CN113952938A - 一种均一粒径琼脂糖磁性微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种均一粒径琼脂糖磁性微球的制备方法，包括以下步骤：A)将琼脂糖、无机盐和磁芯在水中混合，搅拌得到分散相；将聚乙二醇、界面稳定剂在水中混合，得到连续相；所述界面稳定剂为海藻酸钠；B)在搅拌的条件下，将分散相加入连续相中，搅拌乳化，冷却固化后得到琼脂糖磁性微球。本发明利用界面沉淀法，在水/水乳液液滴界面形成一层沉淀层从而显著抑制了Fe3O4@SiO2磁芯的迁移，与此同时，由于界面沉淀层的存在，使得水/水乳液液滴的稳定性大幅度提高，从而使得磁性琼脂糖微球的粒径更为均一。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种均一粒径琼脂糖磁性微球的制备方法。
背景技术
琼脂糖磁性微球作为一种特殊的生物分子固定化载体，能够在特殊化学试剂(如EDC)的作用下将多肽、蛋白、寡聚核苷酸等生物配体共价欧联到微球表面，还能够借助磁场的作用实现快速分离，从而大大减少操作步骤和时间，因此是医学与分子生物学研究中的一个重要载体工具，在细胞分离、蛋白纯化、核酸分离等领域具有广泛的应用。
现有琼脂糖磁性微球主要是通过乳化-固化法制备，其主要步骤是将琼脂糖和纳米磁芯加热溶解形成水相，之后加到含有乳化剂的有机溶剂中，通过机械搅拌(CN103007844A、CN103980519A、CN105713212A)或超声(CN103483602A)充分乳化后，降温固化得到琼脂糖磁性微球。上述方法制备的琼脂糖磁性微球粒径分布较宽，必须经过筛分才可以得到目标粒径产品。中国专利CN200410000087公开了利用特制的膜乳化装置制备尺寸均一的琼脂糖微球的方法。然而，上述制备方法均需使用大量有机溶剂和乳化剂，其中有机溶剂的回收和乳化剂的反复洗涤均使得生产成本大幅度增加。
中国专利CN111073061A和公开文献Particulate Science and Technology,2018,36:592-599中采用水包水技术，实现了无有机溶剂存在下琼脂糖微球制备。然而，经过实验验证，公开文献Particulate Science and Technology,2018,36:592-599中水/水界面较低的界面张力使得纳米磁芯轻易从分散相中泄漏到连续相中，从而导致纳米磁芯无法完全包覆。因此有必要开发一种新型制备方法，制备出粒径分布窄的琼脂糖磁性微球，以便克服传统制备方法的不足以及由此带来的应用上的缺陷。
发明内容
本发明提供了一种均一粒径琼脂糖磁性微球的制备方法，本发明中的制备方法制得的琼脂糖磁性微球球形度高、粒径均一、微球内部均匀分布着Fe3O4@SiO2磁芯，具有较快的磁响应性和超顺磁性。
本发明提供一种均一粒径琼脂糖磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
A)将琼脂糖、无机盐和磁芯在水中混合，搅拌得到分散相；
将聚乙二醇、界面稳定剂在水中混合，得到连续相；
所述界面稳定剂为海藻酸钠；
B)在搅拌的条件下，将分散相加入连续相中，搅拌乳化，冷却固化后得到琼脂糖磁性微球。
优选的，所述无机盐为氯化钠、氯化钾和氯化钙中的一种或几种；
所述无机盐与琼脂糖的质量比为(6.6～12.5)：100。
优选的，所述磁芯为Fe3O4@SiO2磁芯；所述磁芯与琼脂糖的质量比为(10～75)：100。
优选的，所述聚乙二醇为聚乙二醇的平均分子量为15000～25000；
所述聚乙二醇在连续相中的浓度为20～40wt％；
所述聚乙二醇与琼脂糖的质量比为(10～20)：1。
优选的，所述海藻酸钠与聚乙二醇的质量比为(0.5～2.0)：100。
优选的，所述分散相与连续相的体积比为1：(2～5)。
优选的，所述步骤A)中，获得分散相的混合温度为80～120℃；
获得连续相的混合温度为40～80℃；获得连续相的混合时间为30～120min。
优选的，所述步骤B)中搅拌的速度为1000～2000rpm。
优选的，所述步骤B)中搅拌乳化的时间为10～60min；乳化的温度为40～80℃。
优选的，所述步骤B)中冷却固化具体为：将乳化后的混合液在20～25℃的冷水浴中冷却15～40min。
本发明提供了一种均一粒径琼脂糖磁性微球的制备方法，包括以下步骤：A)将琼脂糖、无机盐和磁芯在水中混合，搅拌得到分散相；将聚乙二醇、界面稳定剂在水中混合，得到连续相；所述界面稳定剂为海藻酸钠；B)在搅拌的条件下，将分散相加入连续相中，搅拌乳化，冷却固化后得到琼脂糖磁性微球。本发明利用界面沉淀法，在水/水乳液液滴界面形成一层沉淀层从而显著抑制了Fe3O4@SiO2磁芯的迁移，与此同时，由于界面沉淀层的存在，使得水/水乳液液滴的稳定性大幅度提高，从而使得磁性琼脂糖微球的粒径更为均一。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)由本发明方法制备的琼脂糖磁性微球具有高磁响应和超顺磁性，应用前景好；
2)与市售的磁性琼脂糖微球相比，由本发明方法制备的琼脂糖磁性微球的粒径分布更窄、更均一；
3)本发明的制备方法避免有机溶剂的使用，不仅大幅度降低生产成本，提高了琼脂糖磁性微球的安全性，同时避免了琼脂糖磁性微球中的有机溶剂的残留。
4)本发明的制备方法避免了乳化剂的使用，避免了琼脂糖磁性微球表面乳化剂的残留，由本发明方法制备的琼脂糖磁性微球经过简单的纯水清洗后即可进行化学交联。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明比较例1中在未加入界面沉淀剂时制备的琼脂糖磁性微球的光学显微镜图片；
图2为本发明比较例1中在未加入界面沉淀剂时制备的琼脂糖磁性微球的粒径分布图；
图3为实施例1中连续相中加入0.30g海藻酸钠时制备的琼脂糖磁性微球的光学显微镜图片；
图4为实施例1中连续相中加入0.30g海藻酸钠时制备的琼脂糖磁性微球的粒径分布图；
图5为实施例2中连续相中加入0.15g海藻酸钠时制备的琼脂糖磁性微球的光学显微镜图片；
图6为实施例2中连续相中加入0.15g海藻酸钠时制备的琼脂糖磁性微球的粒径分布图；
图7为实施例3中3wt％固含量时，加入0.10g海藻酸钠时制备的琼脂糖磁性微球的光学显微镜图片；
图8为实施例3中3wt％固含量时，加入0.10g海藻酸钠时制备的琼脂糖磁性微球的粒径分布图；
图9为实施例4中2％固含量时，加入0.10g海藻酸钠时制备的琼脂糖磁性微球的光学显微镜图片；
图10为实施例4中2％固含量时，加入0.10g海藻酸钠时制备的琼脂糖磁性微球的粒径分布图。
具体实施方式
本发明提供了一种均一粒径琼脂糖磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
A)将琼脂糖、无机盐和磁芯在水中混合，搅拌得到分散相；
将聚乙二醇、界面稳定剂在水中混合，得到连续相；
所述界面稳定剂为海藻酸钠；
B)在搅拌的条件下，将分散相加入连续相中，搅拌乳化，冷却固化后得到琼脂糖磁性微球。
本发明首先制备分散相和连续相，本发明将琼脂糖加入纯水中，然后加入无机盐和磁芯，搅拌溶解，得到分散相。
在本发明中，所述无机盐优选为氯化钠、氯化钾和氯化钙中的一种或几种；所述磁芯优选为Fe3O4@SiO2磁芯，即以具有超顺磁性的Fe3O4为内核，以氧化硅为壳层的颗粒。
在本发明中，所述无机盐与琼脂糖的质量比优选为(6.6～25)：100，更优选为(7～20)：100，如6.6:100、7:100、7.5:100、8:100、8.5:100、9:100、9.5:100、10:100、10.5:100、11:100、11.5:100、12:100、12.5:100、13:100、13.5:100、14:100、14.5:100、15:100、15.5:100、16:100、16.5:100、17:100、17.5:100、18:100、18.5:100、19:100、19.5:100、20:100、20.5:100、21:100、21.5:100、22:100、22.5:100、23:100、23.5:100、24:100、24.5:100、25:100，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值；本发明在分散相中添加氯化钙的作用是通过氯化钙与连续相中的海藻酸钠在两相界面处原位形成海藻酸钙沉淀，以用于增强水水相乳液的界面稳定性，抑制Fe3O4@SiO2磁芯在乳化过程中从分散相穿越到连续相中，同时，维持了琼脂糖磁性微球的良好的球形形貌。出于此目的，本申请中氯化钙与琼脂糖的比例较低，为0.06～0.25。
所述磁芯与琼脂糖的质量比优选为(10～75)：100，更优选为(20～65)：100，如10:100、15:100、20:100、25:100、30:100、35:100、40:100、45:100、50:100、55:100、60:100、65:100、70:100、75:100，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
在本发明中，所述分散相中琼脂糖的质量浓度优选为2～6％，更优选为3～5％，最优选为4.0％。
在本发明中，所述搅拌的速度优选为1000～2000rpm，更优选为1200～1800rpm，最优选为1500～1600rpm；所述搅拌的温度优选为80～120℃，更优选为90～110℃，如80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值；所述搅拌的时间优选为20～50min，更优选为30～40min。
本发明将聚乙二醇加入纯水，然后加入界面稳定剂，机械搅拌溶解，得到连续相。
在本发明中，所述聚乙二醇的平均分子量优选为15000～25000，更优选为18000～20000，具体的，在本发明的实施例中，可以使用聚乙二醇20000，所述界面稳定剂为海藻酸钠。所述聚乙二醇在所述连续相中的质量浓度优选为20～40％，更优选为25～35％，如20％、25％、30％、35％、40％，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值；所述海藻酸钠与聚乙二醇的质量比优选为(0.5～2.0)：100，更优选为(1.0～1.5)：100，如0.5:100、0.8:100、1.0:100、1.2:100、1.5:100、1.8:100、2.0:100，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
在本发明中，所述搅拌的速度优选为1000～2000rpm，更优选为1200～1800rpm，最优选为1500～1600rpm；所述搅拌的温度优选为40～80℃，更优选为50～70℃，如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值；所述搅拌的时间优选为30～120min，更优选为50～100min。
在本发明中，所述分散相和连续相的制备不分先后顺序，所述聚乙二醇与琼脂糖的质量比优选为(10～20)：1，更优选为(12～18)：1，如10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
得到分散相和连续相之后，本发明在搅拌的条件下，将所述分散相加入连续相中，搅拌乳化，冷却固化后得到琼脂糖磁性微球。
在本发明中，所述分散相和连续相的体积之比优选为1：(2～5)，更优选为1：(3～4)。所述搅拌的速率优选为1000～2000rpm，更优选为1200～1800rpm，如1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm、1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、2000rpm，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
在本发明中，所述搅拌乳化的温度优选为40～80℃，更优选为50～70℃；如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。所述搅拌乳化的时间优选为10～60min，更优选为20～50min，最优选为30～40min。
搅拌乳化完成之后，将乳化后的体系置于冷水浴中进行冷却固化，得到琼脂糖磁性微球。
在本发明中，所述冷水浴的温度优选为20～25℃；所述冷却固化的时间优选为15～40min，更优选为20～35min，最优选为25～30min。
固化后，本发明优选将所述体系离心洗涤，分离得到所述琼脂糖磁性微球。
本发明提供了一种均一粒径琼脂糖磁性微球的制备方法，包括以下步骤：A)将琼脂糖、无机盐和磁芯在水中混合，搅拌得到分散相；将聚乙二醇、界面稳定剂在水中混合，得到连续相；所述界面稳定剂为海藻酸钠；B)在搅拌的条件下，将分散相加入连续相中，搅拌乳化，冷却固化后得到琼脂糖磁性微球。本发明利用界面沉淀法，在水/水乳液液滴界面形成一层沉淀层从而显著抑制了Fe3O4@SiO2磁芯的迁移，与此同时，由于界面沉淀层的存在，使得水/水乳液液滴的稳定性大幅度提高，从而使得磁性琼脂糖微球的粒径更为均一。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种均一粒径琼脂糖磁性微球的制备方法进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
比较例1
分散相制备：称取2.0g琼脂糖、0.25g KCl和1.10g Fe3O4@SiO2磁芯，加入到50mL纯水中，置于95℃油浴中，300rpm机械搅拌溶解40分钟。
连续相制备：称取20g PEG-20000固体粉末，加入到100mL纯水中，置于65℃水浴中，300rpm机械搅拌溶解60分钟。
乳化冷却：将连续相转速提高至1500rpm，将分散相迅速加入至连续相中，乳化搅拌30分钟后将水浴中热水抽出，加入20～25℃冷水迅速冷却20分钟，3000rpm离心洗涤3次。通过光学显微镜观察所得琼脂糖磁性微球的形貌，利用激光粒度分析仪检测琼脂糖磁性微球的粒径分布。
本比较例制备的琼脂糖磁性微球的光学显微镜图片如图1所示，其粒度分布如图2所示。可以看出，本实施例制备的琼脂糖磁性微球球形度好，大量Fe3O4@SiO2磁芯未能被琼脂糖包裹；粒径分布呈双峰分布，粒径分布较宽。平均粒径(D50)为36.68μm，跨度(SPAN)为1.99。
该比较例中，在分散相中添加氯化钾的目的是为加速琼脂糖溶解，防止长时间的高温溶解导致琼脂糖发生降解。相较于加入氯化钠，氯化钾的加入可以在一定程度上提高分散相的表面张力，从而在一定程度上抑制Fe3O4@SiO2磁芯在双水相乳化过程中从分散相穿越到连续相中。然而，此种抑制作用较为有限，仍有大量Fe3O4@SiO2磁芯发生穿相(如图1光学显微镜所示)。
实施例1
分散相制备：称取2.0g琼脂糖、0.25g KCl和1.10g Fe3O4@SiO2磁芯，加入到50mL纯水中，置于95℃油浴中，300rpm机械搅拌溶解40分钟。
连续相制备：称取20g PEG-20000固体粉末和0.30g海藻酸钠，加入到100mL纯水中，置于65℃水浴中，300rpm机械搅拌溶解60分钟。
乳化冷却：将连续相转速提高至1500rpm，将分散相迅速加入至连续相中，乳化搅拌30分钟后将水浴中热水抽出，加入20～25℃冷水迅速冷却20分钟，3000rpm离心洗涤3次。通过光学显微镜观察所得琼脂糖磁性微球的形貌，利用激光粒度分析仪检测琼脂糖磁性微球的粒径分布。
本实施例制备的琼脂糖磁性微球的光学显微镜图片如图3所示，其粒度分布如图4所示。可以看出，本实施例制备的琼脂糖磁性微球球形度好，Fe3O4@SiO2磁芯均匀分布在琼脂糖微球内部；粒径分布呈单峰分布，粒径分布窄。平均粒径(D50)为60.89μm，跨度(SPAN)为0.80。
实施例2
分散相制备：称取2.0g琼脂糖、0.25g KCl和1.10g Fe3O4@SiO2磁芯，加入到50mL纯水中，置于95℃油浴中，300rpm机械搅拌溶解40分钟。
连续相制备：称取20g PEG-20000固体粉末和0.15g海藻酸钠，加入到100mL纯水中，置于65℃水浴中，300rpm机械搅拌溶解60分钟。
乳化冷却：将连续相转速提高至1500rpm，将分散相迅速加入至连续相中，乳化搅拌30分钟后将水浴中热水抽出，加入20～25℃冷水迅速冷却20分钟，3000rpm离心洗涤3次。通过光学显微镜观察所得琼脂糖磁性微球的形貌，利用激光粒度分析仪检测琼脂糖磁性微球的粒径分布。
本实施例制备的琼脂糖磁性微球的光学显微镜图片如图5所示，其粒度分布如图6所示。可以看出，本实施例制备的琼脂糖磁性微球球形度稍逊，Fe3O4@SiO2磁芯均匀分布在琼脂糖微球内部；粒径分布呈单峰分布，粒径分布窄。平均粒径(D50)为57.25μm，跨度(SPAN)为0.83。
本申请实施例1和实施例2中，在分散相添加氯化钾的同时，还在连续相中添加了海藻酸钠，主要是由于在双水相体系乳化过程中，海藻酸钠会通过化学吸附作用，牢牢地吸附在双水相乳液液滴表面形成一层保护，从而有效抑制Fe3O4@SiO2磁芯在双水相乳化过程中从分散相穿越到连续相中，此种抑制作用较为显著，多数Fe3O4@SiO2磁芯保留在分散相中，仅少量磁芯发生穿相进入到连续相中(如图5光学显微镜所示)，但此种方法会使得琼脂糖磁珠的球形度降低。
实施例3
分散相制备：称取1.5g琼脂糖、0.10g CaCl2和0.50g Fe3O4@SiO2磁芯，加入到50mL纯水中，置于95℃油浴中，300rpm机械搅拌溶解40分钟。
连续相制备：称取20g PEG-20000固体粉末和0.10g海藻酸钠，加入到100mL纯水中，置于65℃水浴中，300rpm机械搅拌溶解60分钟。
乳化冷却：将连续相转速提高至1500rpm，将分散相迅速加入至连续相中，乳化搅拌30分钟后将水浴中热水抽出，加入20～25℃冷水迅速冷却20分钟，3000rpm离心洗涤3次。通过光学显微镜观察所得琼脂糖磁性微球的形貌，利用激光粒度分析仪检测琼脂糖磁性微球的粒径分布。
本实施例制备的琼脂糖磁性微球的光学显微镜图片如图7所示，其粒度分布如图8所示。可以看出，本实施例制备的琼脂糖磁性微球球形度稍逊，Fe3O4@SiO2磁芯均匀分布在琼脂糖微球内部；粒径分布呈单峰分布，粒径分布窄。平均粒径(D50)为38.34μm，跨度(SPAN)为1.11。
实施例4
分散相制备：称取1.0g琼脂糖、0.10g CaCl2和0.33g Fe3O4@SiO2磁芯，加入到50mL纯水中，置于95℃油浴中，300rpm机械搅拌溶解40分钟。
连续相制备：称取20g PEG-20000固体粉末和0.10g海藻酸钠，加入到100mL纯水中，置于65℃水浴中，300rpm机械搅拌溶解60分钟。
乳化冷却：将连续相转速提高至1500rpm，将分散相迅速加入至连续相中，乳化搅拌30分钟后将水浴中热水抽出，加入20～25℃冷水迅速冷却20分钟，3000rpm离心洗涤3次。通过光学显微镜观察所得琼脂糖磁性微球的形貌，利用激光粒度分析仪检测琼脂糖磁性微球的粒径分布。
本实施例制备的琼脂糖磁性微球的光学显微镜图片如图9所示，其粒度分布如图10所示。可以看出，本实施例制备的琼脂糖磁性微球球形度稍逊，Fe3O4@SiO2磁芯均匀分布在琼脂糖微球内部；粒径分布呈单峰分布，粒径分布窄。平均粒径(D50)为50.63μm，跨度(SPAN)为1.02。
本申请实施例3和实施例4中，将氯化钾替换成氯化钙，主要是利用氯化钙与连续相中的海藻酸钠在两相界面处形成海藻酸钙沉淀，以进一步增强水水相乳液的界面稳定性，抑制Fe3O4@SiO2磁芯在乳化过程中从分散相穿越到连续相中，从结果来看，此种方法的效果是最佳的，即在抑制Fe3O4@SiO2磁芯穿相的同时，显著提高了琼脂糖磁珠的球形度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种均一粒径琼脂糖磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
A)将琼脂糖、无机盐和磁芯在水中混合，搅拌得到分散相；
将聚乙二醇、界面稳定剂在水中混合，得到连续相；
所述界面稳定剂为海藻酸钠；
B)在搅拌的条件下，将分散相加入连续相中，搅拌乳化，冷却固化后得到琼脂糖磁性微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述无机盐为氯化钠、氯化钾和氯化钙中的一种或几种；
所述无机盐与琼脂糖的质量比为(6.6～25)：100。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述磁芯为Fe3O4@SiO2磁芯；所述磁芯与琼脂糖的质量比为(10～75)：100。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇为聚乙二醇的平均分子量为15000～25000；
所述聚乙二醇在连续相中的浓度为20～40wt％；
所述聚乙二醇与琼脂糖的质量比为(10～20)：1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠与聚乙二醇的质量比为(0.5～2.0)：100。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述分散相与连续相的体积比为1：(2～5)。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)中，获得分散相的混合温度为80～120℃；
获得连续相的混合温度为40～80℃；获得连续相的混合时间为30～120min。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)中搅拌的速度为1000～2000rpm。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)中搅拌乳化的时间为10～60min；乳化的温度为40～80℃。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)中冷却固化具体为：将乳化后的混合液在20～25℃的冷水浴中冷却15～40min。
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