CN107532131B - 细胞培养装置及细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞培养装置，其具备：连结培养容器，所述连结培养容器具有保持被接种的细胞的细胞保持部、分别具有所述细胞保持部且贮存有液体培养基并沿着第一方向并列配置的m个培养室、以及使所述m个培养室间相互连通的1个以上的连接用流路，由所述m个培养室和所述连接用流路构成单元，将n个所述单元沿着与所述第一方向不同的方向即第二方向并列配置；以及，多个气压管，所述多个气压管在所述连结培养容器中使沿着所述第二方向配置于同列的同列配置培养室之间连通，可对所述同列配置培养室间同时进行加压或同时释放至大气压，利用所述m个培养室内的压力差，可通过所述连接用流路在所述m个培养室之间输送所述液体培养基，所述m是2以上的整数，所述n是2以上的整数。

Description

细胞培养装置及细胞培养方法
技术领域
本发明涉及医药品、化学制品的分析技术，涉及用于使用培养细胞分析医药品、化学制品的药效、毒性、及吸收、分布、代谢、排泄这些体内动态的细胞培养装置及细胞培养方法。
本申请基于2015年4月3日向日本提出的日本特愿2015-077196号主张优先权，在此引用其内容。
背景技术
近年的医药品开发成本显著增加，根据Pammolli等在2011年发表的非专利文献1，指出很大的原因之一是医药品候选化合物在第二相及第三相临床试验中漏失的概率大幅上升。关于开发成功率降低的原因是什么，存在争论，但为了防止在前临床试验中有希望的候选化合物在临床试验中漏失，重要的是在前临床试验的阶段获得与临床试验的相关性好的数据。
前临床试验中，在药效/药物动态/毒性的评价中大多利用使用了培养细胞的试验。在使用了培养细胞的试验中，培养环境和生物体内的环境大不相同被视为与临床试验的相关性差的原因。另外，通过一种培养细胞即使评价药效/药物动态/毒性，也难以评价生物体内涉及到多个脏器的现象，认为这是使用了培养细胞的试验与临床试验的相关性差的一个原因。动物试验中，因种类不同引起的生物功能的差异被视为与试验结果的相关性差的重要原因。
Body-on-a-chip系统是通过使用培养细胞作为脏器模型，且连结多个脏器模型进行培养，从而在生物体外再构成涉及多个脏器的生物体内的现象的方法。Body-on-a-chip系统隐藏着作为能够通过in vitro(体外)实施需要进行通常动物实验的药物动力学分析的动物实验替代方法的可能性，近年急速地引起了关注(参照非专利文献2、3)。特别是期待只要能够利用来自人的培养细胞通过in vitro评价药物动力学分析，就能够取得与临床试验的相关性好的数据。
然而，这些研究大多停留在使用2、3种脏器模型评价易进行验证的模型化合物的原理验证研究时(参照非专利文献4～6)，Body-on-a-chip系统和动物实验/临床试验的相关性的评价尚未确定。为了使该vivo/vitro(体内/体外)相关性变得明确，需要使用各种脏器模型、模型化合物验证Body-on-a-chip系统的有效性。此外，为了将Body-on-a-chip系统作为动物实验替代方法用于创药，还需要同时评价多种化合物的高通量筛选，但该点在上述原理验证研究中未解决。
本发明人等已经在以往的研究中开发能简便处理大量的药剂溶液的“压力驱动型的灌注培养微室列阵”(参照非专利文献7、8)，然后开发具备使用简便的平台的循环培养系统，实施用于实用化的用户评价(参照非专利文献9、专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2015-73468号公报
非专利文献
非专利文献1：F.Pammolli,et al.,Nat.Rev.Drug Discov,10,428(2011)
非专利文献2：S.N.Bhatia and D.E.Ingber,Nat.Biotechnol.,32,760(2014)
非专利文献3：C.Y.Chan,et al.,Lab Chip,13,4697(2013)
非专利文献4：J.H.Sung,et al.,Lab Chip,10,446(2010)
非专利文献5：I.Wagner,et al.,Lab Chip,13,3538(2013)
非专利文献6：J.H.Sung,et al.,Lab Chip,13,1201(2013)
非专利文献7：S.Sugiura,et al.,Anal.Chem.,82,8278(2010)
非专利文献8：S.Sugiura,et al.,Biotechnol.Bioeng.,100,1156(2008)
非专利文献9：K.Hattori,et al.,J.Biosci.Bioeng.,118,327(2014)
非专利文献10：C.Zhang,et al.,Lab Chip,9,3185(2009)
发明内容
发明要解决的技术问题
为了将Body-on-a-chip系统作为动物实验替代方法用于创药，需要同时评价多种化合物的高通量筛选，但该点目前不能实现。
因此，本发明要解决的技术问题在于，以涉及本发明人等已经积累的“压力驱动型灌注培养微室列阵”的见解为基础，开发了使其进一步发展而可实现同时评价多种化合物的高通量筛选的“压力驱动型Body-on-a-chip系统”，可进行使用了各种脏器连结模型和模型化合物的评价。
解决问题的方法
为了解决上述技术问题，本发明的一方式的细胞培养装置是利用微流路连结培养室，连接向各培养室分配压力的压力配管线，通过压力驱动同时输送多个培养室内的液体培养基，由此可同时评价多种化合物。
本发明的第一方式的细胞培养装置具备：
连结培养容器，上述连结培养容器具有保持被接种的细胞的细胞保持部、分别具有上述细胞保持部且贮存有液体培养基并沿着第一方向并列配置的m个培养室、以及使上述m个培养室间相互连通的1个以上的连接用流路，由上述m个培养室和上述连接用流路构成单元，将n个上述单元沿着与上述第一方向不同的方向即第二方向并列配置；以及，
多个气压管，上述多个气压管在上述连结培养容器中使沿着上述第二方向配置于同列的同列配置培养室之间连通，可对上述同列配置培养室间同时进行加压或同时释放至大气压，利用上述m个培养室内的压力差，可通过上述连接用流路在上述m个培养室之间输送上述液体培养基，
上述m是2以上的整数，上述n是2以上的整数。
可以在上述连接用流路的末端或内部具备能够对从上述连接用流路向上述m个培养室流动的方向进行控制的防逆流机构。
就上述m个培养室而言，上述m个培养室均可以具有贮存液体培养基的容器状的槽主体、和开闭自如且气密地对上述槽主体的开口进行封闭的盖部。
可以进一步具备能够保持将上述盖部向上述槽主体按压的盖部按压部，上述盖部按压部具有支撑上述槽主体的基体部、和向上述基体部所支撑的上述槽主体按压上述盖部的按压部件。
上述槽主体可以具有壁部、和具备连接用流路的底部板。
可以进一步具备壁部按压部，上述壁部按压部向上述底部板按压上述壁部从而保持上述壁部，上述壁部按压部具有上述基体部和按压部件，上述按压部件向上述基体部所支撑的上述底部板按压上述壁部。
可以具备加压装置，上述加压装置可以通过上述气压管，根据预设程序对上述各培养室依次加压或释放至大气压。
可以在从上述培养室连接到上述连接用流路的部位具备能够通过表面张力防止空气流入的拉普拉斯阀。
构成上述拉普拉斯阀的微流路的宽度是wL，上述微流路的深度是hL，上述表面张力是γ，上述拉普拉斯阀的拉普拉斯压力是ΔPLap时，
上述拉普拉斯压力由式ΔPLap＝2γ(1/wL+1/hL)表示，
可以以使上述拉普拉斯压力ΔPLap大于施加在上述连结培养容器的压力的方式构成上述微流路。
可以在上述连接用流路的一部分具备阻力流路部位用以调节流量，上述阻力流路部位的流路截面积为上述连接用流路的流路截面积的1/10以下。
上述防逆流机构可以是止回阀。
上述防逆流机构可以是防逆流拉普拉斯阀。
本发明的第二方式的细胞培养方法，其中，
准备细胞培养装置，在m及n是2以上的整数时，上述细胞培养装置具备n单元的1单元连结培养容器，上述1单元连结培养容器中，利用1个以上的连接用流路使m个培养室相互连通，且上述m个培养室均沿着第一方向并列配置，上述n单元的上述连结培养容器沿着与上述第一方向不同的方向即第二方向并列配置，
上述细胞培养方法包括：
第一工序，打开上述连结培养容器的盖，接种细胞并使细胞粘接在上述细胞培养装置的各培养室内；
第二工序，在上述细胞培养装置中，在沿着上述第二方向同列配置的上述第一方向上的第一列培养室中装满液体培养基，关闭上述盖；
第三工序，对上述第一列培养室内进行加压，将沿着上述第二方向同列配置的上述第一方向上的第二列培养室内释放至大气压，由此将上述液体培养基通过上述连接用流路从上述第一列培养室输送至上述第二列培养室；
第四工序，使上述第一方向上的列的序号依次逐个增加1个并对其进行加压和释放至大气压，由此使上述液体培养基通过上述连接用流路，从上述第一方向上的第m-1列培养室输送至第m号培养室；
第五工序，对上述第m列位置的培养室内进行加压，并将上述第一列培养室内释放至大气压，由此将上述液体培养基通过上述连接用流路从上述第m列位置的培养室输送至上述第一列位置的培养室；以及，
第六工序，重复上述第三工序～上述第五工序，由此使上述液体培养基在上述细胞培养装置的上述各培养室内循环。
本发明的第三方式的评价系统，其在上述方式的细胞培养装置中导入细胞。
本发明的其它方式是一种细胞培养装置，其设置有用于贮存液体培养基的m个培养室、和用于保持在各培养室中接种的细胞的细胞保持部，将上述m个培养室利用一个或多个连接用流路相互连通而构成1单元的连结培养容器，进一步具备n单元的该连结培养容器，其中，m及n是2以上的整数，通过设置连通各单元的连结培养容器的同位置的培养室的气压管，并使用该气压管加压或释放至大气压，从而对各单元的连结培养容器的同位置的培养室同时施加压力或同时释放至大气压，利用培养室内的压力差通过上述连接用流路进行液体培养基的输送。
另外，本发明的其它方式的特征在于，在上述细胞培养装置中，在上述连接用流路的末端或内部具备控制从上述连接用流路向上述培养室的流动方向的止回阀。
另外，本发明的其它方式的特征在于，在上述细胞培养装置中，上述培养室具有贮存液体培养基的容器状的槽主体、开闭自如且气密地封闭上述槽主体的开口的盖部。
另外，本发明的其它方式的特征在于，在上述细胞培养装置中，进一步具备将上述盖部向上述槽主体按压并保持的盖部按压部，上述盖部按压部具有支撑上述槽主体的基体部、向支撑于基体部的上述槽主体按压上述盖部的按压部件。
另外，本发明的其它方式的特征在于，在上述细胞培养装置中，上述槽主体具有壁部、具备连接用流路的底部板。
另外，本发明的其它方式的特征在于，在上述细胞培养装置中，进一步具备将上述壁部向上述底部板按压并保持的壁部按压部，上述壁部按压部具有上述基体部和向支撑于上述基体部的上述底部板按压上述壁部的按压部件。
另外，本发明的其它方式的特征在于，在上述细胞培养装置中，具备根据预设程序通过上述气压管对上述各培养室依次加压或释放至大气压的加压装置。
另外，本发明的其它方式的特征在于，在上述细胞培养装置中，在从上述培养室连接到上述连接用流路的部位具备通过表面张力防止空气流入的拉普拉斯阀。
另外，本发明的其它方式的特征在于，在上述细胞培养装置中，为了调节流量而在上述连接用流路的一部分具备流路截面积为1/10以下的阻力流路部位。
另外，本发明的其它方式是一种细胞培养方法，其使用具备m个培养室、以及n单元的连结培养容器的细胞培养装置，利用1个或多个连接用流路相互连通上述m个培养室构成1单元的上述连结培养容器，其中，m及n为2以上的整数，该细胞培养方法包括：
工序1，其打开上述连结培养容器的盖，在各单元的连结培养容器的各培养室内接种细胞使其粘接；
工序2，其在各单元的第一号位置的培养室装满液体培养基，关闭上述盖；
工序3，其将各单元的第一号位置的培养室内加压，且将第二号位置的培养室内释放至大气压，从而将上述液体培养基通过上述连接用流路从第一号位置的培养室输送至第二号位置的培养室；
工序4，其为从上述工序3至以下操作：通过使培养室的位置号数依次逐个增加1个并对其进行加压和释放至大气压，从而将上述液体培养基通过上述连接用流路从第m-1号位置的培养室输送至第m号位置的培养室；
工序5，其通过将各单元的第m号位置的培养室内加压，且将第一号位置的培养室内释放至大气压，从而将上述液体培养基通过上述连接用流路从第m号位置的培养室输送至第一号位置的培养室；
工序6，其通过重复上述工序3～工序5使液体培养基在各单元的m个培养室内循环。
发明的效果
例如，在上述非专利文献3～5中，分别采用使容器倾斜而利用重力的方法、使用内置蠕动泵的装置、外部的注射泵送液的方法，在这些方法中，因装置变得复杂，所以难以同时评价多个化合物。另外，在上述非专利文献3、5中只能评价一种化合物，在非专利文献4中只可评价两种化合物。
然而，本发明人等以先前申请的专利文献1的压力驱动型的灌注培养系统为基础，在使其进一步发展的本发明的Body-on-a-chip系统中利用多个脏器的连结模型能够评价多个药剂的效果。
附图说明
图1A是本发明的第一实施方式的压力驱动型细胞培养装置的一个制作例。
图1B是本发明的第一实施方式的压力驱动型细胞培养装置的一个制作例的2连培养室(Body-on-a-Chip单元)的放大图。
图2A是本发明的第一实施方式的压力驱动型细胞培养装置的一个实例的整体结构图。
图2B是本发明的第一实施方式的压力驱动型细胞培养装置的一个实例的整体结构图(培养装置组装后的立体图)。
图2C是表示在本发明的第一实施方式的压力驱动型细胞培养装置中，支架中收纳了微流路板(底部板)的状态的立体图。
图3是图2A所示的压力驱动型细胞培养装置的微流路板的流路结构图(俯视图)，是2连培养室型的8单元系统用(2脏器×8连板)的实例。
图4是图3的1单元的流路结构图。
图5是图2A所示的压力驱动型细胞培养装置的微流路板的流路结构图，是4连培养室型的4单元系统用(4脏器×4连板)的实例。
图6是图5的1单元的流路结构图。
图7表示利用肝脏或癌的细胞作为脏器模型且将2连培养室型的多单元系统作为2脏器连结模型使用的实例。
图8表示导入肺、肝脏、肾脏、脂肪的细胞，将4连培养室型的多单元系统作为4脏器连结模型使用的实例。
图9A是说明2连培养室类多单元系统的动作原理和2连培养室类多单元系统的使用方法的图。
图9B是说明图9A所示的2连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图9C是说明图9A所示的2连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图9D是说明图9A所示的2连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图9E是说明图9A所示的2连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图10A是说明4连培养室类多单元系统的动作原理和4连培养室类多单元系统的使用方法的图。
图10B是说明图10A所示的4连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图10C是说明图10A所示的4连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图10D是说明图10A所示的4连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图10E是说明图10A所示的4连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图10F是说明图10A所示的4连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图10G是说明图10A所示的4连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图11A是说明拉普拉斯阀的图。
图11B是说明拉普拉斯阀的图。
图11C是说明拉普拉斯阀的图。
图12A是表示本发明第一实施方式的压力驱动型细胞培养装置的一个实例的组装前的正面剖面图和组装后的正面剖面图的图。
图12B是表示本发明第一实施方式的压力驱动型细胞培养装置的一个实例的组装前的侧面剖面图和组装后的侧面剖面图的图。
图12C是表示本发明第一实施方式的压力驱动型细胞培养装置的一个实例的俯视图的图。
图13A是说明本发明的第二实施方式的细胞培养装置的2连培养室类多单元系统的动作原理和2连培养室类多单元系统的使用方法的图。
图13B是说明图13A所示的本发明的第二实施方式的细胞培养装置的2连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图13C是说明图13A所示的本发明的第二实施方式的细胞培养装置的2连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图13D是说明图13A所示的本发明的第二实施方式的细胞培养装置的2连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图13E是说明图13A所示的本发明的第二实施方式的细胞培养装置的2连培养室类多单元系统的动作原理和使用方法的图。
图13F是说明本发明的第二实施方式的细胞培养装置的4连培养室类多单元系统的结构的图。
图14是说明本发明的第三实施方式的细胞培养装置的4连培养室类多单元系统的动作原理和4连培养室类多单元系统的使用方法的图。
图15是说明本发明的第三实施方式的细胞培养装置的4连培养室类多单元系统的动作原理和4连培养室类多单元系统的使用方法的图。
图16A是实施例的肝癌细胞HepG2(肝脏模型)及大肠癌细胞HCT116(大肠癌细胞)的培养板内的配置图。
图16B是表示实施例的肝癌细胞HepG2(肝脏模型)及大肠癌细胞HCT116(大肠癌细胞)的培养程序的图。
图17A是刚要开始实施例的循环培养前(第1天)的HepG2细胞的照片。
图17B是刚要开始实施例的循环培养前(第1天)的HCT116细胞的照片。
图17C是进行48小时实施例的循环培养后的HepG2细胞的照片。
图17D是进行48小时实施例的循环培养后的HCT116细胞的照片。
标记说明
1、101 细胞培养装置(Body-on-a-Chip单元)
1A、101A 主体(槽主体)
2、2A、2A1～2A4、2B、2B1～2B4、2C1～2C4、2D1～2D4、102A～102D、302A1、302A2、402A～402D、1302A1～1302A4 培养室(脏器模型培养室)
3A、303A 2连培养室(2脏器连结模型、2连培养室型PDMS板)
3B、303B、403 4连培养室(4脏器连结模型、4连培养室型PDMS板)
4、15、15A、15B、115、115A～115D、315A、315B、415 连接流路(微流路、脏器连结微流路)
5、5A～5D 气压管(加压线、压力配管线)
6 盖(加压盖)
7 贯通孔板
7A 壁面(壁部、培养室的壁面、贯通孔板及室的内壁)
8 微流路板
8A 2脏器×8连板(2连培养室型的8单元系统、底部板)
8B 4脏器×4连板(4连培养室型的4单元系统、底部板)
9 支架(基体部)
11、11A、11B、111A～111D 止回阀(单向阀)
12、12A、12B、112 上游口
13、13A、13B、113、113A～113D、313A、313B、413A～413D、1313A～1313D 凹部
14、14A、14B、114、114A～114D 下游口
16、16A、16B、116 阻力流路
17、17A、17B、317、317A、317B、417、417A～417D、1317A～1317D 拉普拉斯阀
19A 肝脏
19B 癌
19C 肺
19D 肾脏
19E 脂肪
20 第一止动件(盖部按压部、按压部件)
20A 第二止动件(壁部按压部、按压部件)
21 密封材料
22A、22B、122A～122D 空气过滤器
135、135A～135D 过滤器(加压装置)
201A1 细胞培养装置的正面剖面图(组装前)
201B1 细胞培养装置的侧面剖面图(组装前)
201A2 细胞培养装置的正面剖面图(组装后)
201B2 细胞培养装置的侧面剖面图(组装后)
201C 细胞培养装置的俯视图
311A、311B、1311A～1311D 流路导入口
330A、330B、1330A～1330D 间隔部
331A、331B、431 培养基
331C 混合培养基
350A1、350B1、1350A1～1350D1 CV部(设置有流路导入口的部位)
350A2、350B2、1350A2～1350D2 LV部(设置有拉普拉斯阀及凹部的部位)
419 细胞
具体实施方式
以图1A及图1B所示的利用2种脏器的连结模型评价8种化合物的系统为例，说明本发明第一实施方式的细胞培养装置(Body on-a-Chip单元)1。图1A及图1B的实例中，将图1B所示的连结两个成为脏器模型的培养室2的2连培养室(2脏器连结模型)3A作为1单元，由共8单元构成。构成1单元的培养室2彼此由微流路4连接。通过与图1A的右侧连接的气压管(加压线)5依次加压，从而能够使培养液在各脏器模型培养室2间循环。
图2A是更详细地表示图1A及图1B的系统的本实施方式的细胞培养装置1的整体结构图，由盖(加压盖)6/贯通孔板7/微流路板8/支架(基体部)9四个零件构成。其是通过根据脏器数量、培养基流量等的设计而设计微流路板(底部板)8，从而能够适用于各种脏器连结模型的结构。图2A的实例也能够使用搭载8单元2脏器连结模型3A的微流路板8A，也能够使用搭载4单元4脏器连结模型3B的微流路板8B。本实施方式的细胞培养装置1是仅更换微流路板8就能与各种脏器连结模型对应的结构。
图2A的系统通过将盖6、贯通孔板7、微流路板8、支架(基体部)9各零件重合在一起而构成系统。各零件的详细内容后述。盖6与在侧面加工的孔(图2中未图示，参照图12A～C的气压管5、5A～5D的导入孔)连接，起到将从气压管5导入的压力分配到各培养室2的作用。贯通孔板7构成培养室2的壁面(壁部)7。
支架9固定盖6、贯通孔板7、及微流路板8。这时，通过在盖6和贯通孔板7之间配置有机硅树脂片、O型环等具有柔性的零件(密封剂21)，可防止来自盖6与贯通孔板7的间隙的压力泄漏。另外，微流路板8同样通过使用有机硅树脂制等具有柔性的零件，可防止来自微流路板8与贯通孔板7之间及微流路板8与支架9之间的压力泄漏及漏液。另外，为了使培养液循环，也可以在贯通孔板7设置止回阀11。2脏器连结模型3A中，止回阀11的设置不是必需的。
此外，图2A表示分别形成贯通孔板7、微流路板8、及支架9的实例。
如图2A、及后面示出的图12A～图12C所示，可以分别形成贯通孔板7、微流路板8、及支架9，如后面示出的图9A～图9E及图10A～图10G所示，也可以将贯通孔板7、微流路板8、及支架9一体形成。
此外，在图9A～图9E中，将一体形成贯通孔板7、微流路板8、及支架9的部件作为主体(槽主体)1A表示，在图10A～图10G中，将一体形成贯通孔板7、微流路板8、及支架9的部件作为主体(槽主体)101A表示。
图2B是组装了图2A中所示的盖6、贯通孔板7、微流路板8、及支架9的状态下的培养装置的组装后的立体图。
图2C是表示在支架9中收纳了微流路板8A的状态的一个实例的立体图。
如图2C所示，例如，将微流路板8A收纳于支架9，进而在收纳于支架9的微流路板8A上放置贯通孔板7。如图2B所示，可以在贯通孔板7上安装盖6，利用第一止动件20固定盖6。这时，通过第一止动件(盖部按压部、按压部件)20，能够保持将盖6向槽主体1A按压。
另外，如图2B所示，通过第二止动件(壁部按压部、按压部件)20A，能够将贯通孔板7向微流路板(底部板)8按压并保持。
图3是2连培养室3A型8单元系统中的微流路板(2脏器×8连板)8A的流路结构图(俯视图)，图4是详细说明2脏器×8连板8A中的1单元的流路结构(2连培养室)3A的图。
图4的虚线表示各培养室2的内壁7A，第一培养室2A及第二培养室2B分别具备上游口12、凹部13、下游口14。第一培养室2A的第一下游口14A和第二培养室2B的上游口12B由第一连接流路15A连结。第二培养室2B的第二下游口14B和第一培养室2A的上游口12A由第二连接流路15B连结。在各连接流路15(15A、15B)的中途设置有用于调整流量的阻力流路16(16A、16B)，阻力流路16的截面积优选为连接流路15的截面积的1/10以下，阻力流路16的截面积与连接流路15的截面积比较明显小。因此，在连接流路15流动的液体的液体体积根据阻力流路16的截面积及长度和从气压管5导入的压力，能够简便计算。各培养室2(2A、2B)的凹部13(13A、13B)是由凹部构成的细胞保持部，细胞保持部只要能够保持细胞，就不限定于凹部，也可以是保持片、凝胶等。
另外，优选在各培养室2(2A、2B)的上游口12(12A、12B)设置有止回阀11，在下游口14(14A、14B)设置有拉普拉斯阀17(参照后述的“拉普拉斯阀的说明”的项目及“关于拉普拉斯阀的设计”的项目)。图4中，凹部13(13A、13B)形成为直径6mm×深度2mm，连接流路15(15A、15B)形成为宽度1mm×深度0.5mm，阻力流路16(16A、16B)为宽度0.2mm×深度0.1mm，拉普拉斯阀17(17A、17B)由36条宽度0.1mm×深度0.016mm的微流路构成(该数值例示图1A及图1B的制作例的数值，不限定于此)。
图5是4连培养室型的4单元系统中的微流路板8B的流路结构图。图6是详细说明图5的微流路板8B中1单元(4连培养室)3B的流路结构的图。图6中，与图4同样，凹部113(113A、113B、113C、113D)为直径6mm×深度2mm，连接流路115(115A、115B、115C、115D)为宽度1mm×深度0.5mm，阻力流路116(116A、116B、116C、116D)为宽度0.2mm×深度0.1mm，拉普拉斯阀117(117A、117B、117C、117D)由36条宽度0.1mm×深度0.016mm的微流路构成(该数值例示图1A及图1B的制作例的数值，不限定于此)。第一～第四培养室102A、102B、102C、102D分别具备第一～第四上游口112(112A、112B、112C、112D)、第一～第四凹部113(113A、113B、113C、113D)、第一～第四下游口114(114A、114B、114C、114D)。上游侧的培养室(第一培养室)102A的下游口(第一下游口)114A和下游侧的培养室(第二培养室)102B的上游口(第二上游口)112B由连接流路(第一连接流路)115A连接。最下游侧的培养室(第四培养室)102D的下游口(第四下游口)114D和最上游侧的培养室(第一培养室)102A的上游口(第一上游口)112A由连接流路(第四连接流路)115D连接。此外，根据脏器模型，同样能够从中途的培养室(例如，第二培养室102B、第三培养室102C)的下游口(第二下游口114B、第三下游口114C)使连接流路分支，与上游侧的培养室的上游口连接。
在各培养室102A、102B、102C、102D的凹部113(1113A、113B、113C、113D)能够搭载各种培养细胞作为脏器模型。
图7是利用肝脏19A、癌19B的细胞作为脏器模型，将2连培养室型的8单元系统8A作为2脏器连结模型3A使用的实例。
图8是导入肺19C、肝脏19A、肾脏19D、脂肪19E的细胞，将4连培养室型的4单元系统8B作为4脏器连结模型3B使用的实例。
(2连培养室3A类多单元系统的动作原理)
图9A～图9E是用于说明2连培养室3A类多单元系统的动作原理的图。
微流路板使用图3所示的2连培养室3A型的8单元系统(2脏器×8连板)的微流路板8A。
在图9A所示的结构中，从下重叠支架9、微流路板8A、贯通孔板7及盖6，通过止动件(盖部按压部、壁部按压部)20、20A固定，形成2脏器连结培养用的培养容器(培养装置)1。
此外，在图9A所示的结构中，表示将支架9、微流路板8A、贯通孔板7一体形成的部件的一个实例，该部件称为主体(槽主体)1A。图9A所示的例是设置止回阀11A、11B并能够使培养液循环的结构。
另外，在图9A所示的一体形成型的构成中，主体(槽主体)1A上设置有第一止动件20(参照图2A、图2B、图2C、及图12A～图12C，图9A～图9E中未图示)作为盖6的按压部(盖部按压部)即可。通过卸下第一止动件20，盖6可开闭或可装卸。
此外，如图2A、图2B、图2C、及图12A～图12C所示，在独立地设置支架9、微流路板8A、贯通孔板7的情况(不是一体形成型的情况)下，就支架9上的止动件而言，设置两组止动件即第一止动件(盖部按压部)20和第二止动件(壁部按压部)20A，在通过第二止动件20A固定微流路板8A和贯通孔板7的状态(主体(槽主体)1A)下，可以仅开闭盖6。
关闭盖6时，通过O型环等密封材料21确保盖和主体1A之间的气密性。此外，以下的工序在整个单元同时进行相同的工序。
以下，使用图9B～图9E说明培养基循环的工序。此外，图9B～9E是与图9A的2连培养室3A的结构对应的图，是说明培养基的流动的图。
(1)第一工序(参照图9B)
打开培养容器1的盖6，通过贯通孔板7在形成于微流路板8A上的第一凹部13A及第二凹部13B内接种细胞19使其粘接。
(2)第二工序(参照图9C)
在第一培养室2A装满培养基31，关闭培养板的盖6。
(3)第三工序(参照图9D)
将第一培养室2A内通过第一空气过滤器22A加压，将第二培养室2B内通过第二空气过滤器22B释放至大气压。第一止回阀(单向阀1)11A为闭塞状态，第二止回阀(单向阀2)11B为释放状态，因此，培养基从第一下游口14A通过第一连接流路15A输送至第二培养室2B。第一凹部13A处于比第一下游口14A低的位置，因此，即使在将第一培养室2A内持续加压的情况下，第一凹部13A内的培养基也不会枯竭而残留。这样，因包含凹部的细胞保持部设置于培养室内，所以培养基不枯竭，细胞不死亡。
另外，在离下游口14A近的位置设置有拉普拉斯阀17(17A)，因此，利用后述的“拉普拉斯阀”的功能，即使在输送培养基后将第一培养室2A内加压，空气也不会流入第一连接流路15A。此外，输送液体流量通过设置于压力及微流路板8A上的第一连接流路15A的中途的阻力流路16A的阻力调整。
(4)第四工序(参照图9E)
将第二培养室2B内加压，将第一培养室2A内释放至大气压。通过与第三工序同样的过程，第二培养室2B内的培养基被输送至第一培养室2A。
(5)培养基循环
通过重复第三工序和第四工序，使培养基在两个培养室内(在第一培养室和第二培养室之间)循环。
(4连培养室3B类多单元系统的动作原理)
图10A～图10G是用于说明4连培养室3B类多单元系统的动作原理的图。
微流路板使用图5所示的4连培养室3B型的4单元系统(4脏器×4连板)的微流路板8B。在图10A的结构中，从下重叠支架9、微流路板8、贯通孔板7及盖6，用止动件(盖部按压部、壁部按压部)20、20A(参照图2A、图2B、图2C、及图12A～图12C)固定，形成4脏器连结培养用的培养容器101。
此外，在图10A所示的结构中，表示支架9、微流路板8B、贯通孔板7一体形成的部件的一个实例，将该部件称为主体(槽主体)101A。在图10A所示的实例是设置第一～第四止回阀111A、111B、111C、111D并能够使培养液循环的结构。
另外，在如图10A所示的一体形成型的结构中，在主体(槽主体)101A上设置有第一止动件20(参照图2A、图2B、图2C、及图12A～图12C，图10A～图10G中未图示)作为盖6的按压部(盖部按压部)即可。通过卸下第一止动件20，盖6可开闭或可装卸。
此外，如图2A、图2B、图2C、及图12A～图12C所示，在分别设置支架9、微流路板8A、贯通孔板7的情况(不是一体形成型的情况)下，在支架9上设置两组第一止动件(盖部按压部)20和第二止动件(壁部按压部)，在通过第二止动件20A固定微流路板8B和贯通孔板7的状态(以下称为主体(槽主体)101A)下，通过卸下第一止动件20，可以仅开闭盖6。关闭盖6时，通过O型环等密封材料21确保盖6和主体101A之间的气密性。另外，像与图6对应的那样，在图12A～图12C的4连培养室中设置有第一～第四上游口112A～112D及第一～第四拉普拉斯阀117A～117D。此外，以下的工序在整个单元同时进行相同的工序。
以下，使用图10B～图10G说明培养基循环的工序。此外，图10B～10E是与图10A的4连培养室3B的结构对应的图，是说明培养基的流动的图。
(1)第一工序(参照图10B)
打开培养容器101的盖6，在第一凹部113A、第二凹部113B、第三凹部113C、第四凹部113D内接种细胞19使其粘接。
(2)第二工序(参照图10C)
在第一培养室102A装满培养基31，关闭培养容器(板)101的盖6。
(3)第三工序(参照图10D)
将第一培养室102A内通过第一空气过滤器122A加压，将第二培养室102B内通过第二空气过滤器122B释放至大气压。第一止回阀(单向阀1)111A成为闭塞状态，第二止回阀(单向阀2)111B成为释放状态，因此，培养基31从第一下游口114A通过第一连接流路114A输送到第二培养室102B。第一凹部113A处于比第一下游口114A低的位置，因此，即使在将第一培养室102A内持续加压的情况下，第一凹部113A内的培养基也不枯竭而残留。这样，通过将包含凹部的细胞保持部设置于培养室内，培养基不枯竭，细胞不死亡。
另外，在靠近第一下游口114A的位置设置有拉普拉斯阀117(第一拉普拉斯阀117A)，因此，利用后述的“拉普拉斯阀”的功能，即使输送培养基后将第一培养室102A内加压，空气也不会流入第一连接流路115A。此外，输送液体流量根据设置于压力及连接流路115A的中途的第一阻力流路116A的阻力调整。
(4)第四工序(参照图10E)
将第二培养室102B内通过第二空气过滤器122B加压，将第三培养室102C内通过第三空气过滤器122C释放至大气压。通过与第三工序同样的过程将第二培养室102B内的培养基输送至第三培养室102C。
(5)第五工序(参照图10F)
将第三培养室102C内通过第三空气过滤器122C加压，将第四培养室102D内通过第四空气过滤器122D释放至大气压。通过与第四工序同样的过程将第三培养室102C内的培养基输送至第四培养室102D。
(6)第六工序(参照图10G)
将第四培养室102D内通过第四空气过滤器122D加压，将第一培养室102A内通过第一空气过滤器122A释放至大气压。通过与第五工序同样的过程将第四培养室102D内的培养基输送至第一培养室102A。
(7)培养基循环
通过重复第三工序～第六工序，使培养基在第一～第四这4个培养室内循环。
(拉普拉斯阀的说明)
使用图11A～图11C说明拉普拉斯阀17的结构和功能。图11A表示设置了拉普拉斯阀17的培养室2的局部放大图。图11B表示培养基31通过拉普拉斯阀17从下游口14流入连接流路15的情况的示意图。图11C表示空气流入下游口14时拉普拉斯阀17发挥功能时的示意图。如图11C所示，在微细的流路内，在培养基31和空气之间产生表面由张力引起的压力差，即拉普拉斯压力。流路的表面被液体培养基浸渍的情况下，在小于拉普拉斯压力的空气压条件下，空气不能流入充满了培养基的微细流路。在这种条件下，微细流路能够作为被动的防空气流入机构使用。在本说明书中，将由该微细流路构成的防空气流入机构称为“拉普拉斯阀”。在图3、4、5、及6图示的微流路板8A、8B中，各培养室2A、2B、102A、102B、102C、102D的下游口14、114和连接流路15、115之间放射状设置有36个“拉普拉斯阀”。
(关于拉普拉斯阀的设计)
以下，对于上述拉普拉斯阀17的设计进行说明。
空气流入拉普拉斯阀的压力(拉普拉斯压力，临界压力)(ΔPLap)能够根据构成表面张力(γ)及拉普拉斯阀的微流路的宽度(wL)及深度(hL)，通过以下的式(1)计算。
ΔPLap＝2γ(1/wL+1/hL) (1)
认为用于驱动本实施方式及以下所示的实施方式的培养装置1的实际压力范围由在市售的压力控制装置中可调整的压力范围及细胞的耐压性决定。
假如将细胞的耐压性作为生物体内的血压的上限左右(30kPa＝225mmHg)，则用于驱动本实施方式及以下所示的实施方式的培养装置1的实际压力范围为1kPa～30kPa左右。培养液的表面张力为60mN/m左右，在构成拉普拉斯阀17的微流路的截面为正方形的情况下，即wL＝hL的情况下，根据上述式(1)推算出在30kPa下流入空气的微流路的尺寸为wL＝hL＝8μm左右，推算出在1kPa下流入空气的微流路的尺寸wL＝hL＝240μm左右。
通过使构成拉普拉斯阀17的微流路的尺寸比上述尺寸(30kPa时wL＝hL＝8μm、1kPa时wL＝hL＝240μm)小，在设想的压力下运用时，能够防止空气流入拉普拉斯阀17。
即，只要以使拉普拉斯阀17用于发挥功能的限界的压力即拉普拉斯压力ΔPLap大于在培养装置1中使用的压力范围的方式形成构成拉普拉斯阀17的微流路，就能够防止空气流入拉普拉斯阀17。
此外，wL和hL的比率不是1：1的情况下，也同样可以基于式(1)设计流路的尺寸。
在以下所示的实施例中，将微流路的宽度及深度设为200μm及25μm，推算拉普拉斯压力为5.4kPa，在该压力以下运用本装置。
(关于阻力流路的设计)
在截面为矩形的微流路流动的液体的流量(Q)和压力损失(ΔP)中，具有以下的关系(参照F.M.White,Viscous Fluid Flow,McGraw-Hill Companies,Inc,Boston,2006)。
[数学式1]
ΔP＝R×Q (2)
[数学式2]
Figure BDA0001423762880000181
在上述式(2)及式(3)中，ΔP是微流路的入口与出口的压力差，R是流路阻力，μ是流体的粘度，l是微流路的长度，w是微流路的宽度，h是微流路的深度。该式(2)及式(3)在w＞h的条件下成立。
例如，为了调节流量，本实施方式及以下所示的实施方式的细胞培养装置也可以在上述连接用流路的一部分具备流路截面积为1/10以下的阻力流路部位。
这时，考虑连接用流路的阻力流路部位、连接用流路的阻力流路以外的部位的长度相等的情况。这时，如果阻力流路的截面积为连接用流路的1/10，则宽度w、深度h为1/100.5，式(3)的阻力流路的流路阻力R为连接用流路的阻力流路以外的部位的流路阻力R的100倍。
根据式(2)，对于压力损失而言，阻力流路的压力损失也为连接用流路的阻力流路以外的部位的压力损失的100倍。这时，推算在整个流路流动的流量时，仅考虑阻力流路的阻力和整个流路的压力，推算流量的情况的推算误差为1/100，这可以说是能够容许的误差。
即，为了调节流量而在连接用流路的一部分设置有流路截面积为1/10以下的阻力流路部位的情况下，只考虑阻力流路的压力损失进行流路设计，因此，具有流路网的设计变得容易这种优点。
图12A～图12C是作为图2及图3中所示的细胞培养装置1中的2连培养室3A型的8单元系统8A的详细细胞培养装置1的组装图。
图12A中，用符号201A1表示细胞培养装置1的正面剖面图(组装前)，图12B中，用符号201B1表示细胞培养装置1的侧面剖面图(组装前)。
另外，在图12A中，用符号201A2表示细胞培养装置1的正面剖面图(组装后)，在图12B中，用符号201B2表示细胞培养装置1的侧面剖面图(组装后)。
另外，图12C中用符号201C表示组装后的细胞培养装置1的俯视图。
在图12C中，对设置于盖6的4根气压管(加压线)5A、5B、5C、5D进行说明，俯视图201C的最上面的气压管(第一气压管)5A与设置于贯通孔板7的排列在最上面的(同列配置)4个培养室(纵向(第一方向)上的第一列培养室组)2A1、2A2、2A3、2A4连通。
成为能够将该4个培养室2A1、2A2、2A3、2A4同时加压或能够将该4个培养室2A1、2A2、2A3、2A4同时释放至大气压的结构。
其它3条气压管(第二～第四气压管)5B、5C、5D也成为与该第一气压管5A同样的结构。
此外，因为是2连培养室3A型，所以横向(第二方向)上的第一列培养室2A1和培养室2B1连通。
同样，横向的第一列上的培养室2C1和2D1连通。
其它培养室也如图12C的俯视图201C所示，具有同样的结构。
此外，图12A～图12C中的符号135(135A～135D)表示与气压管连接的过滤器。
在此，以与气压管连接的过滤器135(135A～135D)的方式表示，但过滤器135也可以是可以根据在各培养室事先设定的程序依次加压或释放至大气压的加压装置。
因此，例如，在“2连培养室3A类多单元系统的动作原理”的项目中所示的2连培养室3A类多单元系统的第三工序中，将从图12C的俯视图201C的上面起第一条气压管(第一气压管)5A及第三条气压管(第三气压管)5C加压，将第二条气压管(第二气压管)5B及第四条气压管(第四气压管)5D释放至大气压即可。另外，在接下来的第四工序，将第一条气压管(第一气压管)5A及第三条气压管(第三气压管)5C释放至大气压，将第二条气压管(第二气压管)5B及第四条气压管(第四气压管)5D加压即可。
此外，在更换微流路板形成4连培养室型的4单元系统8B的情况下的“4连培养室3B类多单元系统的动作原理”中记载的第三工序中，将从上起第一条气压管(第一气压管)5A加压，将第二条气压管(第二气压管)5B释放至大气压即可。
在接下来的第四工序中，将从上起第二条气压管(第二气压管)5B加压，将第三条气压管(第三气压管)5C释放至大气压即可。
在接下来的第五工序中，将从上起第三条气压管(第三气压管)5C加压，将第四条气压管(第四气压管)5D释放至大气压即可。
在接下来的第六工序中，将从上起第四条气压管(第四气压管)5D加压，将第一条气压管(第一气压管)5A释放至大气压即可。
在上述说明中，以2连培养室3A型的8单元系统和4连培养室3B型的4单元系统的兼用型细胞培养装置1进行了说明，但不限于这些上述实例，作为m连培养室型的n单元系统(在此，m及n为2以上的整数)，能够实现细胞培养装置。
即，本实施方式的细胞培养装置能够具有下述结构：例如设置有沿着图12C的纵向(第一方向、2A1、2B1、2C1、2D1)并列配置m个培养室的m连培养室，且沿着与该纵向大致垂直配置的横向(第二方向)并列配置有n单元的m连培养室。
在本实施方式的细胞培养装置中具有下述结构：气压管连通由沿着第二方向同列配置的n个培养室构成的同列配置培养室(例如，图12C的培养室2A1、2A2、2A3、2A4)间，在由n个培养室构成的同列配置培养室间可同时加压或可同时释放至大气压。
因此，本实施方式的细胞培养装置构成为，因气压管的存在，利用m个培养室内的压力差，可通过连接用流路在m个培养室之间输送液体培养基。
如果在每个单元使用不同的医药品等液体培养基，则能够一次分析n种医药品的药效等，如果使用相同的液体培养基，则在相同的条件下能够一次进行n次分析。
另外，用于压力驱动的气体优选以适合细胞培养的二氧化碳及氧的含量进行调整。
在上述实施方式中示出了使用止回阀11的实例，但只要是能够防止培养基等液体的逆流的机构(只要设置有防逆流机构)，则不限定于止回阀。
例如，为了防逆流，通过将想要防逆流侧的培养室加压，也能够防逆流，以代替止回阀11。
另外，也可以使用拉普拉斯阀以代替止回阀11。
以下，基于附图说明本发明的第二实施方式的细胞培养装置。
图13A～13E是说明本实施方式的细胞培养装置的2连培养室类多单元系统的动作原理和2连培养室类多单元系统的使用方法的图。
在本实施方式中，与上述第一实施方式不同的是，使用拉普拉斯阀(逆流防止拉普拉斯阀)317(317A、317B)作为防逆流机构以代替上述第一实施方式的止回阀11这一点，关于防逆流机构以外的对应结构，因与第一实施方式相同，省略其说明。
图13A是连结的2连培养室303A的剖面图。
图13B～13E是与图13A的结构对应的图，是说明培养基的流动的图。
连结的2连培养室303A具有第一培养室302A1和第二培养室302A2。
该第一培养室302A1的底部通过第一间隔部330A划分为设置有第一流路导入口311A的部位(第一CV部)350A1和设置有第一拉普拉斯阀317A及第一凹部313A的部位(第一LV部)350A2。
同样，该第二培养室302A2的底部通过第二间隔部330B划分为设置有第二流路导入口311B的部位(第二CV部)350B1和设置有第二拉普拉斯阀317B及第二凹部313B的部位(第二LV部)350B2。
另外，第一培养室302A1中的第一流路导入口311A和第二培养室302A2中的第二拉普拉斯阀317B通过第一流路315A连接。
另外，第一培养室302A1中的第一拉普拉斯阀317A和第二培养室302A2中的第二流路导入口311B通过第二流路315B连接。
在图13A中示出从第一流路315A中的第一流路导入口311A至第一拉普拉斯阀317B之间的部位及第二凹部313B中充满第一培养基331A的状态。
另外，图13A表示从第二流路315B、设置有第一拉普拉斯阀及第一凹部313A的第一LV部350A2至设置有第二流路导入口311B的第二CV部350B1充满第二培养基331B的状态。
如图13A所示，第一培养基331A及第二培养基331B均处于培养基的表面比第一间隔部330A低的位置的情况下，第一培养基331A及第二培养基331B均不能超过第一间隔部330A移动。如图13A所示，因间隔部330A具有给定的高度，即使未设止回阀，通过拉普拉斯阀317B的功能也可以防止培养基的逆流。
此外，在本实施方式的防逆流机构中，例如即使不使用间隔部330A，通过将连接流路(第一流路)315A的出口(第一流路导入口311A)配置于比另一条连接流路(第二流路)315B的入口(第一拉普拉斯阀317A)高的位置，也能发挥功能，防止培养基的逆流。
图13B中示出对第一培养室302A1加压的情况的图。
在将第一培养室302A1加压时，从第一流路导入口311A向第二拉普拉斯阀317B输送第一培养基331A。
同样，通过对第一培养室302A1加压，从第一拉普拉斯阀317A向第二流路导入口311B输送第二培养基331B。
图13B中，在第一流路导入口311A(第一CV部350A1)存在的第一培养基331A全部被输送到第二拉普拉斯阀317B侧(第二LV部350B2)。
这时，第一流路导入口311A、第一流路315A、第二拉普拉斯阀317B的总容量的一个实例小于20μL。与第一培养室302A1的容量相比，对第一流路导入口311A、第一流路315A、第二拉普拉斯阀317B的总容量没有特别限制。另一方面，与第一培养室302A1的容量相比，如果第一流路导入口311A、第一流路315A、第二拉普拉斯阀317B的总容量少，则与存在于第一培养室302A1的凹部(第一凹部)313A的细胞接触的培养基更多地流入第二培养室302A2，因此，可以使由存在于第一培养室302A1的细胞分泌的物质有效地作用于存在于第二培养室302A2的细胞。因此，第一流路导入口311A、第一流路315A、及第二拉普拉斯阀317B的总容量优选为第一培养室的容量的同程度以下，更优选为二分之一以下，进一步优选为十分之一以下。
图13C中，在第一培养室302A1中，存在于第一LV部350A2的第二培养基331B被输送到第二培养室302A2，直至空气到达第一培养室302A1的第一拉普拉斯阀317A。
空气到达拉普拉斯阀317A的情况下，拉普拉斯阀的功能发挥作用，停止输送第二培养基331B。
通过这样的培养基的移动，第一培养基331A和第二培养基331B被混合，形成混合培养基331C。
如图13D及图13E所示，如果将第二培养室302A2加压，则通过与上述图13B、图13C的说明中所示的机构同样的机构，将混合培养基331C从第二培养室302A2输送到第一培养室302A1。
然后，通过重复从图13B所示的操作至图13D所示的操作，混合培养基331C循环，能够更均匀混合混合培养基331C(能够形成均匀的混合培养基331C)。
此外，在图13A～13E中示出使用了2连培养室303A的实例，但如第一实施方式所示，在第二实施方式中也可使用4连培养室式。
在使用了4连培养室式的情况下，也与2连培养室303A的实例相同，通过使用拉普拉斯阀(防逆流拉普拉斯阀)作为防逆流机构，即使不设置第一实施方式所示的止回阀，也可以防止培养基的逆流，并可进行培养基在各培养室间的移动，可进行各培养基的混合。
即，在4连培养室内，通过对各培养室依次加压，可进行培养基循环。
图13F是表示本实施方式的4连培养室303B的一个实例的剖面图。
连结的4连培养室303B具有第一培养室1302A1、第二培养室1302A2、第三培养室1302A3、及第四培养室1302A4。
该第一培养室1302A1的底部通过第一间隔部1330A划分为设置有第一流路导入口1311A的部位(第一CV部)1350A1、和设置有第一拉普拉斯阀1317A及第一凹部1313A的部位(第一LV部)1350A2。
同样，该第二培养室1302A2的底部通过第二间隔部1330B，划分为设置有第二流路导入口1311B的部位(第二CV部)1350B1、和设置有第二拉普拉斯阀1317B及第二凹部1313B的部位(第二LV部)1350B2。
同样，该第三培养室1302A3的底部通过第三间隔部1330C，划分为设置有第三流路导入口1311C的部位(第三CV部)1350C1、和设置有第三拉普拉斯阀1317C及第三凹部1313C的部位(第三LV部)1350C2。
另外，该第四培养室1302A4的底部通过第四间隔部1330D，划分为设置有第四流路导入口1311D的部位(第四CV部)1350D1、和设置有第四拉普拉斯阀1317D及第四凹部1313D的部位(第四LV部)1350D2。
另外，第一培养室1302A1中的第一流路导入口1311A、和第二培养室1302A2中的第二拉普拉斯阀1317B由第一流路1315A连接。
另外，第二培养室1302A2中的第二流路导入口1311B、和第三培养室1302A3中的第三拉普拉斯阀1317C由第二流路1315B连接。
另外，第三培养室1302A3中的第三流路导入口1311C、和第四培养室1302A4中的第四拉普拉斯阀1317D通过第三流路1315C连接。
另外，第四培养室1302A4中的第四流路导入口1311D、和第一培养室1302A1中的第一拉普拉斯阀1317A通过第四流路1315D连接。
在如上所述地构成的本实施方式的4连培养室303B中，在第一～第四凹部1313A～1313D中均接种细胞，在第一～第四培养室1302A1～1302A4中均添加培养基。而且，与2连培养室303A的实例相同，通过依次分别对第一～第四培养室1302A1～1302A4进行加压，防止培养基的逆流，并可进行第一～第四培养室1302A1～1302A4间的培养基的移动，可进行各培养基的混合。
通过使用本实施方式的4连培养室303B，例如，可使从存在于第一室1302A1的细胞分泌的物质有效地作用于存在于第二培养室1302A2的细胞。另外，可使从存在于第二培养室1302A2的细胞分泌的物质有效作用于存在于第三培养室1302A3的细胞。另外，可使从存在于第三培养室1302A3的细胞分泌的物质有效率作用于存在于第四培养室1302A4的细胞。而且，可使从存在于第四培养室1302A4的细胞分泌的物质有效地作用于存在于第一培养室1302A1的细胞。
这样，通过使用本实施方式的4连培养室303B，在第一～第四培养室1302A1～1302A4之间，能够使从分别配置的细胞分泌的物质依次循环。
根据本实施方式的4连培养室303B，例如，像在第一实施方式的图8中所示的4连培养室型的4单元系统8B那样，导入成为肺19C、肝脏19A、肾脏19D、脂肪19E的模型的细胞，与4脏器连结模型3B同样，能够评价细胞间的影响。
本实施方式的4连培养室303B的第一～第四培养室1302A1～1302A4、第一～第四拉普拉斯阀1317A～1317D、第一～第四流路导入口1311A～1311D、及第一～第四流路1315A～1315D等各构成要素的容量、尺寸等也可以与在本实施方式的2连培养室303A中说明的上述实例相同。
在本实施方式中，对2连培养室及4连培养室的实例进行了记载，但只要具有两个以上的培养室即可，培养室的数量不限定于这些。
以下，基于附图说明本发明的第三实施方式的细胞培养装置。
图14及图15是说明本实施方式的细胞培养装置的4连培养室类多单元系统的动作原理和4连培养室类多单元系统的使用方法的图。
在本实施方式中，与上述第一实施方式不同的是(1)使用拉普拉斯阀(防逆流拉普拉斯阀)417作为防逆流机构以代替上述第一实施方式的止回阀11这一点及(2)使用图14所示的4连培养室这一点，关于该(1)及(2)以外的对应结构，因与第一实施方式相同，所以省略其说明。
以下，对图14及图15所示的本实施方式的空气压驱动型的培养基循环方式的细胞培养装置进行说明。
图14从上起(1)是表示本实施方式的4连培养室403的流路的俯视图，(2)是使4连培养室403的构成要素的结合简单化的图，及(3)是4连培养室403的剖面示意图。
图15是使用本实施方式的4连培养室403的情况的空气压驱动型的培养基循环方式的细胞培养装置的动作概念图。
如图15(A)所示，在4连培养室403内设置有第一～第四培养室402A～402D。
另外，在第一～第四培养室402A～402D内分别设置有第一～第四凹部413A～413D。
首先，如图15(A)所示，在第一～第四凹部413A～413D的各凹部接种细胞419使其粘接。
接着，如图15(B)所示，在第二凹部413B注入培养基431。
接着，如图15(C)所示，将第一培养室402A、第二培养室402B、及第四培养室402D加压。
此外，此时加压的压力在第一～第四培养室402A～402D间大致等压，是比设置于4连培养室403的拉普拉斯阀417的拉普拉斯压力低的压力。
这时，如图15(C)所示，在第一培养室402A及第四培养室内存在的培养基的培养基表面因处于比设置有拉普拉斯阀的位置低的位置，所以不发生培养基的流出。
另外，由于以比拉普拉斯压力低的压力进行加压，所以拉普拉斯阀417发挥功能，也不会发生空气流入流路415。
另外，第一培养室402A和第二培养室402B以等压加压，所以不会发生培养基从第二培养室402B移送到第一培养室402A。
如图15(C)所示，注入第二培养室402B的培养基431只移送到释放至大气的第三培养室402C。
接着，如图15(D)所示，通过重复图15(C)所示的培养室的加压操作，能够进行培养基的单路循环。
通过重复该培养室的加压操作及培养基的单路循环，能够促进各室的培养基的混合。
本实施方式中，例示了设置有第一～第四培养室402A～402D的实例，但只要有三个以上的培养室，可进行同样的操作。
本实施方式的培养室只要有三个以上的培养室即可，不限定于4连培养室。
实施例
接着，对于本发明的上述实施方式的细胞培养装置1，示出实施例详细进行说明。此外，下述的实施例是应用了本发明的具体的一个实例，完全不限定本发明。
作为肝脏和癌组织的共培养模型，使用2脏器×8连培养系统(细胞培养装置)进行肝癌细胞HepG2(肝脏模型)及大肠癌细胞HCT116(大肠癌细胞)的培养。图16A表示培养板内的各细胞的配置。此外，图16A所示的图与图7的2脏器连结模型3A对应。
如图16A所示，在沿着细胞培养装置的横向配置且纵向上的第一列培养室组配置肝癌细胞HepG2(肝脏模型)。
在沿着细胞培养装置的横向配置且纵向上的第二列培养室组配置大肠癌细胞HCT116。
另外，在沿着细胞培养装置的横向配置且纵向上的第三列培养室组内配置肝癌细胞HepG2(肝脏模型)。
在沿着细胞培养装置的横向配置且纵向上的第四列培养室组内配置大肠癌细胞HCT116。
另外，图16B表示肝癌细胞HepG2(肝脏模型)及大肠癌细胞HCT116(大肠癌细胞)的培养程序。
利用Collagen Type I(Cell Matrix，新田明胶)，根据制造商提供的顺序涂布培养HepG2的凹部。
培养大肠癌细胞HCT116的凹部利用Fibronectin溶液(28.3ug/ml)50ul涂布。
在用Fibronectin溶液进行涂布后，用培养基清洗各凹部，接种细胞。此时，HepG2细胞以100万细胞/ml的浓度悬浮在William’SE培养基中，HCT116以10万细胞/ml的浓度悬浮在MEM培养基中，以各凹部50ml的液体体积添加。
接种细胞，3小时后在存在各凹部的培养室中均添加各300ml的培养培养基。此时，在包含HepG2的室中添加William’S E培养基，在包含HCT116的室中添加MEM培养基。
通宵静置培养后，将各室的培养基置换为300ml William’S E培养基，进行循环培养。
循环培养通过对添加了HepG2的室和添加了HCT116的室重复10分种4kPa的加压而进行。
图17A表示刚要开始循环培养前(第1天)的HepG2的细胞的照片。
图17B表示刚要开始循环培养前(第1天)的HCT116的细胞的照片。
图17C表示进行48小时循环培养后的HepG2的细胞的照片。
图17D表示进行48小时循环培养后的HCT116的细胞的照片。
观察HepG2及HCT116两细胞均在循环培养之间、凹部的底面粘接的情况，观察HCT116细胞繁殖的情况。
此外，通过在进行循环培养时使用的培养基(William’S E培养基300ml)中添加模型化合物，可同时评价模型化合物对肝脏和癌的影响并在实时反映的状态下评价脏器间相互作用。
工业实用性
如果利用本发明的细胞培养装置及细胞培养方法，则可使用培养细胞分析医药品、化学制品的药效、毒性、及吸收、分布、代谢、排泄这些体内动态。另外，本发明也能够作为动物实验替代方法用于医药品、化学制品的分析。

Claims (13)

1.一种细胞培养装置，其具备：
连结培养容器，所述连结培养容器具有保持被接种的细胞的细胞保持部、分别具有所述细胞保持部且贮存有液体培养基并沿着第一方向并列配置的m个培养室、以及使所述m个培养室间相互连通的1个以上的连接用流路，由所述m个培养室和所述连接用流路构成单元，将n个所述单元沿着与所述第一方向不同的方向即第二方向并列配置；以及，
多个气压管，所述多个气压管在所述连结培养容器中使沿着所述第二方向配置于同列的同列配置培养室之间连通，可对所述同列配置培养室间同时进行加压或同时释放至大气压，利用所述m个培养室内的压力差，可通过所述连接用流路在所述m个培养室之间输送所述液体培养基，
所述m是2以上的整数，所述n是2以上的整数，
在从所述培养室连接到所述连接用流路的部位具备能够通过表面张力防止空气流入的拉普拉斯阀。
2.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中，
在所述连接用流路的末端或内部具备能够对从所述连接用流路向所述m个培养室流动的方向进行控制的防逆流机构。
3.如权利要求1或2所述的细胞培养装置，其中，
就所述m个培养室而言，所述m个培养室均具有贮存液体培养基的容器状的槽主体、和开闭自如且气密地对所述槽主体的开口进行封闭的盖部。
4.如权利要求3所述的细胞培养装置，其中，
进一步具备能够保持将所述盖部向所述槽主体按压的盖部按压部，
所述盖部按压部具有支撑所述槽主体的基体部、和向所述基体部所支撑的所述槽主体按压所述盖部的按压部件。
5.如权利要求4所述的细胞培养装置，其中，
所述槽主体具有壁部、和具备连接用流路的底部板。
6.如权利要求5所述的细胞培养装置，其进一步具备壁部按压部，所述壁部按压部向所述底部板按压所述壁部从而保持所述壁部，
所述壁部按压部具有所述基体部和按压部件，所述按压部件向所述基体部所支撑的所述底部板按压所述壁部。
7.如权利要求1或2所述的细胞培养装置，其具备加压装置，所述加压装置可以通过所述气压管，根据预设程序对所述各培养室依次加压或释放至大气压。
8.如权利要求1或2所述的细胞培养装置，其中，
构成所述拉普拉斯阀的微流路的宽度是wL，所述微流路的深度是hL，所述表面张力是γ，所述拉普拉斯阀的拉普拉斯压力是ΔPLap时，
所述拉普拉斯压力由式ΔPLap＝2γ(1/wL+1/hL)表示，
以使所述拉普拉斯压力ΔPLap大于施加在所述连结培养容器的压力的方式构成所述微流路。
9.如权利要求1或2所述的细胞培养装置，其中，
在所述连接用流路的一部分具备阻力流路部位用以调节流量，所述阻力流路部位的流路截面积为所述连接用流路的流路截面积的1/10以下。
10.如权利要求2所述的细胞培养装置，其中，
所述防逆流机构是止回阀。
11.如权利要求2所述的细胞培养装置，其具备防逆流拉普拉斯阀作为所述防逆流机构。
12.一种细胞培养方法，其中，
准备细胞培养装置，在m及n是2以上的整数时，所述细胞培养装置具备n单元的1单元连结培养容器，所述1单元连结培养容器中，利用1个以上的连接用流路使m个培养室相互连通，且所述m个培养室均沿着第一方向并列配置，所述n单元的所述连结培养容器沿着与所述第一方向不同的方向即第二方向并列配置，
所述细胞培养装置具备多个气压管，所述多个气压管将沿着所述第二方向配置于同列的同列配置培养室之间连通，可对所述同列配置培养室间同时进行加压或同时释放至大气压，
所述细胞培养装置在从所述培养室连接到所述连接用流路的部位具备能够通过表面张力防止空气流入的拉普拉斯阀，
所述细胞培养方法包括：
第一工序，打开所述连结培养容器的盖，接种细胞并使细胞粘接在所述细胞培养装置的各培养室内；
第二工序，在所述细胞培养装置中，在沿着所述第二方向同列配置的所述第一方向上的第一列培养室中装满液体培养基，关闭所述盖；
第三工序，对所述第一列培养室内进行加压，将沿着所述第二方向同列配置的所述第一方向上的第二列培养室内释放至大气压，由此将所述液体培养基通过所述连接用流路从所述第一列培养室输送至所述第二列培养室；
第四工序，使所述第一方向上的列的序号依次逐个增加1个并对其进行加压和释放至大气压，由此使所述液体培养基通过所述连接用流路，从所述第一方向上的第m-1列培养室输送至第m号培养室；
第五工序，对所述第m列位置的培养室内进行加压，并将所述第一列培养室内释放至大气压，由此将所述液体培养基通过所述连接用流路从所述第m列位置的培养室输送至所述第一列位置的培养室；以及，
第六工序，重复所述第三工序～所述第五工序，由此使所述液体培养基在所述细胞培养装置的所述各培养室内循环。
13.一种评价系统，其在权利要求1～11中的任一项所述的细胞培养装置中导入细胞。
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