CN105203516A - 一种基于荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法 - Google Patents
一种基于荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于纳米材料科学和微流控芯片技术领域,涉及一种基于荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法,解决纸芯片不易进行复杂功能化修饰的问题。首先溶胶-凝胶法制备单分散性的二氧化硅纳米粒子,并对二氧化硅纳米粒子进行表面氨基改性;再通过Suzuki反应合成对硝基苯有高选择性和高灵敏度的荧光共轭聚合物;将共轭聚合物通过共价键键合并交联到二氧化硅纳米粒子表面,形成荧光分子印迹纳米微球。将荧光分子印迹纳米微球均匀固定到纸芯片检测区域表面,即得到荧光分子印迹纳米微球修饰纸芯片。本发明可以实现对纸芯片快速,简单的功能化修饰,进而对水中微量硝基苯的高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明属于材料科学与工程和微流控芯片技术领域,是一种通过对二氧化硅纳米粒子进行表面荧光分子印迹修饰,固定于纸芯片检测区域而完成检测水中硝基苯类化合物纸芯片的制备方法。
背景技术
硝基苯类化合物,如间硝基甲苯、对硝基苯酚、硝基苯、一二硝基氯苯和一三硝基甲苯等,作为一类重要的化工原料,己被广泛地应用于医药、农药、炸药、染料、造纸、纺织等领域。环境中的硝基苯主要来自化工厂、染料厂的废水废气,尤其是苯胺染料厂排出的污水中含有大量硝基苯。硝基苯类化合物侵入人体体内后,可引起抽搐、腹痛、头痛、轻度头昏、神经系统紊乱等疾病,严重时还会致癌。由此可见,硝基苯类化合物对人类健康和环境造成的污染是不容忽视的,函待开发一些快速、灵敏、准确检测硝基苯类化合物的方法。
微流控芯片以其体积小,集成功能多的优点,成为研究发展速度最快的分析技术之一。已经有大量的论文报道了芯片的制造,芯片分析技术和应用等方面的研究工作。微流控芯片分析技术建立在微加工的基础上,检测灵敏度高,消耗样品试剂量少,分析速度快,适合检测仅有少量样品的物质。微流控纸芯片作为微流控芯片的一个重要分支,通过在纸芯片上构建微流通道,试样可以在设计的通道内通过毛细作用力流动,不需要借助外部动力,可自动驱动待测样品。关于纸芯片的检测手段主要有比色法、电化学法、化学发光和荧光等,借助成型的检测手段,纸芯片可以应用到不同的领域。使用纸芯片检测硝基苯类化合物是,还需要对纸芯片进行功能化处理,使纸芯片能够对硝基苯识别并产生可检测的信号。
分子印记聚合物具有亲和性和选择性高、抗环境干扰能力强、稳定性好、使用寿命长,应用范围广等优点而在分离提纯、免疫测定、生物模拟、仿生传感以及痕量分析等领域显示出广阔的应用前景。荧光分子印迹共轭聚合作为新型的高分子材料,其共轭骨架允许电子/能量在整条链上自由流动,使每个单体所采集的光能够以集合的形式传递出去,产生信号倍增效应。即对被测量分子表现出“分子导线效应”。将其作为分子识别和荧光效果的信号材料,与纸芯片作为微管路系统相结合形成分子印迹荧光型微流控纸芯片,用于快速识别和测定硝基苯有着巨大的应用潜力。
本发明解决纸芯片不易进行功能化修饰的问题,由于纸芯片基本材质为滤纸,所以适当粒径的纳米颗粒不能随溶液穿透滤纸,而均匀的附着在滤纸表面。通过对二氧化硅纳米粒子进行表面改性和修饰并滴涂在纸芯片的特定区,使纸芯片带有所需要的功能分子并形成功能区,从而完成对纸芯片的功能化修饰。二氧化硅纳米粒子粒径可控,性质稳定,而且易于功能化修饰,可将共轭聚合物通过共价键键合并交联到二氧化硅纳米粒子表面,形成荧光分子印迹纳米微球。将荧光分子印迹纳米微球均匀固定到纸芯片检测区域表面,即得到荧光分子印迹纳米微球修饰纸芯片。可以实现对纸芯片快速,简单的功能化修饰,进而对水中微量硝基苯的高灵敏检测。
发明内容
本发明属于纳米材料科学和微流控芯片技术领域,涉及一种基于荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法,解决纸芯片不易进行复杂功能化修饰的问题。首先溶胶-凝胶法制备单分散性的二氧化硅纳米粒子,并对二氧化硅纳米粒子进行表面氨基改性;再通过Suzuki反应合成对硝基苯有高选择性和高灵敏度的荧光共轭聚合物;将共轭聚合物通过共价键键合并交联到二氧化硅纳米粒子表面,形成荧光分子印迹纳米微球。将荧光分子印迹纳米微球均匀固定到纸芯片检测区域表面,即得到荧光分子印迹纳米微球修饰纸芯片。本发明可以实现对纸芯片快速,简单的功能化修饰,进而对水中微量硝基苯的高灵敏检测。
本发明的技术方案为:
本发明的荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法包括如下步骤:
(1)荧光分子印迹二氧化硅纳米微球的制备;
(2)采用蜡印技术,将设计的图形印刷在滤纸上,制备出亲水的工作区域和流路通道,并将荧光分子印迹二氧化硅纳米微球固定在纸芯片检查区域,折叠纸芯片制作基于荧光分子印迹纳米微球修饰纸芯片;
(3)测定加入硝基苯类化合物水溶液前后纸芯片检测区的荧光强度,用Stern-Volmer方程分析数据,测定水中硝基苯类化合物的浓度。
所述步骤(1)荧光分子印迹二氧化硅纳米微球的制备,具体包括以下步骤:
单分散粒径可控二氧化硅纳米粒子的制备:将正硅酸乙酯、无水乙醇混合加入去离子水搅拌混合,持续搅拌2-6小时后,依次用乙醇和去离子水离心洗涤,即可制得直径约为500nm的二氧化硅纳米粒子。
将二氧化硅纳米粒子用无水乙醇和超纯水超声分散,加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌均匀后通氮气保护反应12小时。产物依次用乙醇和去离子水离心洗涤,制得氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子。
通过Suzuki反应,使用单体3,5-二溴苯甲酰胺和9,9-二己基芴-2,7-二硼酸二(1,3-丙二醇)酯合成对硝基苯有高选择性和高灵敏度的荧光共轭聚合物
将氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子和荧光共轭聚合物分散于一定浓度硝基苯溶液中,缓慢搅拌。加入戊二醛在室温下缓慢搅拌反应交联。反复离心洗涤产物,除去模板分子,得到硝基苯荧光分子印迹纳米微球,如图1所示。
所述步骤(2)采用蜡印技术,将设计的图形印刷在滤纸上,制备出亲水的工作区域和流路通道,并将分子印迹纳米微球固定在纸芯片检查区域,折叠纸芯片制作基于荧光分子印迹纳米微球修饰纸芯片。具体步骤为:
设计纸芯片图形,采用蜡印技术,将设计的图形丝网印刷或手工印刷在滤膜上,烘烤至蜡渗透纸芯片,制备出亲水的工作区域。分子印迹纳米微球超声分散于无水乙醇中,滴加至纸芯片的检测区,真空干燥,分子印迹纳米微球固定在纸芯片检测区中。通过折叠滤纸,使含有流路通道的纸芯片可以进行试剂的引入和样品运输,制得荧光检测纸芯片,如图3所示。
所述步骤(3)测定加入硝基苯类化合物水溶液前后纸芯片检测区的荧光强度,用Stern-Volmer方程分析数据,测定水中硝基苯类化合物的浓度。具体包括以下步骤:
以无水乙醇为溶剂,配制一系列不同浓度的NT溶液,定量将某一标准浓度NT溶液加入纸芯片样品区,静置5min。测试纸芯片荧光分子印迹微球检测区和空白参比区的荧光强度,如图2所示。根据所得的荧光F0/FS和NT的浓度绘制工作曲线,荧光猝灭过程和数据用Stern-Volmer方程分析,如图4所示。
测定纸芯片空白参比区的荧光强度F0和定量加入未知浓度的硝基苯样品溶液检测区荧光强度FS。将F0/FS带入步骤6所得线性方程,计算待测液中硝基苯的浓度。
本发明所具有的优点:
1.本发明对纸芯片基底表面进行功能化改性,不需要对纸芯片本身进行直接化学修饰,是通过对二氧化硅纳米纳米进行表面修饰,固定于纸芯片检测区域而完成。本发明兼具快速、易于操作等优势,可对二氧化硅纳米粒子进行不同需要的化学修饰,制作不同类型的纸芯片。提供了一种修饰纸芯片的新策略,丰富了纸芯片相关研究;
2.将纸芯片技术、分子印迹技术和荧光技术相结合制备基于荧光共轭聚合物的硝基苯分子印迹纸芯片,用于硝基苯类化合物的高效识别与高灵敏荧光检测。形成硝基苯印迹层后,由于共轭聚合物的电子转移和分子识别作用,当加入硝基苯之后,共轭聚合物的荧光随硝基苯的浓度增加丽减弱,据此可实现对硝基苯的高效识别与高灵敏荧光检测;
3.系统考察了该印迹芯片对硝基苯的分析性能,相比其它硝基苯类化合物显示出很高的选择性吸附能力;相对于非印迹聚合物,对硝基苯有着更高的识别选择性和稳定性。
附图说明
图1荧光分子印迹纳米微球合成示意图
图2荧光分子印迹纳米微球荧光猝灭光谱图:曲线a没有加入硝基苯时的荧光强度F0;曲线b、c表示加入不同浓度硝基苯荧光猝灭后的荧光强度FS
图3折叠式纸芯片照片
图4折叠式纸芯片结构和检测示意图:a.修饰荧光分子印迹纳米微球的硝基苯检测区b.纸芯片亲水通道;c.纸芯片加检测样品区d.纸芯片疏水区
具体实施方式:
实施例1一种基于荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法
步骤1.二氧化硅纳米粒子制备:将4.5mL的正硅酸乙酯和45.50mL无水乙醇混合,用磁力搅拌器以1100转/min搅拌;再将24.75mL的去离子水、9mL浓度28%的氨水和16.25mL的无水乙醇搅拌混合;将2份溶液迅速混合,持续搅拌2h后,依次用乙醇和去离子水离心洗涤3次,即可制得直径约为500nm的二氧化硅纳米粒子。
步骤2.二氧化硅纳米粒子表面氨基化修饰:将二氧化硅纳米粒子用38mL无水乙醇和2mL超纯水超声分散,磁力搅拌转速400转/min。滴加200μL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),搅拌均匀后通氮气保护反应12h。将反应液依次用乙醇和去离子水离心洗涤3次,即可制得氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子。
步骤3.荧光共轭聚合物合成:将25mL四氢呋喃,279mg3,5-二溴苯甲酰胺和502mg9,9-二己基芴-2,7-二硼酸二(1,3-丙二醇)酯依次加入烧瓶中,搅拌至溶解后,加入15mL浓度为2mol/L的K2CO3水溶液;通氮气保护升温至69oC回流,加入24mgPd(PPh3)4。反应48h,加入200mg9,9-二己基芴-2,7-二硼酸二(1,3-丙二醇)酯,反应6h。将产物转移到盛有100mL甲醇的烧杯中,抽滤后将不溶物依次以蒸馏水、甲醇、蒸馏水的顺序洗涤三次。洗涤后的固体在索氏提取器中用丙酮抽提24h,25oC真空干燥,得到荧光共轭聚合物,溶解于四氢呋喃制成溶液。
步骤4.分子印迹交联:称取0.5g氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子和共轭聚合物四氢呋喃溶液加入50mL浓度为1mmol/L硝基苯(NT)乙醇溶液中,缓慢搅拌2小时。加入1mL戊二醛(50%浓度),在室温下缓慢搅拌反应12小时交联。产物用丙酮、蒸馏水反复离心洗涤产物,以除去模板分子,真空干燥即可得到硝基苯荧光分子印迹纳米微球,合成过程如图1所示,荧光光谱如图2所示。
步骤5.制作和修饰纸芯片:设计纸芯片图形,如图1左所示。采用蜡印技术,将设计的图形丝网印刷或手工印刷在滤膜上,烘烤至蜡渗透纸芯片,制备出亲水的工作区域。0.1g分子印迹纳米微球超声分散于20mL无水乙醇中,滴加50μL至芯片的检查区,真空干燥,分子印迹纳米微球固定在含有流路通道的纸芯片检查区域中。通过折叠纸芯片,使含有流路通道的纸芯片可以进行试剂的引入和样品运输,最终得到基于荧光分子印迹纳米微球修饰纸芯片,如图3。
步骤6.测定荧光强度:以无水乙醇为溶剂,配制一系列不同浓度的NT溶液,其浓度范围为1.0×10-7mol/L、2.0×10-7mol/L、4.0×10-7mol/L、6.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L、2.0×10-6mol/L。然后将50μL一系列标准浓度NT溶液分别加入纸芯片样品区,如图4所示;静置5min后,测试纸芯片荧光分子印迹微球检测区和空白参比区的荧光强度。由倒置荧光显微镜测定检测区和空白参比区的荧光图像。纸芯片检测区的荧光分子印迹微球被光照激发出荧光,发射出的荧光通过显微镜镜头收集,延显微镜光路经过分光镜和发射滤光片进入EMCCD(ElectronMultiplyingChargeCoupledDevice)。用EMCCD测量经发射滤光片过滤后的荧光的强度灰度值图像,根据MetaMorph软件分析统计荧光图像的灰度值可以获得被测物荧光强度;测定F0为没有加入NT时的荧光强度,FS表示加入NT后的荧光强度,荧光猝灭过程用Stern-Volmer方程分析。根据所得的荧光F0/FS和NT的浓度绘制工作曲线,NT在1.0×10-7~2.0×10-6mol/L的浓度范围内呈线性关系。根据3倍标准偏差求得NT浓度检出限为5.0×10-8mol/L。
步骤7.以步骤6荧光分子印迹微球对间二硝基苯(DNT)标准样进行检测,绘制工作曲线步骤同步骤6,经NT分子表面印迹而形成荧光分子印迹纳米微球,DNT对其的荧光猝灭效率猝灭常数K SV小于NT猝灭常数K S的30%,则荧光分子印迹微球表面的聚合物薄层内孔穴的尺寸和形状与NT的是高度匹配,而与DNT不匹配。因此,本研究使用荧光分子印迹微球可以选择性的检测NT浓度。
步骤8.未知浓度的硝基苯样品的检测:测定荧光分子印迹微球修饰的纸芯片检测区的荧光强度F0;定量加入未知浓度的硝基苯样品溶液,测定荧光强度FS;由倒置荧光显微镜检测荧光。用EMCCD测量经发射滤光片过滤后的荧光的强度灰度值图像,根据MetaMorph软件分析统计荧光图像的灰度值获得被测物荧光强度。将F0/FS带入步骤6所得线性方程,可求算出待测液中硝基苯的浓度。
Claims (4)
1.一种基于荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法,其特征包括以下步骤:
(1)荧光分子印迹二氧化硅纳米微球的制备;
(2)采用蜡印技术,将设计的图形印刷在滤纸上,制备出亲水的工作区域和流路通道,并将荧光分子印迹二氧化硅纳米微球固定在纸芯片检查区域,折叠纸芯片制作基于荧光分子印迹纳米微球修饰纸芯片;
(3)测定加入硝基苯类化合物水溶液前后纸芯片检测区的荧光强度,用Stern-Volmer方程分析数据,测定水中硝基苯类化合物的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法,其特征在于所述步骤(1)具体为:
a单分散粒径可控二氧化硅纳米粒子的制备:将(量)正硅酸乙酯和(量)无水乙醇加入(量)去离子水中搅拌2-6h后,依次用乙醇和去离子水离心洗涤,即可制得直径约为500nm的二氧化硅纳米粒子;
b将二氧化硅纳米粒子用无水乙醇和超纯水超声分散,加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,搅拌均匀后通氮气保护反应12h;产物依次用乙醇和去离子水离心洗涤,制得氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子;
c通过Suzuki反应,使用单体3,5-二溴苯甲酰胺和9,9-二己基芴-2,7-二硼酸二(1,3-丙二醇)酯合成对硝基苯有高选择性和高灵敏度的荧光共轭聚合物
d.将氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子和荧光共轭聚合物分散于一定浓度硝基苯溶液中,缓慢搅拌;加入戊二醛在室温下缓慢搅拌反应交联;反复离心洗涤产物,除去模板分子,得到硝基苯荧光分子印迹纳米微球。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法,其特征在于所述步骤(2)具体为:
设计纸芯片图形,采用蜡印技术,将设计的图形丝网印刷或手工印刷在滤膜上,烘烤至蜡渗透纸芯片,制备出亲水的工作区域;分子印迹纳米微球超声分散于无水乙醇中,滴加至纸芯片的检测区,真空干燥,分子印迹纳米微球固定在纸芯片检测区中;通过折叠滤纸,使含有流路通道的纸芯片可以进行试剂的引入和样品运输,制得荧光检测纸芯片。
4.根据权利要求1所述的一种基于荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法,其特征在于所述步骤(3)具体为:
a以无水乙醇为溶剂,配制一系列不同浓度的NT溶液,定量将一系列不同浓度的NT溶液分别加入纸芯片样品区,静置5min;测试纸芯片荧光分子印迹微球检测区和空白参比区的荧光强度;根据所得的荧光F0/FS和NT的浓度绘制工作曲线,荧光猝灭过程和数据用Stern-Volmer方程分析;
b测定纸芯片空白参比区的荧光强度F0和定量加入未知浓度的硝基苯样品溶液检测区荧光强度FS;将F0/FS带入步骤(3)a所得线性方程,计算待测液中硝基苯的浓度。
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