CN109557296B - 一种循环检测肿瘤细胞药物敏感性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测循环肿瘤细胞药物敏感性的方法，所述方法使用EpCAM抗体和EGFR抗体特异性识别待测样品中的循环肿瘤细胞，使用微流控芯片筛除所述处理过的待测样本保留循环肿瘤细胞，然后使用微流控芯片实时监测循环肿瘤细胞获得循环肿瘤细胞药物敏感性结果。

Description

一种循环检测肿瘤细胞药物敏感性的方法
技术领域
本发明涉及一种检测循环肿瘤细胞药物敏感性的方法。
背景技术
近年来，在中国恶性肿瘤已经成为导致疾病死亡的首要原因，对我们的健康造成了巨大的威胁。目前肿瘤的治疗手段中，化疗是治疗癌症最有效的手段之一，和手术，放疗一起并称癌症的三大治疗手段。其中，手术和放疗属于局部治疗，只对治疗部位的肿瘤有效，对于潜在的转移病灶和已经发生临床转移的癌症就难以发挥有效治疗了。而化疗是一种全身治疗的手段，化疗药物都会随着血液循环遍布全身的绝大部分器官和组织。因此，如何提高化疗的效果，对肿瘤病人，尤其是已经转移的中晚期肿瘤，有重大的临床意义。
然而，目前临床上，还没有一项成熟的方法可以对于病人化疗药物敏感性进行检测，本发明将提供一种新的检测循环肿瘤细胞药物敏感性的方法，目的是为临床肿瘤病人化疗提供一个系统性的药物敏感性筛查报告和用药参考。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测循环肿瘤细胞药物敏感性的方法。
一种检测循环肿瘤细胞药物敏感性的方法，所述方法使用EpCAM抗体和EGFR抗体特异性识别待测样品中的循环肿瘤细胞，获得处理过的待测样本；所述处理过的待测样本富集了抓捕的循环肿瘤细胞。
所述检测肿瘤细胞药物敏感性的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：使用所述EpCAM抗体和所述EGFR抗体特异性识别待测样品中的循环肿瘤细胞后；加入携带有抗EpCAM抗体和抗EGFR抗体的二抗磁珠，然后磁力吸附，洗脱细胞，获得处理过的待测样本；所述处理过的待测样本中循环肿瘤细胞与磁珠、EpCAM抗体和EGFR抗体结合成为循环肿瘤细胞复合体。
所述检测肿瘤细胞药物敏感性的方法，其特征在于所述方法还包括以下步骤：使用微流控芯片筛除所述处理过的待测样本中非特异淋巴细胞和保留循环肿瘤细胞复合体，然后使用微流控芯片实时监测循环肿瘤细胞复合体，获得循环肿瘤细胞药物敏感性结果。
所述微流控芯片包括第一流体入口通道、第一流体出口通道、第二流体入口通道、第二流体出口通道和颗粒保留结构，所述第一流体入口通道、所述第一流体出口通道、所述第二流体入口通道和所述第二流体出口通道末端都连接到所述颗粒保留结构；液体试剂由第一流体入口通道或第二流体入口通道进入到所述颗粒保留结构中，由第一流体出口通道或第一流体出口通道由所述颗粒保留结构流出所述微流控芯片；通过外部的监测仪器可以实时监测所述颗粒保留结构中的细胞。
外部的监测仪器选自显微镜、荧光监测仪器中的一种或几种。
所述使用微流控芯片筛除所述处理过的待测样本中非特异淋巴细胞和保留循环肿瘤细胞复合体的步骤为：通过显微镜监测所述颗粒保留结构，当看到循环肿瘤细胞复合体时，在第一流体入口通道加入液体或第一流体出口通道吸出液体，控制所述微流控芯片中液体的流速，使得非特异淋巴细胞通过或第一流体出口通道流出所述微流控芯片，而循环肿瘤细胞复合体停留在所述颗粒保留结构，当看到循环肿瘤细胞复合体停留在所述颗粒保留结构未发生移动达十五分钟后，即认为循环肿瘤细胞复合体已经固定在所述颗粒保留结构中。
所述使用微流控芯片实时监测循环肿瘤细胞复合体的步骤为：通过显微镜监测所述颗粒保留结构，通过第二流体入口通道加入标记有荧光信号的药物溶液，获得循环肿瘤细胞药物敏感性结果。
所述微流控芯片的所述第一流体入口通道、所述第一流体出口通道、所述第二流体入口通道、所述第二流体出口通道和颗粒保留结构通道里含有大量亲水性材料。
所述待测样品为外周血、胸腔积液。
所述循环肿瘤细胞为肺癌肿瘤细胞。
一种检测肿瘤细胞药物敏感性的方法，所述方法的操作步骤包括：
步骤(1)循环肿瘤细胞抓捕：使用EpCAM抗体和EGFR抗体，特异性识别待测样品中的循环肿瘤细胞，获得处理过的待测样本；所述处理过的待测样本富集了抓捕的循环肿瘤细胞；
步骤(2)纯化处理过的待测样本：将处理过的待测样本加入到微流控芯片，筛除处理过的待测样本中非特异淋巴细胞，将抓取出来的循环肿瘤细胞固定于微流控芯片中；
步骤(3)荧光检测：在固定循环肿瘤细胞的微流控芯片中加入荧光标记的化疗药物，实时检测药物进入细胞的情况和含量；
步骤(4)根据所述步骤(3)的实验数据，给出肿瘤细胞药物敏感性报告。
所述EpCAM抗体和EGFR抗体特异性识别待测样品中的循环肿瘤细胞后，加入携带有抗EpCAM抗体和抗EGFR抗体的二抗磁珠，然后磁力吸附，洗脱细胞，获得处理过的待测样本。
以人体全血或者胸腔积液为例：进入微流芯片的物质就包括：游离磁珠，大量的淋巴细胞，以及与磁珠、所述EpCAM抗体和所述EGFR抗体三者结合的循环肿瘤细胞。这些磁珠、淋巴细胞和循环肿瘤细胞的大小各不相同，通过大量的实验验证可知循环肿瘤细胞和磁珠结合后的体积是最大的，大约是淋巴细胞的两到三倍，而淋巴细胞比游离磁珠的体积大一倍左右，根据游离磁珠、淋巴细胞和循环肿瘤细胞大小，筛除非特异淋巴细胞和多余的磁珠，进而保留循环肿瘤细胞。
本发明提供一种检测循环肿瘤细胞药物敏感性的方法，所述方法使用EpCAM抗体和EGFR抗体特异性识别待测样品中的循环肿瘤细胞，使用微流控芯片筛除所述处理过的待测样本保留循环肿瘤细胞，然后使用微流控芯片实时监测循环肿瘤细胞复，获得循环肿瘤细胞药物敏感性结果。
本项技术的优势：
1.帮助肿瘤病人检测化疗药物敏感性的诊断技术只需要一次性抽取7ml血液样本，所以基本是无创检测；
2.通过检测得到的结果，可以快速给予最优化疗组合建议；
3.化疗过程中，可以实时检测病人对药物的敏感性得变化，让医生更加快速的做出应对；
4.为病人大幅度的减少经济负担。
附图说明
图1为微流控芯片的结构示意图
1-第一流体入口通道；2-第一流体出口通道；3-第二流体入口通道；4-第二流体入口通道；5-颗粒保留结构；S-颗粒保留结构的中心位置。
具体实施方式
为了更好理解本发明的技术方案和优点，以下通过具体实施方式，并结合附图对本发明做进一步说明。
实施例1循环肿瘤细胞抓捕
1)取患者外周血样本7ml于1管于EDTA抗凝管中。上下轻轻颠倒4-6次充分混匀后，室温放置；
2)外周血与生理盐水等体积混合，上下颠倒混匀，确保无明显细胞团块；
3)取3ml细胞分层液于15ml离心管中，并小心的吸取稀释的血细胞4ml沿管壁叠加于分层液面上，体积大于4ml的分多管进行。水平离心，1500rpm，室温条件下离心20分钟；
4)小心吸取淋巴细胞层，置于另一离心管中，加入5倍以上体积的无菌生理盐水，1500rpm室温条件下离心10分钟；
5)将离心得到的细胞团用配置好的1：500抗体稀释液重悬，室温孵育2小时，得到细胞抗体孵育液；
4)将带有抗体的磁珠加入细胞抗体孵育液中，15分钟后，磁力吸附，洗脱细胞，得到处理过的待测样本。
抗体稀释液的成分如下所示：
方案1：EpCAM抗体的浓度为0.8ug，EGFR抗体的浓度为0.8ug，带有抗体的磁珠所携带的抗体为抗EpCAM抗体和抗EGFR抗体。
方案2：EpCAM抗体的浓度为0.8ug，带有抗体的磁珠所携带的抗体为抗EpCAM抗体。
方案3：EGFR抗体的浓度为0.8ug，带有抗体的磁珠所携带的抗体为抗EGFR抗体。
模拟循环肿瘤细胞用方案1-3的抗体稀释液的回收率，实验结果如表1所示。
表格1方案1-3的循环肿瘤细胞回收率
方案1 方案2 方案3
循环肿瘤细胞回收率 85％ 44％ 32％
从表格1的循环肿瘤细胞回收率可以看出，方案1的回收率高于方案2和方案3，说明方案1中使用2种抗体的回收率更高一些。
实施例2
步骤(1)循环肿瘤细胞抓捕
1)取患者外周血样本7ml于1管EDTA抗凝管中。上下轻轻颠倒4-6次充分混匀后，室温放置；
2)外周血与生理盐水等体积混合，上下颠倒混匀，确保无明显细胞团块；
3)取3ml细胞分层液于15ml离心管中，并小心的吸取稀释的血细胞4ml沿管壁叠加于分层液面上，体积大于4ml的分多管进行。水平离心，1500rpm，室温条件下离心20分钟；
4)小心吸取淋巴细胞层，置于另一离心管中，加入5倍以上体积的无菌生理盐水，1500rpm室温条件下离心10分钟；
5)将离心得到的细胞团用配置好的1：500抗体稀释液重悬，抗体稀释液中EpCAM抗体的浓度为0.8ug，EGFR抗体的浓度为0.8ug，室温孵育2小时，得到细胞抗体孵育液；
6)将带有抗体的磁珠加入细胞抗体孵育液中，15分钟后，磁力吸附，洗脱细胞，得到处理过的待测样本。
步骤(2)纯化处理过的待测样本
1)将所述步骤(1)循环肿瘤细胞抓捕获得的处理过的待测样本，用移液枪通过第一流体入口加入到微流控芯片中；
2)通过显微镜监测所述颗粒保留结构，当看到循环肿瘤细胞复合体时，在第一流体入口通道加入液体或第一流体出口通道吸出液体，控制所述微流控芯片中液体的流速，使得非特异淋巴细胞通过或第一流体出口通道流出所述微流控芯片，而循环肿瘤细胞复合体停留在所述颗粒保留结构；
3)当看到循环肿瘤细胞复合体停留在所述颗粒保留结构未发生移动达十五分钟后，即认为循环肿瘤细胞复合体已经固定在所述颗粒保留结构中；即得到固定有肿瘤细胞的微流控芯片。
步骤(3)荧光检测
1)将固定有肿瘤细胞的微流控芯片放置到荧光显微镜上，调节好荧光显微镜的参数，等待荧光显微镜的图形稳定后，从微流控芯片的第二流体入口通道，用移液枪加入肿瘤药物测；
2)荧光显微镜实时监测微流控芯片中肿瘤细胞中的荧光信号；
3)保存实验结果。
步骤(4)根据所述步骤(3)的实验数据，给出肿瘤细胞药物敏感性结果。
实施例3
根据实施例2所述的方法，经完成2例临床肺癌患者的诊断，诊断结果如下表格2所示。
表2：2例临床肺癌患者的肿瘤细胞药物敏感性结果
Figure BDA0001875150250000061

Claims (5)

1.一种用于非疾病诊断目的的检测肿瘤细胞药物敏感性的方法，其特征在于：首先，使用EpCAM抗体和EGFR抗体特异性识别待测样品中的循环肿瘤细胞；其次，加入携带有抗EpCAM抗体和抗EGFR抗体的二抗磁珠，然后磁力吸附，洗脱细胞，获得带有循环肿瘤细胞复合体的待测样本；最后，使用微流控芯片筛除所述处理过的待测样本中非特异淋巴细胞和保留循环肿瘤细胞复合体; 所述微流控芯片包括第一流体入口通道、第一流体出口通道、第二流体入口通道、第二流体出口通道和颗粒保留结构，所述第一流体入口通道、所述第一流体出口通道、所述第二流体入口通道和所述第二流体出口通道末端都连接到所述颗粒保留结构；液体试剂由第一流体入口通道或第二流体入口通道进入到所述颗粒保留结构中，由第一流体出口通道或第二流体出口通道由所述颗粒保留结构流出所述微流控芯片；通过外部的监测仪器可以实时监测所述颗粒保留结构中的细胞；通过第二流体入口通道加入标记有荧光信号的药物溶液，获得循环肿瘤细胞药物敏感性结果。
2.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的检测肿瘤细胞药物敏感性的方法，其特征在于外部的监测仪器选自显微镜和/或荧光监测仪器。
3.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的检测肿瘤细胞药物敏感性的方法，其特征在于所述使用微流控芯片筛除所述处理过的待测样本中非特异淋巴细胞和保留循环肿瘤细胞复合体的步骤为：通过显微镜监测所述颗粒保留结构，当看到循环肿瘤细胞复合体时，在第一流体入口通道加入液体或第一流体出口通道吸出液体，控制所述微流控芯片中液体的流速，使得非特异淋巴细胞通过第一流体出口通道流出所述微流控芯片，而循环肿瘤细胞复合体停留在所述颗粒保留结构，当看到循环肿瘤细胞复合体停留在所述颗粒保留结构未发生移动达十五分钟后，即认为循环肿瘤细胞复合体已经固定在所述颗粒保留结构中。
4.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的检测肿瘤细胞药物敏感性的方法，其特征在于所述微流控芯片的所述第一流体入口通道、所述第一流体出口通道、所述第二流体入口通道、所述第二流体出口通道和颗粒保留结构通道里含有大量亲水性材料。
5.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的检测肿瘤细胞药物敏感性的方法，其特征在于所述待测样品为外周血或胸腔积液。
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