CN111426669B - 一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法 - Google Patents

一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法，包括：在制备的SiO2纳米粒子表面印迹儿茶酚分子，在识别位点处修饰功能单体和标记荧光素NBD，在玻璃纤维表面自组装成探针阵列。本发明将纳米合成、分子印迹、等离子刻蚀技术与光电子诱导转移机理结合，在洗脱儿茶酚分子的二氧化硅纳米粒子探针表面，拥有空间结构与儿茶酚相匹配的识别位点，实现对儿茶酚的选择性识别，进入识别位点的儿茶酚中的羟基中的氢原子与APTS中的氨基上的氮原子的孤对电子形成氢键，基于光电子诱导转移原理，抑制了氮原子的电子转移，导致NBD电子诱导转移，使得标记在识别位点处荧光探针的荧光强度的增强，实现对目标分子儿茶酚高敏感探测。

Description

一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法
技术领域
本发明涉及材料科学领域，特别涉及具有对一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法。
背景技术
儿茶酚常被用作染发剂、硬化剂、皮肤杀菌、电镀添加剂和照相显影剂等，是化工、医药和农药的中间体。同时儿茶酚也对人体呼吸道具有强烈的刺激性及致突变性，甚至会诱发癌变，严重威胁人类健康，已被列入致癌药物清单，因此，迫切需要寻求一种能够对儿茶酚进行高选择性识别和高敏感性探测的方法。
目前检测儿茶酚的方法主要有化学发光法、高效液相色谱法、电化学法、分子印迹技术等。其中化学发光法由于其较高的灵敏度、线性范围宽、反应时间相对较短等优点使其在分析领域得到广泛的应用。王明丽等人（分析化学，2018，46，780-786.）研究了CdS量子点对三联吡啶钌（Ru(bpy)3 2+）电致化学发光（Electrogenerated chemiluminescence，ECL）信号的作用，发现CdS量子点对Ru(bpy)3 2+的ECL信号有良好的增敏作用，基于此建立了CdS量子点/Ru(bpy)3 2+的ECL体系。探讨了该体系的ECL机理，考察了CdS QDs的浓度、缓冲溶液pH值、扫描速率等实验参数对ECL信号的影响，优化了体系的ECL条件，基于邻苯二酚对该体系ECL信号的抑制作用建立了邻苯二酚的ECL检测方法。在一定范围内，邻苯二酚的浓度与ECL信号的变化值呈线性关系，并将本方法用于茶叶中邻苯二酚的检测。Liu等人（ Anal.  Chem.2007，79，8055-8060.）报道了CdTe量子点在水体系中的阳极电化学发光及其基于ECL能量转移的分析应用。首先用巯基丙酸对CdTe量子点进行修饰，得到水溶性量子点，并在铟锡氧化物（Indium tin oxide，ITO）电极上，在pH=9.3溶液中获得稳定且强烈的阳极ECL发射。ECL的发射与ITO表面产生的超氧离子的参与有关，超氧离子可以将电子注入CdTe的1Se量子受限轨道，形成量子点阴离子。这些阴离子与量子点氧化产物的碰撞导致量子点激发态的形成和ECL的发射。从激发态CdTe量子点到猝灭态的ECL能量转移产生了一种检测邻苯二酚衍生物的新方法。但其也存在着仪器昂贵、耗时、操作门槛高等缺点。
相比较下液相色谱法则具有分辨率高，速度快，具有较高的重现性并且可以反复使用等优点，使其在酚类的检测中得以应用。Gerstenberg等人（ Nephron Clinical  Practice，1986，13，239-242.）建立了卷烟冷凝液中儿茶酚的测定方法。采用液相色谱法进行分析，在柱前和分析柱之间进行柱切换。邻苯二酚通过选择性吸附在二羟甲基硅胶柱前分离。然后在不干扰反相色谱柱的情况下测定。通过柱切换，该程序在15分钟内自动运行。该方法非常适合于大量样品的常规测量，因为它允许冷凝液直接注入分析系统，而无需事先费时费力的清理程序。李忠等人（分析化学，2001，29，45-47.）采用液相色谱法测定烟草样品中的儿茶酚。具体为烟草样品中的儿茶酚经水汽蒸馏分离后用C18固相萃取小柱富集，以C18为固定相，以磷酸二氢钾为缓冲溶液，甲醇为流动相，该方法在用于几种烟草样品测定中略见成效。尽管液相色谱法能够实现对该项物质的检测，但大多情况下该方法都会与其他前处理方法联合使用，这使得操作复杂，且其存在涡流扩散及流速太低时，分子扩散严重等缺点，使其在该项检测中没有被广泛推广应用。
电化学分析法由于其灵敏度较高、最低分析检出限较低、准确较高、测量范围宽、仪器设备较简单，价格低廉、仪器的调试和操作简单，容易实现自动化等优点近年来被广泛应用于环境中污染物去除等领域。2005年许一婷等人公开了发明专利（CN1332196C）“一种邻苯二酚检测传感器及其制备方法”该方案制备提供以聚邻氨基苯硫酚为电极修饰物的电化学传感器，即邻苯二酚检测传感器与制备方法，并将邻苯二酚检测传感器作为传感器在水污染物及神经传递物邻苯二酚检测的应用。包括惰性电极基体和导电聚合物修饰膜及导电聚合物膜为乳液聚合产物聚邻氨基苯硫酚，基体电极表面聚合物的附着量为0.3~1.5mg·cm-2。具体实施步骤为将盐酸掺杂的PAT溶于N，N-二甲基甲酰胺中，配成1.0~10.0 mg·mL-1的溶液，取聚合物溶液涂覆于电极表面，烘干；将聚合物膜修饰电极预先在1.0 mol·L-1的硫酸介质中进行循环伏安扫描。2015年阚显文等人公开了发明专利（CN105466995A）“金纳米-碳纸电化学传感器及其制备方法以及邻苯二酚与对苯二酚的同步检测方法”该发明公开了一种金纳米-碳纸电化学传感器及其制备方法以及邻苯二酚与对苯二酚的同步检测方法，具体步骤为首先将石墨纸的两面通过胶带粘黏剥离形成毛面，然后将具有毛面的石墨纸置于氯金酸溶液中进行电化学沉积以制得金纳米-碳纸电化学传感器。通过该制备方法制得的金纳米-碳纸电化学传感器对邻苯二酚进行了检测。2017年庄凰龙等人公开了发明专利（CN107389762A）“一种儿茶酚传感器及其制备方法、儿茶酚检测方法”。该发明提供了一种儿茶酚传感器及其制备方法，具体内容包括碳糊，电极管，电极引线以及修饰层，碳糊从电极管一端压入，电极引线与碳糊接触，并从电极管的另一端引出，修饰层形成于电极管具有碳糊的一端的表面，修饰层包括氧化石墨烯层和DNA层，氧化石墨烯和DNA是良好的修饰剂，且二者具有协同促进作用，用二者修饰碳糊电极基体得到的儿茶酚传感器在测定儿茶酚时候表现出了良好的特性，对儿茶酚有良好的电催化响应作用。虽然电化学分析法在农药检测中有其优越性，不过电化学分析的选择性一般较差，这使其在此方面的发展受到限制。综上所述，以上方法虽然能够实现对儿茶酚的定量检测但尚有很多不足之处，如成本高、制备及检测时间长、程序繁琐、需要配备专业人员等。因此，迫切需要发展一种具有更高灵敏度，更加快速准确的痕量检测方法，本发明一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针的制备能够很好的解决上述问题。
近年来分子印迹技术由于高分子合成、分子设计、分子识别及生物工程等学科的发展使其在色谱、萃取、抗体模拟及酶催化中得到了广泛的应用，尽管如此，该技术仍存在很多缺点，因此科研工作者一直寻求一种与分子印迹相结合的技术方法来弥补其不足。César等人（ Anal. Chim. Acta2005，548，11-19.）将分子印迹技术与脉冲伏安法相结合，合成了一种基于分子印迹技术的高分子吸附剂，并将其应用于水中邻苯二酚测定。具体方案为，以邻苯二酚和4-乙烯基吡啶为模板剂和单体，采用本体聚合法制备了非共价聚合物。文章指出在标准水溶液中，邻苯二酚和5种酚类化合物的混合物通过填充在药筒中的聚合物进行选择性研究，然后用甲醇/乙酸洗脱溶液。从洗脱液中获得的差示脉冲伏安图表明，由于验证了重叠峰，所有化合物都保留在吸附剂上。即使在结构相似的酚类化合物存在下，儿茶酚的提取回收率也较高。Figueiredo等人发表的论文（ Microchem. J.2007，85，290-296.）中则是将分子印迹技术与分光光度法相结合，合成了一种用于邻苯二酚选择性在线提取的分子印迹聚合物，并用分光光度法测定了瓜拉那粉、配对茶和自来水中的邻苯二酚含量。具体制备方法为，同样以邻苯二酚为模板，4-乙烯基吡啶为功能单体，采用本体聚合法制备了印迹聚合物。以高锰酸钾溶液为分光光度法试剂，在酸性介质中，邻苯二酚将Mn（VII）还原为Mn（II），造成色度损失，并在多次运行中进行监测。并且对萃取流速、洗脱流速、螺旋长度、洗脱液性质和浓度、高锰酸钾浓度等变量进行研究，用与邻苯二酚类似的三种分子评价了选择性。得出这些分子分别在1:8、1:10和1:10比例下不存在干扰。2018年马晓国等人公开了发明专利（CN109001280A）“一种噻苯咪唑分子印迹电化学传感器的制备及应用方法”。此发明公布了一种噻苯咪唑分子印迹电化学传感器的制备及应用方法，具体实验方案为，首先在抛光电极上修饰氧化石墨烯得到氧化石墨烯修饰电极，然后将氧化石墨烯修饰电极在氯化钠溶液中进行电还原得到还原氧化石墨烯修饰电极。接着，在还原氧化石墨烯修饰电极表面原位电聚合分子印迹聚合物，形成一层分子印迹膜。分子印迹膜以邻苯二胺和间二苯酚为功能单体，噻苯咪唑为模板分子。去除噻苯咪唑模板分子后，得到基于还原氧化石墨烯的噻苯咪唑分子印迹电化学传感器。将该传感器与差分脉冲伏安法相结合，可对痕量噻苯咪唑进行检测。值得注意的是在使用裸固体电极作为工作电极的分析程序中，酚类化合物的电化学氧化可通过聚合物膜形成的电极污垢导致电极表面失活，因此这种方法逐渐被研究者所遗忘。2018年，王漫漫等人公开了发明专利（CN106362805B）“二氧化钛/石墨烯/分子印迹复合材料及其制备方法和应用”。发明公开了一种二氧化钛/石墨烯/分子印迹复合材料及其制备方法和应用，该复合材料以双酚A为模板分子，二氧化钛/石墨烯复合材料为印迹载体，邻苯二胺为功能单体，在光引发下进行聚合反应形成分子印迹聚合物，洗脱分子印迹聚合物中的模板分子后制备得到。可用于去除水体中的双酚A，能够实现对目标污染物双酚A的选择性吸附和高效催化降解。2019赖萃等人公开了发明专利（CN107649101A）“巯基功能化的二氧化钛分子印迹复合材料及其水相制备方法和应用”。该发明公开了一种巯基功能化的二氧化钛分子印迹复合材料及其水相制备方法和应用，该分子印迹复合材料主要以活化的二氧化钛-硫醇为印迹载体，2，4-二硝基苯酚为模板分子，邻苯二胺为功能单体和交联单体，在过硫酸铵引发下于水相中进行聚合，形成分子印迹聚合物，然后将分子印迹聚合物中的模板分子洗脱后制备得到，可用于去除水体中的2，4-二硝基苯酚。齐沛沛等人公开了发明专利（CN106841343A）“一种戊唑醇分子印迹膜电极、便携传感器及其使用方法和应用”。该发明将探针分子普鲁士蓝固定在戊唑醇分子印迹膜电极上，可以实现样品中非电活性靶标化合物的直接测定，使传感器的操作更为简便而适于现场快速检测。提供了一种戊唑醇分子印迹膜电极的制作方法，包括基体电极，依次修饰在所述基体电极表面的金纳米颗粒、巯基石墨烯以及金-普鲁士蓝，附着在所述金-普鲁士蓝表面的戊唑醇分子印迹膜，其中戊唑醇分子印迹膜为以戊唑醇为模板分子的邻氨基苯酚和间苯二酚聚合物。以上方法虽然在一定程度上能够实现酚类化合物的检测，但仍存在着如程序复杂、所需设备昂贵、维修检测成本高等不足。本发明基于传统分子印迹有效识别位点少，结合量小，吸附速率慢，进入识别位点的目标分析物自身无信号输出及制备环境要求苛刻，功能单体、交联剂等有较大的局限性等缺点，本发明创造性的将纳米材料表面印迹和识别位点功能化修饰技术相结合，该方法可以解决传统分子印迹的缺点，实现对儿茶酚的高选择性识别和高灵敏性探测。
分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymers，MIPs）作为光传感器的传感受体的研究受到了广泛的关注，因为它比传统的传感受体具有更多优点。MIPs对选择性结合位点具有很高的识别能力，甚至在某种程度上，MIPs能够模拟酶和抗体等生物制剂的功能（ Anal.  Bioanal.  Chem. 2004，378，1887–1897.）。在本发明中，我们创造性的将纳米合成、分子印迹技术、微纳米刻蚀技术与光诱导电子转移机理相结合，进行了一项新的技术发明，在SiO2纳米粒子表面构建了荧光标记的儿茶酚分子印迹识别位点探针，通过模板分子儿茶酚、功能单体3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-Aminopropyl trimethoxysilane，APTS）和交联剂正硅酸四乙酯（Tetraethyl orthosilicate，TEOS）的水解缩合反应制备得到用于儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针，进入识别位点的儿茶酚分子中羟基的氢原子与功能单体中的氨基上的氮原子的孤对电子形成氢键，基于光诱导电子转移（Photoinducedelectron transfer，PET）的原理，抑制了功能单体中的氨基上的氮原子的电子转移，导致荧光素NBD电子诱导转移，相匹配的空间结构实现对儿茶酚的选择性识别、标记在识别位点处探针荧光强度的增强，实现对儿茶酚分子的敏感性探测。
发明内容
发明目的：针对目前现有技术存在的不足之处，本发明将纳米合成、分子印迹技术、微纳米刻蚀技术与光诱导电子转移机理相结合，在二氧化硅纳米粒子的表面构建了荧光标记儿茶酚分子印迹的识别位点探针，对其等温吸附量、动力学及选择性进行研究，进一步利用其荧光特性与儿茶酚浓度关系作为信号输出实现对儿茶酚的高选择性识别和高敏感性探测。所述方法为化学合成法，首先合成出二氧化硅纳米粒子，然后以儿茶酚为目标分子，APTS为功能单体，TEOS为交联剂，NBD-APTS为荧光标记探针，在二氧化硅纳米粒子表面制备了荧光标记分子印迹探针，洗脱了儿茶酚分子的二氧化硅纳米粒子表面，拥有与儿茶酚分子相匹配的空间结构，实现对儿茶酚的选择性识别，此外识别位点处标记的荧光探针，基于光诱导电子转移（Photoinduced electron transfer，PET）的原理，通过荧光强度的增强，实现对儿茶酚的敏感探测。制备出对儿茶酚具有选择性识别和探测作用的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列。
本发明的技术方案是：一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法，包括二氧化硅纳米粒子的制备，并在其表面修饰荧光素NBD及功能单体，其特征在于：所述分子印迹二氧化硅探针中洗脱儿茶酚分子的二氧化硅纳米粒子表面，拥有空间结构与儿茶酚分子相匹配的识别位点，相匹配的空间结构实现对儿茶酚分子的识别，进入识别位点的儿茶酚分子中的羟基中的氢原子与功能单体中的氨基上的氮原子的孤对电子形成氢键，基于光诱导电子转移的原理，抑制了功能单体中的氨基上的氮原子的电子转移，导致NBD电子诱导转移，使得标记在识别位点处荧光探针阵列的荧光强度的增强，实现对目标分子儿茶酚探测，用于儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备过程包括如下四个步骤：
第一步是二氧化硅纳米粒子溶液的制备：首先，将1~3mL二氧化硅前驱体正硅酸四乙酯和80~90mL乙醇分别加入到500mL带有磨口塞的三口圆底烧瓶中，用磁力搅拌器以固定转速500rpm搅拌3~5min，使正硅酸四乙酯与乙醇充分混合，然后用量筒量取5~10mL氨水迅速加入到上述反应液中，提高转速至750rpm搅拌3~5min后，再次将转速降至500rpm，用密封脂涂抹密封后持续搅拌反应16~25h，将得到的反应混合物均分移至4支50mL的离心管中，以10000rpm转速进行离心，用95%乙醇反复洗3次，再用30mL的去离子水超声分散，得到二氧化硅纳米粒子溶液；
第二步是NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子的溶液的制备：避光下，将1~3mg的NBD和0.5~1.5mL功能单体加入到12~16mL无水乙醇中，超声分散5min后，放入振荡器中在室温下振荡18~22h，得到NBD-功能单体溶液，将NBD-功能单体溶液与上述制备的一支离心管中的二氧化硅纳米粒子溶液混合，避光条件下，用磁力搅拌器以500rpm搅拌速度反应20~26h，将修饰后的二氧化硅纳米粒子平均分装在四支50mL的离心管中，分别用95%的乙醇依次离心、分散和置换溶剂3次，最后将所得离心沉淀底物分散于50mL无水乙醇溶液中，得到NBD-NH-SiO2纳米粒子溶液，取上述5~15mL的NBD-NH-SiO2纳米粒子溶液置于磨口的100mL锥形瓶中，加入45~55mL无水乙醇稀释，超声分散3~5min后，加入25~35mg儿茶酚、0.5~1.5mL功能单体、1~2mL交联剂和8~12mg表面活性剂继续超声3~5min，在磁力搅拌器上以350rpm的转速反应8~12h，得到NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子溶液，本发明中为对比印迹效果，除未加儿茶酚外，非印迹的SiO2纳米粒子的制备与印迹的SiO2纳米粒子制备过程相同；
第三步是NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针的制备：量取步骤1.2中制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子溶液40mL均分置于2支50mL离心管中，在10000rpm转速下离心，分离得到NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子，用无水乙醇反复洗涤、离心3次去除多余的反应物，然后将所得的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子反复在体积比为8：1：1甲醇/乙酸/乙腈的混合液中回流，提取儿茶酚分子，直到提取液在278.5nm处无紫外吸收峰为止，再用无水乙醇洗涤去除残留的乙酸，然后在50mL丙酮溶液中浸泡12h，最后常温下真空干燥至恒重，得到对儿茶酚识别和检测的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针。
第四步是NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针阵列的制备：首先，将直径为100mm圆形玻璃光纤表面上的水分烘干，涂抹附着剂六甲基乙硅氮烷，再将玻璃光纤放在一个平整的内有小孔与真空管相连金属的托盘上，将光刻胶溶液喷洒在玻璃光纤表面，以500rpm转速旋转托盘上的玻璃光纤，保持3min，得到光刻胶涂抹均匀的玻璃光纤，将其置于真空烘箱里，在60℃下干燥2h，形成固态的薄膜，用325nm波长的光对覆盖硅衬底的光刻胶进行选择性地照射，沉浸在显影液中显影，然后通过等离子刻蚀，在玻璃光纤表面制作出2mm×2mm×1mm微洞阵列，用丙酮清洗去留在玻璃光纤表面的光刻胶，再将圆形玻璃光纤裁剪为20×20 mm2长方形，然后将二氧化硅探针的悬浮液滴到玻璃光纤上，让其自然干燥，微洞里自发地填满了二氧化硅探针，用擦镜纸擦去上述玻璃光纤表面上的二氧化硅探针，留在微洞里的二氧化硅探针构成了荧光探针阵列，得到检测儿茶酚的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针阵列。
所述的NBD为荧光染料4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑；所述的功能单体为3-氨丙基三乙氧基硅烷；所述的交联剂为正硅酸四乙酯；所述的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵；所述的光刻胶为酚醛树脂。
相对于现有技术的有益效果
近年来分子印迹技术由于高分子合成、分子设计、分子识别及生物工程等学科的发展使其在色谱、萃取、抗体模拟及酶催化中得到了广泛的应用，尽管如此，该技术仍存在很多缺点，因此科研工作者一直寻求一种与分子印迹相结合的技术方法来弥补其不足。César等人（ Anal.  Chim.  Acta，2005，548，11-19.）将分子印迹技术与脉冲伏安法相结合，合成了一种基于分子印迹技术的高分子吸附剂，并将其应用于水中邻苯二酚测定。具体方案为，以邻苯二酚和4-乙烯基吡啶为模板剂和单体，采用本体聚合法制备了非共价聚合物。文章指出在标准水溶液中，邻苯二酚和5种酚类化合物的混合物通过填充在药筒中的聚合物进行选择性研究，然后用甲醇/乙酸洗脱溶液。从洗脱液中获得的差示脉冲伏安图表明，由于验证了重叠峰，所有化合物都保留在吸附剂上。即使在结构相似的酚类化合物存在下，儿茶酚的提取回收率也较高。Figueiredo等人发表的论文（ Microchem.  J. 2007，85，290-296.）中则是将分子印迹技术与分光光度法相结合，合成了一种用于邻苯二酚选择性在线提取的分子印迹聚合物，并用分光光度法测定了瓜拉那粉、配对茶和自来水中的邻苯二酚含量。具体制备方法为，同样以邻苯二酚为模板，4-乙烯基吡啶为功能单体，采用本体聚合法制备了印迹聚合物。以高锰酸钾溶液为分光光度法试剂，在酸性介质中，邻苯二酚将Mn（VII）还原为Mn（II），造成色度损失，并在多次运行中进行监测。并且对萃取流速、洗脱流速、螺旋长度、洗脱液性质和浓度、高锰酸钾浓度等变量进行研究，用与邻苯二酚类似的三种分子评价了选择性。得出这些分子分别在1:8、1:10和1:10比例下不存在干扰。2018年马晓国等人公开了发明专利（CN109001280A）“一种噻苯咪唑分子印迹电化学传感器的制备及应用方法”。此发明公布了一种噻苯咪唑分子印迹电化学传感器的制备及应用方法，具体实验方案为，首先在抛光电极上修饰氧化石墨烯得到氧化石墨烯修饰电极，然后将氧化石墨烯修饰电极在氯化钠溶液中进行电还原得到还原氧化石墨烯修饰电极。接着，在还原氧化石墨烯修饰电极表面电聚合分子印迹聚合物，形成一层分子印迹膜。分子印迹膜以邻苯二胺和间二苯酚为功能单体，噻苯咪唑为模板分子。去除噻苯咪唑模板分子后，得到基于还原氧化石墨烯的噻苯咪唑分子印迹电化学传感器。将该传感器与差分脉冲伏安法相结合，可对痕量噻苯咪唑进行检测。值得注意的是在使用裸固体电极作为工作电极的分析程序中，酚类化合物的电化学氧化可通过聚合物膜形成的电极污垢会导致电极表面失活，因此该方法已逐渐被研究者所淘汰。2018年，王漫漫等人公开了发明专利（CN106362805B）“二氧化钛/石墨烯/分子印迹复合材料及其制备方法和应用”。发明公开了一种二氧化钛/石墨烯/分子印迹复合材料及其制备方法和应用，该复合材料以双酚A为模板分子，二氧化钛/石墨烯复合材料为印迹载体，邻苯二胺为功能单体，在光引发下进行聚合反应形成分子印迹聚合物，洗脱分子印迹聚合物中的模板分子后制备得到。可用于去除水体中的双酚A，能够实现对目标污染物双酚A的选择性吸附和高效催化降解。2019赖萃等人公开了发明专利（CN107649101A）“巯基功能化的二氧化钛分子印迹复合材料及其水相制备方法和应用”。该发明公开了一种巯基功能化的二氧化钛分子印迹复合材料及其水相制备方法和应用，该分子印迹复合材料主要以活化的二氧化钛-硫醇为印迹载体，2，4-二硝基苯酚为模板分子，邻苯二胺为功能单体和交联单体，在过硫酸铵引发下于水相中进行聚合，形成分子印迹聚合物，然后将分子印迹聚合物中的模板分子洗脱后制备得到，可用于去除水体中的2，4-二硝基苯酚。齐沛沛等人公开了发明专利（CN106841343A）“一种戊唑醇分子印迹膜电极、便携传感器及其使用方法和应用”。该发明将探针分子普鲁士蓝固定在戊唑醇分子印迹膜电极上，可以实现样品中非电活性靶标化合物的直接测定，使传感器的操作更为简便而适于现场快速检测。具体为提供了一种戊唑醇分子印迹膜电极的制作方法，包括基体电极，依次修饰在所述基体电极表面的金纳米颗粒、巯基石墨烯以及金-普鲁士蓝，附着在所述金-普鲁士蓝表面的戊唑醇分子印迹膜，其中戊唑醇分子印迹膜为以戊唑醇为模板分子的邻氨基苯酚和间苯二酚聚合物。以上方法虽然在一定程度上能够实现酚类化合物的检测，但仍存在着如程序复杂、所需设备昂贵、维修检测成本高等不足。本发明基于传统分子印迹有效识别位点少，结合量小，吸附速率慢，进入识别位点的目标分析物自身无信号输出及制备环境要求苛刻，功能单体、交联剂等有较大的局限性等缺点，本发明创造性的将纳米材料表面印迹和识别位点功能化修饰技术相结合，该方法可以解决传统分子印迹的缺点，实现对儿茶酚的高选择性识别和高灵敏性探测。
本发明首先是二氧化硅纳米粒子溶液的制备：在25℃下用0~1mL移液枪准确量取2mL交联剂，用100 mL量筒量取89 mL无水乙醇，将上述两种溶液混合后加入到500mL带有磨口塞的三口圆底烧瓶中，放入磁子并用磁力搅拌器以固定转速500rpm搅拌3min，使上述圆底烧瓶中的交联剂与无水乙醇充分混合，然后用量筒准确量取8mL氨水迅速加入到上述反应液中，提高磁力搅拌器转速至750rpm搅拌3min后，再次将转速降至500rpm，上述三口烧瓶磨口塞用密封脂涂抹密封后持续搅拌21h，反应结束后将得到的混合液体均匀移至4支50mL的离心管中，以10000rpm转速进行离心，用95%乙醇反复洗3次，再分别用30mL的去离子水超声分散，得到二氧化硅纳米粒子溶胶溶液。
其次是NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子溶液的制备：在避光条件下，将2mg的NBD和1mL功能单体加入到含有15mL无水乙醇的100mL锥形瓶中，将上述溶液超声分散5min后，放入振荡器中在室温下振荡20h，得到NBD-功能单体溶液，将NBD-功能单体溶液与上述制备的一支离心管中的二氧化硅纳米粒子溶液混合，避光条件下用磁力搅拌器以500rpm搅拌24h，得到NBD和氨丙基修饰的二氧化硅纳米粒子，将修饰后的二氧化硅纳米粒子平均分装在四支50mL的离心管中，分别用95%的乙醇依次离心、分散和置换溶剂3次，最后将所得离心沉淀底物分散于50mL无水乙醇溶液中，得到NBD-NH-SiO2溶液，取上述10mL的NBD-NH-SiO2纳米粒子溶液置于磨口的100mL锥形瓶中，加入50mL无水乙醇稀释，再将该溶液超声分散5min后，加入30mg儿茶酚、1mL功能单体、1.5mL的交联剂和10mg表面活性剂继续超声5min，在磁力搅拌器上以350rpm的转速反应10h。得到NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子溶液。本发明中为对比印迹效果，除未加儿茶酚外，非印迹的二氧化硅纳米粒子的制备与印迹的SiO2纳米粒子制备过程相同。
再次是NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅荧光探针的制备：量取上述制备的纳米粒子溶液40mL均分置于2支50mL离心管中，在10000rpm转速下离心，分离得到NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子，用无水乙醇反复洗涤、离心3次去除多余的反应物，然后将所得的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子反复在体积比为8：1：1甲醇/乙酸/乙腈的混合液中回流以提取儿茶酚模板分子，直到提取液在278.5nm处无紫外吸收峰为止，再用无水乙醇洗涤去除残留的乙酸，然后在50mL丙酮溶液中浸泡12h，最后25℃真空干燥至恒重，得到对儿茶酚具有高灵敏性和特异性识别能力的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针。
最后是NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针阵列的制备：首先，将直径为100 mm圆形玻璃光纤表面上的水分烘干，涂抹附着剂六甲基乙硅氮烷，再将玻璃光纤放在一个平整的内有小孔与真空管相连金属的托盘上，将光刻胶溶液喷洒在玻璃光纤表面，以500rpm转速旋转托盘上的玻璃光纤，保持3min，得到光刻胶涂抹均匀的玻璃光纤，将其置于真空烘箱里，在60℃下干燥2h，形成固态的薄膜，用325nm波长的光对覆盖硅衬底的光刻胶进行选择性地照射，沉浸在显影液中显影，然后通过等离子刻蚀，在玻璃光纤表面制作出2mm×2mm×1mm微洞阵列，用丙酮清洗去留在玻璃光纤表面的光刻胶，再将圆形玻璃光纤裁剪为20mm×20mm长方形，然后将二氧化硅探针的悬浮液滴到玻璃光纤上，让其自然干燥，微洞里自发地填满了二氧化硅探针，用擦镜纸擦去上述玻璃光纤表面上的二氧化硅探针，留在微洞里的二氧化硅探针构成了荧光探针阵列，得到检测儿茶酚的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针阵列。
综上所述，本方案所制备的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列实现了对儿茶酚的超高灵敏和痕量检测，并具有成本低，操作便捷等优点。
其一：与传统的分子印迹技术相比较，纳米二氧化硅壳层中，识别位点刚性强，识别位点位于表面，因此，本发明采用表面印迹技术，克服了有效识别位点少，结合量小，吸附速率慢等缺点。
其二：与传统的分子印迹技术，目标分子进入识别位点，自身没有信号，因此无法确定目标分子是否进入识别位点，本技术发明在识别位点处修饰上荧光素基团NBD。
其三：本发明创造性的将光诱导电子转移机理引入分子印迹技术，使得进入识别位点处的目标分子，抑制了功能基团氨基上氮原子的孤对电子转移，促使NBD荧光基团的电子转移，导致了荧光增强，因此，克服了传统分子印迹技术中进入识别位点的目标分析物自身无信号输出的缺点。
其四：本发明制备的荧光探针中，进入识别位点的儿茶酚分子中的羟基中的氢原子与功能单体中的氨基上的氮原子的孤对电子形成氢键，基于光诱导电子转移的原理，抑制了功能单体中的氨基上的氮原子的电子转移，导致荧光素NBD电子诱导转移，相匹配的空间结构实现对儿茶酚的选择性识别、标记在识别位点处探针荧光强度的增强，实现对目标分子儿茶酚的敏感性探测，增加了检测的灵敏度，同时提高了选择性及线性范围。
附图说明
图1是本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子荧光探针基于光诱导电子转移机理探测目标分析物。
图2是本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子荧光探针的制备过程。
图3是本发明中3种化合物在乙醇溶液中的紫外-可见吸收光谱。
图4是本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子的扫描电镜（A）及其归一化的紫外-可见和荧光光谱（B）。
图5是本发明所制备的印迹材料和非印迹材料的吸附等温线（A）和动力学曲线（B）。
图6是本发明所制备的印迹材料和非印迹材料的Langmuir（A）和Freundlich（B）热力学等温吸附拟合线模型。
图7是本发明所制备印迹材料及非印迹材料的准一级动力学拟合曲线（A）和准二级动力学拟合曲线（B）。
图8是本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针随着儿茶酚浓度增加荧光强度的变化（A）和二氧化硅探针的荧光比率（B）。
图9是本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针在玻璃光纤上刻蚀微孔的规则阵列随儿茶酚浓度变化荧光强度演变过程。
根据附图进一步解释具体实施方式
图1是本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子荧光探针基于光诱导电子转移机理探测目标分析物。图中进入识别位点的儿茶酚分子中羟基的氢原子与功能单体中的氨基上的氮原子的孤对电子形成氢键，基于光诱导电子转移的原理，抑制了功能单体中的氨基上的氮原子的电子转移，导致荧光素NBD电子诱导转移，相匹配的空间结构实现对儿茶酚的选择性识别、标记在识别位点处探针荧光强度的增强，实现对儿茶酚分子的敏感性探测，检测过程中，纳米粒子能够多次重复洗脱、离心，再使用。
图2是本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子荧光探针的制备过程。1-2过程中由于二氧化硅纳米粒子表面富含羟基，使得NBD-功能单体复合物、过量的硅烷化试剂、功能单体在二氧化硅的表面与羟基水解缩合反应，使二氧化硅表面修饰上氨基和荧光残基基团（NBD-NH-）；2-3过程中儿茶酚、功能单体和交联剂通过水解缩合反应得到荧光标记分子印迹二氧化硅纳米粒子；3-4过程中荧光标记的分子印迹二氧化硅纳米粒子通过洗脱儿茶酚后（荧光闭）与再结合（荧光开），实现对儿茶酚分子选择性识别和敏感性探测的过程。
图3是本发明中3种化合物在乙醇溶液中的紫外-可见吸收光谱。实施方案为用乙醇作为参比溶液，分别测得NBD、功能单体和NBD-功能单体的紫外可见吸收光谱。图中 a， b和 c线分别表示NBD、NBD-APTS和APTS的紫外-可见吸收光谱。功能单体和NBD反应后在可见区460nm处出现了新的吸收峰，这是因为功能单体中碳链上的富电子氨基上的氮原子与NBD中苯环上的Cl原子位置发生亲核取代反应，使NBD苯环上的氯原子（Cl）被取代的结果，这表明NBD-APTS复合物的成功生成。
图4是本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子的扫描电镜（A）及其归一化的紫外-可见和荧光光谱（B）。其中图4（A）是NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子的扫描电镜，二氧化硅纳米粒子表面修饰和儿茶酚印迹后仍为单分散球形纳米粒子，且表面较为光滑，粒径分布均匀，大小约200nm，提供了大量的比表面积及识别位点，表明该纳米粒子探针被成功的制备。图4（B）中虚线和实线分别为二氧化硅纳米粒子和NBD-NH-SiO2纳米粒子在乙醇溶液中归一化后的紫外-可见光谱，点线为NBD-NH-SiO2纳米粒子的归一化后的荧光光谱。NBD-NH-SiO2纳米粒子紫外-可见光谱在460nm处出现了一个新的吸收峰，表明了NBD中荧光基团已修饰在二氧化硅纳米粒子表面，由于二氧化硅固体悬浊胶体对光源有很强的散射作用，以及单分子的修饰致使NBD-NH-SiO2探针在460nm处的吸收峰较弱。同时，NBD-NH-SiO2探针溶液的最大荧光发射光谱在530nm处，表明了NBD荧光基团嫁接在二氧化硅表面。在自然光下NBD-NH-SiO2荧光探针溶液的颜色为黄绿色，在365nm的紫外光下其颜色为的绿色。进一步说明二氧化硅纳米粒子表面上混合型的功能单体和荧光基团的成功修饰。
图5是本发明所制备的印迹材料和非印迹材料的吸附等温线（A）和动力学曲线（B）。图5（A）为印迹材料对儿茶酚的等温吸附线（ a）和结构类似物对苯二酚的等温吸附线（ b），以及非印迹材料对儿茶酚的等温吸附线（ c）。选取与儿茶酚结构类似的对苯二酚验证印迹材料的选择性。从图5（A）中可以看出儿茶酚在印迹聚合物微球上的最大平衡吸附量（约60.3mg•g-1）为非印迹聚合物纳米粒子最大平衡吸附量（约26.8mg•g-1）的2.26倍，是结构类似物对苯二酚的2倍，说明儿茶酚印迹的聚合物纳米粒子对儿茶酚有较好的识别能力，这是因为制备儿茶酚印迹聚合物纳米粒子表面壳层中形成了与儿茶酚分子形状相匹配、大小合适和能相互作用的功能基团及空间骨架结构，从而使儿茶酚分子能够很好的进入结合位点，由于纳米壳层具有超薄的特点，使得儿茶酚目标分子更容易扩散到纳米壳层表面的印迹位点，因此，儿茶酚分子印迹材料拥有高的结合量。印迹材料对对苯二酚的最大平衡吸附量约为30.5mg•g-1，其结合量是儿茶酚结合量的0.5倍，结果证实了印迹材料具有很高的选择性识别能力。图5（B）儿茶酚分子印迹和非印迹材料的吸附动力学线，其中，（ a）和（ b）分别为印迹材料对儿茶酚和对苯二酚以及非印迹材料对儿茶酚吸附动力学线。其中，儿茶酚的浓度为7.0×10-5mol∙L-1，达到吸附平衡之前，分子印迹二氧化硅纳米粒子从液相中吸附儿茶酚分子的速率远远大于非印迹聚合物粒子，印迹二氧化硅纳米粒子在液相中的吸附达到最大平衡吸附量的50%所需要的时间约为60min，达到最大平衡吸附量的时间约为150min，结合速率为0.412mg•g-1•min-1。而非印迹纳米粒子在溶液中达到最大平衡吸附量的50％所需时间约为120min，达到最大平衡吸附量的时间长达240min，结合速率仅为0.084mg•g-1•min-1。印迹材料对对苯二酚的结合速率为0.107mg•g-1•min-1。儿茶酚印迹的二氧化硅纳米粒子对儿茶酚的结合速率为非印迹材料的4.90倍，是对苯二酚的3.85倍。由于印迹过程中，儿茶酚分子在二氧化硅纳米粒子表面留下的空间骨架结构及特异性结合位点决定了印迹聚合物对儿茶酚分子的高亲合力和特异识别性，同时二氧化硅的多孔结构和纳米尺寸的管壁厚度有利于儿茶酚分子在体系中的扩散，使儿茶酚分子能够快速到达印迹聚合物中的识别位点，这表明本发明所制备的印迹材料与目标分析物具有很高的选择及再结合能力，这为进一步对目标分析物的检测奠定了坚实基础。
图6是本发明所制备的印迹材料和非印迹材料的Langmuir（A）和Freundlich（B）热力学等温吸附拟合线模型。其中 a和 b线分别为印迹材料对儿茶酚和对苯二酚的等温吸附拟合线； c为非印迹材料对儿茶酚的等温吸附拟合线。从拟合结果来看，所制备的NBD-NH-SiO2纳米粒子对儿茶酚、对苯二酚的等温吸附符合Langmuir模型，而非印迹NBD-NH-SiO2纳米粒子对儿茶酚等温吸附也满足Langmuir模型，并且 a、b、c在Langmuir模型中的R2分别为0.988、0.997及0.993，符合程度较高，属于单分子层吸附过程。
图7是本发明所制备印迹材料及非印迹材料的准一级动力学拟合曲线（A）和准二级动力学拟合曲线（B）。其中图7（A）为准一级动力学拟合曲线，（B）为准二级动力学拟合曲线， a、b分别为印迹材料对儿茶酚和对苯二酚的动力学拟合曲线，c为非印迹材料对儿茶酚的动力学拟合曲线。并分别对图7中的印迹儿茶酚的纳米粒子对儿茶酚、结构类似物对苯二酚以及非印迹纳米粒子对儿茶酚实验动力学数据进行拟合，结果显示，所制备的NBD-NH-SiO2纳米粒子对儿茶酚和对苯二酚的吸附动力学都符合准一级动力学模型，而非印迹NBD-NH-SiO2纳米粒子对儿茶酚吸附动力学也满足准一级动力学模型，并且 a、b、c在准一级动力学模型中的R2分别为0.978、0.961及0.975。
图8是本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针随着儿茶酚浓度增加荧光强度的变化（A）和二氧化硅探针的荧光比率（B）。图8（A）中NBD-NH-SiO2纳米粒子在激发波长为460nm下随着儿茶酚浓度从1.0×10-9~10×10-9mol·L-1增加，纳米粒子的荧光强度在530nm处逐渐增强。这是由于儿茶酚中的羟基与氨丙基中富电子的氨基之间相互作用形成了氢键，使得氨基中的孤对电子受激发时无法跃迁至NBD荧光基团中，抑制了光诱导电子转移发生，因此，阻止了NBD荧光基团与氨丙基中氨基之间的光诱导电子转移发生，导致NBD-NH-SiO2纳米粒子探针诱导电子转移，使得探针荧光强度增强。图8（B）中I/I0为荧光强度的变化率，其中 I 0 、 I分别表示没有目标分析物和存在目标分析物时的荧光强度，从图中可以看出，随着儿茶酚浓度的增加，荧光强度比率显著增强，表明这一荧光变化过程强烈的依赖于儿茶酚浓度，因此，目标分析物儿茶酚的加入致使荧光强度的增加表明了NBD-NH-SiO2纳米粒子探针对儿茶酚拥有高敏感性的检测。
图9是本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针在玻璃光纤上刻蚀微孔的规则阵列随儿茶酚浓度变化荧光强度演变过程。图9中共聚焦荧光图像显示了不同浓度儿茶酚溶液滴入10μL后荧光点亮度的变化，从图中可以看出在体积一定时，随着儿茶酚浓度从0，1.0×10-9，1.0×10-8，1.0×10-7，1.0×10-6，1.0×10-5mol·L-1增加，矩形阵列点的荧光亮度不断增强，这表明本发明所制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针，基于光诱导电子转移机理，随着儿茶酚浓度的增加，儿茶酚中的羟基中的氢原子与二氧化硅纳米粒子表面的氨丙基中氮原子上孤对电子形成氢键，抑制了氮原子上孤对电子的激发，诱导NBD荧光基团上电子激发，致使二氧化硅探针阵列荧光强度增强，实现了对儿茶酚敏感性探测。最低检测限为：10×10-6 L×1.0×10-9 mol·L-1×110g·mol=1.1pg儿茶酚。因此，进一步证明了本发明所制备的二氧化硅探针阵列高选择性的识别且高敏感性的探测了儿茶酚分子。
具体实施方式
一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法，包括二氧化硅纳米粒子的制备，并在其表面修饰荧光素NBD及功能单体，其特征在于：所述分子印迹二氧化硅探针中洗脱儿茶酚分子的二氧化硅纳米粒子表面，拥有空间结构与儿茶酚分子相匹配的识别位点，相匹配的空间结构实现对儿茶酚分子的识别，进入识别位点的儿茶酚分子中的羟基中的氢原子与功能单体中的氨基上的氮原子的孤对电子形成氢键，基于光诱导电子转移的原理，抑制了功能单体中的氨基上的氮原子的电子转移，导致NBD电子诱导转移，使得标记在识别位点处荧光探针的荧光强度的增强，实现对目标分子儿茶酚探测，用于儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备过程包括如下四个步骤：
第一步是二氧化硅纳米粒子溶液的制备：首先，将1~3mL二氧化硅前驱体正硅酸四乙酯和80~90mL乙醇分别加入到500mL带有磨口塞的三口圆底烧瓶中，用磁力搅拌器以固定转速500rpm搅拌3~5min，使正硅酸四乙酯与乙醇充分混合，然后用量筒量取5~10mL氨水迅速加入到上述反应液中，提高转速至750rpm搅拌3~5min后，再次将转速降至500rpm，用密封脂涂抹密封后持续搅拌反应16~25h，将得到的反应混合物均分移至4支50mL的离心管中，以10000rpm转速进行离心，用95%乙醇反复洗3次，再用30mL的去离子水超声分散，得到二氧化硅纳米粒子溶液；
第二步是NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子的溶液的制备：避光下，将1~3mg的NBD和0.5~1.5mL功能单体加入到12~16mL无水乙醇中，超声分散5min后，放入振荡器中在室温下振荡18~22h，得到NBD-功能单体溶液，将NBD-功能单体溶液与上述制备的一支离心管中的二氧化硅纳米粒子溶液混合，避光条件下，用磁力搅拌器以500rpm搅拌速度反应20~26h，将修饰后的二氧化硅纳米粒子平均分装在四支50mL的离心管中，分别用95%的乙醇依次离心、分散和置换溶剂3次，最后将所得离心沉淀底物分散于50mL无水乙醇溶液中，得到NBD-NH-SiO2纳米粒子溶液，取上述5~15mL的NBD-NH-SiO2纳米粒子溶液置于磨口的100mL锥形瓶中，加入45~55mL无水乙醇稀释，超声分散3~5min后，加入25~35mg儿茶酚、0.5~1.5mL功能单体、1~2mL交联剂和8~12mg表面活性剂继续超声3~5min，在磁力搅拌器上以350rpm的转速反应8~12h，得到NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子溶液，本发明中为对比印迹效果，除未加儿茶酚外，非印迹的SiO2纳米粒子的制备与印迹的SiO2纳米粒子制备过程相同；
第三步是NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针的制备：量取步骤1.2中制备的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子溶液40mL均分置于2支50mL离心管中，在10000rpm转速下离心，分离得到儿茶酚印迹的二氧化硅纳米粒子，用无水乙醇反复洗涤、离心3次去除多余的反应物，然后将所得的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子反复在体积比为8：1：1甲醇/乙酸/乙腈的混合液中回流，提取儿茶酚分子，直到提取液在278.5nm处无紫外吸收峰为止，再用无水乙醇洗涤去除残留的乙酸，然后在50mL丙酮溶液中浸泡12h，最后常温下真空干燥至恒重，得到对儿茶酚识别和检测的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针。
第四步是NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针阵列的制备：首先，将直径为100 mm圆形玻璃光纤表面上的水分烘干，涂抹附着剂六甲基乙硅氮烷，再将玻璃光纤放在一个平整的内有小孔与真空管相连金属的托盘上，将光刻胶溶液喷洒在玻璃光纤表面，以500rpm转速旋转托盘上的玻璃光纤，保持3min，得到光刻胶涂抹均匀的玻璃光纤，将其置于真空烘箱里，在60℃下干燥2h，形成固态的薄膜，用325nm波长的光对覆盖硅衬底的光刻胶进行选择性地照射，沉浸在显影液中显影，然后通过等离子刻蚀，在玻璃光纤表面制作出2mm×2mm×1mm微洞阵列，用丙酮清洗去留在玻璃光纤表面的光刻胶，再将圆形玻璃光纤裁剪为20mm×20mm长方形，然后将二氧化硅探针的悬浮液滴到玻璃光纤上，让其自然干燥，微洞里自发地填满了二氧化硅探针，用擦镜纸擦去上述玻璃光纤表面上的二氧化硅探针，留在微洞里的二氧化硅探针构成了荧光探针阵列，得到检测儿茶酚的NBD标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针阵列。

Claims (4)

1.一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法，包括二氧化硅纳米粒子的制备，并在其表面修饰荧光素4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑及3-氨丙基三乙氧基硅烷，其特征在于：所述分子印迹二氧化硅探针中洗脱儿茶酚分子的二氧化硅纳米粒子表面，拥有空间结构与儿茶酚分子相匹配的识别位点，相匹配的空间结构实现对儿茶酚分子的识别，进入识别位点的儿茶酚分子中的羟基中的氢原子与3-氨丙基三乙氧基硅烷中的氨基上的氮原子的孤对电子形成氢键，基于光诱导电子转移的原理，抑制了3-氨丙基三乙氧基硅烷中的氨基上的氮原子的电子转移，导致4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑电子诱导转移，使得标记在识别位点处荧光探针的荧光强度强，实现对目标分子儿茶酚探测，用于儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备过程包括如下四个步骤：
1.1第一步是二氧化硅纳米粒子溶液的制备：首先，将1～3mL二氧化硅前驱体正硅酸四乙酯和80～90mL乙醇分别加入到500mL带有磨口塞的三口圆底烧瓶中，用磁力搅拌器以固定转速500rpm搅拌3～5min，使正硅酸四乙酯与乙醇充分混合，然后用量筒量取5～10mL氨水迅速加入到上述反应液中，提高转速至750rpm搅拌3～5min后，再次将转速降至500rpm，用密封脂涂抹密封后持续搅拌反应16～25h，将得到的反应混合物均分移至4支50mL的离心管中，以10000rpm转速进行离心，用95％乙醇反复洗3次，再用30mL的去离子水超声分散，得到二氧化硅纳米粒子溶液；
1.2第二步是4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子的溶液的制备：避光下，将1～3mg 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑和0.5～1.5mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷加入到12～16mL无水乙醇中，超声分散5min后，放入振荡器中在室温下振荡18～22h，得到4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑—3-氨丙基三乙氧基硅溶液，将其溶液与上述制备的一支离心管中的二氧化硅纳米粒子溶液混合，避光条件下，用磁力搅拌器以500rpm搅拌速度反应20～26h，将修饰后的二氧化硅纳米粒子平均分装在四支50mL的离心管中，分别用95％的乙醇依次离心、分散和置换溶剂3次，最后将所得离心沉淀底物分散于50mL无水乙醇溶液中，得到4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑—NH—SiO2纳米粒子溶液，取上述5～15mL的4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑—NH—SiO2纳米粒子溶液置于磨口的100mL锥形瓶中，加入45～55mL无水乙醇稀释，超声分散3～5min后，加入25～35mg儿茶酚、0.5～1.5mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷、1～2mL交联剂和8～12mg表面活性剂继续超声3～5min，在磁力搅拌器上以350rpm的转速反应8～12h，得到4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子溶液，为对比印迹效果，除未加儿茶酚外，非印迹的SiO2纳米粒子的制备与印迹的SiO2纳米粒子制备过程相同；
1.3第三步是4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针的制备：量取步骤1.2中制备的4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子溶液40mL均分置于2支50mL离心管中，在10000rpm转速下离心，分离得到4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子，用无水乙醇反复洗涤、离心3次去除多余的反应物，然后将所得的4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的儿茶酚印迹二氧化硅纳米粒子反复在体积比为8：1：1甲醇/乙酸/乙腈的混合液中回流，提取儿茶酚分子，直到提取液在278.5nm处无紫外吸收峰为止，再用无水乙醇洗涤去除残留的乙酸，然后在50mL丙酮溶液中浸泡12h，最后常温下真空干燥至恒重，得到对儿茶酚识别和检测的4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针；
1.4第四步是4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针阵列的制备：首先，将直径为100mm圆形玻璃光纤表面上的水分烘干，涂抹附着剂六甲基乙硅氮烷，再将玻璃光纤放在一个平整的内有小孔与真空管相连金属的托盘上，将光刻胶溶液喷洒在玻璃光纤表面，以500rpm转速旋转托盘上的玻璃光纤，保持3min，得到光刻胶涂抹均匀的玻璃光纤，将其置于真空烘箱里，在60℃下干燥2h，形成固态的薄膜，用325nm波长的光对覆盖硅衬底的光刻胶进行选择性地照射，沉浸在显影液中显影，然后通过等离子刻蚀，在玻璃光纤表面制作出2mm×2mm×1mm微洞阵列，用丙酮清洗去留在玻璃光纤表面的光刻胶，再将圆形玻璃光纤裁剪为20mm×20mm长方形，然后将二氧化硅探针的悬浮液滴到玻璃光纤上，让其自然干燥，微洞里自发地填满了二氧化硅探针，用擦镜纸擦去上述玻璃光纤表面上的二氧化硅探针，留在微洞里的二氧化硅探针构成了荧光探针阵列，得到检测儿茶酚的4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑标记的儿茶酚印迹二氧化硅探针阵列。
2.根据权利要求1所述的一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法，其特征是：所述的交联剂为正硅酸四乙酯。
3.根据权利要求1所述的一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法，其特征是：所述的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。
4.根据权利要求1所述的一种儿茶酚检测的荧光标记分子印迹二氧化硅探针阵列的制备方法，其特征是：所述的光刻胶为酚醛树脂。
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