CN111019643B - 荧光微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光微球的制备方法，包括：将罗丹明染料和缩合剂溶解于有机溶剂中形成第一混合液；在第一混合液中加入3‑氨丙基三乙氧基硅烷形成荧光大分子溶液；基于荧光大分子溶液形成第二混合液；形成第三混合液，控制第二混合液与第三混合液的流速比，制备得到荧光微球。本发明以硅油和乳化剂形成的第三混合液作为油相，以荧光分子溶液等形成的第二混合液作为水相，通过微流控技术控制油相和水相之间的流速比，可以实现控制不同粒径的荧光微球的制备。采用基于荧光分子溶液作为水相的第二混合液，本发明的荧光微球荧光强度高，粒径均一且荧光染料不易泄露。

Description

荧光微球的制备方法

技术领域

本发明涉及化学合成或制备技术领域，特别是一种基于二氧化硅的粒径可控荧光微球的制备方法。

背景技术

荧光微球的制备方法包括物理吸附法、自组装法、包埋法、接枝法和共聚法，并且在标记和示综、免疫分析、药物筛选、固定化酶、标准方面和流场测量领域有着广泛的应用。

传统的荧光微球制备方法将荧光染料物理包覆在荧光微球中，所制备的荧光微球荧光染料泄露现象严重，而且存在一些其他难以克服的缺陷，比如粒径不均一等。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为解决上述传统的荧光微球制备方法存在的荧光染料泄露现象严重、粒径不均一等缺陷，本发明提出了一种荧光微球的制备方法。

(二)技术方案

本发明公开了了一种荧光微球的制备方法，包括：将罗丹明染料和缩合剂溶解于有机溶剂中形成第一混合液；在第一混合液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷形成荧光大分子溶液；基于荧光大分子溶液形成第二混合液；形成第三混合液，控制第二混合液与第三混合液的流速比，通过微流控技术制备得到荧光微球。

可选地，将罗丹明染料和缩合剂溶解于有机溶剂中形成第一混合液包括：将罗丹明染料和缩合剂溶解于有机溶剂中反应活化0.25小时～4小时，得到第一混合液；其中，罗丹明染料和缩合剂的摩尔比为1：A，1≤A≤10。

可选地，罗丹明染料为罗丹明B或罗丹明B异硫氰酸酯；缩合剂为2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；有机溶剂为乙醇、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

可选地，在第一混合液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷形成荧光大分子溶液包括：在第一混合液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在室温及避光条件下反应6小时～24小时，形成荧光大分子溶液，其中在第一混合液中的罗丹明类染料与3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为1:B，1≤B≤5。

可选地，基于荧光大分子溶液形成第二混合液包括：将硅源前驱体、乙醇、荧光大分子溶液、稀盐酸和表面活性剂混合形成第二混合液；其中，稀盐酸的PH值为1～4，乙醇、荧光大分子溶液和稀盐酸的体积比为C:D:1，500≥C≥5，20≥D≥5，表面活性剂的浓度为0.002mol/L～0.2mol/L。

可选地，基于荧光大分子溶液形成第二混合液包括：硅源前驱体为四乙氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷；以及表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或聚乙烯吡咯烷酮。

可选地，形成第三混合液包括：将硅油和乳化剂混合，对混合后的溶液进行搅拌超声使得硅油和乳化剂分散均匀，并对分散均匀的混合液进行真空处理，形成第三混合液。

可选地，硅油与乳化剂的体积比为20000:E，1≤E≤10。

可选地，控制第二混合液与第三混合液的流速比包括：通过微流控技术控制第二混合液与第三混合液的流速比为1:F，10≤F≤60，继续反应6小时～24小时后制备得到荧光微球。

可选地，制备得到荧光微球之后，还包括：对对得到的荧光微球进行离心、洗涤、干燥以制备荧光微球粉末，其中荧光微球的直径为28μm～60μm。

(三)有益效果

本发明公开的一种荧光微球的制备方法，首先将罗丹明类染料与缩合剂溶解在有机溶剂中反应活化得到第一混合液；然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷反应得到含有酰胺键的荧光分子溶液；最后，以硅油和乳化剂形成的第三混合液作为油相，以荧光分子溶液、硅源前驱物、乙醇、表面活性剂、盐酸和水等形成的第二混合液作为水相，通过微流控技术控制油相和水相之间的流速比，可以实现控制不同粒径的荧光微球的制备，所制备得到的荧光微球在不同的制备条件下粒径均一，且由于采用了基于荧光分子溶液作为水相的第二混合液，将荧光分子均匀的交联在荧光微球中，所以本发明的荧光微球荧光强度高，粒径均一且不易泄露，经过多次水洗，仍有较强的荧光强度。

附图说明

图1是本发明一实施例中荧光微球制备方法的一流程示意图；

图2是本发明一实施例中荧光微球制备方法的另一流程示意图；

图3是本发明一实施例中利用微流控技术制备荧光微球的微流控组成示意图；

图4是本发明一实施例中油相和水相不同的流速比(横轴)和不同荧光微球直径(纵轴)的对应关系图；

图5是本发明一实施例中分散在乙醇中的荧光微球分别经过超声30min(a)和60min(b)后获得的上清液对比照片；

图6是本发明一实施例中荧光微球制备方法的另一流程示意图；

图7是本发明实施例中在油相和水相不同流速比条件下制备的荧光微球扫描电镜(SEM)图；

图8是本发明实施例中在油相和水相不同流速比条件下制备的荧光微球共聚焦显微镜图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

为解决上述传统的荧光微球制备方法存在的荧光染料泄露现象严重、粒径不均一等缺陷，本发明公开了一种荧光微球的制备方法，如图1所示，该方法包括如下步骤：

S110：将罗丹明染料和缩合剂溶解于有机溶剂中形成第一混合液；

S120：在第一混合液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷形成荧光大分子溶液；

S130：基于荧光大分子溶液形成第二混合液；

S140：形成第三混合液，控制第二混合液与第三混合液的流速比，制备得到荧光微球。

作为本发明一实施例，步骤S110包括：将罗丹明染料和缩合剂溶解于有机溶剂中反应活化0.25小时～4小时，得到第一混合液；其中，罗丹明染料和缩合剂的摩尔比为1：A，(1≤A≤10)。

作为本发明一实施例，罗丹明染料为罗丹明B或罗丹明B异硫氰酸酯；缩合剂为2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；有机溶剂为乙醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。

作为本发明一实施例，步骤S120包括：在第一混合液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在室温及避光条件下反应6小时～24小时，形成荧光大分子溶液，其中在第一混合液中的罗丹明类染料与3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为1:B，1≤B≤5。

作为本发明一实施例，步骤S130包括：将硅源前驱体、乙醇、荧光大分子溶液、稀盐酸和表面活性剂混合形成第二混合液；其中，稀盐酸的PH值为1～4，乙醇、荧光大分子溶液和稀盐酸的体积比为C:D:1，500≥C≥5，20≥D≥5，表面活性剂的浓度为0.002mol/L～0.2mol/L。

作为本发明一实施例，步骤S130包括：硅源前驱体为四乙氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷；以及表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或聚乙烯吡咯烷酮。

作为本发明一实施例，步骤S140中形成第三混合液包括：将硅油和乳化剂混合，对混合后的溶液进行搅拌超声使得硅油和乳化剂分散均匀，并对分散均匀的混合液进行真空处理，形成第三混合液。

作为本发明一实施例，硅油与乳化剂的体积比为20000:E，1≤E≤10。

作为本发明一实施例，步骤S140中控制第二混合液与第三混合液的流速比包括：通过微流控技术控制第二混合液与第三混合液的流速比为1:F，10≤F≤60，继续反应6小时～24小时后制备得到荧光微球。

作为本发明一实施例，制备得到荧光微球之后，还包括：对对得到的荧光微球进行离心、洗涤、干燥以制备荧光微球粉末，其中荧光微球的直径为28μm～60μm。

为更加清楚明白地将上述各个实施例所列的技术特征作进一步的说明，本发明特公开荧光微球的制备方法的具体实施例如下：

一种荧光强度高、无荧光泄露、粒径均一且粒径可控的荧光微球的制备方法，如图2所示，该方法具体包括以下操作步骤：

S210：将摩尔比为1：A，(1≤A≤10)的罗丹明染料与缩合剂溶解在有机溶剂中反应活化0.25小时～4小时，得到罗丹明染料-缩合剂-有机溶剂混合反应液，即第一混合液；

其中，缩合剂为2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉(英文缩写为EEDQ)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(英文缩写为EDC)等。有机溶剂为乙醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)等。

S220：将步骤S210所得混合液(即第一混合液)中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷室温下黑暗条件中进行反应6小时～24小时得到荧光大分子溶液，其中罗丹明染料与3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为1:B，1≤B≤5。

S230：取适量硅油和乳化剂，搅拌超声使之分散均匀，真空去除空气，其中硅油与乳化剂的体积比为20000:E，1≤E≤10；即通过硅油和乳化剂的混合形成第三混合液，第三混合液作为微流控过程中的油相，真空去除空气对应于真空处理。

油相(即第三混合液)的制备与前述步骤S210和步骤220均无直接关系，可以与水相(即第二混合液)同时进行。

S240：取适量硅源前驱体、乙醇、荧光大分子溶液、稀盐酸和表面活性剂，其中稀盐酸的PH为1～4，乙醇、荧光大分子溶液与稀盐酸的体积比为C:D:1，500≥C≥5，20≥D≥5，表面活性剂的浓度为0.002mol/L～0.2mol/L。该步骤对应于基于荧光大分子溶液形成第二混合液。

第二混合液以荧光大分子溶液为基础，混合了硅源前驱体，作为后续微流控过程中的水相。硅源前驱体和荧光大分子在酸性环境中水解，即荧光大分子中的-Si-OCH₂CH₃水解为-Si-OH，硅源前驱体中的-Si-OCH₂CH₃或者-Si-OCH₃水解为-Si-OH，在微流控过程中该水相中的溶剂逐渐蒸发同时-Si-OH之间发生缩聚反应，最后形成荧光微球。由于荧光分子和硅源前驱体在水相中的均匀混合所以荧光分子均匀地化学交联在荧光微球中，即将荧光分子固定在了荧光微球中，所以荧光微球中的荧光分子之间不会因为可以自由移动形成二聚体，并且经过多次水洗，也不会发生荧光泄露现象。该水相的采用使得本发明通过微流控技术获得的荧光微球荧光强度高，且荧光不易泄露，经过多次水洗，仍有较强的荧光强度。

其中，硅源前驱体为四乙氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷或苯基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷等。表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或者聚乙烯吡咯烷酮等表面活性剂。

S250：通过微流控技术控制水相与油相的流速比得到不同粒径的小液滴，水相与油相流速比为1:F，10≤F≤60，反应6小时～24小时后得到不同粒径的荧光微球。

微流控技术是制备微球的理想途径，可调控微球的大小、形状和内部结构，通过微流控制备的微球粒径均一，而且可量化生产。如图3所示，其中水相通过微流控设备的水相通入开口进入反应区，油相通过油相通入开口进入反应区，水相和油相进入的流速都可以分别进行控制，对应水相的流速可以用Q_pre表示，对应油相的流速可以用Q_oil表示。一旦水相进入到油相中，随着水相中溶剂的蒸发同时硅源前驱物和荧光大分子开始缩合反应，形成荧光微球。具体地，如图4所示，相应的油相和水相的流速比Q_oil/Q_pre(ratio of flowrate)，从图4可知，油相和水相的流速比Q_oil/Q_pre流速比越大，荧光微球的直径尺寸(diameter of fluorescent microsphere)越小，例如当流速比Q_oil/Q_pre＝10时，对应荧光微球的直径尺寸60μm，当流速比Q_oil/Q_pre＝60时，对应荧光微球的直径尺寸则小于30μm。其中，在流速比Q_oil/Q_pre为[20,60]范围内时，对应的荧光微球的直径尺寸与之接近于线性关系。因此，可见通过控制油相和水相的流速比，即可实现控制荧光微球直径尺寸，做到粒径可控，同时保证了粒径均一。

其中，油相为第三混合液，水相为第二混合液，水相和油相的微流控过程中的流速比可以实现相应的控制。另外，对应于第二条件为反应第三时间，第三时间为上述水相和油相反应过程的反应时间6小时～24小时。

S260：将步骤S250所得产物然后离心、洗涤、干燥，得到荧光微球粉末，其中，荧光微球直径为28μm～60μm。在上述微流控反应之后获得的是荧光微球和硅油的混合物，即反应产物，需要对该反应产物进一步处理，例如离心、洗涤和干燥，最终获得荧光微球的粉末。

在本发明中，将上述方法制备得到的荧光微球粉末按照0.25mg/mL的浓度分散到乙醇中，分别对应超声30min和超声60min，其上清液均呈现清澈透明的现象，并未出现任何红色或者淡红色的情况，可见通过本发明荧光微球的制备方法可以将荧光分子均匀地交联在荧光微球中，所以荧光染料在较大浓度下不会发生自聚，经过多次水洗以及长时间超声，也不会发生荧光泄露现象。如图5所示照片，超声30min对应图5(a)，超声60min对应图5(b)。

为更加清楚明白地将上述各个实施例所列的技术效果作进一步的说明，本发明特公开荧光微球的制备方法的另一具体实施例如下：

一种荧光强度高、无荧光泄露、粒径均一且粒径可控的荧光微球的制备方法，如图6所示，该方法具体包括以下操作步骤：

S610：将摩尔比为1:2的罗丹明B与缩合剂EDC溶解在乙醇中反应活化4小时，得到混合液；

S620：将步骤S610所得混合液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷室温下黑暗条件中进行反应12小时，其中罗丹明B与3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为1:1；

S630：取适量硅油和乳化剂，搅拌超声使之分散均匀,真空去除空气，其中硅油与乳化剂的体积比为7000:1；

S640：取适量硅源前驱体、乙醇、荧光大分子溶液、稀盐酸和表面活性剂，其中稀盐酸的PH为2，乙醇、荧光大分子溶液与稀盐酸的体积比为5:5:1，表面活性剂的浓度为0.0075mol/L；

S650：通过微流控技术控制水相与油相的流速比Q_pre/Q_oil为30:300，反应24小时后得到直径为60μm的荧光微球；

S660：将步骤S650所得产物进行离心、洗涤、干燥，得到荧光微球粉末。

其中，在上述实施例中的荧光微球制备方法中，对应流速比Q_pre/Q_oil为30:300的制备条件所获得的荧光微球的直径尺寸为60μm，其相应的扫描电镜(Scanning electronmicroscope，即SEM)图可参见图7(e)和共聚焦显微镜图(Confocal laser scanningmicroscope，即CLSM)可参见图8(e)，通过图7(e)可见该荧光微球的粒径均一，且尺寸基本上可以维持在60μm，通过图8(e)可见该实施例中制备得到的荧光微球荧光强度高，且荧光不易泄露。

相应地，作为本发明的另一改进，可实现对上述实施例中的步骤S650的水相与油相的流速比Q_pre/Q_oil进行适当改变。当上述实施例中步骤S610-S660的区别仅在于步骤S650中水相与油相的流速比Q_pre/Q_oil的改变，且其他步骤的制备条件保持一致时，具体地，当上述步骤S610-S660对应的实施例为实施例e时，不同于实施例e中的流速比Q_pre/Q_oil的4个不同的实施例可以分别对应实施例a、实施例b、实施例c和实施例d。因此，可以得到如下表格：

因此，若将水相与油相的流速比Q_pre/Q_oil改为油相与水相的流速比Q_oil/Q_pre，则上述表格的内容可以与如图4所示的微流控技术中油相和水相不同的流速比(横轴)和不同荧光微球直径(纵轴)的对应关系相对应，即油相和水相的流速比Q_oil/Q_pre流速比越大，荧光微球的直径尺寸越小。另外，通过对应图7(a)-图7(e)足以反映：本发明通过控制油相和水相的流速比，实现了控制荧光微球直径尺寸，做到粒径可控，同时保证了粒径均一。通过对应图8(a)-图8(e)足以反映：本发明荧光微球的制备方法可以将荧光分子均匀地交联在荧光微球中，使得荧光染料在较大浓度下不会发生自聚，荧光微球荧光强度高，粒径均一且不易泄露，经过多次水洗，仍有较强的荧光强度。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种荧光微球的制备方法，其特征在于，包括：

将罗丹明染料和缩合剂溶解于有机溶剂中形成第一混合液；

在所述第一混合液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷形成荧光大分子溶液；

基于所述荧光大分子溶液形成第二混合液，其中包括：将硅源前驱体、乙醇、荧光大分子溶液、稀盐酸和表面活性剂混合形成第二混合液，其中，所述硅源前驱体为四乙氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷；

形成第三混合液，其中包括：将硅油和乳化剂混合，对混合后的溶液进行搅拌超声使得所述硅油和乳化剂分散均匀，并对分散均匀的混合液进行真空处理，形成所述第三混合液；

控制所述第二混合液与所述第三混合液的流速比，制备得到所述荧光微球，其中，包括：通过微流控技术控制所述第二混合液与所述第三混合液的流速比为1:F，10≤F≤60，继续反应6小时~24小时后制备得到所述荧光微球。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将罗丹明染料和缩合剂溶解于有机溶剂中形成第一混合液，包括：

将罗丹明染料和缩合剂溶解于有机溶剂中反应活化0.25小时~4小时，得到第一混合液；

其中，所述罗丹明染料和缩合剂的摩尔比为1：A，1≤A≤10。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述罗丹明染料为罗丹明B或罗丹明B异硫氰酸酯；

所述缩合剂为2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；

所述有机溶剂为乙醇、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在所述第一混合液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷形成荧光大分子溶液，包括：

在所述第一混合液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在室温及避光条件下反应6小时~24小时，形成荧光大分子溶液，

其中，在所述第一混合液中的罗丹明类染料与所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为1:B，1≤B≤5。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀盐酸的pH值为1~4，所述乙醇、荧光大分子溶液和稀盐酸的体积比为C:D:1，500≥C≥5，20≥D≥5，表面活性剂的浓度为0.002mol/L~0.2mol/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或聚乙烯吡咯烷酮。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硅油与乳化剂的体积比为20000:E，1≤E≤10。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备得到所述荧光微球之后，还包括：

对得到的荧光微球进行离心、洗涤、干燥以制备所述荧光微球粉末，其中所述荧光微球的直径为28μm~60μm。

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