CN108080043B - 真空负压进样的多通道微流控芯片装置及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种真空负压进样的多通道微流控芯片检测装置及制备方法与应用。该多通道微流控芯片包括主通道、上样通道、滤膜、刻蚀有微通道的光学透明层和未刻蚀微通道的光学透明层；所述刻蚀有微通道的光学透明层与未刻蚀微通道的光学透明层键合连接；所述主通道和上样通道是负压状态；所述滤膜位于主通道上部，且与刻蚀有微通道的光学透明层和未刻蚀微通道的光学透明层黏合。本发明所述检测装置样品用量少，能实现样品的自动进样、全血样品血细胞与血浆100％分离、上样通道与纸芯片的无缝对接，使分离和检测步骤能同时完成。

Description

真空负压进样的多通道微流控芯片装置及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种真空负压进样、血液过滤的多通道微流控芯片检测装置。整合全血样本的血细胞过滤、样品的准确上样，同时为多通道纸芯片提供无缝对接接口，构建了一种血液样品预处理关键器件，有潜力广泛应用于医疗器械领域。

背景技术

血液是人体基本的生物材料组件，由血浆和血细胞组成。血浆内含有血浆蛋白(白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原)、脂蛋白等各种营养成分以及无机盐，氧，激素，酶，抗体和细胞代谢产物等。血细胞由红细胞、白细胞和血小板组成。机体的生理变化和病理变化往往引起血液成分的改变，所以血液成分的检测有重要的临床意义。然而在实际应用中，通常需要过滤掉血液中含有的血细胞得到血浆，因为血细胞的存在会对试验造成干扰。关于血浆的分离以及血液成分的检测已有人做过大量的研究，传统的血浆分离方法是离心，然而离心分离需要大量的血样，也需要离心机，这在资源匮乏的地区也难以进行，离心机的使用也需要接受专门训练。因此为了使早期的诊断性测试简单廉价，一个简便的，切实可行的，耗血量少的血液分离装置成为迫切的需要。

微流控芯片(Microfluidic chip)又称芯片实验室(Lab-on-a-chip)或微全分析系统(Micro-Total Analysis System，μTAS)，通过微加工技术将化学中所涉及的样品预处理、反应、分离、检测，生命科学中所涉及的细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成在一块几平方厘米大小的芯片上，利用微通道网络灵活的操控整个实验系统，从而实现传统化学或生物实验室的各项功能。自从20世纪90年代初Manz等人(Manz,A.,Graber,N.andWidmer,H.M.(1990)Miniaturized Total Chemical-Analysis Systems-a Novel Conceptfor Chemical Sensing.Sensor.Actuat.B-Chem.,1,244-248)首次提出了μTAS的概念以来，由于具有分析速度快、试剂消耗少、微型化、集成化和自动化的优点，微流控芯片已广泛应用于分析化学、合成化学、药物筛选、临床诊断、生物技术、环境检测等等领域。

近来，用于即时诊断的微流控芯片装置被大量研究，用于血浆分离的芯片装置的自动化和集成化对于及时诊断是理想的。大量的用于全血分离的微流控技术被提出，例如基于几何障碍，重力沉降，声学作用，惯性力，CD型离心，微过滤等。然而上述方法大多数受到诸如制作过程复杂，全血需要稀释，需要借助泵或其他设备驱动来操控流体的限制，因此不适合即时诊断应用。此外，现有方法在血浆分离和后续的分析检测对接以及样品的精确定量传感方面存在不足。

发明内容

本发明解决了血液样品预处理装置在进样、分离、上样和检测功能集成，分离与分析模块集成，定量分析等方面的不足，提供了一种真空负压进样的多通道微流控芯片装置及制备方法与应用。

按照本发明的第一方面，提供了一种真空负压进样的多通道微流控芯片装置，该多通道微流控芯片包括主通道、上样通道、滤膜、刻蚀有微通道的光学透明层和未刻蚀微通道的光学透明层；所述刻蚀有微通道的光学透明层与未刻蚀微通道的光学透明层键合连接；所述主通道和上样通道位于刻蚀有微通道的光学透明层与未刻蚀微通道的光学透明层键合连接的平面上；所述主通道和上样通道相连通，并呈垂直连接；所述主通道和上样通道是负压状态；所述主通道的宽度大于上样通道的宽度；所述上样通道大于等于两个；所述滤膜位于主通道上部，且与刻蚀有微通道的光学透明层和未刻蚀微通道的光学透明层黏合。

优选地，所述主通道(1)和上样通道(2)中充满了纤维素溶液。

优选地，所述刻蚀有微通道的光学透明层(4)为刻蚀有微通道的聚二甲基硅氧烷层；所述未刻蚀微通道的光学透明层(5)为未刻蚀微通道的聚二甲基硅氧烷层或未刻蚀微通道的载玻片。

优选地，所述滤膜(3)为BTS膜、MF1膜、LF1膜、VF1膜或VF2膜。

优选地，所述上样通道(2)为八个，均平行排布；邻近两个上样通道(2)之间的间隔为0.6mm～1.2mm；

优选地，所述主通道(1)的长度为0.1mm～0.3mm；所述上样通道(2)的宽度为0.05mm～0.15mm；所述主通道(1)和上样通道(2)的深度为20μm～80μm。

按照本发明的另一方面，提供了一种真空负压进样的多通道微流控芯片装置的制备方法，包括以下步骤：

(a)制作如权利要求1所述的刻蚀有微通道的光学透明层上的微通道的芯片掩模；

(b)在基片上滴加光刻胶，并使光刻胶均匀分布在基片上；

(c)将步骤(b)得到的基片进行加热，使光刻胶中的溶剂挥发；

(d)利用紫外光光刻将步骤(a)所述的芯片掩模上的微通道转移至步骤(c)得到的基片上；

(e)将步骤(d)得到的基片进行加热，使基片紫外光光刻区域内的光刻胶发生充分的交联反应；

(f)将步骤(e)得到的基片进行显影和定影；

(g)将步骤(f)得到的基片进行加热，使基片上的光刻胶加固；

(h)将光学透明材料和固化剂混匀后，倾倒在步骤(g)得到的基片上进行烘烤，光学透明材料固化后，将光学透明材料从基片上进行剥离，得到具有如权利要求1所述的刻蚀有微通道的光学透明层上的微通道的芯片；

(i)将步骤(h)得到的的芯片和没有微通道结构的光学透明层进行键合；

(j)将步骤(i)得到的键合后的芯片进行横切和竖切，漏出微通道；

(k)将步骤(j)得到的芯片浸泡在等离子体中后取出，增加微通道的亲水性；

(l)将步骤(k)得到的芯片的微通道上部贴滤膜；

(m)将步骤(l)得到的芯片进行抽真空，即得到所述真空负压进样的多通道微流控芯片装置。

优选地，在所述步骤(k)之后，在微通道中导入纤维素溶液，使所述纤维素溶液布满微通道。

优选地，所述步骤(h)中的光学透明材料为聚二甲基硅氧烷，步骤(i)中的光学透明材料为聚二甲基硅氧烷或载玻片。

优选地，步骤(l)所述的滤膜为BTS膜、MF1膜、LF1膜、VF1膜或VF2膜。

按照本发明的另一方面，提供了一种真空负压进样的多通道微流控芯片装置用于分离血细胞和血浆的应用。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的有益效果：

(1)样品的自动进样

在进样之前PDMS芯片已经过抽真空处理，使得微通道里的气压低于大气压，此外等离子体处理增加了微通道的亲水性，因此不需要外部辅助力量(如泵推)，便可实现样品的自动进样。

(2)能实现全血样品血细胞过滤100％

由于微孔过滤膜孔径为0.25μm～0.5μm，因此可以移除全血或血清样品中粒径大于2μm～3μm的红细胞、血小板，仅让血浆流入PDMS微通道，实现了全血样品血细胞过滤100％。

(3)上样通道与纸芯片的无缝对接

通过往上样通道导入纤维素溶液，可以方便在上样通道内形成纤维素层，亦即纸芯片(用于载件和分析的核心部件，在纸芯片内可以嵌入特定的抗体或反应试剂)，从而实现上样通道与纸芯片的无缝对接。

(4)样品用量少，且能实现精确定量传感

因为使用了微流控芯片平台，样品用量少，本实验一次用到的血量约为20μl。由于纸芯片的尺寸一定，其上样的体积也随之固定，因此可以对血清样品进行准确的定量分析。

(5)分离和检测步骤能同时完成

PDMS芯片整合了微孔膜的过滤作用和纸芯片的检测功能，使得分离和检测步骤能同时完成。

总之，本发明所述的真空负压进样的多通道微流控芯片装置能实现全血样本的血细胞过滤、样品的准确上样和八通道分流上样，同时为多通道纸芯片提供无缝对接接口(即对接死体积为0)。基于微流控芯片技术的样品前处理功能模块是实现在线定量传感的共性关键技术，功能单元包括全血样本的血细胞过滤、样品的定量取样，并且与微流控多通道纸芯片无缝杂合对接，从而实现高通量精准定量传感。

附图说明

图1为本发明的微流控芯片立体示意图。

图2为本发明的微流控芯片微通道结构平面示意图。

图3为微孔过滤膜示意图。

图4为微流控芯片微通道加工流程图。

图5为本发明的微流控芯片键合后处理流程图。

图6为本发明的微流控芯片红色素自动进样时序图，其中(a)图、(b)图、(c)图、(d)图、(e)图、(f)图、(g)图和(h)图分别表示红色素在0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s和70s时的时序图。

图7为本发明的微流控芯片用于血液过滤的时序图，其中(a)图、(b)图、(c)图、(d)图、(e)图和(f)图分别表示血液在0min、2min、4min、6min、8min和10min时的时序图。

在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1-主通道，2-上样通道，3-滤膜，4-刻蚀有微通道的光学透明层，5-未刻蚀微通道的光学透明层。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

本实施例中，真空负压进样、血液过滤的多通道微流控芯片检测装置由微流控芯片和微孔过滤膜两部分组成。如图1所示，微流控芯片为聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片，其由刻有微通道结构的PDMS薄层与没有微通道的PDMS薄层键合而成。

PDMS薄层内微通道结构为一条主通道和八条平行的上样通道垂直相连，整个微通道的结构类似一个梳子的形状，如图2所示。

本实施例中，八条上样通道位于主通道的同一侧，通道宽度以及通道之间间隔的距离设置相同，溶液从主通道口1进入，然后分散成八条支流进入到上样通道2内。

本实施例对微通道结构的描述中所采用的具体尺寸或数据仅是实例性的，不构成对本发明的限定，其中的尺寸或数据根据实际需要可以进行具体选择或确认。例如主通道和上样通道的宽度以及深度，可根据实际要求设定。

微孔过滤膜在本实例中采用BTS膜制作，MF1、LF1、VF1或者VF2膜亦可，如图3所示。在一大张BTS膜上用小刀切割一片5mm×5mm的方块，每次实验，用胶水黏合在主通道之上。

实施例2

本发明中的真空负压进样的多通道微流控芯片装置的制备方法包含以下步骤：

(1)PDMS微流控芯片的制作，其流程参见图4，具体的制作过程可以分为以下步骤：

(1-1)掩模的设计和制作：设计微流控芯片的掩模图形，通过打印机(分辨率大于20000dpi)将掩模图形打印到菲林胶片上，得到菲林掩模。

(1-2)基片清洗及匀胶：基片经丙酮、Piranha溶液和超纯水严格清洗并用高温(150℃×1h)烘干后，在基片中心滴加适量SU-8光刻胶(大约1ml/inch²)，置于匀胶机转盘上，采用600rpm×18s、2100rpm×60s(以100rpm/min的速度提高转速)的程序匀胶。整个制作阳模过程在必须装有黄光特种灯管(可滤除可见光中的蓝光和紫外波段的光)的百级超净间内进行。

(1-3)前烘：在热平板上采用以下加热程序对匀胶后的基片进行前烘：室温下平整放置120min，从室温以2℃/min的速度升温至65℃，在65℃的温度下保持15min，再以2℃/min的速度升温至95℃，在95℃的温度下保持120min后，以2℃/min的速度降温至室温，如图4中(a)所示。前烘的作用是挥发光刻胶内的溶剂，同时使SU-8光刻胶中的光敏分子在垂直方向上获得高斯分布，增加光刻胶在基片上的粘着力。

(1-4)曝光：利用紫外光光刻的办法一次完全曝光70秒，如图4中(b)所示，将菲林掩模上的图形转移到匀胶后的基片上。经过前烘处理后的匀胶基片，光敏分子均匀分布在光刻胶层，经过紫外光i线(365nm)的照射后，光引发剂吸收光子发生光化学反应，生成强酸，在后烘过程中作为酸性催化剂引发SU-8的交联反应，如图4中(c)所示。交联形成的致密交联网络结构在其后的显影过程中变得惰性而不能被显影液溶解，微结构部分由此在胶内与非结构部分区分开来。

(1-5)后烘：在热平板上采用的以下加热程序对曝光后的匀胶基片进行后烘：从室温以2℃/min的速度升温至65℃，在65℃的温度下保持15min，再以2℃/min的速度升温至95℃，在95℃的温度下保持40min后，以2℃/min的速度降温至室温，如图4中(d)所示。后烘充分能使曝光区域内交联反应充分，从而在显影中获得垂直的微结构。

(1-6)显影和定影：显影和定影是在基片上生成图形的关键步骤。丙二醇单甲基醚乙酸酯(PGMEA)和异丙醇分别是SU-8光刻胶最常用的显影液和定影液。用PGMEA显影60秒，基片上未曝光部分光刻胶被均匀溶解后，再用异丙醇定影，最后用氮气枪将基片吹干后，可以很明显的在基片上看到设计的图形。

(1-7)坚膜：如图4中(e)所示，将显影后具有微结构的基片置于真空烘箱中，135℃的温度下静置120min，自然冷却，加固交联后的SU-8胶在基片上的粘附。

(1-8)PDMS固化：首先将PDMS低聚体和固化剂按照10：1的比例搅拌混匀，置于真空干燥器中真空脱气后，倒在有围堰的坚膜后的基片上，置于热平板上65℃温度下烘烤4小时后，PDMS将通过交联反应形成有弹性的透明固体，如图4中(f)所示。从SU-8阳模上剥离下来的PDMS就具有所需的微通道结构，如图4中(g)所示。

(1-9)键合：打开氧等离子体清洗腔，将需要键和的已固化后的PDMS平放入腔内，待键合的表面朝上放置；抽真空，打开高频电源至600V，当达到所需真空度时清洗机会起辉(紫红色)，氧气流量为600ml/min，清洗60秒；用超纯水淋洗30秒、贴合、对齐后，置于真空烘箱中，在65℃、真空度为0.7atm条件下静置120min，使PDMS与PDMS键合在一起，得到具有微通道的微流控PDMS芯片,如图4中(h)所示。

(2)微流控芯片键合后处理，其流程图参见图5，具体的操作过程可以分为以下步骤：

(2-1)芯片切割：用切胶机将加工好的微流控芯片的主通道横向切断，使得主通道外漏。另外，八条上样通道也横向切开，使得上样通道外露。

(2-2)等离子处理：将上述的切割的芯片置于等离子清洗机中，处理时间大约2min，以增加微通道的亲水性，如图5中(a)所示。

(2-3)胶水点涂：用注射器针头蘸取普通的胶水，在露出的主通道口周围点涂一圈，胶水和主通道口要保持一定的距离，避免在贴膜时，胶水将主通道口堵塞。如图5中(b)所示。

(2-4)贴膜：将裁剪的BTS膜小块，用镊子拾取覆盖在点涂的胶水之上，然后倒置对着桌面轻轻挤压，使BTS膜和PDMS贴合的更紧。形成的装置图如图5中(c)所示。

(2-5)抽真空：在贴膜处理之后，将PDMS芯片进行抽真空处理，时间大约5min，如图5中(d)所示。如此形成了真空负压进样、血液过滤的多通道微流控芯片。

(3)上样通道内导入纸芯片

通过往本文设计的8个上样通道导入纤维素溶液，可以方便在上样通道内形成纤维素层，亦即纸芯片(用于载件和分析的核心部件，在纸芯片内可以嵌入特定的抗体或反应试剂)，从而实现上样通道与纸芯片的无缝对接。由于纸芯片的尺寸一定，其上样的体积也随之固定，因此可以对血清样品进行准确的定量分析(例如血糖，炎症因子，血气电介质，癌症标志物等)。

实施例3

一种真空负压进样、血液过滤的多通道微流控芯片检测装置。所述微流控芯片由刻有微通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄层与没有微通道的PDMS薄层键合而成。在两块键合好的PDMS上横切一刀，使微通道的主通道外露，在外露的主通道口周围一定距离涂一层胶水，将一小块BTS膜黏合在胶水上，使得主通道口被密封，如此构成了最终的芯片装置。

微通道结构由一条入口通道和八条出口通道相连组成，其结构特征如下：溶液入口通道(后面简称主通道)是一条笔直的通道，和八条溶液出口通道(后面简称上样通道)相连。八条上样通道呈平行式排布，通道之间间隔相同的一定的距离，位于主通道的一侧，和主通道成90度夹角。整个微图案类似一个梳子的形状。

两块PDMS键合好，横切一刀露出主通道后，先打等离子体处理，以增加通道的亲水性，随后贴膜处理，抽真空。抽完真空即可滴加血液样品。在BTS微孔过滤膜以及真空负压的作用下，血样样品中的血细胞以及血小板被过滤掉，血清顺着主通道流进八条上样通道。八条上样通道内设有纸芯片，从而实现微流控芯片与纸质芯片的无缝对接，以及样品的精确定量取样。

实施例4

本实施例中，我们采用红色素和全血样品对多通道微流控芯片自动进样，以及血液过滤的性能进行了评价。红色素的自动进样如图6所示，图中微流控芯片还未贴膜处理，在芯片入口处滴加约20μl的红色素溶液，红色素在真空负压的作用下，自动进入到芯片通道中，大约70秒时间，八条上样通道被填充满。

实施例5

全血样品的的自动进样以及BTS膜过滤的效果如图7所示，图中微流控芯片经过贴膜处理，在芯片入口处滴加约20μl的全血样品，在微孔过滤膜以及真空负压的作用下，血细胞被微孔膜阻挡，血清被分离出来，沿着主通道进入到八条上样通道。大约10分钟的时间，八条上样通道被填充满。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种真空负压进样的多通道微流控芯片装置，其特征在于，该多通道微流控芯片包括主通道(1)、上样通道(2)、滤膜(3)、刻蚀有微通道的光学透明层(4)和未刻蚀微通道的光学透明层(5)；所述刻蚀有微通道的光学透明层(4)与未刻蚀微通道的光学透明层(5)键合连接；所述主通道(1)和上样通道(2)位于刻蚀有微通道的光学透明层(4)与未刻蚀微通道的光学透明层(5)键合连接的平面上；所述主通道(1)和上样通道(2)相连通，并呈垂直连接；所述主通道(1)和上样通道(2)是负压状态；所述主通道(1)的宽度大于上样通道(2)的宽度；所述上样通道(2)大于等于两个；所述滤膜(3)位于主通道(1)上部，且与刻蚀有微通道的光学透明层(4)和未刻蚀微通道的光学透明层(5)黏合。

2.如权利要求1所述的真空负压进样的多通道微流控芯片装置，其特征在于，所述主通道(1)和上样通道(2)中充满了纤维素溶液。

3.如权利要求1或2所述的真空负压进样的多通道微流控芯片装置，其特征在于，所述刻蚀有微通道的光学透明层(4)为刻蚀有微通道的聚二甲基硅氧烷层；所述未刻蚀微通道的光学透明层(5)为未刻蚀微通道的聚二甲基硅氧烷层或未刻蚀微通道的载玻片。

4.如权利要求1或2所述的真空负压进样的多通道微流控芯片装置，其特征在于，所述上样通道(2)为八个，均平行排布；邻近两个上样通道(2)之间的间隔为0.6mm～1.2mm；所述主通道(1)的长度为0.1mm～0.3mm；所述上样通道(2)的宽度为0.05mm～0.15mm；所述主通道(1)和上样通道(2)的深度为20μm～80μm。

5.如权利要求1所述的真空负压进样的多通道微流控芯片装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)制作如权利要求1所述的刻蚀有微通道的光学透明层上的微通道的芯片掩模；

(b)在基片上滴加光刻胶，并使光刻胶均匀分布在基片上；

(c)将步骤(b)得到的基片进行加热，使光刻胶中的溶剂挥发；

(d)利用紫外光光刻将步骤(a)所述的芯片掩模上的微通道转移至步骤(c)得到的基片上；

(e)将步骤(d)得到的基片进行加热，使基片紫外光光刻区域内的光刻胶发生充分的交联反应；

(f)将步骤(e)得到的基片进行显影和定影；

(g)将步骤(f)得到的基片进行加热，使基片上的光刻胶加固；

(h)将光学透明材料和固化剂混匀后，倾倒在步骤(g)得到的基片上进行烘烤，光学透明材料固化后，将光学透明材料从基片上进行剥离，得到具有如权利要求1所述的刻蚀有微通道的光学透明层上的微通道的芯片；

(i)将步骤(h)得到的的芯片和没有微通道结构的光学透明层进行键合；

(j)将步骤(i)得到的键合后的芯片进行横切和竖切，漏出微通道；

(k)将步骤(j)得到的芯片浸泡在等离子体中后取出，增加微通道的亲水性；

(l)将步骤(k)得到的芯片的微通道上部贴滤膜；

(m)将步骤(l)得到的芯片进行抽真空，即得到所述真空负压进样的多通道微流控芯片装置。

6.如权利要求5所述的真空负压进样的多通道微流控芯片装置的制备方法，其特征在于，在所述步骤(k)之后，在微通道中导入纤维素溶液，使所述纤维素溶液布满微通道。

7.如权利要求5或6所述的真空负压进样的多通道微流控芯片装置的制备方法，其特征在于，所述步骤(h)中的光学透明材料为聚二甲基硅氧烷，步骤(i)中的光学透明材料为聚二甲基硅氧烷或载玻片。

8.如权利要求1-4任一所述的真空负压进样的多通道微流控芯片装置用于分离血细胞和血浆的应用。