CN104911162A - 一种可控多孔无载体固定化脂肪酶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可控多孔无载体固定化脂肪酶及其制备方法。本发明所述可控多孔无载体固定化脂肪酶是通过脂肪酶、氯化钙、碳酸钠和硫酸铵共沉淀制备脂肪酶/碳酸钙微球，再加入二硫苏糖醇进行脂肪酶交联自组装，然后用乙二胺四乙酸二钠去除碳酸钙，得到可控多孔无载体固定化脂肪酶。本发明所述可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备过程是在常温常压下进行，操作条件温和，制得的可控多孔无载体固定化脂肪酶具有结构稳定，形貌、孔道尺寸可调控，微粒内成分单一，酶活性高，可有效降低底物分子的传质限制，提高了酶催化效率，适合推广应用。

Description

一种可控多孔无载体固定化脂肪酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及与载体结合的或固相化的酶相关领域，具体涉及一种可控多孔无载体固定化脂肪酶及其制备方法。
技术背景
脂肪酶催化因其具有反应条件温和、专一性强、效率高等优势而得到越来越多的关注，但直接用游离的脂肪酶作催化剂，其存在操作稳定性差、易失活、不易重复使用、分离纯化操作复杂的问题。为了解决以上问题，人们将脂肪酶固定在载体上以克服游离脂肪酶存在的缺点，固定化酶与游离酶相比稳定性高、易从反应系统中分离、能重复使用、利于实现自动化生产。因此获得性能优异的固定化脂肪酶对实现工业环境下高效利用，促进生物催化产业的快速发展具有重要意义。但目前，常用的固定化方法中大都通过将脂肪酶固定在成本高昂不溶性聚合物或无机载体上，载体的存在会“稀释”脂肪酶的活性(在整个固定化酶重量中，载体一般占90％以上)，降低脂肪酶的结合容量和反应能力，同时，由于脂肪酶具有一定的高级空间结构，极易受到表面活性剂、载体表面物理性状、化学接枝等因素的影响，对脂肪酶的空间结构或活性中心造成不可逆的破坏，使得脂肪酶活力下降、或失活，严重影响了固定化脂肪酶的效果和催化效率。
近年来，出现了一种无载体固定化酶的方法——交联酶聚集体法，其原理为：向酶液中添加盐、有机溶剂、非离子聚合物等沉淀剂，可以使酶蛋白通过非共价键形成超分子结构-不溶性的物理聚集体，然后再利用交联剂对聚集体进行共价捆绑，就得到交联酶聚集体，其结构和活性在反应体系中不易被破坏。该固定化方法获得的固定化酶稳定性好、活性高，成本低廉，设备简单，无需其他载体，因而单位体积活性大、空间效率高。但交联酶聚集体也存在一定的局限性：交联酶聚集体没有一定的物理形态，粒径分布范围宽，颗粒大小不均，形貌不规则；表面密实平整，比表面积小，无太多孔隙结构，而大多数具有催化活性的酶分子被隐蔽于交联酶聚集体内部，在催化过程中存在扩散限制效应、空间位阻和分配效应，这些都会影响到酶的催化特性,进而影响其使用效率。
发明内容
本发明的目的在于解决目前固定化酶普遍存在的负载量低、制备过程复杂且成本高、酶活性低、催化效率低下，以及交联酶聚集体固定化酶存在的可控制备性差、传质阻力大等问题，提供一种形态和孔径均可控的无载体固定化酶的制备方法。
本发明另一目的在于提供上述可控的多孔无载体固定化酶。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备方法包括如下步骤：
(1)将游离态脂肪酶和牛血清白蛋白保护剂溶于磷酸盐缓冲液中配制成酶溶液；加入氯化钙溶液中混合均匀后，再加入碳酸钠溶液，经搅拌、静置，得到球形碳酸钙颗粒；滴加饱和硫酸铵溶液，经震荡、静置、离心洗涤，得到脂肪酶共沉淀颗粒；
(2)向步骤(1)得到的脂肪酶共沉淀颗粒中加入二硫苏糖醇溶液，经震荡、静置、离心洗涤以去除二硫苏糖醇，得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液悬浮分散后，静置，得到分子间交联自组装固定化脂肪酶微粒；
(3)向步骤(2)得到的分子间交联自组装固定化脂肪酶颗粒中加入EDTA溶液，经震荡洗涤后，离心洗涤3～5次以去除氯化钙和碳酸钠的反应产物碳酸钙，得到可控多孔无载体固定化脂肪酶。
作为进一步的优选技术方案，所述的可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备方法包括如下步骤：
(1)将质量比为10～5:1的游离态脂肪酶和牛血清白蛋白保护剂溶于浓度为0.1～1.0mol/L、pH值为5.8～8的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为10～15mg/ml的酶溶液，加入0.2～0.5mol/L氯化钙水溶液，混合均匀后，快速加入等量、等摩尔浓度的碳酸钠溶液，在4～25℃条件下磁力搅拌1～2min，静置2～3h，通过共沉淀让游离态脂肪酶分子均匀分散于CaCO3微粒内部，形成稳定的球形碳酸钙颗粒；再滴加酶溶液体积3～4倍的饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下震荡1～2min，静置2～3h进行脂肪酶凝聚沉淀后，3000rpm离心洗涤3min，得到脂肪酶共沉淀颗粒；
(2)向步骤(1)得到的脂肪酶共沉淀颗粒中加入50mmol/L的二硫苏糖醇溶液，4～25℃下震荡1～2min，静置30～45min以打开酶分子内的二硫键，然后3000rpm离心洗涤3min以去除二硫苏糖醇，将获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h，使游离的巯基在脂肪酶分子间重新形成新的二硫键，得到分子间交联自组装固定化酶微粒；
(3)向步骤(2)得到的分子间交联自组装固定化脂肪酶颗粒中加入0.05～0.5mol/L的EDTA溶液，4～25℃下震荡洗涤1h，再离心洗涤3～5次以去除氯化钙和碳酸钠的反应产物碳酸钙，得到可控多孔无载体固定化脂肪酶。
作为一种优选的技术方案，上述制备方法中，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、扩展青霉脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶或皱褶假丝酵母脂肪酶。
作为一种优选的技术方案，上述制备方法中，所述脂肪酶与碳酸钙的质量比为0.1～1:1；所述脂肪酶与二硫苏糖醇的质量比为0.01～0.1:1；所述EDTA与碳酸钙的质量比为0.05～0.1:1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明制备方法利用氯化钙和碳酸钠反应的产物碳酸钙作为模板剂，碳酸钙具有多孔球形结构，以其为模板(俗称模具)能够使肪酶超分子结构塑造出所需规则形状，当碳酸钙模板去除后，肪酶超分子结构仍能保持规则形状，在制备无载体固定化脂肪酶的多孔、形貌、粒径、孔径等过程中实现可控化；
(2)本发明制备方法中，碳酸钙作为一种良好的无机模板材料，具有价廉易得、稳定性好且易于去除等优点；
(3)本发明制备方法利用二硫苏糖醇(DTT)能够将酶蛋白质分子内的二硫键断裂成巯基，当DTT去除后，游离的巯基能自发形成新的分子内或分子间二硫键，酶分子间新二硫键的形成有助于酶蛋白质分子之间自组装成微粒，实现酶蛋白质微粒大小均匀且结构稳定，取代了常规戊二醛、苯基二异硫氰、双重氮联苯胺等交联剂的引入，使微粒内成分单一，只含有酶蛋白质分子，进而提高酶固载量；
(4)本发明方法所制备的可控多孔无载体固定化脂肪酶具有可调控的物理形态，形貌规则，粒径、孔径均一、活性高，稳定性好，比表面积大，有效改善了底物分子的传质限制，提高了酶的催化效率。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步阐述。但实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)将质量比为5:1游离态米黑根毛霉脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于pH＝5.8，摩尔浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，制成10mg/mL酶液，取50mL酶液，加入0.5mol/L氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4～25℃温度条件下磁力搅拌1min，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO3微粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加150mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
(2)向共沉淀颗粒中加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液1ml，4℃下缓慢震荡1min，静置30min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
(3)向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.05mol/L的EDTA溶液10ml，4℃下震荡反应1h，于3000rpm离心洗涤10min，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活为90.2％。回收多孔固定化脂肪酶微球，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活仍保留80.3％。
(4)对照试验
将质量比为5:1游离态米黑根毛霉脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于pH＝5.8，摩尔浓度为0.1mol/L的20mL磷酸盐缓冲液中，制成10mg/mL酶液。取50mL酶液，滴加150mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min，将获得的沉淀再悬浮于磷酸盐缓冲液中，向其中缓慢滴加5％的戊二醛溶液10ml，并轻微搅拌，交联120min，3000rpm离心5min，弃去上清液，经磷酸盐缓冲液洗涤数3次，得到交联脂肪酶聚集体，经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为70.2％。回收交联脂肪酶聚集体，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，交联脂肪酶聚集体的相对酶活保留为30.5％。
实施例2
(1)将质量比为6:1游离态南极假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝7，摩尔浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液中，制成11mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.4mol/L氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4～25℃温度条件下磁力搅拌1min，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO3微粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加180mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
(2)向共沉淀颗粒中加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液1ml，4℃下缓慢震荡1min，静置30min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
(3)向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.05mol/L的EDTA溶液12ml，4℃下震荡反应1h，于3000rpm离心洗涤10min，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活为96.7％。回收多孔固定化脂肪酶微球，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活仍保留83.3％。
(4)对照试验
将质量比为6:1游离态南极假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝7，摩尔浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液中，制成11mg/mL酶液。取50mL酶液，滴加180mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min，将获得的沉淀再悬浮于磷酸盐缓冲液中，向其中缓慢滴加5％的戊二醛溶液10ml，并轻微搅拌，交联120min，3000rpm离心5min，弃去上清液，经磷酸盐缓冲液洗涤数3次，得到交联脂肪酶聚集体，经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为72％。回收交联脂肪酶聚集体，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，交联脂肪酶聚集体的相对酶活保留为36.5％。
实施例3
(1)将质量比为10:1游离态扩展青霉脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝8，摩尔浓度为1mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.5mol/L氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4～25℃温度条件下磁力搅拌1min，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO3微粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加200mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
(2)向共沉淀颗粒中加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液1.2ml，4℃下缓慢震荡1min，静置30min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
(3)向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.1mol/L的EDTA溶液10ml，4℃下震荡反应1h，于3000rpm离心洗涤10min，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活为92.6％。回收多孔固定化脂肪酶微球，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活仍保留81.7％。
(4)对照试验
将质量比为10:1游离态扩展青霉脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝8，摩尔浓度为1mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，滴加200mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min，将获得的沉淀再悬浮于磷酸盐缓冲液中，向其中缓慢滴加5％的戊二醛溶液10ml，并轻微搅拌，交联120min，3000r/min离心5min，弃去上清液，经磷酸盐缓冲液洗涤数3次，得到交联脂肪酶聚集体，经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为84％。回收交联脂肪酶聚集体，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，交联脂肪酶聚集体的相对酶活保留为40.6％。
实施例4
(1)将质量比为8:1柱状假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝7，摩尔浓度为0.8mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.5mol/l氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4～25℃温度条件下磁力搅拌1min，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO3微粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加200mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
(2)向共沉淀颗粒中加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液1.5ml，4℃下缓慢震荡1min，静置45min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
(3)向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.5mol/l EDTA溶液5ml，4℃下震荡反应1h，于3000rpm离心洗涤10min，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活为91.7％。回收多孔固定化脂肪酶微球，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活仍保留76.4％。
(4)对照试验
将质量比为8:1柱状假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝，摩尔浓度为0.8mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，滴加200mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min，将获得的沉淀再悬浮于磷酸盐缓冲液中，向其中缓慢滴加5％的戊二醛溶液10ml，并轻微搅拌，交联120min，3000r/min离心5min，弃去上清液，经磷酸盐缓冲液洗涤数3次，得到交联脂肪酶聚集体，经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为75％。回收交联脂肪酶聚集体，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，交联脂肪酶聚集体的相对酶活保留为37.7％。
实施例5
(1)将质量比为7:1皱褶假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝7.5，摩尔浓度为0.5mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.4mol/l氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4～25℃温度条件下磁力搅拌1min，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO3微粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加180mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
(2)向共沉淀颗粒中加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液1.2ml，4℃下缓慢震荡1min，静置45min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
(3)向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.3mol/L的EDTA溶液8ml，4℃下震荡反应1h，于3000rpm离心洗涤10min，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活为97.7％。回收多孔固定化脂肪酶微球，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活仍保留86.5％。
(4)对照试验
将质量比为7:1皱褶假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝7.5，摩尔浓度为0.5mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，滴加180mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min，将获得的沉淀再悬浮于磷酸盐缓冲液中，向其中缓慢滴加5％的戊二醛溶液10ml，并轻微搅拌，交联120min，3000rpm离心5min，弃去上清液，经磷酸盐缓冲液洗涤数3次，得到交联脂肪酶聚集体，经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为77％。回收交联脂肪酶聚集体，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，交联脂肪酶聚集体的相对酶活保留为47.5％。

Claims (5)

1.一种可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将游离态脂肪酶和牛血清白蛋白保护剂溶于磷酸盐缓冲液中配制成酶溶液；加入氯化钙溶液中混合均匀后，再加入碳酸钠溶液，经搅拌、静置，得到球形碳酸钙颗粒；滴加饱和硫酸铵溶液，经震荡、静置、离心洗涤，得到脂肪酶共沉淀颗粒；
（2）向步骤（1）得到的脂肪酶共沉淀颗粒中加入二硫苏糖醇溶液，经震荡、静置、离心洗涤以去除二硫苏糖醇，得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液悬浮分散后，静置，得到分子间交联自组装固定化脂肪酶微粒；
（3）向步骤（2）得到的分子间交联自组装固定化脂肪酶颗粒中加入EDTA溶液，经震荡洗涤后，离心洗涤3～5次以去除氯化钙和碳酸钠的反应产物碳酸钙，得到可控多孔无载体固定化脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将质量比为10～5:1的游离态脂肪酶和牛血清白蛋白保护剂溶于浓度为0.1～1.0mol/L、pH值为5.8～8的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为10～15mg/ml的酶溶液，加入0.2～0.5mol/L氯化钙水溶液，混合均匀后，快速加入等量、等摩尔浓度的碳酸钠溶液，在4～25℃条件下磁力搅拌1～2min，静置2～3h，通过共沉淀让游离态脂肪酶分子均匀分散于碳酸钙微粒内部，形成稳定的球形碳酸钙颗粒；再滴加酶溶液体积3～4倍的饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下震荡1～2min，静置2～3h后，3000rpm离心洗涤3min，得到脂肪酶共沉淀颗粒；
（2）向步骤（1）得到的脂肪酶共沉淀颗粒中加入50mmol/L的二硫苏糖醇溶液，4～25℃下震荡1～2min，静置30～45min以打开酶分子内的二硫键，然后3000rpm离心洗涤3min以去除二硫苏糖醇，将获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h，使游离的巯基在脂肪酶分子间重新形成新的二硫键，得到分子间交联自组装固定化酶微粒；
（3）向步骤（2）得到的分子间交联自组装固定化脂肪酶颗粒中加入0.05～0.5mol/L的EDTA溶液，4～25℃下震荡洗涤1h，再离心洗涤3～5次以去除碳酸钙，得到可控多孔无载体固定化脂肪酶。
3.根据权利要求1或2所述可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、扩展青霉脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶或皱褶假丝酵母脂肪酶。
4.根据权利要求1或2所述可控多孔无载体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述脂肪酶与碳酸钙的质量比为0.1～1:1；所述脂肪酶与二硫苏糖醇的质量比为0.01～0.1:1；所述EDTA与碳酸钙的质量比为0.05～0.1:1。
5.权利要求1～4中任意一条权利要求所述制备方法制得的可控多孔无载体固定化脂肪酶。
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