一种肠壁脱落细胞的分选富集装置及其分选富集方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域,具体涉及一种肠壁脱落细胞的分选富集装置。本发明还涉及一种用于该分选富集装置的分选富集方法。
背景技术
中国国家肿瘤中心2015年的数据显示,消化道相关的肿瘤发生率和致死率排名和靠前,因此针对消化道相关肿瘤的临床应用,尤其是诊断和治疗,具有重大的临床意义。以结直肠癌为例,致死率高的一个主要原因在于结直肠癌早期无明显的临床症状,等到患者病情明显而就诊时,大多数已发展成肿瘤中晚期,如果能对结直肠癌进行早期的临床诊断和治疗,将极大的提高患者的存活率。
目前已有的结直肠癌临床诊断的方法主要有结肠镜检测、大便隐血检测,粪便RNA或DNA检测及液体活检等。其中粪便DNA检测随着精准医疗的发展,由于无创、样品易获取以及较高的诊断特异性等特点,逐渐成为最佳的诊断方法。粪便DNA诊断的步骤包括:粪便样品的采集,粪便DNA提取,粪便DNA分析诊断。
目前已有的粪便DNA提取的方法有两类,分别为直接提取粪便中的DNA和富集肠壁脱落细胞后再从细胞中提取DNA。直接提取法的目标为粪便中的DNA,实现方式包括柱式离心管吸附提取法,磁珠捕获法以及电泳捕获法。直接提取法的DNA提取背景复杂,除人肠壁脱落细胞DNA外,还有细菌DNA和散落在粪便中的人基因DNA等,因此需要设计高灵敏度的特异性探针,此外还需去除粪便中的多糖等PCR抑制成分。富集肠壁脱落细胞后再提取人基因组DNA,此种方法能够保证DNA均来源于肠壁脱落细胞,较之直接提取法,虽然具有更好的细胞特异性和结果的准确性,但是目前采用的方法仍然存在一定不足。目前已有的富集肠壁脱落细胞的方法包括:①密度梯度法,利用密度梯度获取肠壁脱落细胞,此方法虽然获取的细胞纯度较好,但是获取过程中对细胞的损害较大,目前已很少使用。②淘洗法,将粪便样品进行过滤淘洗,获得肠壁脱落细胞。此方法对细胞的损害较小,其缺陷一方面在于不能将细菌、白细胞、微小的食物残渣等尺寸比肠壁脱落细胞小的物质过滤掉,影响图片检测效果,另一方面此方法需要分别进行四次过滤操作,整个操作过程繁琐,且人为操作过多,容易造成误操作影响最终的检测结果。③免疫磁珠法,通过将包被有特异性抗体的磁珠与肠壁脱落细胞的表面特异性抗原结合,然后使用磁器对表面粘附有磁珠的细胞进行富集。此方法虽然快捷,但是对抗原的特异性和活性要求较高,不能避免粪便中粘液等物质的影响,因此检出率不高。
因此,提供一种肠壁脱落细胞的分选富集装置及其分选富集方法,以期提高肠壁脱落细胞的提取纯度,避免待测细胞被破坏,简化提取过程,有效保证检测的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种肠壁脱落细胞的分选富集装置,以期提高肠壁脱落细胞的提取纯度,简化提取过程,有效保证检测的准确性。本发明的另一目的是提供一种用于该分选富集装置的分选富集方法。
为了实现上述目的,本发明提供一种肠壁脱落细胞的分选富集装置,包括富集器和连通所述富集器顶部的分离器,所述分离器为具有分离腔的柱状结构,所述分离器包括分别与其连通的原料进口和样品出口,所述分离腔内设置有过滤组件;所述富集器包括富集腔,所述富集腔上连通具有第一阀的样品通道、具有第二阀的富集通道、具有第三阀的缓冲液通道和具有第四阀的废液通道,所述样品通道与所述富集通道经第一通道连通所述富集腔,所述缓冲液通道与所述废液通道经第二通道连通所述富集腔,所述富集腔内设置有富集组件,所述样品出口与所述样品通道连通。
优选地,所述过滤组件包括至少两个过滤膜,各所述过滤膜的过滤孔径自所述原料进口至所述样品出口依次递减,原料经所述原料进口进入分离腔,依次经过各所述过滤膜逐级过滤后,经所述样品出口排出。
优选地,所述富集组件包括若干微棱柱,各所述微棱柱相互平行间距固接于所述富集腔内,两相邻所述微棱柱形成微流控通道,所述微流控通道朝向第一通道的开口尺寸大于所述微流控通道朝向所述第二通道的开口尺寸。
优选地,所述微棱柱为三棱柱,两相邻所述三棱柱朝向所述第二通道的端面平齐。
优选地,所述微流控通道的宽度为15-20μm。
优选地,所述第一阀、所述第二阀、所述第三阀和所述第四阀为大小、尺寸一致的气动阀,所述气动阀包括依次连接的富集芯片层、弹性芯片层和气动芯片层,所述富集芯片层与所述弹性芯片层之间设有液体通道,所述气动芯片层与所述弹性芯片层之间设有气体通道,所述气体通道连通有气源,且气体通道内充有定压气体,所述定压气体增压,所述弹性芯片层朝向所述液体通道发生弹性形变使得所述液体通道关闭,所述定压气体恢复原定压力,所述弹性芯片层的弹性形变回复使得所述液体通道打开。
优选地,所述富集通道连通有收集器,所述收集器收集所述富集装置富集的待检物质。
本发明还提供一种上述分选富集装置的分选富集方法,其包括如下步骤:
1)定量采集原料,将原料与定量溶剂充分混合,形成液态原料;
2)将液态原料经由原料进口注入分离器的分离腔内,液态原料经过过滤组件进行过滤,形成液态样品,液态样品经过样品出口进入富集器的样品通道;
3)启动气源,使得第二阀和第三阀关闭,第一阀和第四阀打开,液态样品经过第一阀进入富集腔内,富集组件上富集有样品内的待检物质,经过富集腔的样品形成废液经由废液通道排出;
4)待样品在富集腔内富集完毕后,关闭第一阀和第四阀;
5)打开第二阀和第三阀,经由缓冲液通道注入缓冲液,缓冲液使得富集组件上富集的样品内的待检物质与富集组件分离,并混合形成待检液,待检液经由富集通道排出富集腔;
6)待检液经由富集通道进入收集器内;
7)将收集器密封,放置阴凉低温的环境中保存待检。
优选地,在步骤5)中,缓冲液的流向与液态样品的流向相反。
本发明所提供的分选富集装置,包括富集器和连通所述富集器顶部的分离器,所述分离器为具有分离腔的柱状结构,所述分离器包括分别与其连通的原料进口和样品出口,所述分离腔内设置有过滤组件;所述富集器包括富集腔,所述富集腔上连通具有第一阀的样品通道、具有第二阀的富集通道、具有第三阀的缓冲液通道和具有第四阀的废液通道,所述样品通道与所述富集通道经第一通道连通所述富集腔,所述缓冲液通道与所述废液通道经第二通道连通所述富集腔,所述富集腔内设置有富集组件,所述样品出口与所述样品通道连通。上述结构中,该分选富集装置包括分离器和富集器,分离器固接在富集器的顶部,同时分离器与富集器相连通,液态原料(液态原料为粪便和溶剂充分混合的液态混合物)依次经过分离器和富集器,即分离器使得液态混合物进行过滤,过滤后的液态样品进入富集器,富集器使得液态样品内的被检测物质进行富集。分离器放置方式为垂直与富集器的顶部平面,分离器上的原料进口设置在分离器的顶端,其液态混合物经原料进口进入分离腔内,分离腔内有过滤组件,该过滤组件为多级过滤结构,其过滤等级自原料进口至样品出口依次升高,液态混合物经过过滤组件,过滤组件的最高过滤等级能够使得液态混合物中的待检细胞通过,此时液态混合物中的多种杂质被过滤组件过滤掉,由于在液态混合物中,存在众多尺寸小于待检细胞的物质,例如红细胞、白细胞或细菌,上述尺寸小于待检细胞的物质不能被过滤组件过滤掉,液态混合物经过过滤组件后形成的液态样品中含有待检细胞和多种尺寸较小的物质;液态样品进入样品通道,此时打开样品通道上的第一阀和废液通道上的第四阀,液态样品经过样品通道进入富集腔内,在富集腔内设置有富集组件,该富集组件对液态样品进行过滤,由于富集组件的过滤间隙直径小于待检细胞的直径,且大于液体样品内其它物质的直径,此时待检细胞被富集在过滤组件上,液态样品中的其它物质经过富集组件后通过废液通道排出富集腔,待所有液态样品全部经过富集组件后关闭第一阀和第四阀,随之打开第二阀和第三阀,从缓冲液通道注入缓冲液,缓冲液经缓冲通道进入富集腔内,缓冲液使得富集在富集组件上的待检细胞与富集组件脱离,并随缓冲液经由富集通道排出富集腔,并进行收集,至此得到含有待检细胞的缓冲液用于后期检测。
基于上述结构,通过分离器对液态原料进行初级过滤,去除液态原料中的大于待检细胞直径的杂质,再次经过富集器,使得待检细胞富集在富集器内,富集器具有四个通道,其中样品通道和废液通道形成一个富集通道,缓冲液通道和富集通道形成一个收集通道,两个通道为反向工作,即富集通道开通时待检细胞不能经过富集组件,收集通道开通时待检细胞被带出。富集通道开通时直径小于待检细胞的杂质被过滤掉,待检细胞被富集在富集组件上,当收集通道开通时,利用缓冲液反向将待检细胞带离富集组件从而实现对待检细胞的分离富集。该装置利用细胞自身尺寸的物理特性,实现了对待检细胞的分离和富集,从而提高了肠壁脱落细胞的提取纯度,避免待测细胞被破坏,同时提取过程简单,有效保证了检测的准确性。
附图说明
图1为分离富集装置的结构示意图;
图2为分离器的结构示意图;
图3为图2所示分离器的轴向剖视图;
图4为富集器的未使用时的结构示意图;
图5为富集器的液态样品经过时的结构示意图;
图6为富集器的缓冲液经过时的结构示意图;
图7为第一阀未充气时的结构示意剖视图;
图8为第一阀充气时的结构示意剖视图。
其中,1为分离器;2为富集器
11为原料进口,12为样品出口,13为过滤组件,131为第一过滤膜,132为第二过滤膜,133为第三过滤膜,134为第四过滤膜;
21为样品通道,22为第一阀,23为富集腔,24为富集组件,25为第三阀,26为缓冲液通道,27为废液通道,28为第四阀,29为第二阀,30为富集通道;
221为富集芯片层,222为弹性芯片层,223为气动芯片层,224为气体通道,225为液体通道。
具体实施例
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
请参考图1、图2、图3、图4、图5和图6,图1为分离富集装置的结构示意图;图2为分离器的结构示意图;图3为图2所示分离器的轴向剖视图;图4为富集器的未使用时的结构示意图;图5为富集器的液态样品经过时的结构示意图;图6为富集器的缓冲液经过时的结构示意图。
在一种具体实施方式中,本发明所提供的分选富集装置,包括富集器2和连通所述富集器2顶部的分离器1,所述分离器1为具有分离腔的柱状结构,所述分离器1包括分别与其连通的原料进口11和样品出口12,所述分离腔内设置有过滤组件13;所述富集器2包括富集腔23,所述富集腔23上连通具有第一阀22的样品通道21、具有第二阀29的富集通道30、具有第三阀25的缓冲液通道26和具有第四阀28的废液通道27,所述样品通道21与所述富集通道30经第一通道连通所述富集腔23,所述缓冲液通道26与所述废液通道27经第二通道连通所述富集腔23,所述富集腔23内设置有富集组件24,所述样品出口12与所述样品通道21连通。上述结构中,该分选富集装置包括分离器1和富集器2,分离器1固接在富集器2的顶部,同时分离器1与富集器2相连通,液态原料(液态原料为粪便和溶剂充分混合的液态混合物)依次经过分离器1和富集器2,即分离器1使得液态混合物进行过滤,过滤后的液态样品进入富集器2,富集器2使得液态样品内的被检测物质进行富集。分离器1放置方式为垂直与富集器2的顶部平面,分离器1上的原料进口11设置在分离器1的顶端,其液态混合物经原料进口11进入分离腔内,分离腔内有过滤组件13,该过滤组件13为多级过滤结构,其过滤等级自原料进口11至样品出口12依次升高,液态混合物经过过滤组件13,过滤组件13的最高过滤等级能够使得液态混合物中的待检细胞通过,此时液态混合物中的多种杂质被过滤组件13过滤掉,由于在液态混合物中,存在众多尺寸小于待检细胞的物质,例如红细胞、白细胞或细菌,上述尺寸小于待检细胞的物质不能被过滤组件13过滤掉,液态混合物经过过滤组件13后形成的液态样品中含有待检细胞和多种尺寸较小的物质;液态样品进入样品通道21,此时打开样品通道21上的第一阀22和废液通道27上的第四阀28,液态样品经过样品通道21进入富集腔23内,在富集腔23内设置有富集组件24,该富集组件24对液态样品进行过滤,由于富集组件24的过滤间隙直径小于待检细胞的直径,且大于液体样品内其它物质的直径,此时待检细胞被富集在过滤组件13上,液态样品中的其它物质经过富集组件24后通过废液通道27排出富集腔23,带所有液态样品全部经过富集组件24后关闭第一阀22和第四阀28,随之打开第二阀29和第三阀25,从缓冲液通道26注入缓冲液,缓冲液经缓冲通道进入富集腔23内,缓冲液使得富集在富集组件24上的待检细胞与富集组件24脱离,并随缓冲液经由富集通道30排出富集腔23,同时在富集通道30上连通有收集器,经过富集有待检细胞的缓冲液被收集在收集器内,至此得到含有待检细胞的缓冲液用于后期检测。
基于上述结构,通过分离器1对液态原料进行初级过滤,去除液态原料中的大于待检细胞直径的杂质,再次经过富集器2,使得待检细胞富集在富集器2内,富集器2具有四个通道,其中样品通道21和废液通道27形成一个富集通道30,缓冲液通道26和富集通道30形成一个收集通道,两个通道为反向工作,即富集通道30开通时待检细胞不能经过富集组件24,收集通道开通时待检细胞被带出。富集通道30开通时直径小于待检细胞的杂质被过滤掉,待检细胞被富集在富集组件24上,当收集通道开通时,利用缓冲液反向将待检细胞带离富集组件24从而实现对待检细胞的分离富集。该装置利用细胞自身尺寸的物理特性,实现了对待检细胞的分离和富集,从而提高了肠壁脱落细胞的提取纯度,避免待测细胞被破坏,同时提取过程简单,有效保证了检测的准确性。
需要指出的是,样品通道21与富集通道30设置在富集腔23的一侧,且样品通道21在上,富集通道30在下;缓冲液通道26与废液通道27设置在富集腔23的另一侧,且缓冲液通道26在上,废液通道27在下。收集器一般为玻璃材质的试剂瓶,同时在该试剂瓶的开口加装有密封盖,避免环境对于试剂瓶内物质的污染,从而提高检测的精度。
进一步理解的是,所述过滤组件13包括至少两个过滤膜,各所述过滤膜的过滤孔径自所述原料进口11至所述样品出口12依次递减,原料经所述原料进口11进入分离腔,依次经过各所述过滤膜逐级过滤后,经所述样品出口12排出。该结构中,过滤组件13由多个过滤膜组合形成,一般由四层过滤膜间隔设置组成,其间隔距离均为3cm,四层过滤膜自上而下(自原料通道至样品通道21)依次为第一过滤膜131、第二过滤膜132、第三过滤膜133和第四过滤膜134,第一过滤膜131的滤膜孔径为600μm,滤孔采取圆周布局,第二过滤膜132的滤膜孔径为150μm,滤孔采取圆周布局,第三过滤膜133的滤膜孔径为75μm,滤孔采取圆周布局,第四过滤膜134的滤膜孔径为50μm,滤孔采取圆周布局,相邻两层过滤膜上的滤膜孔不同轴。一般待检细胞的直径为20μm,当液态原料在自身重力作用下依次经过四层过滤膜后大于50μm的杂质都被过滤掉,待检细胞和一些直径小于50μm的物质形成液态样品进入下一步工序。
该结构能够实现液态原料的逐级过滤,利用待检细胞自身尺寸的物理特性,实现了对杂质的过滤,有效保证了提取的纯度,同时该过程为物理提取过程无需添加任何化学制剂,不会对待检细胞形成破坏,操作时工序简单,节约了大量的人员成本。
具体地,所述富集组件24包括若干微棱柱,各所述微棱柱相互平行间距固接于所述富集腔23内,两相邻所述微棱柱形成微流控通道,所述微流控通道朝向第一通道的开口尺寸大于所述微流控通道朝向所述第二通道的开口尺寸。该结构中,富集组件24由多根棱柱排列形成,该棱柱为三棱柱,其横向截面为等边三角形,多根棱柱的均为横向(该方向与液态样品的流入方向垂直)平行排布,相邻两个棱柱间隔设置形成微流控通道,该间隔距离最小为15μm,由于相邻两个棱柱的横向截面为等边三角形,微流控通道由两个等边三角形相夹形成横向截面为等腰梯形结构,两个等边三角形朝向缓冲液通道26的边平齐,微流控通道朝向样品通道21的一端的宽度大于其朝向缓冲液通道26的一端。此时液态样品进入富集腔23后,经过富集组件24,液态样品的流动方向为自微流控通道的大开口端至小开口端,由于待检细胞的直径为20μm,当液态样品流经富集组件24时,待检细胞被卡在微流控通道外侧,其它直径小于15μm的物质经过富集组件24后经废液通道27排出。缓冲液经缓冲液通道26进入富集腔23,由于缓冲液的流动方向与液态样品的流向相反,缓冲液将卡在微流控通道外侧的待检细胞带离富集组件24并随缓冲液经由富集通道30排出。
该结构中,三棱柱的横截面为等边三角形的结构,相邻的三棱柱之间形成截面为等腰梯形微流控通道,利用等腰梯形两底边长度的物理特性设置最短底边(朝向缓冲液的边)的长度小于待检细胞的直径,使得待检细胞能够被挡在富集组件24外侧进行富集,从而实现对待检细胞的富集提取。此结构实现了液态样品内的待检细胞的富集,利用待检细胞自身尺寸的物理特性,实现了对直径小于待检细胞物质的过滤,有效保证了待检细胞的提取纯度,同时该过程为物理提取过程无需添加任何化学制剂,不会对待检细胞形成破坏,操作时工序简单,节约了大量的人员成本。
请参考图7和图8,图7为第一阀未充气时的结构示意剖视图;图8为第一阀充气时的结构示意剖视图。
具体理解的是,所述第一阀22、所述第二阀29、所述第三阀25和所述第四阀28为大小、尺寸一致的气动阀,所述气动阀包括依次连接的富集芯片层221、弹性芯片层222和气动芯片层223,所述富集芯片层221与所述弹性芯片层222之间设有液体通道225,所述气动芯片层223与所述弹性芯片层222之间设有气体通道224,所述气体通道224连通有气源,且气体通道224内充有定压气体,所述定压气体增压,所述弹性芯片层222朝向所述液体通道225发生弹性形变使得所述液体通道225关闭,所述定压气体恢复原定压力,所述弹性芯片层222的弹性形变回复使得所述液体通道225打开。上述结构中分别对样品通道21、富集通道30、缓冲液通道26和废液通道27加装第一阀22、第二阀29、第三阀25和第四阀28,上述四个阀的结构一样,均为气动阀,该气动阀由三部分组成,分别为富集芯片层221、弹性芯片层222和气动芯片层223,弹性芯片层222处于富集芯片层221和气动芯片层223之间,富集芯片层221与弹性芯片层222之间设有液体通道225,气动芯片层223与弹性芯片层222之间设有气体通道224,气体通道224连通有气源,气体通道224内充气,弹性芯片层222朝向液体通道225发生弹性形变使得液体通道225关闭,气体通道224无气体时,弹性芯片层222未发生弹性形变使得液体通道225打开。上述四个阀分别连通气源,在气源处设置有分别控制四个阀的开关,通过启动或关停不同的开关实现不同通道的开通或关闭,该种方式操作简单,能够有效提高工作效率,继而降低检测成本。
需要指出的是,上述第一阀、第二阀、第三阀和第四阀的结构还可以为其它结构形式,在满足设计和使用的前提下还可以选用液压阀等一切可以实现管道关闭与打开的阀体。
本发明还提供一种基于上述分选富集装置的分选富集方法,其包括如下步骤:
1)定量采集原料,将原料与定量溶剂充分混合,形成液态原料,
2)将液态原料经由原料进口11注入分离器1的分离腔内,液态原料经过过滤组件13进行过滤,形成液态样品,液态样品经过样品出口12进入富集器2的样品通道21;
3)启动气源,使得第二阀29和第三阀25关闭,第一阀22和第四阀28打开,液态样品经过第一阀22进入富集腔23内,富集组件24上富集有样品内的待检物质,经过富集腔23的样品形成废液经由废液通道27排出;
4)待样品在富集腔23内富集完毕后,关闭第一阀22和第四阀28;
5)打开第二阀29和第三阀25,经由缓冲液通道26注入缓冲液,缓冲液使得富集组件24上富集的样品内的待检物质与富集组件24分离,并混合形成待检液,待检液经由富集通道30排出富集腔23;
6)待检液经由富集通道30进入收集器内;
7)将收集器密封,放置阴凉低温的环境中保存待检。
上述步骤中,定量采集原料和定量溶剂需要根据具体的检测标准进行配比,同时形成的液态原料为一般为悬浮溶液,所述使用的溶剂一般为蒸馏水;液态样品进入分离器1进行分离时,在自身重力的作用下自上而下流向,经过分离器1后液态原料被初步过滤(过滤出液态原料中直径大于50μm的杂质)形成液态样品,同时第一阀22和第四阀28,使得液态样品的富集过程开启,液态样品中的待检细胞经过富集组件24后被富集在富集组件24的外侧,关闭第一阀22和第四阀28,再打开第二阀29和第三阀25,缓冲液被注入到富集腔23内,缓冲液的流向与液态样品的流向相反,此时缓冲液将被富集的待检细胞带离富集腔23,经过富集通道30被收集到收集器内,同时装有待检细胞的收集器进行密封,放置在阴凉低温的环境中保存,放置环境对于待检细胞的污染,从而影响检测效果。
上述各实施例仅是本发明的优选实施方式,在本技术领域内,凡是基于本发明技术方案上的变化和改进,不应排除在本发明的保护范围之外。