンプル液用薄板２１、シース液用薄板２２、シース液を吸引する図示しない吸引手段及び／又は吸引装置を含んでいる。吸引手段及び／又は吸引装置は、シース液用薄板２２を移動する方向と平行となるチップ１の外周辺２７に当接して配置し、ピラー４の間からシース液を吸引できるようになっている。
サンプル液用薄板２１、シース液用薄板２２は、ガラス、プラスチック等、サンプルやシース液と反応しないものであれば特に制限はない。シース液としては、分離すべき微粒子に損傷等を与えないものであれば特に制限はなく、全血をサンプルとして用いる場合は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等各種緩衝液、疑似体液（ＳＢＦ）、一般的な細胞培養液等、一般的に使用されているシース液であれば特に制限はない。サンプル液用薄板２１及びシース液用薄板２２を壁流路部３上に配置し、全血をチップ１とサンプル液用薄板２１の間に注入し、シース液をチップ１とシース液用薄板２２の間に注入し、チップ１とサンプル用薄板２１及びシース液用薄板２２を相対的に移動させることで、メニスカス２５が発生する。
図１０は、メニスカスの発生原理を説明する図で、本発明では、移流集積法と呼ばれる、気液界面に存在する微粒子間の毛管力（とくに横毛管力：ｌａｔｅｒａｌ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｏｒｃｅと呼ばれる）を利用して、微粒子同士を細密充填構造に配列する手法を用いている。微粒子が溶液に分散した懸濁液のメニスカスを基板上に形成すると、メニスカスの先端において、図１０に示すように微粒子が溶液から頭を出す箇所が形成される。この頭が出ている箇所では、界面張力及び重力により下に押し付けられる力が微粒子に発生しながらメニスカスと共に移動する。
上記のメニスカスの原理により、捕捉対象微粒子８であるＣＴＣを含む全血が上方に開放したマイクロ流路５内に押し付けられ、また、シース液もマイクロ流路５内に押し付けられる。そして、吸引手段及び／又は吸引装置により吸引することで、ＣＴＣ８がマイクロ流路５を流れ、第１捕捉部位６で捕捉される。一方、除去される微粒子９である血球細胞は、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力により吸引ユニット３５を介してシース液と共にチップ１から排出される。
壁流路部３と、サンプル液用薄板２１及びシース液用薄板２２との間隔は、２００〜１０００μｍとすることが好ましい。２００μｍより小さいとサンプル液の導入量が減少し処理能力が低下し、１０００μｍより大きいとメニスカス力が低下し十分な分離が得られない。なお、上記間隔は、マイクロステージで調整することができる。また、チップ１と、サンプル液用薄板２１及びシース液用薄板２２との相対移動速度は、２０〜５０μｍ／ｓが好ましい。２０μｍ／ｓより遅いと、処理時間が長くなり処理能力が低下し、５０μｍ／ｓより速いと微粒子が捕捉されずに分離効率が低減する。
シース液の流速は、２０〜４５００μｍ／ｓが好ましい。なお、シース液の流速は、ピラー４とピラー４の間隔、また、壁面とピラー４の間隔に応じて異なり、狭い場所ほど速くなる。本発明において「シース液の流速」とは、Ｚ1の間隔のピラー４とピラー４の間、壁面とピラー４の間を流れる流速を意味する。シース液の流速が、２０μｍ／ｓより遅いと血球細胞を洗浄する能力の低下により分離効率が低減し、４５００μｍ／ｓより速いと一旦捕捉されたＣＴＣが吸引され直線状に捕捉できなくなる。シース液の流速は、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力により調整すればよい。吸引装置は吸引ポンプ、マイクロシリンジ等、液体を吸引できるものであれば特に制限はない。なお、図９に示す例は、チップ１とシース液用薄板２２との間にシース液を必要に応じて注入する形式であるが、シース液用薄板２２の一端に、シース液容器又はシース液容器から伸長しているチューブ等を連結することで、シース液を自動的に供給できるようにしてもよい。
図１１は、本発明の微粒子分離用システムの他の実施形態の概略及び微粒子分離方法を示す図で、チップ１とカバー板を相対移動させずサンプル液を吸引することでメニスカスを発生させる実施形態を示している。本実施形態の微粒子分離用システムは、チップ１、該チップ１の壁流路部３の上に配置し、サンプル液及びシース液を吸引することでメニスカスを発生させるためのカバー板３１、図示しない吸引手段及び／又は吸引装置を少なくとも含んでいる。図１１に示す実施形態では、チップ１の外周辺に、ピラー４と同じ高さの段差部７１を形成し、長手方向に形成されサンプル液及びシース液を毛管力で吸引することができる横溝３３と該横溝３３に連通する吸引孔３４を含む吸引ユニット３５を介して、吸引手段及び／又は吸引装置によりサンプル液及びシース液を吸引する例を示している。段差部７を形成することで、吸引ユニット３５の両端３５１及び３５２、並びに一方の側面３５３を段差部７と当接することができるので、空気等が入ることなく、もう一方の側面３５４側からサンプル液、シース液を吸引することができる。なお、サンプル液及びシース液は、チップ１の外周辺にピラー４を形成していない平面部を設け、平面部から吸引手段及び／又は吸引装置を用いて吸引できるようにしてもよい。
また、本実施形態では、吸引手段及び／又は吸引装置を用いてサンプル液を吸引することでサンプル液中に含まれる微粒子を分離することから、希釈したサンプル液（以下、希釈したサンプル液を「希釈サンプル液」と記載することがある。）を使用すればサンプル液自体がシース液の役割をするので、サンプル液を流した後にシース液を流すことは必須ではない。目的微粒子の高純度な分離の場合はシース液を流すことで残存している除去する微粒子を洗い流す等、分離の目的に応じてシース液を流すか否かの選択を行えばよい。
図１２は、図１１のＡ−Ａ′断面図で、本実施形態におけるメニスカスの発生原理を説明する図である。図１２（１）に示すように、壁流路部３とカバー板３１の間に希釈サンプル液３２、又はサンプル液及びシース液３２（以下、希釈サンプル液、サンプル液及びシース液のことを「サンプル液等」と記載することがある。）を注入し、図示しない吸引手段及び／又は吸引装置で吸引すると、サンプル液等３２は、マイクロ流路５及びピラー４の間をとおり吸引ユニット３５から排出される。その際、壁流路部３及びカバー板３１との間のサンプル液等３２には、毛細管力が発生するため、図１２（２）に示すようなメニスカスが発生する。
なお、図１２（２）に示すサンプル液等３２の移動方向は、壁流路部３に対してカバー板３１を平行に配置した場合であり、例えば、図１２（３）に示すように、吸引ユニット３５側のカバー板３１を壁流路部３に近付けるように傾斜して配置すると、サンプル液等３２に係る圧力のため、サンプル液等３２は吸引ユニット３５側に移動する。逆に、図１２（４）に示すように、吸引ユニット３５とは反対側のカバー板３１を壁流路部３に近付けるように傾斜して配置すると、サンプル液等３２に係る圧力のため、サンプル液等３２は吸引ユニット３５とは反対側に移動する。図１２（２）〜（４）の何れの実施形態でも本発明の実施をすることができるが、図１２（３）に示す実施形態は、サンプル液等３２が吸引ユニット３５側に近付くことから、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力を小さくすることができるので好ましい。壁流路部３とカバー板３１の間隔は、上記のサンプル液用薄板２１と同様に、２００〜１０００μｍの間が好ましく、この間隔の範囲内で、マイクロステージを用いて調整すればよい。カバー板３１を傾斜する場合は、６°〜１８°程度傾けることが好ましい。傾斜角度が６°より小さい場合は、サンプル液等３２に係る圧力が不足し、１８°より大きい場合は、微粒子の捕捉に有効なメニスカスの角度より大きくなり過ぎるので好ましくない。
カバー板３１は、上記のサンプル液用薄板２１と同様の材料で作製すればよい。また、カバー板３１の大きさは特に制限は無いが、本実施形態では、カバー板３１を移動することなくメニスカスを発生できることから、処理効率を向上させるためには、カバー板３１の下端を第１捕捉部位６から１ｍｍ〜２ｍｍ程度離すことが好ましく、２ｍｍ〜３ｍｍ離すことがより好ましい。１ｍｍ以下であると第１捕捉部位６に捕捉された捕捉対象微粒子８を抽出するための微粒子抽出手段１０４を導入するスペースが狭すぎ、３ｍｍ以上であるとマイクロ流路５の空気中に露出される部分が広すぎることから分離処理の効率が落ちる。なお、捕捉ピラー４を形成したチップ１を本実施形態に用いる場合は、上記と同様の理由により、捕捉ピラー４は壁流路部３の端部に近い位置に形成することが好ましい。
なお、図１１に示した実施形態は、チップ１が４角形の例であるが、チップ１が円形状の場合は、吸引ユニット３５を円形のチップ１の外周に形成した平面部１０に配置し、カバー板３１も例えば円形状で壁流路部３を覆うような大きさに形成し、カバー板３１の中央にサンプル液等３２の注入孔を形成することで、チップ１の中央に注入したサンプル液等３２を、チップ１の外周に吸い寄せるようにして移流集積を発生させてもよい。また、上記とは逆に、カバー板３１を円形の外周部分を覆う略リング状とし、略リング状の中央に円形状の吸引ユニット３５を配置し、チップ１の外周部分から注入したサンプル液等３２を、チップ１の中心に吸い寄せるようにして移流集積を発生させてもよい。
サンプル液等３２の吸引手段としては、例えば、布、コットン、スポンジ、セーム皮等の吸引パッドが挙げられ、チップ１のピラー４の上部又はピラー４を形成していない平面部に直接吸引パッドを当接してサンプル液等３２を吸引・排出すればよい。サンプル液等３２の吸引・排出は、吸引ユニット３５を介して行ってもよい。
図１３は、ピラー４を形成していない平面部に当接する場合の吸引ユニット３５の実施形態の一例を示しており、図１３（１）は吸引ユニット３５の概略を示す上面図で、図１３（２）は吸引ユニット３５のＢ−Ｂ′断面図を示している。横溝３３の幅は、少なくとも除去された微粒子を通過させる必要があることから、サンプルが全血の場合は少なくとも８μｍ以上、処理能力を上げるためには１０μｍ以上とすることがより好ましい。一方、横溝３３の幅は毛管力が発生すれば特に上限は無く、吸引するサンプル液等３２の量や毛管力等を考慮して適宜調整すればよく、例えば、２００μｍ程度の幅を設けてもよい。また、吸引するサンプル液等３２が横溝３３に吸引されるためには、吸引ユニット３５を平面部に当接した際に隙間が生じる必要がある。そのため、例えば、吸引ユニット３５の端部３５１及び３５２、並びに横溝３３を挟む２つの側面３５３及び３５４の内、平面部７１に当接した際にピラー４とは反対側の側面３５３の高さを同じにしておき、ピラー４側に配置する側面３５４のみ、端部３５１、端部３５２及び側面３５３より短くしておけばよい。側面３５３と３５４の差は、横溝３３の幅と同様、８μｍ以上が好ましく、１０μ以上がより好ましい。毛管力が発生すれば特に差の上限は無く、吸引するシース液量や毛管力等を考慮して適宜調整すればよく、例えば、２００μｍ程度の差を設けてもよい。なお、図１１に示すように、チップ１に段差部７１を設ける場合は、側面３５３及び３５４の高さは同じにすればよい。また、横溝３３に吸引したサンプル液等３２を、ポンプ、マイクロシリンジ等の吸引装置を用い、吸引孔３４を通して吸引・排出してもよい。排出するサンプル液等の量が多く、横溝３３のみでは吸引できない場合は、吸引装置を組合せて用いればよい。吸引孔３４の数は特に制限は無く、基板２上に形成したピラー４の間を流れるサンプル液等３２の流速に大きな差異が発生しない程度の数を設ければよい。
また、横溝３３の幅を大きくし、横溝３３に上記の布、コットン、スポンジ、セーム皮等の吸引手段を挿入し、該吸引手段に吸収したサンプル液３２を、吸引孔３４をとおして吸引装置で吸引してもよい。本実施形態においては、マイクロ流路５及びピラー４間を流れるサンプル液等３２の流速は、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力により調整する。そのため、単に吸引手段でサンプル液等３２を吸引する、又は、毛管力により横溝３３にサンプル液等３２を吸引するより、吸引手段に吸引したサンプル液等３２を更に吸引装置で吸引することで、サンプル液等３２の吸引速度を安定に保つことができる。吸引装置と吸引孔３４は、シリコン等のチューブを用いて連結すればよい。
吸引ユニット３５を構成する材料は、アクリル、ナイロン、テフロン（登録商標）等の樹脂、又はガラス等、サンプル液やシース液と反応しないものであれば特に制限はない。吸引ユニット３５は、ドリル及びエンドミル等の切削工具を用いた切削加工、又は吸引ユニット３５の形状のモールドを作製し射出成形により作製することができる。
本実施形態の微粒子分離用システムは、先ず、壁流路部３とカバー板３１の間にサンプル液を入れ、吸引手段及び／又は吸引装置によりサンプル液を吸引し、次に、必要に応じて、シース液を壁流路部３とカバー板３１の間に入れ、シース液を吸引することで、例えば、血液サンプル中のＣＴＣを第１捕捉部位等で捕捉し、他の血球細胞等はシース液と共に洗い流すことができる。壁流路部３とカバー板３１の間へのサンプル液又はシース液は、シリンジ等を用いて注入してもよいし、カバー板３１に孔を設け、該孔からサンプル液及びシース液を注入してもよい。また、サンプル液が血液等の粘度の高い場合は、２〜１０倍、好ましくは３〜５倍程度に希釈した希釈サンプル液を用いてもよい。
サンプル液等３２の流速は、２０〜４５００μｍ／ｓが好ましい。２０μｍ／ｓより遅いと血球細胞を分離・洗浄する能力の低下により分離効率が低減し、４５００μｍ／ｓより速いと一旦捕捉されたＣＴＣが吸引され分離効率が低減する。サンプル液及びシース液の流速は、吸引手段及び／又は吸引装置の吸引力により調整すればよい。
図１４は、微粒子分離用システム１００の全体像を示す概略図である。本発明の微粒子分離用システム１００は、チップ１を載置するチップ台１０１、捕捉対象微粒子８を検出する検出手段１０２、チップ台１０１を一軸直動方向（図１３では⇔の方向）に移動するための駆動手段１０３、図示しないシース液吸引手段及び／又は吸引装置を少なくとも含んでおり、捕捉された捕捉対象微粒子８を取り出す場合は、微粒子抽出手段１０４を含んでいてもよい。更に、捕捉した微粒子が核酸を含む生体材料で、分離後にＰＣＲを行う場合は図示しないＰＣＲ手段を含んでいてもよい。本発明の微粒子分離用システム１００は、チップ１上に捕捉対象微粒子８がほぼ直線状に捕捉されるため、サンプル液等を流した後、駆動手段１０３を用いてチップ台１０１を一軸直動方向に移動するだけで、捕捉対象微粒子８の検出を行うことができる。なお、図１３に示す実施形態では、チップ台１０１を移動可能としているが、チップ台１０１を固定し、検出手段１０２を一軸直動方向に移動可能としてもよい。
微粒子の検出手段１０２としては、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡等、捕捉した微粒子を検出できるものであれば特に制限は無い。例えば、捕捉された微粒子がＣＴＣの場合、ＦＩＴＣやＰＥで標識された抗ＥｐＣＡＭ抗体等のＣＴＣ特異的な抗体を用いて蛍光染色したＣＴＣを観察できる蛍光顕微鏡等を用いることができる。また、光学顕微鏡を用いて明視野観察を行う場合には、パパニコロウ染色やギムザ染色を行うことで細胞内の核、細胞質等の形態的特徴を指標としてＣＴＣ検出を行うことが出来る。なお、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡の検出範囲は大凡５００×５００〜１０００×１０００μｍ程度である。そのため、ＣＴＣや胃がん細胞塊等、捕捉対象微粒子８の直径が１０〜５０μｍ程度の場合、仮に第１捕捉部位６からすり抜け隣接する第２捕捉部位７で捕捉されたとしても、その程度の位置の違いは検出手段１０２の検出範囲内であることから、一軸直動方向の操作で捕捉対象微粒子８を十分検出することが可能である。
駆動手段１０３は、チップ台１０１を移動できれば特に問題は無く、ステップモーター等の公知の駆動手段を用いればよい。微粒子抽出手段１０４は、微粒子を抽出できるものであれば特に制限は無く、例えば、細胞吸引手段を備えたマニピュレータ等が挙げられる。微粒子抽出手段１０４は、捕捉された捕捉対象微粒子８を検出する検出手段１０２と連動したマニピュレータにより自動的に回収できるようにすればよく、例えば、特開２０１０−２９１７８号公報に記載されているような細胞ピッキングシステムを用いることができる。
以上のとおり、本発明のチップ１を用いると、サンプル液中の捕捉対象微粒子８を、ほぼ直線状に分離することができる。そして、チップ１上で捕捉対象微粒子８に試薬等を加えて反応及び観察したり、チップ１から捕捉対象微粒子を検出・回収する場合は、チップ台１０１又は検出手段１０２を一軸直動方向に一度移動するだけで、捕捉された捕捉対象微粒子８を回収・観察することができる。したがって、サンプル液中から捕捉対象微粒子８を分離し、そして観察又は抽出する場合、捕捉対象微粒子をチップ１上の捕捉部位でランダムに捕捉する従来のチップ１と比較して、スループットを大幅に改善することができる。
図１５は、円形状のチップ１を用いた微粒子分離用システム１１０概略図で、チップ１を載置して回転させる回転手段１１１、移流集積ユニット１１２、図示しない吸引手段及び／又は吸引装置、並びに検出手段を少なくとも含んでいる。また、捕捉した微粒子を取り出す場合は微粒子抽出手段１０４を含んでもよい。更に、捕捉した微粒子が核酸を含む生体材料で、分離後にＰＣＲを行う場合はＰＣＲ手段１１４を含んでいてもよく、図１５ではＰＣＲに用いられるウェルを配置した例を示している。また、後述する移流集積ユニットのシース液注入口にシース液を送液するシース液インジェクション１１５及びサンプル注入口にサンプルを送液するサンプルインジェクション１１６を設けてもよい。シース液インジェクション１１５及びサンプルインジェクション１１６は、送液できるものであれば特に制限は無く、シリンジ等を用いて手動で送液してもよいし、市販の定流量ポンプ等を用いてもよい。また、送液に動力を使用せず、ボトル等から重量により滴下してもよく、その場合、点滴の流量調整に用いられるクレンメを設けて流量を調整してもよい。
回転手段１１１は、チップ１を載置して回転できるものであれば特に制限は無く、例えば、チップ１を載置できる回転可能な円盤の下にステップモーター等の駆動手段を設けて、円盤を一軸回転するようにすればよい。なお、発生するメニスカスの大きさを一定にすることが好ましいことから、駆動手段は円盤を一定速度で回転制御できるものであることが好ましい。
図１６は、移流集積ユニット１１２の概略を示す図である。移流集積ユニット１１２は、シース液注入口５２１、サンプル注入口５２２、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４が少なくとも形成されている。また、移流集積ユニット１１２には、シース液吸引パッドを装着又はシース液を毛管力で吸引する孔５２５、該孔５２５に連通し図示しないシース液吸引装置と接続するためのシース液吸引口５２６が設けられていてもよい。シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４は、チップ１の壁流路部３と相対移動することでメニスカスを発生させるため、壁流路部３に相対する面は平面形状であることが好ましい。また、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４と壁流路部３との間でメニスカスが発生し、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４以外ではメニスカスが発生する必要は無いことから、移流集積ユニットのシース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４は、他の部分より厚くし段差を設ける必要がある。一方、孔５２５に関しては、孔５２５にシース液吸引パッドを装着する場合は、シース液吸引パッドがシース液に当接するように、シース液吸引パッドを装着する孔５２５からの突出量を調整すればよいので、孔５２５は前記他の部分と同じ面に形成してもよいし、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４と同じ高さとなる位置に孔５２５を設ける平面部を形成し、該平面部に孔５２５を形成してもよい。また、孔５２５を、シース液を毛管力で吸引する孔として用いる場合には、平面部１０から毛管力によりシース液を吸引できる間隔となるように、孔５２５を形成する平面部を、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４より厚めに形成してもよい。また、シース液吸引口５２６は孔５２５に連通していれば形成する個数、位置は特に制限は無く、適宜調整すればよい。
本実施形態では、後述する移流集積ユニットのシース液移流集積用平面部（以下、「シース液平面部」と記載することもある。）と壁流路部３部分でシース液にメニスカスを発生させ、そして、シース液にメニスカスを発生させるエリアより外周側であって、サンプル移流集積用平面部（以下、「サンプル平面部」と記載することもある。）と壁流路部３でサンプルにメニスカスを発生させる。そして、移流集積ユニットの孔から、サンプル液及びシース液を排出することができる。
図１６に示すように、シース液注入口５２１はシース液平面部５２３内に、サンプル注入口５２２はサンプル平面部５２４内に形成されてもよいし、移流集積ユニット１１２とチップ１を相対移動させる際に、シース液平面部５２３の上流側にシース液注入口５２１を、サンプル平面部５２４の上流側にサンプル注入口５２２を形成してもよい。また、シース液は、中心孔から外周方向に流れることから、シース液平面部５２３は、中心孔付近に形成されていれば形状及び大きさに特に制限は無い。一方、サンプル平面部５２４は、壁流路部３の上でメニスカスのラインが発生するような形状であれば特に制限は無いが、効率的に捕捉対象微粒子８を捕捉するためには、中心孔４２から壁流路部３全面にメニスカスラインが発生するような形状及び大きさとすることが好ましい。
図１７は、移流集積ユニット１１２を斜め上から拡大撮影した写真で、移流集積ユニット１１２は、回転手段１１１に載置されたチップ１との間隔を保つための高さ調整手段１１７に取り付けられている。高さ調整手段１１７は、螺子等により移流集積ユニット１１２の高さを調整できるものであれば特に制限は無い。移流集積ユニット１１２のシース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４は、壁流路部３から２００〜１０００μｍ離れた位置に位置するように配置されている。壁流路部３と移流集積ユニット１１２のシース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４との間隔が２００μｍ以下であるとサンプル液の導入量が減少し処理能力が低下し、１０００μｍ以上であるとメニスカス力が低下し十分な分離が得られない。また、移流集積ユニット１１２を使用する際には、シリコン等のチューブ１１８を介して、シース液注入口５２１はシース液インジェクション１１５、サンプル注入口５２２はサンプルインジェクション１１６、及びシース液吸引口５２６は図示しないシース液吸引装置に接続すればよい。
シース液吸引手段は、チップ１の平面部１０に当接してシース液を吸引できるものであれば特に制限は無い。例えば、布、コットン、スポンジ、セーム皮等のシース液吸引パッドを直接又は移流集積ユニット１１２の孔５２５を介してチップ１の平面部１０に当接してシース液を吸引すればよい。
また、孔５２５にシース液吸引パッドを挿入する代わりに、孔５２５の幅を毛管力が発生する幅に調整し、孔５２５をチップ１の平面部１０に当接することで、毛管力によりシース液を吸引してもよい。その場合、孔５２５の幅は、少なくともシース液と共に除去された微粒子を通過させる必要があることから、サンプルが全血の場合は少なくとも８μｍ以上、処理能力を上げるためには１０μｍ以上とすることがより好ましい。一方、孔５２５の幅は毛管力が発生すれば特に上限は無く、吸引するシース液量や毛管力等を考慮して適宜調整すればよく、例えば、２００μｍ程度の幅を設けてもよい。また、吸引するサンプル液、シース液が孔５２５に吸引されるためには、孔５２５を平面部１０に当接した際に隙間が生じる必要がある。そのため、例えば、孔５２５の両端、並びに平面部１０に当接した際にピラー４とは反対側の側面の高さを同じにしておき、孔５２５のピラー４側の側面のみ、他の部分より高さを低くしておけばよい。高さの差は、８μｍ以上が好ましく、１０μ以上がより好ましい。差の上限は毛管力が発生すれば特に上限は無く、吸引するシース液量や毛管力等を考慮して適宜調整すればよく、例えば、２００μｍ程度の差を設けてもよい。なお、チップ１は上記実施形態に限定されず、例えば、平面部１０に換え、図１１に示すような段差部７１を設け、移流集積ユニット１１２の孔５２５がピラー４側になるように配置してもよい。また、平面部１０に換え、基板２の表面より低くなっている溝部を設け、溝部からサンプル液、シース液を吸引できるような大きさ及び配置となるように、移流集積ユニットを調整してもよい。
シース液は、上記に例示した吸引手段による吸引の他、吸引ポンプ等の吸引装置を用い、該吸引装置に接続する吸引口を平面部１０に当接してシース液を吸引してもよい。なお、本発明においては、チップ１の形状を問わず、シース液の流速は、シース液吸引手段の吸引力で調整する。そのため、微粒子の分離に使用するシース液量及びサンプル量が多くなり、シース液吸引パッド又は毛管力を発生させる孔が、シース液で飽和状態になるとシース液の吸引速度が安定しなくなるおそれがある。そのため、シース液の流速をより安定に保てるよう、上記のシース液吸引手段を組合せて用いてもよい。例えば、コットン等のシース液吸引パッドの一端をシース液に接触させてシース液を吸収しつつ、吸引ポンプ等の吸引装置を用いて、シース液吸引パッドの他端からシース液吸引パッドに吸収されたシース液を吸引してもよい。また、シース液を毛管力で吸引できる孔５２５の一端から毛管力によりシース液を吸引しつつ、前記孔５２５に連通する吸引口から吸引装置でシース液を吸引してもよい。更に、移流集積ユニット１１２に前記孔５２５を設けず、シース液吸引ポンプ等の吸引装置に接続する吸引口を毛管力が発生する大きさ又は吸引口に吸引パッドを差し込み、前記吸引口を平面部１０に当接するようにしてもよい。なお、本実施形態においても、サンプル液及びシース液を別々に注入することに代え、希釈サンプル液を用いてもよい。
移流集積ユニット１１２を構成する材料は、アクリル、ナイロン、テフロン（登録商標）等の樹脂、又はガラス等、サンプルやシース液と反応しないものであれば特に制限はない。移流集積ユニット１１２は、ドリル及びエンドミル等の切削工具を用いた切削加工、又は移流集積ユニット１１２の形状のモールドを作製し射出成形により作製することができる。なお、本発明における移流集積ユニット１１２は、シース液注入口５２１、サンプル注入口５２２、シース液平面部５２３及びサンプル平面部５２４、更に必要に応じて形成される孔５５及びシース液吸引口５６が含まれていれば、単一の部材で形成されていても、別々に作製した部材を組み合わせてもよい。
シース液平面部５２３とサンプル平面部５２４は半径方向の位置が異なるので、チップ１を回転させた場合の両者の相対速度は異なるが、何れも、チップ１との相対速度が５０〜１５００μｍ／ｓの範囲となるようチップ１を回転させることが好ましく、６０〜１０００μｍ／ｓがより好ましい。５０μｍ／ｓより遅いと処理時間が長くなり処理能力が低下し、１５００μｍ／ｓより速いと捕捉対象微粒子８が捕捉されずに分離効率が低減する。なお、図１５に示すシステムでは、移流集積ユニット１１２を固定しチップ１を回転させているが、チップ１を固定して移流集積ユニット１１２を回転させてもよい。
以上のとおり、円形状のチップ１を用いると、捕捉対象微粒子８はほぼ円形状に捕捉される。したがって、検出手段１０２の位置を捕捉対象微粒子８が捕捉される円形上に予め位置させておき、サンプル液等を流し終えた後、チップ１を一軸回転するだけで、捕捉された捕捉対象微粒子８を検出することができる。したがって、図１４に示す実施形態と同様、サンプル液中から捕捉対象微粒子８を分離し、そして観察又は抽出する場合、捕捉対象微粒子をチップ１上の捕捉部位でランダムに捕捉する従来のチップ１と比較して、スループットを大幅に改善することができる。
本発明の微粒子分離システムには、捕捉対象微粒子の捕捉効率を上げるための磁場発生装置及び／又は電場発生装置等を設けてもよい。例えば、第１捕捉部位６又はマイクロ流路５のピラー４を形成した部分に対応するチップ台１０１又は回転手段１１１の円盤部分を永久磁石等で形成してもよいし、チップ台１０１又は円盤部分の下側に磁場発生装置として永久磁石又は電磁石を設置して磁場ポテンシャル場を発生させてもよい。ＥｐＣＡＭ抗体等を標識した磁性粒子を特異的に吸着させたＣＴＣ、又は磁性粒子を非特異的に吸着させたＣＴＣ（エンドサイトーシスから取り込む）等、捕捉対象微粒子８に磁性を帯びさせた上で、本発明の微粒子分離用システムを用いると、磁性標識されていない他の微粒子から精度よく目的とする微粒子を分離することが可能である。
また、電場発生装置として電極を設けて電場ポテンシャル場（不均一電場中）を発生させ、ＣＴＣと周囲媒質の分極と電場の勾配により生じる静電気力（クーロン力）を用いてＣＴＣの捕捉をアシストすることも可能である。
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
＜実施例１＞
〔チップの作製〕
先ず、シリコン基板をアセトン・エタノール・超純水の順に、４５ｋＨｚで５分間ずつ超音波洗浄機により有機洗浄し、１４５℃で２０分間ベイクした。次に、シリコン基板上にＳＵ−８をスピンコートし、ホットプレート上で、９５℃で３０分間、プリベイクした。次に、壁流路部、３本のピラーからなる第１捕捉部位及び６本のピラーからなる第２捕捉部位に対応したクロムマスクを用い露光後、ホットプレート上で、９５℃で２分間、ポストエクスポージャーベイクを行い、ＰＭシンナーを用い現像した。現像後は、エタノールならびに超純水を用いリンスし、スピンドライヤー等で水分をとばし乾燥させ、鋳型を作製した。形成された鋳型を、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に転写し、転写後、両者を分離し、鋳型が転写されたＰＤＭＳをガラス板上に貼付した。その後、ＰＤＭＳ表面をプラズマ処理（周波数５０ｋＨｚ，出力７００Ｗ、３０秒間）により親水化し、チップを作製した。
図１８は実施例１で作製したチップ１の外観を示す写真で、チップの大きさは縦７５ｍｍ、横２５ｍｍであった。また、壁流路部の長さは１５ｍｍ、第１捕捉部位６及び第２捕捉部位７が形成されている大きさは、縦１０ｍｍ、横２５ｍｍであった。
図１９は、実施例１で作製したチップ１の壁流路部３の端部と第１捕捉部位６付近の拡大写真である。壁流路部３の厚さは約２０μｍ、高さは約３０μｍ、隣り合う壁流路部３の壁面と壁面の距離（マイクロ流路５の幅）は約２４μｍであった。全てのピラー４の直径は約２０μｍ、ピラーの高さは約３０μｍであった。また、第１捕捉部位６を形成する３本のピラーの内、マイクロ流路５の方向に面するピラー４とピラー４の間隔が約２４μｍだった以外は、その他のピラー４の組み合わせの間隔は全て７μｍであった。また、第２捕捉部位７の大きさは約３０μｍであった。更に、壁流路部３の端部と第１捕捉部位６のマイクロ流路５の方向に面するピラー４との間隔は７μｍであった。
＜比較例１＞
実施例１の壁流路部３及び第１捕捉部位６を形成せず、第２捕捉部位のみを形成するクロムマスクを用いた以外は、実施例１と同様の手順でチップを作製した。図２０は比較例１で作製したチップ１の拡大写真である。
＜実施例２＞
〔血液サンプルの作製〕
採取したヒト血液４０μｌにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を１６０μｌ添加したものに、１．１×１０４個の胃がん細胞株（ヒト胃がん由来の細胞株（ＧＣＩＹ−ＧＦＰ）をトリプシン処理でバラバラにしたもの）を懸濁し、がん患者の血液を模した血液サンプルを作製した。なお、がん細胞の平均粒径は２５μｍであった。
〔微粒子分離用システムの作製及び血液サンプルからのＣＴＣ分離実験〕
図２１は、実施例２で作製した微粒子分離システムの写真である。微粒子分離用システムは、ガラスで作製したチップ台１０１、検出手段１０２である蛍光顕微鏡、チップ台１０１の一軸直動方向への駆動手段１０３として図示しないステップモーター、抽出手段１０４としてマニピュレータを含んでいる。そして、実施例１で作製したチップ１をチップ台１０１の上に置き、チップ１の壁流路部３上に、ガラスで作製した縦２５ｍｍ、横３５ｍｍで中央にサンプル注入孔が形成されたカバー板３１、及び吸引ユニット３５（プラスチック製、外形：横３８ｍｍ、縦１８ｍｍ、高さ７ｍｍ、挿入部分：横３０ｍｍ、縦１０ｍｍ、深さ５ｍｍ）を配置した。チップ１の壁流路部３とカバー板３１の先端との間隔は５００μｍ、壁流路部３とカバー板３１との角度φは、１０度となるようにマイクロステージで調整した。次に、チップ１とカバー板３１の先端部分に、カバー板３１に注入孔（外形３ｍｍ）を施し、上記血液サンプルをシリコンチューブ（外形３ｍｍ、内径２ｍｍ）を介して連続供給し、吸引装置であるシリンジポンプ（ケーディーサイエンティフィック、ＫＤＳ−１００）の吸引力により、ＣＴＣの分離を行った。図２２は、血液サンプルを流し終えた後、蛍光実態（正立）顕微鏡で撮影したチップ１の写真である。写真から明らかなように、ＣＴＣは壁流路部３（マイクロ流路５）の先端に形成した第１捕捉部位６に直線状に捕捉されていた。また、実際にチップ台１０１を一軸直動方向（横方向）に移動したところ、蛍光顕微鏡の位置を変えることなく捕捉されたＣＴＣを検出し、マニピュレータでＣＴＣを回収することができた。
＜比較例２＞
実施例１で作製したチップ１に代え、比較例１で作製したチップ１を用いた以外は実施例１と同様の手順でＣＴＣの捕捉を行い、写真を撮影した。図２３は比較例１で撮影した写真である。写真から明らかなように、ＣＴＣはチップ１の第２捕捉部位７にランダムに捕捉されていた。これは、チップ１とカバー板３１の間のメニスカスラインが第２捕捉部位７上を移動するためである。したがって、チップ台１０１を単に一軸直動方向（横方向）に移動するのみではチップ１上の捕捉された全てのＣＴＣを検出することができず、チップ１を横方向及び縦方向の２軸方向に移動するための駆動手段が必要であることが明らかとなった。
本発明のチップを含む微粒子分離用システムを使用することで、サンプル中のサイズの異なる微粒子を、抗体等を用いることなく迅速かつ高効率で分離することができる。更に、分離した捕捉対象微粒子は、チップ上に直線状又は円形状に捕捉されるため、チップを移動するための駆動軸は直動軸又は回転軸で設計することができるので、スループットを向上できることに加え、装置を小型化、低価格化することができる。したがって、全血からのＣＴＣの分離等、臨床の場において非常に有効であることから、病院や救急センターなどの医療機関や大学医学部などの研究機関、教育機関において、がん診断のシステムとして利用が可能である。

Claims (16)

  1. 基板、該基板上に形成された少なくとも３個以上の壁流路部及び少なくとも３本以上のピラーを含み、
    前記壁流路部は、一端が前記基板上に設けられ他端が上方に開放し、隣り合う２つの壁流路部でマイクロ流路を形成し、
    前記ピラーは、一端が前記基板上に設けられ他端が上方に開放するように形成され、２本のピラーで捕捉対象微粒子を捕捉するための第１捕捉部位を形成し、
    捕捉対象微粒子の大きさをＸ、除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記壁流路部の壁面と壁面の間隔はＸ以上であり、
    前記第１捕捉部位は、前記マイクロ流路から離れた位置に形成され、第１捕捉部位を形成する任意の隣り合うピラー同士の間隔Ｚ1はＹ＜Ｚ1＜Ｘ、０．８Ｙ≦Ｚ1≦０．８Ｘ、Ｙ＜Ｚ1≦０．８Ｘ、又は０．８Ｙ≦Ｚ1＜Ｘから選択される１種であり、隣り合う第１捕捉部位は少なくとも１本のピラーを共有し、更に第１捕捉部位を結んだ線が直線となるように形成されている微粒子分離用チップ。
  2. 請求項１に記載の第１捕捉部位において、２本のピラーに代え、３本以上のピラーで第１捕捉部位を形成し、任意の隣り合うピラーの組み合わせの内、間隔が最も長いピラーの組み合わせが前記マイクロ流路方向に面するように配置され、他の隣り合うピラー同士の間隔は前記Ｚ1と同じである請求項１に記載の微粒子分離用チップ。
  3. 前記第１捕捉部位に隣接して第２捕捉部位が形成され、
    前記第２捕捉部位は３本以上のピラーで形成され、任意の隣り合うピラー同士の間隔は前記Ｚ1と同じで、且つ前記第２捕捉部位を形成する３本以上のピラーは、第２捕捉部位に捕捉された捕捉対象微粒子が任意の隣り合うピラーの間から流出しない位置関係に配置され、更に、第１捕捉部位と第２捕捉部位は、少なくとも１本のピラーを共有している請求項1又は２に記載の微粒子分離用チップ。
  4. 基板、該基板上に形成された少なくとも３個以上の壁流路部及び少なくとも３本以上のピラーを含み、
    前記壁流路部は、一端が前記基板上に設けられ他端が上方に開放し、隣り合う２つの壁流路部でマイクロ流路を形成し、
    前記ピラーは、一端が前記基板上に設けられ他端が上方に開放するように形成され、２本のピラーで捕捉対象微粒子を捕捉するための第１捕捉部位を形成し、
    捕捉対象微粒子の大きさをＸ、除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記壁流路部の壁面と壁面の間隔はＸ以上であり、
    前記第１捕捉部位は、前記マイクロ流路から離れた位置に形成され、第１捕捉部位を形成する任意の隣り合うピラー同士の間隔Ｚ 1 はＹ＜Ｚ 1 ＜Ｘ、０．８Ｙ≦Ｚ 1 ≦０．８Ｘ、Ｙ＜Ｚ 1 ≦０．８Ｘ、又は０．８Ｙ≦Ｚ 1 ＜Ｘから選択される１種であり、隣り合う第１捕捉部位は少なくとも１本のピラーを共有し、
    前記基板が円形で、前記壁流路部が円周に向かって放射状に形成され、前記第１捕捉部位を結んだ線も円形となるように形成されている微粒子分離用チップ。
  5. 基板、該基板上に形成された少なくとも３個以上の壁流路部及び少なくとも２本以上の捕捉ピラーを含み、
    前記壁流路部は、一端が前記基板上に設けられ他端が上方に開放し、隣り合う２つの壁流路部でマイクロ流路を形成し、
    前記捕捉ピラーは、一端が前記基板上に設けられ、他端が上方に開放するように形成され、
    捕捉対象微粒子の大きさをＸ、除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記壁流路部の壁面と壁面の間隔はＸ以上であり、
    前記壁面と壁面との間に少なくとも前記捕捉ピラーが形成され、該捕捉ピラーと前記壁面の間隔をＺ2とした場合、前記壁面に対する前記捕捉ピラーの位置及び大きさはＹ＜Ｚ2＜Ｘ、０．８Ｙ≦Ｚ2≦０．８Ｘ、Ｙ＜Ｚ2≦０．８Ｘ、又は０．８Ｙ≦Ｚ2＜Ｘから選択される１種となるように形成され、更に、各捕捉ピラーを結んだ線が直線となるように形成されている微粒子分離用チップ。
  6. 前記捕捉ピラーが、前記壁面と壁面との間に代え、前記壁流路部の端部から離れた位置であって、且つ前記端部との間隔が前記Ｚ2となるように形成されている請求項５に記載の微粒子分離用チップ。
  7. 前記捕捉ピラーを共有しながら更に第１捕捉部位が形成されている請求項６に記載の微粒子分離用チップ。
  8. 基板、該基板上に形成された少なくとも３個以上の壁流路部及び少なくとも２本以上の捕捉ピラーを含み、
    前記壁流路部は、一端が前記基板上に設けられ他端が上方に開放し、隣り合う２つの壁流路部でマイクロ流路を形成し、
    前記捕捉ピラーは、一端が前記基板上に設けられ、他端が上方に開放するように形成され、
    捕捉対象微粒子の大きさをＸ、除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記壁流路部の壁面と壁面の間隔はＸ以上であり、
    前記壁面と壁面との間に少なくとも前記捕捉ピラーが形成され、該捕捉ピラーと前記壁面の間隔をＺ 2 とした場合、前記壁面に対する前記捕捉ピラーの位置及び大きさはＹ＜Ｚ 2 ＜Ｘ、０．８Ｙ≦Ｚ 2 ≦０．８Ｘ、Ｙ＜Ｚ 2 ≦０．８Ｘ、又は０．８Ｙ≦Ｚ 2 ＜Ｘから選択される１種となるように形成され、
    前記基板が円形で、前記壁流路部が円周に向かって放射状に形成され、前記捕捉ピラーを結んだ線も円形となるように形成されている微粒子分離用チップ。
  9. 前記捕捉対象微粒子がＣＴＣで、除去される微粒子が血球細胞である請求項１〜８の何れか一項に記載の微粒子分離用チップ。
  10. 請求項１〜３、５〜７の何れか一項に記載されている微粒子分離用チップ、
    前記微粒子分離用チップを載置するチップ台、
    前記微粒子分離用チップに捕捉された捕捉対象微粒子を検出するための検出手段、
    前記チップ台又は前記検出手段を一軸直動方向に移動するための駆動手段、
    を少なくとも含む微粒子分離用システム。
  11. 請求項４又は８に記載の微粒子分離用チップ、
    前記微粒子分離用チップを載置して回転させる回転手段、
    前記微粒子分離用チップに捕捉された捕捉対象微粒子を検出するための検出手段、
    を少なくとも含む微粒子分離用システム。
  12. 検出手段で検出した捕捉対象微粒子を抽出する微粒子抽出手段を更に含む請求項１０又は１１に記載の微粒子分離用システム。
  13. 請求項１〜３、５〜７の何れか一項に記載の微粒子分離用チップの壁流路部部分で希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液にメニスカスを発生させ、発生したメニスカスにより希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液を２つの壁流路部で形成したマイクロ流路内に押し込む工程、
    前記微粒子分離用チップの壁流路部とは反対側から吸引手段及び／又は吸引装置により希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液を吸引することで、サンプル中の捕捉対象微粒子は前記微粒子分離用チップに設けられた第１捕捉部位又は捕捉ピラーと壁流路部の間で捕捉され、除去される微粒子は微粒子分離用チップから除去される工程、
    を含む微粒子分離方法。
  14. 請求項１３に記載の微粒子分離方法により捕捉対象微粒子を分離後に、
    微粒子分離用チップを載置するチップ台を一軸直動方向に移動、又は捕捉対象微粒子を検出する検出手段を一軸直動方向に移動することで、前記第１捕捉部位又は捕捉ピラーと壁流路部の間で捕捉された捕捉対象微粒子を検出する工程、
    検出した捕捉対象微粒子を微粒子抽出手段で抽出する工程、
    を含む微粒子抽出方法。
  15. 請求項４又は８に記載の微粒子分離用チップの壁流路部部分で希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液にメニスカスを発生させ、発生したメニスカスにより希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液を２つの壁流路部で形成したマイクロ流路内に押し込む工程、
    吸引手段及び／又は吸引装置により希釈サンプル液、又はサンプル液及びシース液を吸引することで、捕捉対象微粒子は前記微粒子分離用チップに設けられた第１捕捉部位又は捕捉ピラーと壁流路部の間で捕捉され、除去される微粒子は微粒子分離用チップから除去される工程、
    を含む微粒子分離方法。
  16. 請求項１５に記載の微粒子分離方法により捕捉対象微粒子を分離後に、
    微粒子分離用チップを回転することで、前記第１捕捉部位又は捕捉ピラーと壁流路部の間で捕捉された捕捉対象微粒子を検出する工程、
    検出した捕捉対象微粒子を微粒子抽出手段で抽出する工程、
    を含む微粒子抽出方法。
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