KR101691049B1 - 관류 세포 배양 장치, 이의 제조 방법 및 세포 배양 방법 - Google Patents

Abstract

관류(microfluidic perfusion) 세포 배양 장치는, 세포 배양액을 운반하도록 구성된 제1 채널; 상기 제1 채널에 연결되며 세포를 수용하도록 구성된 마이크로챔버; 상기 마이크로챔버에 연결되며, 상기 마이크로챔버를 통과한 세포 배양액을 운반하도록 구성된 제2 채널; 및 상기 마이크로챔버로부터 세포가 빠져나가는 것을 방지하도록 배치된 세포 통과 방지용 필터를 포함할 수 있다. 상기 관류 세포 배양 장치를 이용하면 복수의 세포 배양부에 시딩(seeding)되는 세포 개수를 상대적으로 균일하게 할 수 있으며, 나노채널을 통하여 세포 분비물을 검출함으로써 세포 분비물의 검출 감도를 높일 수 있다.

Description

관류 세포 배양 장치, 이의 제조 방법 및 세포 배양 방법{MICROFLUIDIC PERFUSION CELL CULTURE APPARATUS, METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME AND METHOD OF CELL CULTURE}

실시예들은 관류(microfluidic perfusion) 세포 배양 장치, 이의 제조 방법 및 세포 배양 방법에 관한 것이다.

세포 배양 기술은 줄기세포 분화 및 암세포 독성 실험 등 다양한 생물학적 실험에 필수적으로 사용되어야 하는 기술이다. 세포 배양을 위하여 일반 실험실에서 용기 내에 세포 및 배양액을 주입하여 정적(static)인 조건에서 세포를 배양할 수 있다. 그러나, 이 경우 많은 양의 배양액과 시약이 요구되며, 시간에 따라 세포 분비물에 의해 배양액이 오염되기 때문에 자주 교체해야 하는 단점이 있다.

한편, 반도체 제조 공정인 미세가공 기술을 이용하여 인체 내 조건과 유사한 조건에서 세포를 배양하는 기술이 있다. 이 중 소위 랩온어칩(lab-on-a-chip)이라고 일컬어지는 기술은 여러 가지 실험 조건들을 하나의 마이크로칩 안에 조성하여 실험을 실행하는 것으로 칩 위의 실험실을 말한다. 최근에는 포토리소그래피(photolithography) 및 소프트 리소그래피(soft lithography) 기술 등을 이용하여 관류(microfluidic perfusion) 세포배양칩을 만듬으로써 세포 증식 및 분화 등에 대한 연구가 이루어지고 있다.

이러한 관류 세포 배양 장치는, 세포 배양액이 칩 내에 머무르는 것이 아니라 지속적으로 순환되므로 배양액의 교체가 불필요하고, 이로 인해 배양액의 오염이 발생하지 않는다. 또한, 세포주변의 물리/화학적 환경을 생체내 환경과 유사하게 할 수 있기 때문에 세포의 생물학적 특성 규명이나 세포 간 세포독성(cytotoxicity) 등의 시험에 유용하게 활용될 수 있다.

세포배양을 통한 신약개발이나 세포연구 시, 동일한 크기와 형태의 세포배양을 위한 챔버(chamber)를 병렬 또는 직렬로 배치한 어레이(array) 타입의 장치가 이용되고 있다. 일반적으로 세포주입구로부터 일정수의 세포가 주입이 되어 세포 표면의 ECM(extra celluar matrix)을 통해 챔버 바닥면에 붙게 되며, 안정적인 상태에 도달하면 세포가 증식 및 성장을 시작한다. 이러한 일련의 과정을 세포 시딩(seeding)이라고 한다. 어레이 타입의 세포 배양부로 구성된 관류 세포 배양 장치에서, 배치되어 있는 각 챔버에 세포가 주입된 후 동일한 수의 세포들이 시딩되는 것이 중요하다. 세포들은 증식 및 성장할 때 배양액의 영양분을 섭취하고 대사물질을 배출하며, 이로 인해 배양액의 pH에 영향을 주게 된다. 또한, 세포들간의 상호신호 전달을 통해 그들의 개체수뿐만 아니라 증식 속도를 조절하기도 한다. 따라서 처음에 각 챔버마다 다른 수의 세포들로 시딩이 된다면 같은 처리를 수행하더라도 다른 결과를 얻을 수 있다. 기존의 어레이 형태의 관류세포배양 장치에서는 이러한 동일한 수의 세포 시딩을 고려하지 않고 실험을 수행하였기 때문에 결과의 신뢰도나 재현도면에서 문제가 될 수 있다.

공개특허공보 제10-2011-0064549호

본 발명의 일 측면에 따르면, 복수의 세포 배양부에 동일한 개수의 세포를 시딩(seeding)할 수 있으며 세포 분비물의 검출을 위한 검출부를 나노미터 수준으로 소형화하여 검출 민감도를 향상시킨 관류(microfluidic perfusion) 세포 배양 장치, 이의 제조 방법 및 세포 배양 방법을 제공할 수 있다.

일 실시예에 따른 관류(microfluidic perfusion) 세포 배양 장치는, 세포 배양액을 운반하도록 구성된 제1 채널; 상기 제1 채널에 연결되며 세포를 수용하도록 구성된 마이크로챔버; 상기 마이크로챔버에 연결되며, 상기 마이크로챔버를 통과한 세포 배양액을 운반하도록 구성된 제2 채널; 및 상기 마이크로챔버로부터 세포가 빠져나가는 것을 방지하도록 배치된 세포 통과 방지용 필터를 포함할 수 있다.

일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치의 제조 방법은, 채널에 대응되는 하나 또는 복수 개의 제1 함몰부를 포함하는 상부 기판을 준비하는 단계; 마이크로챔버에 대응되는 제2 함몰부를 포함하는 하부 기판을 준비하는 단계; 및 상기 제1 함몰부 및 상기 제2 함몰부가 서로 대향하도록 상기 상부 기판과 상기 하부 기판을 접합하는 단계를 포함하되, 상기 상부 기판 또는 상기 하부 기판에는 상기 마이크로챔버로부터 세포가 빠져나가는 것을 방지하기 위한 돌출부가 형성될 수 있다.

일 실시예에 따른 세포 배양 방법은, 마이크로챔버 내로 세포를 주입하는 단계; 상기 마이크로챔버에 연결된 제1 채널 내로 세포 배양액을 주입하는 단계; 상기 마이크로챔버를 통하여 상기 세포 배양액을 이동시키는 단계; 상기 마이크로챔버에 연결된 제2 채널을 통해, 상기 마이크로챔버를 통과한 세포 배양액을 이동시키는 단계; 및 세포 통과 방지용 필터를 이용하여 상기 마이크로챔버로부터 세포가 빠져나가는 것을 방지하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 세포 배양액이 흐르는 나노채널의 저면에 마이크로챔버가 위치하며, 세포 통과 방지용 필터를 이용하여 마이크로챔버로부터 세포가 이탈하지 못하도록 구성된 관류(microfluidic perfusion) 세포 배양 장치, 이의 제조 방법 및 세포 배양 기술을 제공할 수 있다. 상기 관류 세포 배양 장치를 이용하면 복수의 세포 배양부에 시딩(seeding)되는 세포 개수를 상대적으로 균일하게 할 수 있으며, 세포 분비물이 나노채널을 통과할 때 검출 감도를 높일 수 있다. 다시 말하면, 세포로부터 분비되는 생체물질(예컨대, 단백질, 항체 등)을 광학적으로 분석할 때 마이크로 크기의 채널에서는 분석하고자 하는 생체물질들의 농도가 매우 희석되어 있기 때문에 매우 작은 광학신호가 발생하게 되는데, 본 발명의 일 측면에 의하면 챔버 뒷부분의 채널 폭을 나노크기로 감소시킴으로써 검출면적 대비 신호발생크기를 비약적으로 향상시킬 수 있다. 그 결과, 세포로부터 분비되는 매우 소량의 생체물질들을 고감도로 검출할 수 있게 된다.

도 1은 일 실시예에 따른 관류(microfluidic perfusion) 세포 배양 장치의 사시도이다.
도 2는 도 1에 도시된 관류 세포 배양 장치에서 세포 배양부의 확대도이다.
도 3a 내지 3c는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치의 동작을 설명하기 위한 개념도이다.
도 4는 또 다른 실시예에 다른 관류 세포 배양 장치의 개념적인 구성도이다.
도 5는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치를 포함하는 세포 배양 시스템의 개략도이다.
도 6a 내지 6e는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치의 제조 방법에서 상부 기판을 준비하는 과정을 나타내는 단면도이다.
도 7a 내지 7e는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치의 제조 방법에서 하부 기판을 준비하는 과정을 나타내는 단면도이다.
도 8a 및 8b는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치의 제조 방법에서 상부 기판과 하부 기판의 결합 과정을 나타내는 단면도이다.
도 9는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치를 이용하여 세포를 주입한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10a 및 10b는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치를 이용하여 세포를 배양한 결과를 나타내는 사진이다.

이하에서, 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 대하여 상세히 살펴본다.

도 1은 일 실시예에 따른 관류(microfluidic perfusion) 세포 배양 장치의 사시도이다.

도 1을 참조하면, 관류 세포 배양 장치(1)는 제1 채널(10), 제2 채널(15), 마이크로챔버(20) 및 마이크로챔버(20)로부터 세포가 빠져나가는 것을 방지하기 위한 세포 통과 방지용 필터(미도시)를 포함할 수 있다. 관류 세포 배양 장치(1)는 서로 접합된 상부 기판(100) 및 하부 기판(200) 상에 형성될 수 있다. 상부 기판(100) 및 하부 기판(200)에 대해서는 도 5 내지 도 8을 참조하여 상세히 후술한다. 일 실시예에서, 관류 세포 배양 장치(1)는 배양액 주입구(30) 및 배양액 배출구(40)를 더 포함할 수 있다. 또한 일 실시예에서, 관류 세포 배양 장치(1)는 세포 주입구(50)를 더 포함할 수도 있다.

제1 채널(10)은 배양액 주입구(30)와 마이크로챔버(20) 사이에 연결될 수 있다. 제1 채널(10)은 배양액 주입구(30)를 통해 주입된 세포 배양액을 마이크로챔버(20)로 운반할 수 있다. 일 실시예에서, 제1 채널(10)은 마이크로미터 수준의 깊이를 갖는 마이크로채널일 수 있다. 본 명세서에서 깊이란, 배양액의 이동 방향에 대해 수직한 방향을 따른 채널 또는 챔버의 내부 길이를 지칭한다.

제2 채널(15)은 마이크로챔버(20)와 배양액 배출구(40) 사이에 연결될 수 있다. 제2 채널(15)은 마이크로챔버(20)를 통과한 세포 배양액을 배양액 배출구(40)로 운반할 수 있다. 이때, 마이크로챔버(20) 내의 세포로부터 생성된 세포 분비물이 세포 배양액 내에 포함되어 제2 채널(15)을 통해 운반될 수 있다. 일 실시예에서, 제2 채널(15)은 나노미터 수준의 깊이를 갖는 나노채널일 수 있다. 제2 채널(15)의 깊이에 대해서는 도 3을 참조하여 상세히 후술한다.

도 1에 도시된 실시예에서 제1 및 제2 채널(10, 15)은 직선 형태로 연장되는 하나의 채널로 도시되었다. 그러나, 이는 예시적인 것으로서, 다른 실시예에서 제1 및 제2 채널(10, 15)은 휘어지거나 꺾인 형상을 가질 수 있다. 또 다른 실시예에서, 제1 및 제2 채널(10, 15)은 각각 서로 유체 교환이 가능하도록 연결되거나 또는 서로 분리된 복수 개의 채널을 포함할 수도 있다.

마이크로챔버(20)는 제1 채널(10) 및 제2 채널(15) 사이에 연결되며, 세포를 수용할 수 있을 정도의 크기를 갖는다. 마이크로챔버(20)는 배양액의 이동 방향에 대해 수직한 방향으로 마이크로미터 수준의 깊이를 가질 수 있다. 마이크로챔버(20)의 깊이에 대해서는 도 3을 참조하여 상세히 후술한다. 마이크로챔버(20)는 세포 주입구(50)를 통하여 주입된 세포가 마이크로챔버(20) 내에 위치하도록 구성된다. 배양액 주입구(30)를 통해 주입된 세포 배양액이 제1 채널(10)을 통해 마이크로챔버(20)에 주입되며, 세포 배양액이 마이크로챔버(20)를 통과함으로써 마이크로챔버(20) 내에 위치한 세포의 배양이 이루어진다. 마이크로챔버(20)를 통과한 세포 배양액은 제2 채널(15)로 흘러나간다. 즉, 세포 배양액이 흐르는 경로에 위치하여 세포를 수용하는 마이크로챔버(20)가 세포 배양부에 해당된다.

도 1에 도시된 실시예에서는, 제1 및 제2 채널(10, 15)은 일 방향으로 연장되며, 제1 및 제2 채널(10, 15)의 길이 방향을 따라 복수 개의 마이크로챔버(20)가 일렬로 배열되어 위치한다. 배양액 주입구(30)를 통해 주입되어 제1 채널(10) 내를 흐르는 세포 배양액은 복수 개의 마이크로챔버(20)를 차례로 통과한 후 제2 채널(15)을 통해 운반되어 배양액 배출구(40)를 통해 배출된다. 그러나 이는 예시적인 것으로서, 다른 실시예에서 관류 세포 배양 장치는 다른 상이한 형태로 배열된 하나 이상의 나노채널 및 하나 이상의 마이크로챔버의 어레이를 포함하거나, 또는 단 하나의 마이크로챔버만을 포함할 수도 있다.

도 2는 도 1에 도시된 관류 세포 배양 장치에서 마이크로챔버를 포함하는 세포 배양부의 확대도이다.

도 2를 참조하면, 관류 세포 배양 장치는 마이크로챔버(20)로부터 세포가 빠져나가는 것을 방지하기 위한 세포 통과 방지용 필터(60)를 포함할 수 있다. 세포 통과 방지용 필터(60)는 세포 배양액이 마이크로챔버(20)로 유입되는 부분 및 세포 배양액이 마이크로챔버(20)로부터 유출되는 부분을 통한 세포 이탈을 방지하도록 제1 채널(10)과 마이크로챔버(20) 사이 및/또는 마이크로챔버(20)와 제2 채널(15) 사이에 배치될 수 있다. 예컨대, 세포 통과 방지용 필터(60)는 마이크로챔버(20)의 양 끝에 각각 위치할 수 있다.

마이크로챔버(20)에 연결된 하나 이상의 세포 주입로(51)를 통하여 마이크로챔버(20) 내로 세포가 주입될 수 있다. 세포 주입로(51)는 도 1을 참조하여 전술한 세포 주입구(50)와 연결될 수 있다. 일 실시예에서, 제1 및 제2 채널(10, 15)은 일 방향으로 연장되는 형상을 가지며, 세포 주입로(51)는 마이크로챔버(20)가 위치하는 부분에서 제1 및 제2 채널(10, 15)의 길이 방향과 직교하는 방향으로 연장되어 마이크로챔버(20)에 연결될 수도 있다.

세포 통과 방지용 필터(60)는 서로 이격된 복수 개의 미세구조체로 이루어질 수 있다. 각각의 미세구조체는 마이크로미터 또는 나노미터 수준의 크기를 갖는 구조체일 수 있다. 각각의 미세구조체는 다각형 또는 다른 상이한 형상의 단면을 갖는 기둥 형상일 수 있다. 세포가 세포 통과 방지용 필터(60)를 통과하지 못하도록 하기 위해, 세포 통과 방지용 필터(60)에서 서로 인접한 미세구조체들 사이의 간격은 세포의 크기보다 작을 수 있다. 제1 채널(10) 내를 흐르는 세포 배양액은 유체이므로 미세구조체들 사이를 통과하여 마이크로챔버(20)로 유입될 수 있으며, 마이크로챔버(20)를 통과한 후 다시 미세구조체들 사이를 통과하여 제2 채널(20)을 통하여 배출구 방향으로 흐를 수 있다. 반면, 마이크로챔버(20) 내에 주입된 세포는 미세구조체들 사이의 공간을 통과하지 못하므로 마이크로챔버(20) 내에 구속된다.

세포의 안정적인 배양과 다양한 처리에 따른 세포 반응을 분석하기 위해서는, 각 세포 배양부에 주입되는 세포의 개수, 최적의 세포 배양을 위한 공간적 배치, 세포 배양액의 공급 속도에 따른 세포 주변의 환경, 세포 배양액의 수송 및 처리 방법, 세포 증식 특성 및 신호 측정 등에 연관된 다양한 요소들을 가급적 균일하게 유지하여야 한다. 실시예들에 따른 관류 세포 배양 장치를 이용하면, 주입된 세포가 마이크로챔버(20)를 이탈하여 다른 위치로 이동하는 것을 세포 통과 방지용 필터(60)에 의해 방지할 수 있으므로, 각각의 세포 배양부에 동일한 시료를 주입하였을 때 각 세포 배양부에 비교적 균일한 개수의 세포가 시딩(seeding)되도록 할 수 있다.

도 3a 내지 3c는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치의 동작을 설명하기 위한 개념도이다. 도 3a는 관류 세포 배양 장치에서 하나의 마이크로챔버(20) 및 이에 연결된 제1 채널(10)과 제2 채널(15)의 평면도이며, 도 3b는 도 3a의 단면도이다. 또한, 도 3c는 마이크로챔버(20)를 통과한 세포 배양액의 검출을 위한 제2 채널(15) 내 이송 경로를 나타낸다.

도 3a를 참조하면, 세포 주입구(50)를 통해 하나 이상의 세포(2)가 마이크로챔버(20) 내로 주입될 수 있다. 세포(2)는 세포 통과 방지용 필터(60)를 이루는 미세구조체들 사이의 간격에 비해 큰 크기를 가지므로, 세포 통과 방지용 필터(60)를 통과하지 못하고 마이크로챔버(20) 내에 수용된다. 한편, 제1 채널(10)을 통하여 마이크로챔버(20) 내로 주입된 세포 배양액은 세포 통과 방지용 필터(60)를 통과할 수 있으므로 마이크로챔버(20)를 통과하여 다시 제2 채널(15) 내를 흐를 수 있다.

도 3b를 참조하면, 효율적인 세포 수용 및 세포 배양액의 운반을 위하여 제2 채널(15)은 세포 배양액의 흐름 방향(즉, 제1 및 제2 채널(10, 15)의 길이 방향)에 대해 수직한 방향으로 나노미터 수준의 깊이(H₁)를 갖는 나노채널일 수 있다. 예컨대, 일 실시예에서, 제2 채널(10)의 깊이(H₁)는 약 100 nm 이하일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 도 3b에서 마이크로채널인 제1 채널(10)은 나노채널인 제2 채널(15)에 비하여 상대적으로 큰 깊이를 갖는 것으로 도시된다. 그러나 도 3b에 도시된 각 채널(10, 15)의 깊이는 각 채널(10, 15)의 실제 깊이를 비례적으로 나타내는 것이 아니며, 깊이 차이를 가시화하기 위하여 과장된 것임이 용이하게 이해될 것이다.

또한, 마이크로챔버(20)는 세포 배양액의 흐름 방향에 대해 수직한 방향으로 마이크로미터 수준의 깊이(H₂)를 가질 수 있다. 예컨대, 일 실시예에서, 마이크로챔버(20)의 깊이(H₂)는 약 300 ㎛ 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 일 실시예에서, 마이크로챔버(20)의 깊이(H₂)는 세포 배양액의 흐름 방향을 따른 마이크로챔버(20)의 길이(W)의 약 2배 내지 약 5배일 수도 있다.

마이크로챔버(20) 내의 세포(2)들이 세포 배양액에 노출됨에 따라, 세포 호흡 등과 같은 세포 대사의 결과로서 다양한 세포 분비물(25)이 생성될 수 있다. 세포 분비물(25)은 세포 배양액 내에 부유되어 세포 배양액과 함께 나노채널(10) 내를 이동하게 된다.

도 3c를 참조하면, 마이크로챔버(20) 내에서 생성되어 세포 통과 방지용 필터(60)를 통과한 세포 분비물(25)은 제2 채널(15)을 따라 이동할 수 있다. 제2 채널(15)은 전기적 및/또는 광학적 검출 수단(미도시)에 의하여 세포 분비물(25)을 관찰하기 위한 검출용 유로(70)를 포함할 수 있다. 예컨대, 검출용 유로(70)는 제2 채널(15)의 다른 부분에 비하여 작은 폭을 가져 세포 분비물들이 검출용 유로(70)의 길이 방향으로 늘어서게 함으로써 검출을 용이하게 할 수도 있다. 이때, 제2 채널(15)의 다른 부분에 비하여 폭이 좁아진 검출용 유로(70)의 폭은 약 100 내지 500 nm일 수도 있다. 그러나 이는 예시적인 것으로서, 다른 실시예에서 검출 수단의 구성에 따라 검출용 유로(70)는 도시된 것과 상이하게 구성될 수 있으며, 또는 별도의 검출용 유로(70) 없이 제2 채널(15)을 통하여 검출이 이루어질 수도 있다.

도 4는 또 다른 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치의 개념적인 구성도이다. 도 4에 도시된 각 구성요소는 단지 유체 흐름을 위한 구성요소들 사이의 연결을 개념적으로 나타내는 것이며, 실제 구성요소의 크기를 모사하는 것이 아니라는 점이 이해되어야 할 것이다.

도 4를 참조하면, 본 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치는 어레이 형태로 배열된 복수 개의 마이크로챔버(20)를 포함할 수 있다. 관류 세포 배양 장치는 복수 개의 제1 채널(80)과 복수 개의 제2 채널(85)을 포함하되, 복수 개의 마이크로챔버(20) 각각은 각각의 제1 채널(80) 및 각각의 제2 채널(85) 사이에 연결될 수 있다. 복수 개의 마이크로챔버(20)는 제1 채널(80)을 통해 배양액 주입구(30)에 연결될 수 있다. 도시되는 바와 같이, 복수 개의 제1채널(80)은 부분적으로 서로 연결되어 하나의 배양액 주입구(30)에 연결되나, 마이크로챔버(20)에 연결되는 부분에서는 서로 분기되어 각 마이크로챔버(20)에 연결될 수 있다.

각각의 마이크로챔버(20)에는 세포 주입구(50)가 연결되어, 세포 주입구(50)를 통하여 마이크로챔버(20) 내로 세포가 주입될 수 있다. 또한, 관류 세포 배양 장치는 제2 채널(85)을 통하여 복수 개의 마이크로챔버(20) 각각에 연결된 복수 개의 배양액 배출구(40)를 포함할 수 있으며, 각각의 마이크로챔버(20)를 통과한 세포 배양액 및 세포 분비물이 각각의 배양액 배출구(40)를 통하여 배출될 수 있다.

도 1을 참조하여 전술한 실시예와 비교하면, 도 1의 실시예에서 복수 개의 마이크로챔버(20)가 하나의 제1 채널(10) 및 제2 채널(15) 사이에 일렬로 배치되는 것에 비해, 도 4의 실시예에서 복수 개의 마이크로챔버(20)는 각각의 제1 채널(80) 및 제2 채널(85) 사이에 복수 개가 병렬적으로 배치된다. 제1 채널(80), 제2 채널(85) 및 마이크로챔버(20)의 어레이의 형태를 제외하면 도 4에 도시된 관류 세포 배양 장치의 동작은 도 1 내지 도 3을 참조하여 전술한 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치와 동일하므로, 자세한 설명은 생략한다.

도 5는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치를 포함하는 세포 배양 시스템의 개략도이다.

도 5를 참조하면, 관류 세포 배양 시스템은 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치(1)를 인큐베이션(incubation) 챔버(7) 내에 위치시키고, 관류 세포 배양 장치(1)에 배양액 주입관(3) 및 배양액 방출관(5)을 연결시킴으로써 구성될 수 있다. 일 실시예에서, 배양액 주입관(3)에는 주입되는 세포 배양액 내의 기포를 제거하기 위한 기포 트랩(bubble trap)(4)이 설치될 수도 있다. 배양액 주입관(3)을 통해 주입된 세포 배양액은 관류 세포 배양 장치(1)의 마이크로챔버를 거쳐 배양액 방출관(5)을 통해 흘러나가게 된다. 배양액 주입관(3) 및/또는 배양액 방출관(5)에는 세포 배양액의 흐름을 제어하기 위한 실린지 펌프(syringe pump)(미도시)가 연결될 수도 있다.

관류 세포 배양 시스템은 관류 세포 배양 장치(1)의 마이크로챔버 내의 세포(2)로부터 생성된 세포 분비물을 검출하기 위한 검출부(6)를 포함할 수 있다. 검출부(6)는 마이크로챔버를 통과하여 나노채널(즉, 제2 채널) 내를 흐르는 세포 배양액으로부터 세포 분비물을 검출할 수 있다. 검출부(6)에 의하여 세포 분비물을 검출함으로써, 세포 분비물의 종류와 농도를 분석할 수 있으며, 이에 따라 약물처리에 따른 세포의 반응, 세포 간 신호 전달, 세포 노화 측정 등에 적용될 수 있다.

일 실시예에서, 검출부(6)는 광학적인 방법으로 세포 분비물을 관찰하기 위한 수단으로서, 대물 렌즈 및 현미경 등을 포함할 수 있다. 그러나 이는 예시적인 것으로서, 다른 실시예에서 검출부(6)는 전기적인 방법으로 세포 분비물을 검출하기 위한 전극 및 전류 측정 장치 등을 포함하거나, 또는 다른 상이한 방식으로 세포 분비물을 검출할 수 있는 장비를 포함할 수도 있다.

세포 분비물의 고감도 검출을 위해서는, 검출부를 나노미터 수준으로 소형화하는 것이 유리하다. 실시예들에 따른 관류 세포 배양 장치에 의하면, 나노채널에 연결된 마이크로챔버 내에 세포를 주입하되, 필터를 이용하여 마이크로챔버로부터 나노채널로 세포가 이동하지 않도록 함으로써, 세포 분비물의 검출이 나노채널에서 이루어지므로 검출 감도를 높일 수 있다. 이러한 세포 분비물의 검출 기술은 약물 스크리닝(screening), 바이오 센서(biosensor), 환경 모니터링 등 다양한 분야에 적용될 수 있다.

도 6a 내지 6e는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치의 제조 방법에서 상부 기판을 준비하는 과정을 나타내는 단면도이다.

도 6a를 참조하면, 먼저 지지 기판(110)상에 마스크 층(120)을 형성할 수 있다. 마스크 층(120)은 추후 지지 기판(110)의 식각 과정에서 식각 마스크의 기능을 하는 층으로서, 예컨대, 포토레지스트(photoresist)로 이루어질 수 있다.

마스크 층(120)은 추후 형성하고자 하는 채널 및 세포 통과 방지용 필터에 대응되는 형상으로 패터닝될 수 있다. 예컨대, 마스크 층(120)은 제1 및 제2 채널의 형성을 위해 일 방향으로 연장되는 형상을 갖되, 세포 통과 방지용 필터인 복수 개의 미세구조체 형성을 위하여 요철 형태로 패터닝된 부분을 포함할 수 있다.

도 6b를 참조하면, 마스크 층(120)을 식각 마스크로 이용하여 지지 기판(110)을 식각할 수 있다. 지지 기판(120)은 심도반응성이온식각(Deep Reactive Ion Etching; DRIE) 또는 다른 적절한 식각 방법에 의하여 식각될 수 있다. 추후 제1 및 제2 채널을 형성하기 위해, 지지 기판(120)은 서로 상이한 식각 깊이를 갖는 복수 개의 영역으로 식각될 수도 있다. 예컨대, 추후 마이크로채널인 제1 채널이 형성될 영역에서 지지 기판(120)은 마이크로미터 수준의 깊이로 식각될 수 있다. 반면, 추후 나노채널인 제2 채널이 형성될 영역에서 지지 기판(120)은 나노미터 수준의 깊이, 예컨대, 약 100 nm 이하의 깊이로 식각될 수 있다.

도 6c를 참조하면, 지지 기판(110)의 식각 후 마스크 층을 제거할 수 있다. 마스크 층에 의하여 덮여 있던 지지 기판(110)의 영역은 식각되지 않으며, 그 결과 지지 기판(110)에서 식각되지 않은 부분은 식각된 지지 기판(110)의 나머지 부분과 단차를 갖는 돌출 영역이 된다. 일 실시예에서는, 마스크 층을 제거한 후 지지 기판(110)상에 이형제를 도포할 수도 있다. 예컨대, 이형제는 자기조립단분자막(self-assembled monolayer; SAM)으로 이루어질 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

도 6d를 참조하면, 지지 기판(110)상에 기판 물질(100)을 형성할 수 있다. 기판 물질(100)은 관류 세포 배양 장치를 구성할 기판을 형성하기 위한 재료이다. 예컨대, 기판 물질(100)은 폴리디메틸실록세인(Polydimethylsiloxane; PDMS)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

도 6e를 참조하면, 기판 물질(100)을 지지 기판으로부터 분리함으로써 도 1을 참조하여 전술한 것과 같은 상부 기판(100)을 형성할 수 있다. 또한, 지지 기판으로부터 분리된 기판 물질(100)을 천공하여 배양액 주입구(30) 및 배양액 배출구(40)를 형성할 수도 있다.

도 6d에서 지지 기판(110)은 식각되지 않은 영역이 다른 영역과 단차를 갖고 돌출된 형상을 가지므로, 지지 기판(110)을 몰드(mold)로 하여 형성된 상부 기판(100)은 지지 기판의 돌출 영역에 대응되는 함몰부를 갖는다. 추후 상부 기판(100)과 하부 기판의 접합 시 이러한 함몰부에 의하여 제1 채널 및 제2 채널이 형성된다. 또한 상부 기판(100)은, 추후 하부 기판과의 접합 시 세포 통과 방지용 필터의 형성을 위해, 함몰부 내에 위치하는 요철 형태의 돌출 부분(미도시)을 포함할 수도 있다.

도 7a 내지 7e는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치의 제조 방법에서 하부 기판을 준비하는 과정을 나타내는 단면도이다.

도 7a를 참조하면, 먼저 지지 기판(210)상에 마스크 층(220)을 형성할 수 있다. 마스크 층(220)은 추후 상부 기판과의 접합을 통해 형성하고자 하는 마이크로챔버의 형상에 대응되도록 패터닝될 수 있다. 도 7b를 참조하면, 마스크 층(220)을 식각 마스크로 이용하여 지지 기판(210)을 식각할 수 있다. 일 실시예에서, 지지 기판(210)은 약 300 ㎛ 이상의 깊이로 식각될 수도 있다. 도 7c를 참조하면, 지지 기판(210)의 식각 후 마스크 층을 제거할 수 있다. 일 실시예에서는, 마스크 층의 제거 후 지지 기판(210) 상에 이형제를 형성할 수도 있다.

도 7a 내지 7c에 도시된 각 공정은 마스크 층(220)의 패턴 형태를 제외하면 도 6a 내지 6c를 참조하여 전술한 각 공정과 동일할 수 있으므로, 자세한 설명은 생략한다.

도 7d를 참조하면, 식각된 지지 기판(210) 상에 기판 물질(230)을 형성할 수 있다. 일 실시예에서는, 지지 기판(210)상에 기판 물질(230)을 위치시킨 후, 기판 물질(230)상에 지지 필름(240)을 위치시킬 수 있다. 그리고, 지지 필름(240)의 상부에 롤러(roller) 등에 의하여 압력을 가한 결과, 지지 기판(210)을 몰드로 하여 기판 물질(230)의 형상을 결정할 수 있다. 또한, 이때 기판 물질(230)은 지지 필름(240)에 부착될 수도 있다.

일 실시예에서, 기판 물질(230)은 PDMS 또는 다른 적당한 물질로 이루어질 수 있다. 또한 일 실시예에서, 지지 필름(240)은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(Polyethylene Terephthalate; PET)로 이루어질 수도 있다. 그러나 이는 예시적인 것으로서, 상기 물질에 의해 실시예들이 한정되는 것은 아니다.

도 7e를 참조하면, 기판 물질을 지지 기판으로부터 분리함으로써, 도 1을 참조하여 전술한 것과 같은 하부 기판(200)을 형성할 수 있다. 하부 기판(200)은 지지 필름(240)상에 부착되어 있을 수도 있다. 도 7d에서 지지 기판(210)은 식각되지 않은 영역이 다른 영역과 단차를 갖고 돌출된 형상을 가지므로, 지지 기판(210)을 몰드로 하여 형성된 하부 기판(200)은 지지 기판의 돌출 영역에 대응되는 함몰부를 갖는다. 상기 함몰부는 하부 기판(200)을 완전히 관통하는 홀의 형태일 수도 있다. 추후 상부 기판과 하부 기판의 접합 시 이러한 함몰부에 의하여 마이크로챔버가 형성될 수 있다.

도 8a 및 8b는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치의 제조 방법에서 상부 기판과 하부 기판의 결합 과정을 나타내는 단면도이다.

도 8a를 참조하면, 상부 기판(100)과 하부 기판(200)을 서로 정렬시킨 후, 상부 기판(100)에서 함몰부가 위치하는 면과 하부 기판(200)에서 함몰부가 위치하는 면이 서로 마주하도록 상부 기판(100)과 하부 기판(200)을 접합할 수 있다. 그 결과, 상부 기판(100)의 함몰부와 하부 기판(200)의 표면 사이의 공간에 의하여 제1 채널 및 제2 채널이 정의될 수 있다. 또한, 상부 기판(100)의 함몰부와 하부 기판(200)의 함몰부 사이의 공간에 의하여 제1 채널 및 제2 채널의 사이에 위치하는 마이크로챔버가 정의될 수 있다.

도 7을 참조하여 전술한 것과 같이, 상부 기판(100)은 함몰부 내에 위치하는 요철 형태의 돌출 부분(미도시)을 포함할 수 있다. 요철 형태의 돌출 부분에 의하여, 제1 채널과 마이크로챔버 사이 및/또는 마이크로챔버와 제2 채널 사이에 위치하는 복수 개의 미세구조체로 이루어진 세포 통과 방지용 필터가 정의될 수 있다. 본 실시예에서는 세포 통과 방지용 필터를 형성하기 위한 돌출 부분이 상부 기판(100)에 형성되는 것으로 기재하였으나, 이는 예시적인 것으로서, 다른 실시예에서 이러한 돌출 부분은 본 명세서에 기재된 원리와 동일한 원리에 의하여 하부 기판(220)에 형성될 수도 있다.

도 8b를 참조하면, 일 실시예에서는 하부 기판(200)과 부착된 지지 필름(240)을 제거하고, 하부 기판(200)을 유리 기판(300)상에 접합시킬 수도 있다.

도 9는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치를 이용하여 세포를 주입한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 9는 총 135개의 마이크로챔버 각각에 대략적으로 200개의 세포를 주입하고 일정 시간이 흐른 후 마이크로챔버 내의 세포의 개수를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 총 135개의 마이크로챔버 내의 평균 세포 수는 약 175개로 나타났으며, 세포 수의 표준 편차(σ)는 약 62개로 나타났다. 세포 통과 방지용 필터를 이용하여 마이크로챔버로부터 세포가 이탈하는 것을 방지한 결과, 각 세포 배양부에 위치하는 세포의 수를 종래에 비하여 상대적으로 균일하게 유지할 수 있음을 알 수 있다.

도 10a는 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치에서 세포가 주입되어 마이크로챔버의 바닥에 시딩된 상태를 나타내는 사진이며, 도 10b는 도 10a의 마이크로챔버 내에서 세포를 36시간 동안 배양한 결과를 나타내는 사진이다.

도 10b는, 도 10a에 도시된 마이크로챔버 내 특정 영역(400)에서 배양되는 세포를 세포 주입 직후(0h), 6시간 후(6h), 12시간 후(12h), 24시간 후(24h) 및 36시간 후(36h)에 각각 촬영한 상태를 나타낸다. 도시되는 바와 같이, 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 장치에 의하여 세포 배양이 원활하게 이루어지는 것을 확인할 수 있다.

이상에서 살펴본 본 발명은 도면에 도시된 실시예들을 참고로 하여 설명하였으나 이는 예시적인 것에 불과하며 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 실시예의 변형이 가능하다는 점을 이해할 것이다. 그러나, 이와 같은 변형은 본 발명의 기술적 보호범위 내에 있다고 보아야 한다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해서 정해져야 할 것이다.

Claims (20)

1. 세포 배양액을 운반하도록 구성된 제1 채널;
   상기 제1 채널에 연결되며 세포를 수용하도록 구성된 마이크로챔버;
   상기 마이크로챔버에 연결되며, 상기 마이크로챔버를 통과한 세포 배양액을 운반하도록 구성된 제2 채널;
   상기 제1 채널 및 상기 제2 채널의 길이 방향과 직교하는 방향으로 연장되어, 상기 제1 채널 및 상기 제2 채널 사이에서 상기 마이크로챔버에 연결되며, 세포가 주입되도록 구성된 세포 주입로; 및
   상기 마이크로챔버로부터 세포가 빠져나가는 것을 방지하도록 상기 제1 채널과 상기 마이크로챔버 사이 및 상기 마이크로챔버와 상기 제2 채널 사이에 배치된 세포 통과 방지용 필터를 포함하되,
   상기 세포 통과 방지용 필터는 요철 형태의 돌출 부분을 포함하며,
   상기 제2 채널의 깊이는 100 nm 이하인 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 세포 통과 방지용 필터는, 세포의 직경에 비해 작은 간격을 갖도록 서로 이격하여 배열된 복수 개의 미세구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치.
   
3. 제 2항에 있어서,
   상기 복수 개의 미세구조체 각각은 기둥 형상인 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치.
   
4. 제 1항에 있어서,
   세포 배양액이 주입되도록 구성된 배양액 주입구; 및
   상기 주입구를 통해 주입되어 상기 마이크로챔버를 통과한 세포 배양액을 배출하도록 구성된 배양액 배출구를 더 포함하되,
   상기 제1 채널은 상기 배양액 주입구 및 상기 마이크로챔버 사이를 연결하며,
   상기 제2 채널은 상기 마이크로챔버 및 상기 배양액 배출구 사이를 연결하는 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치.
   
5. 제 4항에 있어서,
   상기 마이크로챔버는, 상기 배양액 주입구와 상기 배양액 배출구 사이에 일렬로 배열된 복수 개의 마이크로챔버를 포함하는 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치.
   
6. 제 4항에 있어서,
   상기 제1 채널은 상기 배양액 주입구에 연결된 복수 개의 제1 채널을 포함하며,
   상기 제2 채널은 상기 배양액 배출구에 연결된 복수 개의 제2 채널을 포함하고,
   상기 마이크로챔버는 상기 복수 개의 제1 채널 각각과 상기 복수 개의 제2 채널 각각의 사이에 연결된 복수 개의 마이크로챔버를 포함하는 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1항에 있어서,
   세포 배양액의 이동 방향에 수직한 방향의 상기 마이크로챔버의 깊이는 300 ㎛ 이상인 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치.
   
10. 제 1항에 있어서,
    세포 배양액의 이동 방향에 수직한 방향의 상기 마이크로챔버의 깊이는, 세포 배양액의 이동 방향을 따른 상기 마이크로챔버의 길이의 2배 내지 5배인 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치.
    
11. 제 1항에 있어서,
    상기 마이크로챔버를 통과하여 상기 제2 채널을 통해 운반되는 세포 배양액으로부터 세포 분비물을 검출하도록 구성된 검출부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치.
    
12. 제1 채널, 제2 채널 및 상기 제1 채널 및 상기 제2 채널의 길이 방향과 직교하는 방향으로 연장되는 세포 주입로에 대응되는 하나 또는 복수 개의 제1 함몰부를 포함하는 상부 기판을 준비하는 단계;
    마이크로챔버에 대응되는 제2 함몰부를 포함하는 하부 기판을 준비하는 단계; 및
    상기 제1 함몰부 및 상기 제2 함몰부가 서로 대향하며, 상기 제1 채널 및 상기 제2 채널이 상기 마이크로챔버에 연결되고 상기 세포 주입로가 상기 제1 채널 및 상기 제2 채널 사이에서 상기 마이크로챔버에 연결되도록 상기 상부 기판과 상기 하부 기판을 접합하는 단계를 포함하되,
    상기 상부 기판 또는 상기 하부 기판에는 상기 마이크로챔버로부터 세포가 빠져나가는 것을 방지하기 위한 돌출부가 형성되고,
    상기 상부 기판과 상기 하부 기판의 접합 시, 상기 돌출부는 상기 제1 채널과 상기 마이크로챔버 사이 및 상기 마이크로챔버와 상기 제2 채널 사이에 위치하며,
    상기 제2 채널의 깊이는 100 nm 이하인 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치의 제조 방법.
    
13. 제 12항에 있어서,
    상기 상부 기판을 준비하는 단계는,
    지지 기판상의 마스크를 이용하여 상기 지지 기판을 식각하는 단계;
    식각된 상기 지지 기판상에 기판 물질을 형성하는 단계; 및
    상기 기판 물질을 상기 지지 기판으로부터 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치의 제조 방법.
    
14. 삭제
15. 제 12항에 있어서,
    상기 하부 기판을 준비하는 단계는,
    지지 기판상의 마스크를 이용하여 상기 지지 기판을 식각하는 단계;
    식각된 상기 지지 기판상에 기판 물질을 형성하는 단계; 및
    상기 기판 물질을 상기 지지 기판으로부터 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치의 제조 방법.
    
16. 제 15항에 있어서,
    상기 지지 기판을 식각하는 단계는, 상기 지지 기판을 300 ㎛ 이상의 깊이로 식각하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치의 제조 방법.
    
17. 제 15항에 있어서,
    상기 기판 물질을 상기 지지 기판으로부터 분리하는 단계는, 상기 기판 물질을 지지 필름상에 부착시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 관류 세포 배양 장치의 제조 방법.
    
18. 마이크로챔버에 연결된 세포 주입로를 통해 상기 마이크로챔버 내로 세포를 주입하는 단계;
    상기 마이크로챔버에 연결된 제1 채널 내로 세포 배양액을 주입하는 단계;
    상기 마이크로챔버를 통하여 상기 세포 배양액을 이동시키는 단계;
    상기 마이크로챔버에 연결된 제2 채널을 통해, 상기 마이크로챔버를 통과한 세포 배양액을 이동시키는 단계; 및
    상기 제1 채널과 상기 마이크로챔버 사이 및 상기 마이크로챔버와 상기 제2 채널 사이에 위치하며, 요철 형태의 돌출 부분을 포함하는 세포 통과 방지용 필터를 이용하여 상기 마이크로챔버로부터 세포가 빠져나가는 것을 방지하는 단계를 포함하되,
    상기 세포 주입로는, 상기 제1 채널 및 상기 제2 채널의 길이 방향과 직교하는 방향으로 연장되어, 상기 제1 채널 및 상기 제2 채널 사이에서 상기 마이크로챔버에 연결되며,
    상기 제2 채널의 깊이는 100 nm 이하인 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
    
19. 제 18항에 있어서,
    상기 마이크로챔버를 통과한 세포 배양액을 이동시키는 단계는, 상기 마이크로챔버를 통과한 세포 배양액을 상기 세포 통과 방지용 필터를 통과하여 상기 제2 채널로 이동시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
    
20. 제 19항에 있어서,
    상기 마이크로챔버를 통과한 세포 배양액을 상기 제2 채널로부터 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.

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