CN104711188A - 一种分离血液流体中肿瘤细胞的装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种分离血液流体中肿瘤细胞的装置，包括通过主循环管道依次串联且能循环流通的流体进样口、第一驱动泵、分离柱和流体出样口，所述第一驱动泵为蠕动泵，且在所述主循环管道上还设置有抗凝生理盐水注入口和抗凝拮抗剂注入口；所述分离柱中设置有两个以上的子过滤柱，且每个子过滤柱上均设置有用于分离肿瘤细胞的径迹蚀刻膜，所述径迹蚀刻膜的孔径为5-25um，且每个子过滤柱中的径迹蚀刻膜形成独立的立体过滤通道；所述装置还包括细胞收集器；所述装置先后构成过滤和脱离两条运行通路。所述装置是现有技术中一发明专利的省略发明。本发明的装置能实现其全部功能。
Description
技术领域
本发明涉及流体中细胞分离领域，具体涉及一种分离血液流体中肿瘤细胞的装置。
背景技术
现有技术中，在需要分离和检测活体动物(包括人体)血液中癌细胞(circulating tumorcells，CTC)时，大多是通过抽取一定量的血液，再经过密度梯度离心法等方法进行细胞分选和计数。密度梯度离心法是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分选。但其缺点明显。因此，本领域需要一种新的装置和方法用于分离和检测活体动物血液中癌细胞的数目。近年来，本领域出现通过使用径迹蚀刻膜来分离血液中癌细胞的方法，例如崔浣华、王世成等人公开的《聚碳酸酯径迹微孔滤膜的制备和应用》中公开使用径迹微孔滤膜诊断血液中的癌细胞，具体是将截留在径迹微孔滤膜上的癌细胞放入显微镜下观察。本发明的发明人也使用该膜来分离某些活体动物(如小兔子)和人的血液中的癌细胞并对该癌细胞进行诊断和计数。但这样的方法对应的装置仅能一次分离活体动物极少部分血液中的癌细胞，而不能对活体动物的大部分或全部血液中的癌细胞进行有效分离，尤其对于个体较大的活体动物(如人体)来说，这一缺陷显得尤为突出。原因是，为了保持动物处在正常生存状态下不可能将活体动物的全身血液放光以分离其中癌细胞，这样个体会死亡。另外，由于血液中的肿瘤细胞(CTC)数量极为稀少，如果只抽取活体动物的少量血液进行分离检测，其分离检测的敏感性会大大降低；而增加处理血液量，对活体动物的健康和生命都是威胁。
因此，本发明的发明人在先申请的已授权专利CN201410016566.3中提供一种流体膜过滤细胞分离装置(如本发明附图5所示)，包括第一驱动泵(1)、第二驱动泵(2)、分离柱(3)、检测柱(4)和若干个三通阀和副驱动泵，所述副驱动泵包括第一副泵(11)和第二副泵(12)；所述分离柱的一端通过第一三通阀(5)与第一驱动泵(1)相连，另一端通过第二三通阀(6)与第二驱动泵(2)相连，所述检测柱(4)与第一三通阀(5)的第三个通道口相连；所述分离柱(3)内包含并联的至少五根子过滤柱，所述子过滤柱包括固定支架和依附在固定支架底端及侧面四周的聚碳酸酯或聚酯材质的径迹蚀刻膜(7)，径迹蚀刻膜孔径为5-25μm；所述检测柱(4)包含活动连接的上下两部分，两部分的外侧均设置与管道相适应的液体通道口(8)，密封的两部分之间的内空处设置一层聚碳酸酯或聚酯材质的径迹蚀刻膜(7)，径迹蚀刻膜的孔径为5-25μm；且在第一驱动泵(1)与第一三通阀(5)之间设置第三三通阀(9)，所述第三三通阀的另一通道与驱动抗凝生理盐水的第一副泵(11)连接，和在第二三通阀(6)与出样口(21)之间设置第四三通阀(10)，所述第四三通阀与驱动抗凝拮抗剂的第二副泵(12)连接；所述装置利用三通阀、分离柱和检测柱构成两条运行通路；其中，第一条通路为大样本量的细胞混悬液从细胞液体容器(18)经进样口(20)、第一驱动泵(1)、第一三通阀(5)进入分离柱(3)而后从另一端流出，进行过滤后再通过出样口(21)回到细胞液体容器(18)，通过细胞液体容器-泵-分离柱的不断循环来进行分离，达到高效分离特定大体积细胞的目的；第二条通路为调节第一三通阀(5)和第二三通阀(6)，关闭进样口(20)和分离柱(3)的连接通道，流体从第二驱动泵(2)反向流过分离柱(3)而后从另一端流出，进入检测柱(4)，该通路对分离柱(3)上截留下来的特定大体积细胞进一步进行富集，将其集中在检测柱(4)的过滤膜上，以便对膜上细胞进行各项下游操作检测，废液从检测柱(4)的另一端流出。
但本发明的发明人在随后的研究中发现该装置仍有不足，本领域技术人员仍需要在改进该装置方面做出努力。
发明内容
因此，本发明提供一种分离血液流体中肿瘤细胞的装置，包括通过主循环管道依次串联且能循环流通的流体进样口、第一驱动泵、分离柱和流体出样口，所述第一驱动泵为蠕动泵，且在所述进样口和分离柱之间的主循环管道上还设置有抗凝生理盐水注入口，以及在所述分离柱和出样口之间的主循环管道上还设置有抗凝拮抗剂注入口；
所述抗凝拮抗剂注入口与所述分离柱之间的主循环管道为没有任何侧壁开口的封闭管道，且所述抗凝拮抗剂注入口与所述出样口之间的主循环管道也为没有任何侧壁开口的封闭管道；所述分离柱中设置有两个以上的子过滤柱，且每个子过滤柱上均设置有用于分离肿瘤细胞的径迹蚀刻膜，所述径迹蚀刻膜的孔径为5-25um，且每个子过滤柱中的径迹蚀刻膜形成独立的立体过滤通道；所述装置还包括细胞收集器；
所述装置先后构成两条运行通路；其中，第一条通路为血液从细胞液体容器经进样口、第一驱动泵进入分离柱而后从其另一端流出，再通过出样口回到细胞液体容器，通过细胞液体容器-泵-分离柱的不断循环来进行过滤分离，达到高效分离血液中肿瘤细胞的目的；同时分别从所述抗凝生理盐水注入口和所述抗凝拮抗剂注入口向主循环管道中注入抗凝生理盐水和抗凝拮抗剂；第二条通路为与第一条通路流动方向相反的非循环通路，其中，第二液流从所述出样口和/或所述抗凝拮抗剂注入口注入主循环管道中，第二液流流经所述分离柱并流至位于第二液流流动方向上的分离柱下游的细胞收集器中。
本发明提供的径迹蚀刻膜7的孔径与待分离的癌细胞的大小匹配，使得血液中正常的红细胞、白细胞和血小板以及其他小分子均能正常滤过，而癌细胞截留在径迹蚀刻膜7的上游侧。本发明中，所述径迹蚀刻膜7可以设置在固定支架的外侧、内侧或嵌在支架中，本发明中对此无限制。本发明中，所述分离柱3和检测柱42均可以自由地水平放置或竖直放置或以其它方式放置，均不影响本发明的实施。
本发明中，每个子过滤柱中的径迹蚀刻膜形成独立的立体过滤通道是指子过滤柱中的径迹蚀刻膜并非是单张平面径迹蚀刻膜，也不是由流体同一方向流动所经过的平行的多张平面径迹蚀刻膜。本发明中，朝不同方向设置的径迹蚀刻膜封闭地构成(或者与膜支架共同构成)子过滤柱的过滤通道。本发明中，所述径迹蚀刻膜可以形成圆柱形流体通道，也可以形成立方体形流体通道。例如片状子过滤柱的平行相对的两个最大表面封闭径迹蚀刻膜(流动流经这两张径迹蚀刻膜的方向不同)，而其它几个小的表面使用塑料封闭，除入口面以外的其它五个表面构成立体的过滤通道。
在本发明中，某段主循环管道为没有任何侧壁开口的封闭管道是指没有任何流体流动管道接入该段主循环管道中而供流体从此处流入或流出主循环管道。
本领域技术人员能理解的，所述抗凝生理盐水注入口9可以位于流体进样口20与所述蠕动泵1之间，也可以位于所述蠕动泵1和分离柱3之间，都不影响本发明的实施。
本发明中，用于反向冲出截留在径迹蚀刻膜上的肿瘤细胞的第二液流可以是PBS、TBS等缓冲液，或者是等渗液生理盐水。
在一种具体的实施方案中，使用第一驱动泵反向运转驱动完成所述第二液流在第二条通路中的流动，所述细胞收集器连接在第二液流流动方向上的第一驱动泵下游。
在另一种具体的实施方案中，所述装置还包括通过管道从所述抗凝生理盐水注入口连接至主循环管道的第一副泵，且所述第一副泵为蠕动泵；使用第一副泵驱动完成所述第二液流在第二条通路中的流动，所述细胞收集器连接在第二液流流动方向上的第一副泵下游。
在另一种具体的实施方案中，所述装置还包括通过管道从所述抗凝拮抗剂注入口连接至主循环管道的第二副泵，所述第二副泵为蠕动泵；使用第二副泵驱动完成所述第二液流在第二条通路中的流动，所述细胞收集器连接在第二液流流动方向上的分离柱下游。
本领域技术人员能理解的，第一驱动泵1至少驱动血液流体在第一条通路中的循环流动，但第二条通路中第二液流流动的驱动力由所述第一驱动泵1提供时，所述第一驱动泵1必须是能正向转动和反向转动的蠕动泵。所述第一副泵11和第二副泵12可以是蠕动泵或推动泵，这是根据该泵是否在第二条通路运行过程中发挥作用而决定的，若其为第二条通路提供驱动力，则其必然选择蠕动泵，且第一副泵11必须是能正向转动和反向转动的蠕动泵。
优选地，所述分离柱与所述抗凝生理盐水注入口之间的主循环管道为没有任何侧壁开口的封闭管道。
在一种具体的实施方案中，所述细胞收集器为流体收集容器或检测柱，且所述检测柱中含有平面设置的径迹蚀刻膜，所述检测柱能将流过分离柱后的第二液流中的肿瘤细胞富集。
本发明中所述流体收集容器41将从分离柱3上反向冲出的肿瘤细胞和第二液流(如以生理盐水为主体)全部收集，再送入离心装置中离心得到肿瘤细胞。此处的离心操作不同于背景技术中对血液原液的离心操作，因为经本发明装置过滤和反冲后得到的液体的离心是组分非常简单的固液分离，且此时的离心操作即使是针对大量的液体样本也可以方便快捷地完成。
所述检测柱42中包含径迹蚀刻膜，它能将所述第二液流的主体部分滤过、同时将其中夹带的肿瘤细胞富集在其径迹蚀刻膜的上游侧。本发明中，所述检测柱42可以直接送至检测仪器下进行肿瘤细胞的检测。也就是说，在本发明中，所述“检测柱42”的实质意思是肿瘤细胞分离富集柱。
在上述方法的一种具体实施方式中，所述细胞液体容器18为活体动物或人体，在第一条通路中，进样口20连接活体动物或人体的动脉，出样口21连通所述活体动物或人体的静脉，使得活体动物或人体血液在本发明装置作用下实现癌细胞过滤分离除去而不会再返回其体内。
本发明中，所述“抗凝生理盐水”是指含抗凝剂的生理盐水，所述抗凝剂例如为EDTA盐或枸橼酸(柠檬酸)盐等，将“抗凝生理盐水”加入主循环管道中使得流体(含癌细胞的血液)在进入分离柱3后与所述径迹蚀刻膜7接触的过程中不会血液凝固。所述“抗凝拮抗剂”是指含抗凝剂的拮抗剂的生理盐水，所述“抗凝剂的拮抗剂”为钙盐，如氯化钙。已经滤除癌细胞的血液送回活体动物(含人体)体内之前，必须在分离柱3下游的主循环管道加入所述“抗凝拮抗剂”，如此才能使得添加了抗凝剂的血液不会因直接导入活体动物而对其产生毒害作用。
经过本发明中装置第一条通路中的循环后，可以循环流动使得回流的血液中的癌细胞几乎全部或绝大部分被去除，该装置不需耗损活体动物或人体的一滴血液即可达到清除血液中癌细胞的效果。如此以来，定期使用本发明中的装置滤除血液中的癌细胞后，可以阻断癌细胞经血液途径从活体动物或人体的一种器官至另外的器官之间的转移。尤其是在优选的含多条并列膜管或多片并列的膜片(多个子过滤柱)的分离柱3的方案中，大面积的径迹蚀刻膜7使得过滤的通量大幅增加，可以满足在所述细胞液体容器18中的流体总量高达5L(与人体的血液总量相当)时的高效过滤分离。也就是说，本发明的装置为癌症转移的治疗和体内癌细胞减少提供了一种开拓性的新方法和新装置，具有极高的经济价值和社会价值。
综上所述，在先申请中通过第一驱动泵1的驱动(同时第一副泵11和第二副泵12分别用于向管道中注入抗凝生理盐水和抗凝拮抗剂)实现第一条通路的过滤，通过第二驱动泵2的驱动实现分离柱3中的肿瘤细胞从膜上脱离进入第二液流的过程。
而本发明中省略了第二驱动泵2及其与主循环管道连通的管道的使用，而利用在本发明中必然要存在的另一个驱动泵(第一驱动泵1)驱动第二液流的流动，或利用可以存在的第一副泵11和/或第二副泵12(在先专利中第一副泵11和第二副泵12均为必须存在的泵，而本发明中的第一副泵和第二副泵也是必须的，但其可以通过在第一驱动泵1上增加并联的泵头来等同替换)来驱动第二液流的流动。
也就是说，现在发明人发现，在先专利中用于肿瘤细胞从分离柱3上脱离的第二驱动泵2是不必要存在的，省略该泵时，本发明的装置仍然可以实现该脱离功能。也就是说，本发明相比最接近的现有技术来说，在省去一项其中必要的要素后，装置的相应功能并未因此消失。因此，申请人提出上述要素省略发明。
使用本发明的装置，不仅可以分离活体动物或人体体内的癌细胞，直接减少血液中循环的癌细胞数目，进而防止肿瘤在不同器官之间的转移；本发明还可以达到诊断活体动物或人体的血液中是否存在癌细胞(癌细胞是否已经从原发灶转移到血液中)和检测血液中癌细胞数目的目的。
本领域技术人员可以理解地，上述只说明了本发明装置中分离柱3在第一条通路和第二条通路中的安装并不调头的情况。实际上，当启动第二条通路前，使用者将所述分离柱3反接，这样依然正向驱动(与第一条通路中的蠕动泵转动方式相同)第一驱动泵1即可实现分离柱中癌细胞与所述径迹蚀刻膜7的脱离。相应地，在分离柱3的下游接上所述细胞收集器(4)即可。
使用本发明中的方法和装置，不仅实现了对大量血液中癌细胞数目的检测和计数。而且还能直接将本发明中的装置连通活体动物或人体的血管，从而在不抽出一滴活体动物或人体血液的情况下实现对活体动物或人体的血液中总癌细胞数目的计数。此外，在本发明中第一驱动泵的作用下，相应还能实现清除血液中癌细胞，防止癌细胞从原发灶向体内另外器官的转移的效果。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例的第一条通路的结构示意图；
图2是本发明优选实施例的第二条通路的结构示意图；
图3是本发明优选实施例的另一种第二条通路的结构示意图；
图4是本发明优选实施例的另一种第二条通路的结构示意图；
图5是本发明在先专利中装置的整体结构示意图；
图6为本发明的装置效果与传统的现有技术的装置效果的对比图。
1、第一驱动泵，2、第二驱动泵，3、分离柱，4、细胞收集器(检测柱)，41、流体收集容器，42、检测柱，5、第一三通阀，6、第二三通阀，7、径迹蚀刻膜，8、液体通道口，9、抗凝生理盐水注入口(第三三通阀)，10、抗凝拮抗剂注入口(第四三通阀)，11、第一副泵，12、第二副泵，18、细胞液体容器，20、进样口，21、出样口；其中括号内容为图5的现有技术中的对应的标记内容。
具体实施方式
如图1和图2中提供了一种分离血液流体中肿瘤细胞的装置，包括通过主循环管道依次串联且能循环流通的流体进样口、第一驱动泵、分离柱和流体出样口，所述第一驱动泵为蠕动泵，且在所述进样口和分离柱之间的主循环管道上还设置有抗凝生理盐水注入口，以及在所述分离柱和出样口之间的主循环管道上还设置有抗凝拮抗剂注入口；所述抗凝拮抗剂注入口与所述分离柱之间的主循环管道为没有任何侧壁开口的封闭管道，且所述抗凝拮抗剂注入口与所述出样口之间的主循环管道也为没有任何侧壁开口的封闭管道；所述分离柱中设置有两个以上的子过滤柱，且每个子过滤柱上均设置有用于分离肿瘤细胞的径迹蚀刻膜，所述径迹蚀刻膜的孔径为5-25um；所述装置还包括细胞收集器；所述装置先后构成两条运行通路；其中，第一条通路(图1)为血液从细胞液体容器经进样口、第一驱动泵进入分离柱而后从其另一端流出，再通过出样口回到细胞液体容器，通过细胞液体容器-泵-分离柱的不断循环来进行过滤分离，达到高效分离血液中肿瘤细胞的目的；同时分别从所述抗凝生理盐水注入口和所述抗凝拮抗剂注入口向主循环管道中注入抗凝生理盐水和抗凝拮抗剂；第二条通路(图2)为与第一条通路流动方向相反的非循环通路，其中，第二液流从所述出样口和/或所述抗凝拮抗剂注入口注入主循环管道中，第二液流流经所述分离柱并流至位于第二液流流动方向上的分离柱下游的细胞收集器中。
图1中的细胞液体容器18为人体或活体动物，从出样口21至细胞液体容器18的管道和从细胞液体容器18至进样口20的管道为人体或活体动物体内的血管。
图2为使用第一驱动泵1和/或第二副泵12驱动完成所述第二液流在第二条通路中的流动，所述细胞收集器4连接在第二液流流动方向上的第一驱动泵1下游。
图3为使用第一副泵11驱动完成所述第二液流在第二条通路中的流动，所述细胞收集器4连接在第二液流流动方向上的第一副泵11下游。图3中位于细胞收集器4左边的短管是表示可以在第一条通路中从此处注入抗凝生理盐水。也就是说，第一条通路和第二条通路所用的装置当然可以均集成在同一台设备中。
图4为将图2中的流体收集容器41改为检测柱42的装置，在图4中第二条通路中的第二液流完成流动过程后，取下所述检测柱42即可送入检测装置(如显微镜)下进行检测，而不再需要对流体收集容器41中的流体进行离心获取肿瘤细胞。
参见图6，利用本发明装置和常规分离装置进行体外实验的分离结果比较。
先分别配置A549、LLC、H520、H1299四种肺癌细胞各1000个与生理盐水共同形成5L细胞悬浮液。
本发明的装置中分离柱的直径为6厘米，长11厘米，分离柱中装有11根直径为1厘米，长10厘米的并列的圆柱形过滤子柱。所述分离柱的总有效过滤面积是354平方厘米。细胞悬浮液在分离柱上做循环流动，该分离柱处理的细胞悬浮液总量为5L，流体流速为250毫升/分钟。
常规分离装置，其分离柱的形状和结构类似于本发明中的检测柱4，其直径为6厘米的径迹蚀刻膜的有效过滤面积为28.26平方厘米。细胞悬浮液在分离柱上一次性过滤，而不是循环流动，该分离柱处理的上述细胞悬浮液总量为5mL。因此，理论上来说该细胞悬浮液中只含有1个细胞左右。
图6中，实心点表示本发明装置所得结果，空心点表示常规分离装置所得结果。从图中可以看到，本发明装置所分选到的完整、无破损的A549、LLC、H520、H1299四种肺癌细胞的数目分别为988.33±148.17、862.67±103.65、1048±79.3、855±91.39个。配置细胞悬浮液中使用的1000个细胞以及图6中的结果数据都是通过细胞计数仪得到的，因此会有些许误差。而常规分离装置的多次分离结果会在理论值(1个癌细胞)上下浮动；这样得到的数据无法用于准确判断活体动物(包括人体)体内的血液中是否有癌细胞的存在或者血液中癌细胞的多少。
本发明的装置在省略第二驱动泵2及其相应管道的情况下，能实现与在先专利CN201410016566.3同等的功能。
癌细胞的大小比正常血细胞的体积大，本发明装置中在血液一次流过分离柱的过程中即使可能有部分癌细胞透过该膜，也可能会有极少部分血细胞截留在膜上；但因为本发明中的装置的分离步骤是循环进行的，因而在血液多次流过分离柱后，膜对正常血细胞和癌细胞之间的分离就会非常彻底。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种分离血液流体中肿瘤细胞的装置，包括通过主循环管道依次串联且能循环流通的流体进样口(20)、第一驱动泵(1)、分离柱(3)和流体出样口(21)，所述第一驱动泵(1)为蠕动泵，且在所述进样口(20)和分离柱(3)之间的主循环管道上还设置有抗凝生理盐水注入口(9)，以及在所述分离柱(3)和出样口(21)之间的主循环管道上还设置有抗凝拮抗剂注入口(10)；
所述抗凝拮抗剂注入口(10)与所述分离柱(3)之间的主循环管道为没有任何侧壁开口的封闭管道，且所述抗凝拮抗剂注入口(10)与所述出样口(21)之间的主循环管道也为没有任何侧壁开口的封闭管道；所述分离柱(3)中设置有两个以上的子过滤柱，且每个子过滤柱上均设置有用于分离肿瘤细胞的径迹蚀刻膜(7)，所述径迹蚀刻膜的孔径为5-25um，且每个子过滤柱中的径迹蚀刻膜(7)形成独立的立体过滤通道；所述装置还包括细胞收集器(4)；
所述装置先后构成两条运行通路；其中，第一条通路为血液从细胞液体容器(18)经进样口(20)、第一驱动泵(1)进入分离柱(3)而后从其另一端流出，再通过出样口(21)回到细胞液体容器(18)，通过细胞液体容器-泵-分离柱的不断循环来进行过滤分离，达到高效分离血液中肿瘤细胞的目的；同时分别从所述抗凝生理盐水注入口(9)和所述抗凝拮抗剂注入口(10)向主循环管道中注入抗凝生理盐水和抗凝拮抗剂；第二条通路为与第一条通路流动方向相反的非循环通路，其中，第二液流从所述出样口(21)和/或所述抗凝拮抗剂注入口(10)注入主循环管道中，第二液流流经所述分离柱(3)并流至位于第二液流流动方向上的分离柱(3)下游的细胞收集器(4)中。
2.根据权利要求1所述装置，其特征在于，使用第一驱动泵(1)反向运转驱动完成所述第二液流在第二条通路中的流动，所述细胞收集器(4)连接在第二液流流动方向上的第一驱动泵(1)下游。
3.根据权利要求1所述装置，其特征在于，所述装置还包括通过管道从所述抗凝生理盐水注入口(9)连接至主循环管道的第一副泵(11)，且所述第一副泵(11)为蠕动泵；使用第一副泵(11)驱动完成所述第二液流在第二条通路中的流动，所述细胞收集器(4)连接在第二液流流动方向上的第一副泵(11)下游。
4.根据权利要求1所述装置，其特征在于，所述装置还包括通过管道从所述抗凝拮抗剂注入口(10)连接至主循环管道的第二副泵(12)，所述第二副泵(12)为蠕动泵；使用第二副泵(12)驱动完成所述第二液流在第二条通路中的流动，所述细胞收集器(4)连接在第二液流流动方向上的分离柱(3)下游。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述装置，其特征在于，所述分离柱(3)与所述抗凝生理盐水注入口(9)之间的主循环管道为没有任何侧壁开口的封闭管道。
6.根据权利要求1～4中任意一项所述装置，其特征在于，所述细胞收集器(4)为流体收集容器(41)或检测柱(42)，且所述检测柱中含有平面设置的径迹蚀刻膜(7)，所述检测柱(42)能将流过分离柱(3)后的第二液流中的肿瘤细胞富集。
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