CN204824871U

CN204824871U - 一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离富集装置

Info

Publication number: CN204824871U
Application number: CN201520519486.XU
Authority: CN
Inventors: 刘宝瑞; 沈洁; 袁玲
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2025-07-16

Abstract

本实用新型提供了一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞(CTC)分离和富集装置，其特征在于：包括采集通道、抗凝通道、控制阀、采血仪、采血袋、CTC采集过滤器和血液回输通道，采集通道与抗凝通道分别或共同连接在控制阀的输入端，控制阀的一个切换端与采血袋的输入端连接，采血袋在血液采集阶段放置于采血仪上，采血袋的输出端依次与CTC采集过滤器和血液回输通道连接，该血液回输通道的输出端与控制阀的另一个切换端连接，该装置的血液采集/回输的循环过程依靠变换采血袋相对于采集通道/血液回输通道的位置来进行转换。其优点在于该装置能够在实现了对循环肿瘤细胞最大可能的分离富集的基础上，成功将剩余液体回输、不造成液体损失，并能循环反复采集。

Description

一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离富集装置

技术领域

本实用新型涉及一种医学和生物分离富集装置，特别涉及一种循环肿瘤细胞分离富集装置。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulatingtumourcell,CTC)指因为侵袭、脱落、手术操作等内外部因素导致的进入血液循环的肿瘤细胞。CTC的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临川筛药、耐药性的检测，以及肿瘤新药物的开发等。外周血CTC的数目被证实可以作为肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多数肿瘤患者预后标志，或者术后复发的预测指标(JoosseSA,GorgesTM,PantelK.:“Biology,detection,andclinicalimplicationsofcirculatingtumorcells.”,EMBOMolMed.2014,14；7(1):1-11)。

目前，CTC检测手段种类繁多、原理各异。然而，由于循环肿瘤细胞在外周血中丰度极低，约0.3-100个/ml，与白细胞相差4-7个数量级，如何高效率、高纯度地分离CTC一直是研究的热点。现有CTC分离富集技术主要包括密度梯度离心，免疫磁珠分离，过滤分离，微流控芯片等。比如，基于免疫磁珠的分离富集方法的CellSearch^TMSystem，可重复性好，敏感性高，CTC检出率达到70％-85％，被认为是当今CTC检测金标准；微流控芯片技术使待检血样以特定流速流过微米级的通道，通道中立有上万个微柱，每个微柱上包被有抗EpCAM抗体以捕获循环肿瘤细胞，其CTC检出率达到了99％(NagrathS,SequistLV,MaheswaranS,etal:“Isolationofrarecirculatingtumourcellsincancerpatientsbymicrochiptechnology.”,Nature2007,450(7173):1235-1239)；体外过滤分离(ISET)技术利用散布有直径8μm小孔的聚碳酸酯滤膜分离循环肿瘤细胞，该方法避免了抗原抗体结合的局限性，操作简便，细胞损伤较少，可以检测出混入1ml血液中的1个肿瘤细胞，敏感性高。但是，这些方法在每次抽取5-10ml血液后，从中分离和富集的CTC数量极为有限(一般为0-20个/7.5ml)；

此外，在实际应用中，从每次抽取5-10ml的血液量中富集到的CTC数量基本不能完成或者说很难完成CTC培养的需要，例如：如果在富集CTC后进行基因测序，则需要经过繁杂的单细胞预扩增，其价格昂贵，操作繁琐，技术难点大；而如果通过重复上述CTC检测实验来提高CTC富集量，不但成本高，而且反复抽取检测血液，亦会使得血液损失量大。现有的CTC分离和富集技术存在着的上述缺陷，限制了与其相关的CTC检测技术在临床上的应用。

实用新型内容

本实用新型的目的就在于解决上述问题，提供一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离富集装置。在该装置的闭合循环回路中，含有循环肿瘤细胞的液体在经过该装置采集循环肿瘤细胞过滤器的过滤后被回输入体内，如此循环往复，从而在不造成血液损失的情况下，不断使循环肿瘤细胞富集在滤膜上，同时也可以达到尽可能除尽液体中的循环肿瘤细胞的效果。

本实用新型的技术方案是：

本实用新型提供了一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：包括采集通道1、抗凝通道2、控制阀3、采血仪4、采血袋5、循环肿瘤细胞采集过滤器6和血液回输通道7。所述采集通道1和抗凝通道2的输出端可以通过连接部件(如三通)汇合后与控制阀3的输入端连接，也可以分别直接连接控制阀3的输入端；控制阀3至少具有三个出/入口，可以至少完成两个通道的切换；控制阀3的一个切换端与采血袋5的输入端连接；采血袋5的输出端依次与循环肿瘤细胞采集过滤器6和血液回输通道7连接，可以在采血袋5输出端外部采用扎结连接软管或者设置夹紧部件(如：止液夹等)的形式控制液体流出；该血液回输通道7的输出端与控制阀3的另一个切换端连接，至此，形成完整的闭合环路。采血袋5在血液采集阶段放置于采血仪4上，采血仪4需要放置于低于采集通道1入口的位置，通过震动使采血袋4中血液与抗凝剂充分混匀，并且能定量采集液体体积；在血液回输阶段时，采血袋5的位置需高于回输通道7的输出端，以使得采血袋5中的液体在重力的作用下回输到体内。采血袋5的位置可以通过人工手动或者升降装置调节，以转换血液采集阶段与血液回输阶段的循环过程，以及调节采血袋5到合适的操作位置。

可选地，所述循环肿瘤细胞采集过滤器6由上、下两部分组成，中间压入CTC富集滤膜，可通过打开过滤器6上、下两部分来重装或者更换CTC富集滤膜。所述循环肿瘤细胞采集过滤器6中的CTC富集滤膜是一张孔径一致，并规则排布有微孔的滤膜，以紫外光刻技术和反应离子蚀刻技术制造，其材质为派瑞林(聚对二甲苯)薄膜，膜厚度为2-20μm，膜孔径在6-40μm，膜面积为0.2-20cm²，膜含有滤孔为10000-1000000个。该滤膜没有特异性，主要靠孔径大小把肿瘤细胞与血液中的其他细胞区分开来。一般肿瘤细胞直径>10μm，人体血液中正常白细胞和红细胞的直径<10μm，因而通过滤膜，可以截留肿瘤细胞，而使人体所需的白细胞和红细胞回输人体。

可选地，所述采血仪4置于低于采集通道1入口0.5-1.5m位置，震动频次为20-40次，采集液体总体积为20-500ml。

可选地，回输通道7在液体回输时，其位置低于采血袋0.5-1.5m。

可选地，在循环肿瘤细胞采集过滤器6与血液回输通道7还连接有流速控制器9，可以根据患者需求调节液体回输流速，增加舒适度。

可选地，所述流速控制器9将血液回输速度控制在1-180滴/分钟，即0.06-12ml/分钟(15滴/ml)。

可选地，根据本实用新型的装置，所述抗凝通道2中含有肝素和生理盐水配合而成的抗凝剂，抗凝剂浓度为V_肝素：V_生理盐水＝1:1～1:100。

本实用新型的优点和效果在于：

1)该装置的闭合环路一方面达到了在过滤富集肿瘤细胞的基础上，将剩余液体成功地回输入体内，从而不损失液体的有益效果；另一方面全程封闭的通路可以确保回输的血液不受到任何污染，安全可靠。

2)在达到了采集血液回输、不造成液体损失的基础上，该装置能够进行循环反复采集血液，从而提高了循环肿瘤细胞的富集率。CTC富集率在单次循环后达到95-100％，多次循环后可以使得CTC富集数目达到20-100个，为后续细胞表征鉴定、基因检测提供了技术保障。

3)本装置摒弃了经常采用的使用加压或者负压吸引的方式形成血液采集回输连续循环的操作方法,而是通过变换采血袋相对于采集/回输通道的高低位置来操作血液采集或者回输的过程。这样可以简化操作系统配置，并且使得整个采集过程便于控制，有效延长血液与抗凝剂的混合时间，避免闭合环路由于血液凝结而形成堵塞。

附图说明

图1：基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置的结构示意图。

图2：CTC免疫荧光图。

图中各标号表示对应的部件名称如下：

1.采集通道；2.抗凝通道；3.控制阀；4.采血仪；5.采血袋；6.循环肿瘤细胞采集过滤器；7.血液回输通道；8.止液夹；9.流速控制器。

具体实施方式

为了阐明本实用新型的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本实用新型做进一步的介绍。

如图1所示：

所述基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，包括采集通道1，抗凝通道2，控制阀3，采血仪4，采血袋5，循环肿瘤细胞采集过滤器6，血液回输通道7，止液夹8和流速控制器9。采集通道1为一个双向管道，其一端可进入液体，另一端以输液器连接三通的一个输入端，三通的另外一个输入端通过输液器连接抗凝通道2，三通的输出端通过输液皮条与控制阀3的输入端连接，该控制阀3的一个切换端与采血袋5的输入端连接，采血袋5放置在电子采血仪4上，在采血袋5的输出端设置有止液夹8，该端口依次连接循环肿瘤细胞采集过滤器6、流速控制器9和血液回输通道7，血液回输通道7的输出口与控制阀3的另一个切换端连接。

循环肿瘤细胞采集过滤器6含有自制加工的CTC富集滤膜。该过滤器由上下两部分组成，中间压入滤膜，可通过打开过滤器6的上下两部分来重装滤膜。该滤膜是一张孔径一致、并规则排布有微孔的滤膜，以紫外光刻技术和反应离子蚀刻技术制造，材质为派瑞林(聚对二甲苯)薄膜，膜面积为3.14cm²，膜厚度为10μm，滤膜孔径为8μm。

在血液采集阶段，使用止液夹8关闭采血袋5的输出口，以使得含有血液和抗凝剂的混合液体暂存于采血袋5中，切换控制阀3，使其与采血袋5输入端连接的那个切换端畅通，而其与血液回输通道7连接的另一切换端闭合。在抗凝通路滴速为162滴/分钟(10.8ml/分钟)时，来自采集通道1的血液与来自抗凝通道2的肝素抗凝剂(V_肝素：V_生理盐水＝1:50)在三通处以V_血液：V_抗凝剂＝1:9的比例汇合，并流经控制阀3进入采血袋5。采血袋5放置在位于低于采集通道1入口处1m的电子采血仪4上。电子采血仪4通过震动使采血袋5中液体充分混匀，其震动频次为32±2次。设定液体采集总质量为200克，当达到200克时，采血仪4停止震动，该过程历时17分钟，此时血液和抗凝剂的总体积约200ml，其中采集血液约20ml。

在CTC采集以及血液回输阶段，切换控制阀3，使其连接采血袋5输入口的那个切换端闭合,暂停采血，并使其连接血液回输通道7的那个切换端畅通。将采血袋5放置在高于血液回输通道7入口约1m的输液架上，去除止液夹8，以使得采血袋5输出口畅通。在重力的作用下，已经充分混匀的液体从采血袋5中流出，并依次通过CTC采集过滤器6、流速控制器9和血液回输通道7，逐步回输体内，大约17分钟回输完毕。流速控制器的回输滴速为180滴/分钟(即12ml/分钟)。在此血液回输的过程中，CTC被采集富集在循环肿瘤细胞采集过滤器6中的CTC富集滤膜上。液体回输结束后用20ml生理盐水冲洗采血袋，继续回输至体内。

根据循环肿瘤细胞的后续检测方案需要，可以如此循环反复操作，从而在同一张滤膜上分离富集足够量的CTC，同时不损失液体。

图2是CTC免疫荧光图。其中，以CK8、CK18以及CK19荧光抗体标记上皮细胞、CD45荧光抗体标记白细胞、DAPI荧光染料将细胞核染色,然后采用荧光显微镜进行分析，将DAPI、CK阳性而CD45阴性的细胞定义为循环肿瘤细胞。图2中，CK荧光抗体标记上皮细胞(绿色)、CD45荧光抗体标记白细胞(红色)、DAPI荧光染料标记细胞核(蓝色)，其中DAPI、CK阳性而CD45阴性的细胞即为CTC(即循环肿瘤细胞)，DAPI、CD45阳性而CK阴性的细胞即为WBC(即白细胞)。结果表明，本实用新型的单通道闭合环路装置可使CTC的富集率达到95-100％,通过多次循环可富集CTC数目达到20-100个。在一位晚期胃癌患者的20ml血液中，富集到的CTC数目为11个(11个/20ml)，与金标准Cellsearch的鉴定结果(4个/7.5ml)一致，且优于普通体外滤膜法ISET装置所得结果(2个/5ml)。经过4-5次循环，可使富集CTC数目达到50余个，可顺利进行CTC培养、基因测序、基因突变、基因SNP、基因拷贝数分析和基因mRNA等定量分析，而不需要全基因组扩增，这将为临床提供更准确的用药信息和指导，为实时个体化药物治疗提供更准确的检测来源。

由上可见，本实用新型的装置可以在高效率富集CTC的同时不损失液体，为后续细胞表征鉴定、基因检测提供了技术保障。此方法操作方便，富集率高，可重复性强，成本低，具有广泛的临床应用前景。

以上显示和描述了本实用新型的基本原理、主要特征和本实用新型的优点。本行业的技术人员应该了解，本实用新型不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本实用新型的原理，在不脱离本实用新型精神和范围的前提下，本实用新型还会有各种变化和改进，本实用新型要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims

1.一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：包括采集通道、抗凝通道、控制阀、采血仪、采血袋、循环肿瘤细胞采集过滤器和血液回输通道，所述采集通道与抗凝通道分别或者共同连接在控制阀的输入端，控制阀的一个切换端与采血袋的输入端连接，采血袋在血液采集阶段放置于采血仪上，采血袋的输出端依次与循环肿瘤细胞采集过滤器和血液回输通道连接，该血液回输通道的输出端与控制阀的另一个切换端连接，该装置的血液采集/回输的循环过程依靠变换采血袋相对于采集通道/血液回输通道的位置来进行转换。

2.如权利要求1所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：所述采血袋相对于采集通道/血液回输通道的位置变换通过人工手动或者升降装置调节。

3.如权利要求1或者2所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：所述采血仪在采集血液过程中置于低于采集通道入口0.5-1.5m的位置，震动频次为20-40次，采集液体总体积为20-500ml。

4.如权利要求1或者2所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：回输通道在液体回输时，其位置低于采血袋0.5-1.5m。

5.如权利要求1所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：所述循环肿瘤细胞采集过滤器由上下两部分组成，中间设置有CTC富集滤膜，该上下两部分以可开合形式连接。

6.如权利要求5所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：所述CTC富集滤膜的膜厚度为2-20μm，膜孔径在6-40μm，膜面积为0.2-20cm²，膜含有滤孔为10000-1000000个。

7.如权利要求5或者6所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：所述CTC富集滤膜的材质为派瑞林薄膜，又称聚对二甲苯薄膜。

8.如权利要求1所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：还包括夹紧部件，在血液采集阶段从外部设置在采血袋输出端。

9.如权利要求1所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：该装置在循环肿瘤细胞采集过滤器与血液回输通道之间还设置了流速控制器。

10.如权利要求1所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于：所述抗凝通道中含有肝素和生理盐水配合而成的抗凝剂，抗凝剂浓度为V_肝素：V_生理盐水＝1:1～1:100。