CN112955537A - 细胞培养基片及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞培养基片，其包含微流路，在注入培养液时不易产生交叉污染。细胞培养基片具备：板材，具有第一面；第一开口部，形成于板材的内部，一方的端部在第一面上露出而成；第二开口部，形成于板材的内部且与第一开口部不同的位置，一方的端部在第一面上露出而成；以及中空状的连通部，将第一开口部的另一方的端部与第二开口部的另一方的端部连通，在板材的第一面上的至少第一开口部或第二开口部的附近具有实施了疏水处理的疏水部。

Description

细胞培养基片及其制造方法

技术领域

本发明涉及细胞培养基片及其制造方法。

背景技术

以往，作为能够一次性观察、检查多个试样的实验器具，有微孔板(microplate)(例如，参照下述专利文献1)。微孔板是形成有多个微流路的平板状的器具，能够在各微流路中分别在不同的条件下培养或检查成为检查对象的细胞、微生物等。通过使用微孔板，能够一次性容易地比较多个微流路内的检查对象。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2016/158233号

发明内容

发明要解决的课题

作为向微流路的溶液供给方法，有使用泵与管连续地供给溶液的方式以及使用微量移液管(micropipet)等供给恒定容量的溶液的分批式的方式。但是，在使用泵与管的方式中，需要在基片的周围配置泵以及管，因此存在整体上尺寸大型化，而且电源的处理等复杂化的课题。因此，从通过简易的方法向微流路供给溶液的观点出发，优选使用微量移液管等向微流路内供给溶液的方式。

然而，在包含容积(容量)小的微流路的细胞培养基片中，培养液的导入口与导出口的间隔较窄。另外，在该细胞培养基片中，考虑到微流路的容量较小，能够并列设置多个微流路。在该情况下，某个微流路A的导入口与邻接的微流路B的导入口或导出口的间隔也较窄。

在这样的状态的下，在使用微量移液管从某个微流路A的导入口导入了溶液X的情况下，存在溶液X向所述导入口的周边润湿扩散的隐患。如上所述，相同的微流路A内的导入口与导出口的间隔、邻接的微流路的间隔较窄，因此润湿扩散后的溶液X侵入导出口、邻接的微流路内，存在产生交叉污染(所谓的污染)的隐患。若产生这样的现象，则存在无法正确地评价所培养的细胞等的可能性。

鉴于上述的课题，本发明的目的在于提供一种细胞培养基片，其包含微流路，在注入培养液时不易产生交叉污染。

用来解决课题的手段

本发明的细胞培养基片，其特征在于，具备：

板材，具有第一面；

第一开口部，形成于所述板材的内部，一方的端部在所述第一面上露出而成；

第二开口部，形成于所述板材的内部且与所述第一开口部不同的位置，一方的端部在所述第一面上露出而成；

中空状的连通部，将所述第一开口部的另一方的端部与所述第二开口部的另一方的端部连通，

在所述板材的所述第一面上的至少所述第一开口部或所述第二开口部的附近具有实施了疏水处理的疏水部。

根据所述细胞培养基片，通过使用例如微量移液管从第一开口部或第二开口部注入包含细胞的培养液，能够在连通部内培养细胞。而且，在板材的第一面上的至少第一开口部或第二开口部的附近实施了疏水处理，因此，在从实施了该疏水处理的开口部注入了培养液的情况下，即使假设在开口部的周围附着有培养液，也会滴落(日文：着滴化)并停留在第一面上的开口部附近，可防止培养液流入其外侧。由此，使用所述细胞培养基片，即使在邻接的培养空间(连结部)内培养多个细胞的情况下，也可抑制培养液流入邻接的培养空间内。

另外，如上述那样，通过利用疏水部实施了疏水处理，漏出到该疏水部的培养液成为水滴状态。因此，能够容易地返回到开口部(第一开口部、第二开口部)侧。当供给至培养空间内的培养液的量变化时，有时会对细胞的培养状态带来影响，但根据上述的构成，能够向各培养空间内供给规定量的培养液，能够提高试验的精度。

另外，在本说明书中，第一开口部或第二开口部的“附近”也可以是指，从第一面上的各开口部的外周到至少离开0.5mm的位置为止的区域。另外，疏水部不一定需要形成为完全覆盖第一开口部或第二开口部的外周，也可以在所述外周的外侧的一部分区域形成有非疏水部。更具体而言，优选的是，在从第一开口部或第二开口部的外缘到离开相当于开口部的半径(在开口部为非圆形的情况下为内切圆的半径)的长度的位置为止的区域所构成的面积的70％以上且100％以下的区域设有疏水部。更优选的是，疏水部以包含开口部的外缘的70％以上且100％以下的区域的方式设置。

所述疏水部优选的是，除了疏水性之外，还具有耐水性、药品耐久性以及生物体相容性等。作为一个例子，所述疏水部能够采用包含含有氟系聚合物的材料。更详细地说，通过利用压印或喷墨来涂覆氟系聚合物溶液，能够形成所述疏水部。

也可以是，所述细胞培养基片的从所述第一开口部的所述一方的端部经由所述连通部到达所述第二开口部的所述一方的端部的空间的容积为100μL以下。

在该构成的情况下，培养细胞的空间由微小空间构成。即使是这样的构成，如上述那样，由于在板材的第一面上的至少第一开口部或第二开口部的附近实施了疏水处理，因此通过从第一开口部或第二开口部注入微量的培养液，能够抑制培养液通过板材的第一面上而流出的情况。

也可以是，形成于所述第一面上的、所述第一开口部的所述一方的端部和所述第二开口部的所述一方的端部的内径均为5mm以下。另外，也可以是，形成于所述第一面上的、所述第一开口部的所述一方的端部与所述第二开口部的所述一方的端部的分离距离为20mm以下。

另外，也可以在相同的细胞培养基片上形成有多个包含第一开口部、连通部以及第二开口部而成的培养空间。在这样的情况下，邻接的培养空间所具备的各开口部彼此(第一开口部彼此)的分离距离优选设为10mm以下。由此，能够同时并行地在不同的环境下培养多个细胞，可实现高密度化/高生产率化。而且，通过在各开口部的周围设有疏水部，降低了培养液混入邻接的培养空间内的风险，消除了交叉污染的问题。

本发明为所述细胞培养基片的制造方法，其特征在于，具有：

工序(a)，制作第一基板和平板状的第二基板，该第一基板具有从一方的面朝向另一方的面贯通的至少两处贯通孔、以及将所述贯通孔彼此连通的孔部；

工序(b)，对所述第一基板的所述一方的面中的至少露出有一处所述贯通孔的区域的附近实施疏水处理；以及

工序(c)，使所述第一基板的所述另一方的面与所述第二基板贴合而制作所述板材。

根据上述方法，通过所述两个贯通孔与孔部，可制造具有第一开口部、第二开口部以及将它们连通的连通部、并且至少在一方的开口部的附近的面上具有实施了疏水处理的疏水部的细胞培养基片。

发明效果

根据本发明，可实现在注入培养液时不易产生交叉污染的细胞培养基片。

附图说明

图1是示意地表示细胞培养基片的一实施方式的构造的立体图。

图2是从第一基板侧观察细胞培养基片时的示意性的俯视图。

图3是沿图2内的X1－X1线切断细胞培养基片时的示意性的剖面图。

图4是仿照图3图示注入有培养液的状态的细胞培养基片的示意性的剖面图。

图5是用于说明细胞培养基片的尺寸的示意性的剖面图。

图6是对不具有疏水部的细胞培养基片注入了培养液的状态下的细胞培养基片的示意性的俯视图。

图7是对不具有疏水部的细胞培养基片注入了培养液的状态下的细胞培养基片的示意性的剖面图。

图8A是示意地表示具备多个培养室的细胞培养基片的一个例子的俯视图。

图8B是示意地表示对多个培养室注入了培养液之后的、沿图8A中的A1－A1线切断时的状态的附图。

图9是示意地表示细胞培养基片的制造方法的工序剖面图。

图10是示意地表示其他实施方式的细胞培养基片的构造的剖面图。

图11是表示疏水部的形状的一个例子的示意性的俯视图。

图12A是从第一基板侧观察其他实施方式的细胞培养基片时的示意性的俯视图。

图12B是从第一基板侧观察其他实施方式的细胞培养基片时的示意性的俯视图。

具体实施方式

参照附图对本发明的细胞培养基片及其制造方法进行说明。另外，以下的各附图只是示意性地图示。即，附图上的尺寸比与实际的尺寸比不一定一致，另外，在各附图间尺寸比也不一定一致。

[构造]

图1是示意地表示细胞培养基片的一实施方式的构造的立体图。如图1所示，细胞培养基片1具备由第一基板2a与第二基板2b构成的板材2。图2是从第一基板2a侧观察细胞培养基片1时的示意性的俯视图。图3是沿图2内的X1－X1线切断细胞培养基片1时的示意性的剖面图。

在本实施方式中，细胞培养基片1具备由第一基板2a与第二基板2b构成的板材2。在板材2中，在第一基板2a上在分离的位置形成有两个贯通孔，这些贯通孔的一方的面与第二基板2b接触，从而形成有第一开口部21及第二开口部22。即，在从第一基板2a侧观察细胞培养基片1时，如图2所示，第一开口部21的一方的端部21a以及第二开口部22的一方的端部22a露出。如图2所示，第一基板2a的面中的露出有各开口部(21、22)的端部(21a、22a)的一侧的面3与“第一面”对应。以下，将该面适当称作“第一面3”。

第一基板2a在第二基板2b侧的面具有细管状的凹部，通过该凹部与第二基板2b之间的区域形成有连通部11。连通部11构成将第一开口部21的与端部21a相反的一侧的端部21b以及第二开口部22的与端部22a相反的一侧的端部22b连通的中空流路。在本实施方式中，连通部11构成培养细胞的空间(培养室)。

换言之，构成培养室的连通部11被由板材2构成的壁部覆盖周围，由将从第一开口部21朝向第二开口部22的方向d1作为长边方向的细管状空间构成(参照图3)。例如，在图3中，通过从第一开口部21的端部21a侧注入包含细胞41的培养液42，从而在构成培养室的连通部11内培养细胞41(也参照图4)。

在第一基板2a的第一面3上的至少形成有各开口部(21、22)的端部(21a、22a)的部位的附近具有实施了疏水处理的区域(31、32)。将该区域适当称作“疏水部31”、“疏水部32”。

疏水部31在第一基板2a的第一面3上至少形成于开口部21的端部21a的附近的区域即可。同样，疏水部32在第一基板2a的第一面3上至少形成于开口部22的端部22a的附近的区域即可。这里，“开口部21的端部21a的附近”是指，从开口部21的端部21a的外周(外缘)到朝向外侧离开所述端部21a的内径的50％的位置为止的区域。同样，“开口部22的端部22a的附近”是指，从开口部22的端部22a的外周(外缘)到朝向外侧离开所述端部22a的内径的50％的位置为止的区域。

疏水部31、疏水部32只要能够起到防液体的功能，就可以用任意的原材料·方法来形成。作为一个例子，能够采用将氟系聚合物、有机硅等疏水性材料涂覆于第一基板2a的第一面3上的规定的区域的方式。另外，也可以设置具有基于荷叶效应的疏水性的显现功能的细微构造。

尺寸的一个例子如以下所述(参照图5)。第二基板2b的高度(厚度)w3约为1mm，优选为100μm以上且2mm以下。第一开口部21的高度h21及第二开口部22的高度h22均为约3mm。连通部11(培养室)的高度h11约为300μm，优选为200μm以上且500μm以下。另外，连通部11(培养室)的长边方向的长度t11约为9mm。在本实施方式中，所述长度t11与第一开口部21的端部21a及第二开口部22的端部22a的分离距离大致对应。

如图2所示，第一开口部21的端部21a及第二开口部22的端部22a的内径均为约2mm。所述端部21a及端部22a的外切圆(在为圆形状的情况下为该圆)的直径(内径)优选为5mm以下，更优选为3mm以下。

另外，第一开口部21从端部21a朝向端部21b，内径无需均匀，也可以存在具有不同的内径的区域。对于第二开口部22也相同。

从第一开口部21的端部21a经由连通部11到达第二开口部22的端部22a的空间的容积为100mm³(100μL)以下，更优选为10mm³(10μL)。

构成板材2的第一基板2a及第二基板2b优选由实质上非多孔质体的材料构成。这里，“实质上非多孔质体”是指，介质的表观表面积与实际表面积近似的状态。作为形成上述那样的非多孔质体的材料的例子，可列举玻璃、硅等无机材料、或者聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚苯乙烯(PS)等树脂材料。另外，也可以组合2种以上这些树脂材料。通过用这样的材料构成板材2，能够抑制从在连通部11内培养的细胞41释放的生理活性物质被吸收到构成连通部11的壁的板材2内，并且能够再次返回到细胞41侧。

构成板材2的第一基板2a及第二基板2b优选由具有透光性的材料构成。在板材2由上述的树脂材料构成的情况下，能够从细胞培养基片1的外侧目视确认细胞41。

如上述那样，在本实施方式中，各开口部(21、22)的内径以及构成各开口部(21、22)的开口面的端部(21a、22a)的直径极短。另外，由开口部(21、22)以及连通部11构成的空间的容积也极小。在向这样的微小空间内注入包含细胞41的培养液42时，可以利用使用微量移液管那样的能够定量供给极少量的液体的器具的方法。

这里，在本实施方式中，在各开口部(21、22)的端部(21a、22a)的附近设有疏水部(31、32)。因此，例如，在使用微量移液管从第一开口部21侧注入了培养液42的情况下，即使该培养液42漏出到第一基板2a的第一面3上的第一开口部21的外侧的位置，由于在第一面3上被疏水化，因此能够避免进一步向外侧流出的情况(参照图4)。另外，在图4中，图示为各疏水部(31、32)具有高度，但这是为了方便图示，实际上也可以在第一面3的表面上形成为极薄的膜。

与此相对，如图6及图7所示，在不具有疏水部(31、32)的细胞培养基片100的情况下，当从第一开口部21注入的培养液42溢出到第一面3的上表面时，原样地在第一面3上流动。另外，图6对应于仿照图2从第一基板2a侧观察细胞培养基片100时的俯视图，图7对应于沿图6内的X2－X2线切断时的剖面图。在图6及图7中，示意地图示了由于注入的培养液42的量较多，培养液42也溢出到第二开口部22侧的情况。

如上述那样，由第一开口部21、连通部11以及第二开口部22构成的流路为极微小的尺寸。因此，如图8A中图示的那样，设想多个流路以相互独立的状态形成于相同的板材2内的情况。根据该构成，能够并行地培养多个细胞41，因此实验·评价的效率提高。另外，图8A中图示的各培养空间的配置数量、配置的方式只是一个例子。例如，在图8A中，例示地示出了在行方向及列方向上形成有多个培养空间的情况，但例如也可以在一个方向上形成有一个培养空间。

这里，如图6及图7所示，在开口部(111、112)附近的第一面3上未实施疏水处理的情况下，存在如下可能性：从开口部111注入的培养液42在第一基板2a的第一面3上流动，通过与构成邻接的培养室的连通部11连通的开口部(111、112)而流入所述邻接的培养室内。若发生这样的情况，则从在某个培养室(连通部11)内培养的细胞41释放的生理活性物质流入其他培养室(连通部11)内，存在对在该其他培养室内培养的细胞41产生作用的隐患。若发生这样的情况，则存在无法正确地评价所培养的细胞的隐患。

与此相对，如本实施方式的细胞培养基片1那样，通过在开口部(21、22)附近的第一面3上设置实施了疏水处理的疏水部(31、32)，即使假设在培养液42从开口部(21、22)流出的情况下，也会水滴化而停留在该位置，防止流入邻接的培养室内。如上述那样，在向细胞培养基片1的构成培养室的连通部11内供给培养液42时，需要从直径小的开口部(21、22)注入培养液42，存在培养液42溢出到开口部(21、22)的外侧的可能性。假设，若培养液42溢出到开口部(21、22)的外侧，则存在原样地向周围润湿扩散的隐患。但是，如上述那样，通过在开口部(21、22)附近的第一面3上设置疏水部(31、32)，即使假设培养液42从开口部(21、22)溢出，也会被液滴化而停留在该位置，因此不易向周围润湿扩散。

图8B是表示向图8A所示的细胞培养基片1注入了培养液42之后的沿A1－A1线切断时的状态的示意性的附图。由于在开口部21的外周形成有疏水部31，因此在疏水部31的内侧培养液42水滴化(水滴42a)，防止流入邻接的开口部21。例如，在开口部21的内径为2mm的情况下，形成于开口部21的上表面的水滴42a的直径为2.8mm以上且3.8mm以下左右。

[制造方法]

参照图9对细胞培养基片1的制造方法的一个例子进行说明。首先，如图9的(a)所示，准备规定的形状的模具(51、52)。模具51是第一基板2a的模具，模具52是第二基板2b的模具。模具51呈与第一基板2a的开口部(21a、21b)对应的形状。

接下来，如图9的(b)所示，使用该模具(51、52)，使用上述的材料(例如，树脂材料)进行注射成型，制作第一基板2a及第二基板2b(工序(a))。之后，如图9的(c)所示，在第一基板2a的第一面3侧的规定的位置进行疏水用的表面处理(工序(b))。具体而言，如上述那样，在规定的位置通过喷墨方式或压印方式涂覆氟系聚合物树脂。作为疏水用的表面处理的方法，并不限定于上述的方法，但优选使用不污染设于第一基板2a的贯通孔、孔部的方法。

之后，如图9的(d)所示，将第一基板2a的与第一面3相反的一侧的面和第二基板2b贴合(工序(c))。在贴合时优选不污染在贴合工序后形成的开口部(21、22)以及连通部11的内侧的流路的方法。具体而言，优选不使用粘接剂而进行。作为一个例子，能够采用如下方法：在对两基板(2a、2b)的接合面照射真空紫外线而进行了表面处理之后，在使接合面彼此抵接的状态下进行加压及加热。

另外，也可以是，在工序(a)中，不使用模具，而使用预先准备的具有图9的(b)所示那样的形状的第一基板2a及第二基板2b，来执行工序(b)及工序(c)。另外，也可以是，在工序(c)中，遍及各基板(2a、2b)的外表面整体而实施表面处理。

[其他实施方式]

以下，对其他实施方式进行说明。

〈1〉在上述实施方式中，对在第一基板2a的第一面3中的至少形成有各开口部(21、22)的端部(21a、22a)的位置的附近具有实施了疏水处理的区域(疏水部31、疏水部32)的情况进行了说明。但是，也可以是遍及第一基板2a的第一面3a整体而实施了疏水处理。

另外，也可以是，仅在第一基板2a的第一面3中的形成有一方的开口部例如第一开口部21的端部21a的位置的附近实施了疏水处理。在该情况下，也可以从实施了疏水处理的一侧的开口部(这里为第一开口部21)侧注入培养液42。

〈2〉如图10所示，在细胞培养基片1中，也可以使第一开口部21与第二开口部22的内径不同。在该情况下，能够从内径大的第一开口部21注入培养液42，从内径小的第二开口部22向外部取出培养液42。在该情况下，也可以是，仅在成为注入培养液42的一侧的第一开口部21的端部21a的附近设置疏水部31，在第二开口部22的端部22a的附近不设置疏水部32。

〈3〉在上述实施方式中，对构成培养室的连通部11与各开口部(21、22)将第二基板2b的上表面作为共用的底面的情况进行了说明。但是，该方式是一个例子。但是，在能够使细胞培养基片1的制造工序容易化、且使细胞培养基片1的尺寸极其小型化这一点上，优选连通部11与各开口部(21、22)的底面被共用。

〈4〉在参照图2所述的实施方式中，对以包围第一开口部21的端部21a的周围的方式设有疏水部31的情况进行了说明。但是，疏水部31不一定需要形成为完全包围第一开口部21的端部21a的周围，例如，如图11所示，也可以在第一开口部21的端部21a的外周部的区域的一部分形成有非疏水部31a。特别是，在上述的工序(b)中，在对形成疏水部31的部位以外实施了掩模的状态下，通过喷射蒸镀疏水性材料而形成疏水部31的情况下，在第一基板2a的第一面3上的与用于保持掩模的桥接部对置的位置形成非疏水部31a。

此时，疏水部31优选设于从第一开口部21的外缘21c到离开相当于第一开口部21的半径r21的长度的位置为止的区域(即由外缘21c与虚拟圆21d夹住的区域)所构成的面积的70％以上的区域。而且，疏水部31更优选以包含第一开口部21的外缘21c的70％以上的区域的方式设置。对于设于第二开口部22侧的疏水部32也相同。

另外，在图11中，对非疏水部31a在第一开口部21的外侧分散形成有多处的情况进行了图示，但也可以设于一处。形成非疏水部31a的数量、形状是任意的。

另外，疏水部31从第一开口部21的端部21a的外周起的宽度，也可以不一定均匀。在形成有非疏水部31a的情况下也相同。

〈5〉在上述实施方式中，对一对开口部(21、22)与构成培养室的连通部11连通而成的细胞培养基片1进行了说明。但是，在本发明的细胞培养基片1中，与连通部11连通的开口部(21、22)的数量未被限定。

图12A及图12B是仿照图2从第一基板2a侧观察其他实施方式的细胞培养基片1时的示意性的俯视图。图12A所示的细胞培养基片1具备两个第一开口部21和一个第二开口部22，各开口部(21、22)由连通部11连通。另外，图12B所示的细胞培养基片1具备一个第一开口部21和三个第二开口部22，以将第一开口部21与每一个第二开口部22连通的方式设有三个连通部11。

而且，在图12A及图12B的任一个细胞培养基片1中，在开口部(21、22)的附近均形成有疏水部(31、32)。另外，如上述那样，可以仅在第一开口部21与第二开口部22中的任一方的附近形成有疏水部(31、32)，在存在多个第一开口部21、第二开口部22的情况下，也可以仅在一个以上的开口部(21、22)的附近形成有疏水部(31、32)。

附图标记说明

1：细胞培养基片

2：板材

2a：第一基板

2b：第二基板

3：第一面

11：连通部(培养室)

21：第一开口部

21a、21b：第一开口部的端部

21c：第一开口部的外缘

21d：虚拟圆

22：第二开口部

22a、22b：第二开口部的端部

31：疏水部

31a：非疏水部

32：疏水部

41：细胞

42：培养液

42a：培养液的水滴部分

51、52：模具

100：不具有疏水部的细胞培养基片

111、112：细胞培养基片100所具备的开口部

Claims (6)

1.一种细胞培养基片，其特征在于，具备：

板材，具有第一面；

第一开口部，形成于所述板材的内部，一方的端部在所述第一面上露出而成；

第二开口部，形成于所述板材的内部且与所述第一开口部不同的位置，一方的端部在所述第一面上露出而成；

中空状的连通部，将所述第一开口部的另一方的端部与所述第二开口部的另一方的端部连通，

在所述板材的所述第一面上的至少所述第一开口部或所述第二开口部的附近具有疏水部，该疏水部被实施了疏水处理。

2.如权利要求1所述的细胞培养基片，其特征在于，

所述疏水部包含含有氟系聚合物的材料。

3.如权利要求1或2所述的细胞培养基片，其特征在于，

从所述第一开口部的所述一方的端部经由所述连通部到达所述第二开口部的所述一方的端部的空间的容积为100μL以下。

4.如权利要求3所述的细胞培养基片，其特征在于，

形成于所述第一面上的、所述第一开口部的所述一方的端部和所述第二开口部的所述一方的端部的内径均为5mm以下。

5.如权利要求3或4所述的细胞培养基片，其特征在于，

形成于所述第一面上的、所述第一开口部的所述一方的端部与所述第二开口部的所述一方的端部的分离距离为20mm以下。

6.一种细胞培养基片的制造方法，其是权利要求1所述的细胞培养基片的制造方法，其特征在于，具有：

工序(a)，制作第一基板和平板状的第二基板，该第一基板具有从一方的面朝向另一方的面贯通的至少两处贯通孔、以及将所述贯通孔彼此连通的孔部；

工序(b)，对所述第一基板的所述一方的面中的至少露出有一处所述贯通孔的区域的附近实施疏水处理；以及

工序(c)，使所述第一基板的所述另一方的面与所述第二基板贴合而制作所述板材。

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