CN108660060A - 一种富集、纯化循环肿瘤细胞的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微流控芯片，包括位于所述芯片本体四角的定位孔、加样孔、样品反应腔、物理筛选流道、废液流道、废液收集腔、上表面镀有磁铁的磁力吸附腔体、产物流道、产物收集腔和产物吸取孔，样品反应腔与磁力吸附腔体之间通过物理筛选流道相连通，磁力吸附腔体与产物收集腔之间通过产物流道相连通，物理筛选流道的下侧壁通过开设缺口与所述废液流道相连通；本发明还公开了采用上述微流控芯片富集、纯化循环肿瘤细胞的方法，仅需要1台离心机即可完成实验，操作快速、简便，不需使用昂贵的EpCAM抗体，成本相对低廉；所得的循环血肿瘤细胞不仅限于表达EpCAM抗体的类型，分离纯化效果更好，表面无免疫磁珠，其生物学活性更好。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物医学技术领域，具体是一种富集、纯化循环肿瘤细胞的微流控芯片。
背景技术
近年来，肿瘤的发病率正逐年上升，恶性肿瘤已经成为我国居民死亡的首要病因。恶性肿瘤的一个主要特征即是转移，是指肿瘤细胞在大量增殖后从原发灶脱落，进而侵入血管、淋巴管或体腔，最后存活下来的少数肿瘤细胞随着血流、淋巴流迁移到另一远隔部位或器官形成转移灶。循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)是脱离了肿瘤原发部位和转移部位而进入血液循环中的各类肿瘤细胞的统称。CTCs作为原发灶和转移灶之间的桥梁，携带了大量的肿瘤进展和转移的信息，在转移过程中经历了上皮-间质转化，使其具有更强的转移潜能，在肿瘤转移复发过程中扮演着极为重要的角色。
检测CTCs可以帮助我们对恶性肿瘤进行早期诊断，并且这种诊断指标具有高度的敏感性与特异性，即在早期的无症状的恶性肿瘤患者外周血中也可检测到少量的CTCs，而在良性疾病及健康体检者血液中均未检出过CTCs。通过计量检测到的CTCs的数量，更加可以判断肿瘤分期，从另一个侧面反应肿瘤的发展状况。监控CTCs的数量变化，还可以判断药物治疗效果，监控病情进展。
除了计数之外，对于CTCs的基因检测也有重要作用。研究表明，CTCs与原发灶内瘤细胞具有相似的基因遗传学特征。也就意味着通过检测分析CTCs中的基因信息，可以替代组织活检，通过更微创的、可持续获得样品的、相对廉价的方式，获得肿瘤细胞基因信息，指导其用药治疗，实现精准医疗的目标。
然而，由于CTCs存在于外周血中的数量是非常少量的，大约十亿血细胞中存在1个CTCs。且CTCs本身的异质性和缺乏有效的泛用性特异性标志物，导致CTCs的研究存在着巨大的挑战。系统是目前唯一一个获得FDA批准上市的产品，其原理是基于免疫磁珠富集法，在磁珠表面包被肿瘤细胞上皮标志物EpCAM抗体，通过正向富集的方式从循环血中分离CTCs。但是该方法仍存在一些弊端，首先所消耗的EpCAM抗体昂贵，并且该方法无法捕获不表达EpCAM的细胞或EpCAM表位丢失的细胞，分离后的细胞可能会因为磁珠无法与细胞完全分离干净而导致细胞完整性和活性受到破坏，导致捕获细胞的再利用受到一定影响。
申请号为CN201711446591.5的中国专利公开了一种微流控芯片，包括芯片主体，所述芯片主体包括通道，所述通道设有若干涡旋结构；所述涡旋结构为与通道边缘的边呈10～20度的微通道，或间断性设在通道上的圆形结构或矩形结构，所述圆形结构或矩形结构水平横截面的内径大于通道水平横截面的宽度。该专利申请还公开了上述微流控芯片进行分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法，其包括以下步骤：步骤S1，将混合有癌细胞的血细胞混合液注入芯片中，通过粘贴在芯片底部的压电陶瓷片产生主动涡旋震荡，通过微通道时产生空气气泡，使得细胞溶液产生涡流，大的细胞被捕获在通道边缘的微通道处；步骤S2，以0.03～0.4mL/min的速度向通道内加入PBS冲洗通道和细胞溶液，并保持压电陶瓷片处于持续工作状态，PBS逐渐将白细胞和红细胞洗出通道，最后仅有癌细胞被捕获富集在通道内。申请号为CN201711446591.5的中国专利中所述方法主要利用振荡器模拟离心情况，并利用离心时不同大小细胞所处的位置差异，分离得到体积较大的循环血肿瘤细胞；且该方法没有利用磁珠进行进一步的筛选，无法分离体积较大的白细胞。除此之外利用压电陶瓷片产生震荡模拟离心的方式对于设备的要求较高，操作也更繁琐。
申请号为CN201610344918.7的中国专利公开了一种循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，包括分离纯化室、分流柱以及微柱，所述分离纯化室具有样品入口、用于供靶标细胞流出的第一出口以及分布在所述第一出口两侧以用于供非靶标细胞流出的第二出口；所述分离纯化室内具有两个微柱阵列，每个所述微柱阵列由多个微柱行组成，每个所述微柱行上具有多个所述微柱，每个所述微柱行上相邻的两个所述微柱之间具有间隙且该间隙形成用于供非靶标细胞通过的非靶标细胞通道，两个所述微柱阵列之间具有间隙且该间隙形成靶细胞通道，所述靶标细胞通道的宽度大于所述非靶标细胞通道的宽度；所述微柱行与所述靶标细胞通道夹有锐角，且该锐角朝向于所述样品入口；所述分流柱设置在所述分离纯化室内且靠近于所述样品入口处，所述分流柱用于将所述样品分流至两侧的所述微柱阵列内。该专利申请还公开了一种循环肿瘤细胞自动分离纯化方法，包括如下步骤：将样品由分离纯化室的入口进样，进入所述分离纯化室内的所述样品经过分流柱分流至两侧的两个微柱阵列内；所述样品通过所述微柱阵列的所述微柱之间的间隔以及两个所述微柱阵列之间具有的通道进行分离，半径小于微柱临界半径的非靶标细胞与微柱阵列碰撞后不发生侧向位移，按原来的流向通过所述微柱之间的间隔经所述分离纯化室的第二出口流出；半径大于微柱临界半径的细胞的靶标细胞与微柱阵列碰撞后发生侧向位移，逐步汇集进入两个所述微柱阵列之间具有的通道内，并经所述分离纯化室的第一出口流出，进入靶标细胞收集室。申请号为CN201610344918.7的中国专利中所述方法中所用的微阵列柱的结构较复杂，对于微流控芯片的制作要求十分精细，成本较高。并且该方法进液时需要使用外加泵，为样品施加固定流速，对设备要求更高，整个流程不能一步完成，操作更复杂。
申请号为CN201610344920.4的中国专利公开了一种循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片，包括样品进样模块、样品分选模块以及缓冲液进样模块；所述样品进样模块包括进样单元及进样微通道；所述样品分选模块包括样品分选单元、靶细胞收集单元以及非靶细胞收集单元；所述缓冲液进样模块包括振荡流单元及连续流单元；所述样品分选单元具有容置腔，所述容置腔内具有由多个微柱行组成的微柱阵列，每个所述微柱行由多个微柱组成，所述微柱行将所述容置腔分隔成多个收集区，每个所述微柱行上相邻所述微柱之间具有相等的间隔且该间隔形成样品通道，不同的所述微柱行上所述样品通道的宽度均不等；由所述微柱阵列的第一个微柱行至最后一个微柱行，所述样品通道的宽度逐渐减小；所述进样单元、所述进样微通道以及所述容置腔依次连通，且所述进样微通道连通于所述微柱阵列的第一个收集区，所述进样单元用于将待检测样品通过所述进样微通道送入所述容置腔中，进入所述容置腔内的所述待检测样品通过所述微柱阵列并按照所述待检测样品的细胞尺寸进行分选；所述靶细胞收集单元连通于所述微柱阵列中所述样品通道不小于靶细胞临界体积的微柱行所在的收集区以用于收集经分选得到的靶细胞；所述非靶细胞收集单元连通于所述微柱阵列中所述样品通道小于靶细胞临界体积的微柱行所在的收集区以用于收集经分选后得到的非靶细胞；所述振荡流单元及所述连续流单元分别连通于所述容置腔，所述振荡流单元用于向所述容置腔内提供用于振荡的缓冲液流，所述振荡流单元能够交替地分别向所述容置腔内提供压力和提供吸力；所述连续流单元用于向所述容置腔内提供连续的缓冲液流，所述连续流单元能够连续地向所述容置腔内提供压力。该专利申请还公开了一种循环肿瘤细胞自动捕获方法，包括如下步骤：通过样品进样模块的进样单元及进样微通道进样至样品分选单元的容置腔内；所述容置腔内的样品通过所述容置腔内的微柱阵列上宽度逐渐减小的微柱行样品通道进行分选，细胞尺寸较大的靶细胞截留在所述微柱阵列中样品通道不小于靶细胞临界体积的所有微柱行所在的收集区内，细胞尺寸较小的非靶细胞进入所述微柱阵列中所述样品通道小于靶细胞临界体积的所有微柱行所在的收集区内；缓冲液进样模块的连续流单元向所述容置腔内提供连续的缓冲液流，并且所述连续流单元连续地向所述容置腔内提供压力，以使得所述收集区内的靶细胞和非靶细胞处于流动状态，所述缓冲液进样模块的振荡流单元向所述容置腔内提供用于振荡的缓冲液流，并且所述振荡流单元交替地向所述容置腔内提供压力和提供吸力，所述振荡流单元向所述容置腔内提供的压力促使靶细胞和非靶细胞纵向通过各个微柱行的样品通道，所述振荡流单元向所述容置腔内提供的吸力促使卡在各个微柱行的样品通道内的靶细胞和非靶细胞吸回至所述收集区内；所述靶细胞收集区内的靶细胞在所述连续流单元提供的压力作用下处于横向流动状态并朝向靶细胞收集单元流动，进入所述非靶细胞收集区内的非靶细胞在所述连续流单元提供的压力作用下处于横向流动状态并朝向非靶细胞收集单元流动。申请号为CN201610344920.4的中国专利中所述方法与申请号为CN201711446591.5的中国专利中所述方法相似，该方法中所用微阵列柱的结构复杂，对于微流控芯片的制作要求十分精细，成本高。且该方法缺少磁珠进行进一步的筛选的过程，无法分离体积较大的白细胞，进液同样需要使用外加泵，为样品施加固定流速，对设备要求更高。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，适应现实发展，提供一种快速高效、成本低廉的循环血肿瘤细胞分离、富集、纯化的微流控芯片。
本发明所述的一种富集、纯化循环肿瘤细胞的微流控芯片，包括芯片本体，所述芯片本体包括位于所述芯片本体四角的定位孔、加样孔、样品反应腔、物理筛选流道、废液流道、废液收集腔、上表面镀有磁铁的磁力吸附腔体、产物流道、产物收集腔和产物吸取孔，所述加样孔位于所述样品反应腔上，所述产物吸取孔位于所述产物收集腔上，所述物理筛选流道和所述产物流道为管道结构，所述样品反应腔与所述磁力吸附腔体之间通过所述物理筛选流道相连通，所述磁力吸附腔体与所述产物收集腔之间通过所述产物流道相连通，所述物理筛选流道与所述废液流道通过位于所述物理筛选流道下侧壁的缺口相连通。
进一步，所述缺口的宽度为8～12μm。
进一步，所述物理筛选流道的临界半径为20～25μm。
更进一步，所述产物流道的临界半径为20～30μm。
更进一步，所述产物流道的临界半径为25μm。
本发明还公开了上述微流控芯片应用于富集、纯化循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：
步骤S1，从所述加样孔向所述样品反应腔中加入人类全血样品，随后加入含有包被了CD45、CD2抗体的免疫磁珠的反应液，常温温浴20分钟；
步骤S2，将所述芯片本体四角的定位孔分别与离心机相应适配器对齐插入，固定芯片；
步骤S3，以150～500rpm的速率水平离心15～45min；
步骤S4，从所述产物吸取孔中吸取分离纯化所得的循环肿瘤细胞。
进一步，以300rpm的速率水平离心30min。
本发明的优点和积极效果：
本发明结合了传统的物理大小筛选方法以及免疫磁珠负向选择法，首先通过物理筛选流道选出CTCs与较大的白细胞，然后通过包被有CD45与CD2抗体的免疫磁珠吸附白细胞，从而分离纯化得到CTCs。该方法使用物理方法进行初步筛选，操作简单、快速，成本低廉；使用免疫磁珠负向筛选去除掉初步筛选产物中的体积较大的白细胞，一方面避免产物中丢失掉不表达EpCAM的细胞或EpCAM表位丢失的细胞，另一方面避免了免疫磁珠对于CTCs生物学活性造成损伤。
本发明提供的微流控芯片及其富集、纯化循环肿瘤细胞的方法，仅需要一台离心机即可完成实验，操作快速、简便，不需使用昂贵的EpCAM抗体，因此，成本相对低廉；所得的循环血肿瘤细胞不仅限于表达EpCAM抗体的类型，分离纯化效果更好；所得的循环血肿瘤细胞表面无免疫磁珠，其生物学活性更好。
与现有技术相比，本发明具有如下实质性特点和显著的进步：
申请号为CN201711446591.5的中国专利所述方法主要利用振荡器模拟离心情况，并利用离心时不同大小细胞所处的位置差异，分离得到体积较大的循环血肿瘤细胞；没有利用磁珠进行进一步的筛选，无法分离较体积较大的白细胞。并且利用压电陶瓷片产生震荡模拟离心的方式对于设备要求较高，操作也更繁琐；而本发明通过筛孔分离获得体积较大的循环血肿瘤细胞。
本发明设计原理是根据细胞粒径不同，通过筛孔分离获得体积较大的循环血肿瘤细胞，在原理及设计通道结构上并无交叉。本发明通过磁珠吸附，负向去除体积较大的白细胞，所得到的循环血肿瘤细胞纯度更高。与申请号为CN201711446591.5的中国专利相比，本发明所需设备也更加简单，成本更低，操作更便捷。
申请号为CN201610344918.7的中国专利所述方法，使用的微阵列筛选方法与本发明的结构及效能均不相同。该方法中所用微阵列柱的结构更复杂，对于微流控芯片的制作要求更精细，成本更高。而本发明的芯片对于精细度要求较低，制作更简便，成本更低廉。并且申请号为CN201610344918.7的中国专利所述方法进液时需要使用外加泵，为样品施加固定流速，对设备要求更高，整个流程不能一步完成，操作更复杂。而本发明仅需离心机即可完成实验过程，设备要求简单，整个流程一步完成更加便捷，对于操作人员要求更低，更加易于普及并广泛应用。
申请号为CN201610344920.4的中国专利所述方法与申请号为CN201610344918.7的中国专利所述方法相似，使用的微阵列筛选方法与本发明的结构及效能均不相同。该方法中所用微阵列柱的结构更复杂，对于微流控芯片的制作要求更精细，成本更高。而本发明的芯片对于精细度要求较低，制作更简便，成本更低廉。并且申请号为CN201610344920.4的中国专利所述方法缺少磁珠进行进一步的筛选的过程，无法分离体积较大的白细胞。而本发明通过磁珠吸附，负向去除体积较大的白细胞，所得到的循环血肿瘤细胞纯度更高。除此之外，申请号为CN201610344920.4的中国专利所述方法进液同样需要使用外加泵，为样品施加固定流速，对设备要求更高。而本发明仅需离心机即可完成实验过程，设备要求简单，整个流程一步完成更加便捷，对于操作人员要求更低，更加易于普及并广泛应用。
附图说明
图1为本发明提供的微流控芯片的正面俯视结构示意图；
图2为所述物理筛选流道与所述废液流道相连通处的局部截面剖视图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
一种富集、纯化循环肿瘤细胞的微流控芯片，如图1～2所示，包括芯片本体，所述芯片本体包括位于所述芯片本体四角的定位孔1～4、加样孔5、样品反应腔6、物理筛选流道7、废液流道8、废液收集腔9、上表面镀有磁铁的磁力吸附腔体10、产物流道11、产物收集腔12和产物吸取孔13，所述加样孔5位于所述样品反应腔6上，所述产物吸取孔13位于所述产物收集腔12上，所述物理筛选流道7和所述产物流道11为管道结构，所述样品反应腔6与所述磁力吸附腔体10之间通过所述物理筛选流道7相连通，所述磁力吸附腔体10与所述产物收集腔12之间通过所述产物流道11相连通，所述物理筛选流道7与所述废液流道8通过位于所述物理筛选流道7下侧壁的缺口相连通，所述缺口的宽度为10μm，所述物理筛选流道7的临界半径为22μm，所述产物流道11的临界半径为25μm。
上述微流控芯片应用于富集、纯化循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：
步骤S1，从所述加样孔5向所述样品反应腔6中加入人类全血样品，随后加入含有包被了CD45、CD2抗体的免疫磁珠的反应液，常温温浴20分钟；
步骤S2，将所述芯片本体四角的定位孔1～4分别与离心机相应适配器对齐插入，固定芯片；
步骤S3，以300rpm的速率水平离心30min；
步骤S4，从所述产物吸取孔13中吸取分离纯化所得的循环肿瘤细胞。
本发明中提供的微流控芯片主要利用的力量为水平离心机旋转时所产生的离心力。首先从加样孔5向样品反应腔6中加入人类全血样品、含有包被了CD45、CD2抗体的免疫磁珠的反应液，经过常温温浴20分钟使得血样中白细胞表面结合了包被CD45、CD2抗体的免疫磁珠。随后在离心力的作用下，反应液从样品反应腔6流入物理筛选流道7。同样在离心力的作用下，物理筛选流道7中的血细胞首先会通过物理筛选流道7下侧壁的缺口向废液流道8中流动，并最终流入废液收集腔9中，但直径超过10μm的循环肿瘤细胞以及体积较大的白细胞则会被物理筛选流道7的侧壁拦截，并斜向运动至磁力吸附腔体10中。由于磁力吸附腔体10的上表面镀有磁铁，在磁力的作用下，与免疫磁珠结合的体积较大的白细胞被吸附在磁力吸附腔体10中，而余下的循环肿瘤细胞则继续在离心力的作用下，经过产物流道11最终到达产物收集腔12中。经过本方法分离纯化得到的循环肿瘤细胞可以通过产物吸取孔13取出，用于下一步的实验。
上述实施例仅是本发明的较优实施方式，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修饰、修改及替代变化，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种富集、纯化循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，包括芯片本体，所述芯片本体包括位于所述芯片本体四角的定位孔(1，2，3，4)、加样孔(5)、样品反应腔(6)、物理筛选流道(7)、废液流道(8)、废液收集腔(9)、上表面镀有磁铁的磁力吸附腔体(10)、产物流道(11)、产物收集腔(12)和产物吸取孔(13)，所述加样孔(5)位于所述样品反应腔(6)上，所述产物吸取孔(13)位于所述产物收集腔(12)上，所述物理筛选流道(7)和所述产物流道(11)为管道结构，所述样品反应腔(6)与所述磁力吸附腔体(10)之间通过所述物理筛选流道(7)相连通，所述磁力吸附腔体(10)与所述产物收集腔(12)之间通过所述产物流道(11)相连通，所述物理筛选流道(7)与所述废液流道(8)通过位于所述物理筛选流道(7)下侧壁的缺口相连通。
2.根据权利要求1所述的一种富集、纯化循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述缺口的宽度为8～12μm。
3.根据权利要求1～2所述的一种富集、纯化循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述物理筛选流道(7)的临界半径为20～25μm。
4.根据权利要求3所述的一种富集、纯化循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述产物流道(11)的临界半径为20～30μm。
5.根据权利要求4所述的一种富集、纯化循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述产物流道(11)的临界半径为25μm。
6.如权利要求1～2、4～5任意一项所述的微流控芯片应用于富集、纯化循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，从所述加样孔(5)向所述样品反应腔(6)中加入人类全血样品，随后加入含有包被了CD45、CD2抗体的免疫磁珠的反应液，常温温浴20分钟；
步骤S2，将所述芯片本体四角的定位孔(1，2，3，4)分别与离心机相应的适配器对齐插入，固定芯片；
步骤S3，以150～500rpm的速率水平离心15～45min；
步骤S4，从所述产物吸取孔(13)中吸取分离纯化所得的循环肿瘤细胞。
7.根据权利要求6所述的微流控芯片应用于富集、纯化循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，以300rpm的速率水平离心30min。
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Denomination of invention: A microfluidic chip for enriching and purifying circulating tumor cells Granted publication date: 20231208 Pledgee: Bank of Ningbo Co.,Ltd. Suzhou Branch Pledgor: SUZHOU HUIZHEN MEDICAL TESTING Co.,Ltd. Registration number: Y2024980008822 |