CN102505008B - 一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体及其制备方法与应用。本发明首先通过将交联脂肪酶聚集体置于磷酸盐缓冲液中，充分振荡，使交联脂肪酶聚集体均匀分布在磷酸盐缓冲液中；接着加入戊二醛活化的磁性固定化交联脂肪酶聚集体，交联；将液体和固体分离，取固体，洗涤，真空冷冻干燥，得到相对酶活在80％以上的磁性固定化交联脂肪酶聚集体。本发明的制备方法成本低、易于操作。本发明通过磁性固化酶技术和交联酶聚集体技术有机结合，不仅提高了磁性固定化酶的活力，而且改善CLEAs操作性能差的问题，得到的既具有较高酶活力又有良好操作性能的磁性固定化交联脂肪酶聚集体性质稳定，能作为生物酶催化剂广泛应用，特别适用于大规模酶反应器。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域，特别涉及一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体及其制备方法与应用。
背景技术
脂肪酶(lipase)即三酰基甘油酰基水解酶，其功能为催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶的基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链，其催化活性决定于它的蛋白质结构。天然的脂肪酶存在稳定性差、易失活、无法重复利用，反应后混入产品中，造成产物难分离、纯度低、纯化困难等问题，将其工业化生产仍存在着较大困难。研究发现，磁性固定化脂肪酶具有能回收、可反复使用、操作生能好、产物易分离、适用于大规格酶解反应器等优点，在生产中具有很大的应用潜力。但是，磁性固定化脂肪酶活相对于游离酶要低，这是由于：①所固定的酶蛋白的分子状态都是游离状态或自然状态，游离状态或自然状态的酶分子在固定化过程与磁性固定化载体作用容易失活，有时固定化酶的相对酶活仅为10％(相对酶活＝固定化酶的酶活/所用游离酶的酶活*100％)；②磁性固定化载体对酶的“活力稀释”(dilution ofactivity)作用，即单位质量固定化酶中酶的量大大减少了。针对这些问题，目前主要的改善措施包括：通过优化固定化条件来减少游离酶的失活，从而提高磁性固定化酶的活性；或者，采用纳米级的磁性载体，增加比表面积，提高单位质量固定化酶中酶的量。
近十年间，出现一种崭新的交联酶聚集体(CLEAs)技术，它是一种用盐、有机溶剂或非离子型聚合物等沉淀酶蛋白制备酶聚集体，再用双功能试剂对聚集体进行交联制备交联酶聚集体(CLEAs)的方法。与游离酶相比，CLEAs技术获得的交联酶聚集体稳定性好、活性高，活性甚至可提高10倍以上。Cao等用非离子多聚体PEG沉淀青霉素G酰化酶，后通过戊二醛交联，所得的CLEAs活力几乎达到原酶活的100％(Cao L.Q.，Rantwijk F.V.Cross-linked enzymeaggregates：A simple and effective method for the immobilization of penicillinacylase.Organic Letters，2000，2(10)：1361-1364.)。Hubert等人采用PEG为淀沉剂制备的交联虫漆酶聚集体呈现“超酶活”，酶的活力可达到游离酶活力的130％(Hubert Cabana，J.Peter Jones，Spiros N.Agathos.Preparation and characterizationof cross-linked laccase aggregates and their application to the elimination ofendocrine disrupting chemicals.Journal of Biotechnology，2007，132(1)：23-31.)。Sangeetha等人研究交联枯草杆菌蛋白酶聚集体稳定性，发现交联酶聚集体表现更广的pH、温度适应性(K.Sangeetha，T.Emilia，Abraham.Preparation andcharacterization of cross-linked enzyme aggregates(CLEA)of Subtilisin forcontrolled release applications.International Journal of Biological Macromolecules，2008，43：314-319.)。但CLEAs的结构相对而言比较疏散，其用于大规模酶反应器的操作性能明显差于磁性固定化酶。工业化大规模的酶反应器为了让底物与酶催化剂充分接触，通常采用增加底物流体流动的措施，这样CLEAs的结构会被破坏，降低CLEAs的酶活。
如何获得高酶活而操作性能好的磁性固化酶是酶生物催化工业化应用的关键难题，是酶工业化应用的瓶颈问题。磁性固化酶技术和交联酶聚集体技术是酶固定化的两种新技术，研究者对这两种技术都分别在进行着不断地改善与完善工作。但是，由于两种技术的自身的限制，将两种技术相结合的酶固定化技术未见报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的磁性固定化交联脂肪酶聚集体。
本发明的再一目的在于提供所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备方法，包含以下步骤：
(1)活化的磁性壳聚糖复合微球的制备：用磷酸盐缓冲液将磁性壳聚糖复合微球充分溶胀；接着加入戊二醛溶液进行活化，戊二醛的最终体积浓度为0.03～3.0％；
(2)磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备：将交联脂肪酶聚集体置于磷酸盐缓冲液中，充分振荡，使交联脂肪酶聚集体均匀分布在磷酸盐缓冲液中；接着加入步骤(1)制备的活化的磁性固定化交联脂肪酶聚集体，于400～1000r/min的搅拌速度下交联5～10小时；将液体和固体分离，取固体，蒸馏水洗涤，真空冷冻干燥，得到磁性固定化交联脂肪酶聚集体。
所述的磷酸盐缓冲液优选为摩尔浓度0.1～1.0mol/L、pH值5.8～9.0的磷酸盐缓冲液；
步骤(1)中所述的磁性壳聚糖复合微球优选通过包含如下步骤的制备方法制备得到：
①将壳聚糖溶解在体积浓度为1.0～3.0％醋酸溶液中，得到均一透明的壳聚糖浓度为1.0～4.0％的胶体溶液；接着加入Fe3O4纳米颗粒，Fe3O4纳米颗粒的用量相当于前述胶体溶液中壳聚糖质量的1/4～1，超声作用下分散10～40min，得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液，放置待用；
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液；司班与吐温按质量比2～4∶1配比，液体石蜡占液体石蜡油相溶液的质量百分比85～95％；
③将步骤①制备的磁性壳聚糖胶体溶液滴入在搅拌状态下的液体石蜡油相溶液，磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液按体积比1∶2～4配比；接着搅拌10～40min后迅速加入戊二醛溶液，控制戊二醛最终浓度为体积百分比0.1～1.0％，继续搅拌40～120分钟，调节pH值为8～12，于60～80℃条件下反应60～120分钟，最后经磁铁吸附，洗涤，干燥，得到磁性壳聚糖复合微球。
步骤①中所述的Fe3O4纳米颗粒的粒径范围优选为50～300nm；
步骤①中所述的超声的频率优选为20～40KHz；
步骤②中所述的司班优选为司班-80或司班-65；
步骤②中所述的吐温优选为吐温-80或吐温-65；
步骤③中所述的洗涤优选为依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤；
步骤③中所述的干燥优选为真空干燥；
步骤(1)中所述的充分溶胀为磁性壳聚糖复合微球溶胀至体积不再变大；
步骤(1)中所述的磷酸盐缓冲液的用量优选为按每1g磁性壳聚糖复合微球配比20～50mL磷酸盐缓冲液计算；
步骤(1)中所述的溶胀的时间优选为10～24小时；
步骤(1)中所述的戊二醛的用量优选为每10g磁性壳聚糖复合微球使用1.0～5.0mL戊二醛进行活化；
步骤(2)中所述的交联脂肪酶聚集体优选通过包含如下步骤的制备方法制备得到：
A、将脂肪酶冻干酶粉溶解于磷酸盐缓冲液中制成浓度为10～100mg/mL酶液，往酶液中滴加有机溶剂进行沉淀，有机溶剂滴加完毕后于4～10℃下静置0.5～4.0小时，使脂肪酶沉淀；
B、接着加入戊二醛溶液，控制戊二醛终浓度为体积百分比0.1～5.0％，于4～10℃下搅拌，使脂肪酶交联2～5小时；将所得悬浊液的固体和液体分离，取固体，用磷酸盐缓冲液充分洗涤，直至上清液中检不出脂肪酶，将固体进行真空冷冻干燥，得到交联脂肪酶聚集体。
步骤A中所述的有机溶剂优选为叔丁醇、丙酮或乙腈中的一种或至少两种；
步骤A中所述的有机溶剂的浓度为质量浓度50～100％；
步骤A中所述的有机溶剂的用量优选为每1mL酶液配比3～30mL有机溶剂；
步骤B中所述的将所得悬浊液的固体和液体分离的方式优选为离心；
所述的离心的条件优选为1500～4000rpm；
所述的磷酸盐缓冲液优选为摩尔浓度0.1～1.0mol/L、pH值5.8～9.0的磷酸盐缓冲液；
步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液的用量优选为按每1g交联脂肪酶聚集体配比10～100mg磷酸盐缓冲液计算；
步骤(2)中所述的磁性壳聚糖复合微球和所述的交联脂肪酶聚集体按质量比10～30∶1配比；
步骤(2)中所述的交联的温度优选为20～40℃；
步骤(2)中所述的将液体和固体分离的方式优选为离心；
所述的离心的条件优选为1500～4000rpm；
一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体，通过上述方法制备得到；
所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活在80％以上，为80～85％；
所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体在食品领域、生物领域或医药领域中作为生物酶催化剂进行应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明将CLEAs技术引入磁性固定化酶的制备，实现磁性载体颗粒大小与CLEAs大小相匹配，从而将CLEAs替代游离酶固定在磁性固定化载体。这样，不仅提高了磁性固定化酶的活力，而且改善CLEAs操作性能差的问题，从而获得一种既具有较高酶活力，同时又有良好操作性能的生物酶催化剂。
(2)本发明所提供的制备方法成本低、易于操作，采用复合有机溶剂对酶液进行沉淀，使酶保持了很高的活性，并且达到较好的沉淀效果；得到的磁性固定化交联脂肪酶性质稳定、可多次重复利用、适用于大规模酶反应器。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)制备交联脂肪酶聚集体
称取脂肪酶冻干酶粉，将其溶解于pH＝5.8，摩尔浓度为0.1mol/L的50mL磷酸盐缓冲液中，制成10mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于试管中，并逐滴加入叔丁醇乙腈混合液(质量浓度100％的叔丁醇和质量浓度100％的乙腈按体积比1∶1混合得到)6mL，于4℃下静置4.0小时，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的终体积浓度为0.1％，于4℃下搅拌5小时进行交联反应，将所得悬浊液于3000rpm/min离心10min，将离心所得沉淀物用pH＝7.0，摩尔浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤，直至上清液中检不出脂肪酶，经真空冷冻干燥，得到交联脂肪酶聚集体。
(2)制备磁性壳聚糖复合微球
①将壳聚糖(壳聚糖脱乙酰度≥90％，粘度＜100cps，购于上海伯奥生物科技有限公司＝溶解在体积浓度为1.0％醋酸溶液中配成均一透明的壳聚糖质量浓度为1.0％的胶体溶液，再加入粒径为100nm的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4颗粒∶壳聚糖＝1∶4(w/w))，在30KHz条件下超声分散30min，得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液，放置待用。
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液(司班-802.4g，吐温-801.2g，液体石蜡80mL)。
③缓慢搅拌下将步骤①制备的的磁性壳聚糖胶体溶液滴入步骤②制备的液体石蜡油相溶液中，磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液的体积比为1∶4，搅拌10min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为0.1％，继续搅拌40分钟，调节pH值为8，并将体系在60℃条件下反应60min，最后在磁铁吸附下得到磁性壳聚糖复合微球，依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤，真空干燥得到磁性壳聚糖复合微球。
(3)制备磁性固定化交联脂肪酶聚集体
①称取步骤(1)中制备的交联脂肪酶聚集体0.1g，置于10mL，pH＝7.0，摩尔浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液中，经充分振荡使聚集体均匀分布。
②取2.0g步骤(2)中制备的磁性壳聚糖复合微球，加到100mL，pH＝7.0，摩尔浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡10小时，用4mL体积浓度为0.1％的戊二醛进行活化(戊二醛终浓度为0.03％)。
③将上述聚集体及磁性壳聚糖复合微球充分混合，在温度20℃下不断振荡5小时进行交联，于2000rpm/min离心10min，用蒸馏水充分洗涤，真空冷冻干燥，得到磁性固定化交联脂肪酶聚集体。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活为80.2％。每次反应结束后在外加磁场的作用下进行固液分离，将磁性固定化交联脂肪酶聚集体用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活仍保留75.3％。
实施例2
(1)制备交联脂肪酶聚集体
称取脂肪酶冻干酶粉，将其溶解于pH＝9.0，摩尔浓度为1.0mol/L的50mL磷酸盐缓冲液中，制成100mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于试管中，并逐滴加入叔丁醇丙酮混合液(质量浓度50％的叔丁醇和质量浓度50％的丙酮按体积比1∶1混合得到)60mL，于10℃下静置0.5小时，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为5.0％，于10℃下搅拌2小时进行交联反应，将所得悬浊液在2000rpm/min的条件下离心10min，将离心所得沉淀物用pH＝7.0，摩尔浓度为1.0mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤，直至上清液中检不出脂肪酶，经真空冷冻干燥，得到交联脂肪酶聚集体。
(2)制备磁性壳聚糖复合微球
①将壳聚糖溶解在体积浓度为3.0％醋酸溶液中配成均一透明的壳聚糖质量浓度为4.0％的胶体溶液，再加入粒径为100nm的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4颗粒∶壳聚糖＝1∶1(w/w))，在20KHz条件下超声分散40min，得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液，放置待用。
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液(司班-802.4g，吐温-801.2g，液体石蜡80mL)。
③缓慢搅拌下将步骤①制备的的磁性壳聚糖胶体溶液滴入步骤②制备的液体石蜡油相溶液中，磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液的体积比为1∶2，搅拌40min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为1.0％，继续搅拌120分钟，调节pH值为12，并将体系在80℃条件下反应120min，最后在磁铁吸附下得到磁性壳聚糖复合微球，依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤，真空干燥得到磁性壳聚糖复合微球。
(3)制备磁性固定化交联脂肪酶聚集体
①称取步骤(1)中制备的交联脂肪酶聚集体0.1g，置于10mL，pH＝5.8，摩尔浓度为0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，经充分振荡使聚集体均匀分布。
②取2.0g步骤(2)中制备的磁性壳聚糖复合微球，加到40mL，pH＝5.8，摩尔浓度为0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡24小时，直接加入14mL体积浓度为5.0％的戊二醛进行活化(戊二醛终浓度为3.0％)。
③将上述聚集体及磁性壳聚糖复合微球充分混合，在温度40℃下不断振荡10小时进行交联，在2000rpm/min的条件下离心10min，用蒸馏水充分洗涤，真空冷冻干燥，得到磁性固定化交联脂肪酶聚集体。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活为81.9％。每次反应结束后在外加磁场的作用下进行固液分离，将磁性固定化交联脂肪酶聚集体用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活仍保留77.2％。
实施例3
(1)制备交联脂肪酶聚集体
称取脂肪酶冻干酶粉，将其溶解于pH＝6.0，摩尔浓度为0.8mol/L的50mL磷酸盐缓冲液中，制成40mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于试管中，并逐滴加入乙腈丙酮混合液(质量浓度90％的乙腈和质量浓度90％的丙酮按体积比1∶1混合得到)20mL，于6℃下静置3.0小时，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为质量浓度0.09％，于6℃下搅拌4小时进行交联反应，将所得悬浊液在3000rpm/min的条件下离心10min，将离心所得沉淀物用pH＝7.0，摩尔浓度为0.4mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤，直至上清液中检不出脂肪酶，经真空冷冻干燥，得到交联脂肪酶聚集体。
(2)制备磁性壳聚糖复合微球
①将壳聚糖溶解在体积浓度为2.0％醋酸溶液中配成均一透明的壳聚糖质量浓度为4.0％的胶体溶液，再加入粒径为100nm的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4颗粒∶壳聚糖＝1∶2(w/w))，在30KHz条件下超声分散40min，得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液，放置待用。
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液(司班-654.8g，吐温-651.2g，液体石蜡80mL)。
③缓慢搅拌下将步骤①制备的的磁性壳聚糖胶体溶液滴入步骤②制备的液体石蜡油相溶液中，磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液的体积比为1∶3，搅拌20min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为0.4％，继续搅拌80分钟，调节pH值为10，并将体系在65℃条件下反应90min，最后在磁铁吸附下得到磁性壳聚糖复合微球，依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤，真空干燥得到磁性壳聚糖复合微球。
(3)制备磁性固定化交联脂肪酶聚集体
①称取步骤(1)中制备的交联脂肪酶聚集体0.1g，置于10mL，pH＝8.0，摩尔浓度为0.8mol/L磷酸盐缓冲液中，经充分振荡使聚集体均匀分布。
②取2.0g步骤(2)中制备的磁性壳聚糖复合微球，加到70mL，pH＝8.0，摩尔浓度为0.8mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡16小时，用4mL体积浓度为2.0％的戊二醛进行活化(戊二醛终浓度为0.57％)。
③将上述聚集体及磁性壳聚糖复合微球充分混合，在温度30℃下不断振荡6小时进行交联，在2000rpm/min的条件下离心10min，用蒸馏水充分洗涤，真空冷冻干燥，得到磁性固定化交联脂肪酶聚集体。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活为83.2％。每次反应结束后在外加磁场的作用下进行固液分离，将磁性固定化交联脂肪酶聚集体用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定15次以后，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活仍保留76.1％。
实施例4
(1)制备交联脂肪酶聚集体
称取脂肪酶冻干酶粉，将其溶解于pH＝7.0，摩尔浓度为0.5mol/L的50mL磷酸盐缓冲液中，制成60mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于试管中，并逐滴加入乙腈丙酮混合液(质量浓度90％的乙腈和质量浓度90％的丙酮按体积比1∶1混合得到)20mL和丙酮溶液(质量浓度为85％)30mL，于8℃下静置2.0小时，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为质量浓度2.5％，于8℃下搅拌3小时进行交联反应，将所得悬浊液在2000rpm/min的条件下离心10min，将离心所得沉淀物用pH＝8.0，摩尔浓度为0.8mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤，直至上清液中检不出脂肪酶，经真空冷冻干燥，得到交联脂肪酶聚集体。
(2)制备磁性壳聚糖复合微球
①将壳聚糖溶解在体积浓度为2.5％醋酸溶液中配成均一透明的壳聚糖质量浓度为3.2％的胶体溶液，再加入粒径为100nm的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4颗粒∶壳聚糖＝1∶3(w/w))，在30KHz条件下超声分散40min，得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液，放置待用。
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液(司班-803.6g，吐温-801.2g，液体石蜡80mL)。
③缓慢搅拌下将步骤①制备的的磁性壳聚糖胶体溶液滴入步骤②制备的液体石蜡油相溶液中，磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液的体积比为1∶3，搅拌35min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为0.6％，继续搅拌100分钟，调节pH值为11，并将体系在70℃条件下反应80min，最后在磁铁吸附下得到磁性壳聚糖复合微球，依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤，真空干燥得到磁性壳聚糖复合微球。
(3)制备磁性固定化交联脂肪酶聚集体
①称取步骤(1)中制备的交联脂肪酶聚集体0.1g，置于10mL，pH＝7.0，摩尔浓度为0.7mol/L磷酸盐缓冲液中，经充分振荡使聚集体均匀分布。
②取2.0g步骤(2)中制备的磁性壳聚糖复合微球，加到50mL，pH＝7.0，摩尔浓度为0.7mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡20小时，用4mL体积浓度为3.0％的戊二醛进行活化(戊二醛终浓度为0.85％)。
③将上述聚集体及磁性壳聚糖复合微球充分混合，在温度35℃下不断振荡8小时进行交联，在2000rpm/min的条件下离心10min，用蒸馏水充分洗涤，真空冷冻干燥，得到磁性固定化交联脂肪酶聚集体。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活为82.5％。每次反应结束后在外加磁场的作用下进行固液分离，将磁性固定化交联脂肪酶聚集体用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活仍保留76.5％。
实施例5
(1)制备交联脂肪酶聚集体
称取脂肪酶冻干酶粉，将其溶解于pH＝6.5，摩尔浓度为0.7mol/L的50mL磷酸盐缓冲液中，制成85mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于试管中，并逐滴加入叔丁醇溶液(质量浓度为75％)24mL，于5℃下静置3.5小时，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为质量浓度3.0％，于6.5℃下搅拌3.5小时进行交联反应，将所得悬浊液在2000rpm/min的条件下离心10min，将离心所得沉淀物用pH＝6.0，摩尔浓度为0.7mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤，直至上清液中检不出脂肪酶，经真空冷冻干燥，得到交联脂肪酶聚集体。
(2)制备磁性壳聚糖复合微球
①将壳聚糖溶解在体积浓度为1.5％醋酸溶液中配成均一透明的壳聚糖质量浓度为2.5％的胶体溶液，再加入粒径为100nm的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4颗粒∶壳聚糖＝1∶3(w/w))，在30KHz条件下超声分散40min，得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液，放置待用。
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液(司班-652.4g，吐温-651.2g，液体石蜡80mL)。
③缓慢搅拌下将步骤①制备的的磁性壳聚糖胶体溶液滴入步骤②制备的液体石蜡油相溶液中，磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液的体积比为1∶2，搅拌25min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为0.7％，继续搅拌65分钟，调节pH值为10，并将体系在80℃条件下反应90min，最后在磁铁吸附下得到磁性壳聚糖复合微球，依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤，真空干燥得到磁性壳聚糖复合微球。
(3)制备磁性固定化交联脂肪酶聚集体
①称取步骤(1)中制备的交联脂肪酶聚集体0.1g，置于10mL，pH＝8.0，摩尔浓度为0.6mol/L磷酸盐缓冲液中，经充分振荡使聚集体均匀分布。
②取2.0g步骤(2)中制备的磁性壳聚糖复合微球，加到80mL，pH＝8.0，摩尔浓度为0.6mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡18小时，用4mL体积浓度为2.0％的戊二醛进行活化(戊二醛终浓度为0.57％)。
③将上述聚集体及磁性壳聚糖复合微球充分混合，在温度25℃下不断振荡6小时进行交联，在2000rpm/min的条件下离心10min，用蒸馏水充分洗涤，真空冷冻干燥，得到磁性固定化交联脂肪酶聚集体。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活为75.1％。每次反应结束后在外加磁场的作用下进行固液分离，将磁性固定化交联脂肪酶聚集体用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活仍保留70.7％。
对比实施例1
(1)制备脂肪酶溶液
称取脂肪酶冻干酶粉，将其溶解于pH＝6.5，摩尔浓度为0.7mol/L的50mL磷酸盐缓冲液中，制成85mg/mL酶液，放置待用。
(2)制备磁性壳聚糖复合微球
①将壳聚糖溶解在体积浓度为1.5％醋酸溶液中配成均一透明的壳聚糖质量浓度为2.5％的胶体溶液，再加入粒径为100nm的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4颗粒∶壳聚糖＝1∶3(w/w))，在30KHz条件下超声分散40min，得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液，放置待用。
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液(司班-652.4g，吐温-651.2g，液体石蜡80mL)。
③缓慢搅拌下将步骤①制备的的磁性壳聚糖胶体溶液滴入步骤②制备的液体石蜡油相溶液中，磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液的体积比为1∶2，搅拌25min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为0.7％，继续搅拌65分钟，调节pH值为10，并将体系在80℃条件下反应90min，最后在磁铁吸附下得到磁性壳聚糖复合微球，依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤，真空干燥得到磁性壳聚糖复合微球。
(3)制备磁性固定化脂肪酶
①取步骤(1)中制备的脂肪酶液1.17mL。
②取2.0g步骤(2)中制备的磁性壳聚糖复合微球，加到80mL，pH＝8.0，摩尔浓度为0.6mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡18小时，用4mL体积浓度为2.0％的戊二醛进行活化(戊二醛终浓度为0.57％)。
③将上述脂肪酶液及磁性壳聚糖复合微球充分混合，在温度25℃下不断振荡6小时进行交联，在2000rpm/min的条件下离心10min，用蒸馏水充分洗涤，真空冷冻干燥，得到磁性固定化交联脂肪酶聚集体。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，磁性固定化脂肪酶的相对酶活为40.1％。每次反应结束后在外加磁场的作用下进行固液分离，将固定化酶用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，磁性固定化脂肪酶的相对酶活仍保留35.7％。
对比实施例2
(1)制备交联脂肪酶聚集体
称取脂肪酶冻干酶粉，将其溶解于pH＝7.0，摩尔浓度为0.5mol/L的50mL磷酸盐缓冲液中，制成60mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于试管中，并逐滴加入乙腈丙酮混合液(质量浓度90％的乙腈和质量浓度90％的丙酮按体积比1∶1混合得到)20mL和丙酮溶液(质量浓度为85％)30mL，于8℃下静置2.0小时，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为质量浓度12.5％，于8℃下搅拌3小时进行交联反应，将所得悬浊液在2000rpm/min的条件下离心10min，将离心所得沉淀物用pH＝8.0，摩尔浓度为0.8mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤，直至上清液中检不出脂肪酶，经真空冷冻干燥，得到交联脂肪酶聚集体。
(2)制备磁性壳聚糖复合微球
①将壳聚糖溶解在体积浓度为2.5％醋酸溶液中配成均一透明的壳聚糖质量浓度为3.2％的胶体溶液，再加入粒径为100nm的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4颗粒∶壳聚糖＝1∶3(w/w))，在30KHz条件下超声分散40min，得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液，放置待用。
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液(司班-803.6g，吐温-801.2g，液体石蜡80mL)。
③缓慢搅拌下将步骤①制备的的磁性壳聚糖胶体溶液滴入步骤②制备的液体石蜡油相溶液中，磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液的体积比为1∶3，搅拌35min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为0.6％，继续搅拌100分钟，调节pH值为11，并将体系在70℃条件下反应80min，最后在磁铁吸附下得到磁性壳聚糖复合微球，依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤，真空干燥得到磁性壳聚糖复合微球。
(3)制备磁性固定化交联脂肪酶聚集体
①称取步骤(1)中制备的交联脂肪酶聚集体0.1g，置于10mL，pH＝7.0，摩尔浓度为0.7mol/L磷酸盐缓冲液中，经充分振荡使聚集体均匀分布。
②取2.0g步骤(2)中制备的磁性壳聚糖复合微球，加到50mL，pH＝7.0，摩尔浓度为0.7mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡20小时，用4mL体积浓度为3.0％的戊二醛进行活化(戊二醛终浓度为0.85％)。
③将上述聚集体及磁性壳聚糖复合微球充分混合，在温度35℃下不断振荡8小时进行交联，在2000rpm/min的条件下离心10min，用蒸馏水充分洗涤，真空冷冻干燥，得到磁性固定化交联脂肪酶聚集体。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活为50.5％。每次反应结束后在外加磁场的作用下进行固液分离，将磁性固定化交联脂肪酶聚集体用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入第二轮反应，如此重复测定10次以后，磁性固定化交联脂肪酶聚集体的相对酶活仍保留46.3％。
对比实施例3
(1)制备交联脂肪酶聚集体
称取脂肪酶冻干酶粉，将其溶解于pH＝7.0，摩尔浓度为0.5mol/L的50mL磷酸盐缓冲液中，制成60mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于试管中，并逐滴加入乙腈丙酮混合液(质量浓度90％的乙腈和质量浓度90％的丙酮按体积比1∶1混合得到)20mL和丙酮溶液(质量浓度为85％)30mL，于8℃下静置2.0小时，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最终体积浓度为质量浓度2.5％，于8℃下搅拌3小时进行交联反应，将所得悬浊液在2000rpm/min的条件下离心10min，将离心所得沉淀物用pH＝8.0，摩尔浓度为0.8mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤，直至上清液中检不出脂肪酶，经真空冷冻干燥，得到交联脂肪酶聚集体。
经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为90.5％。每次反应结束后，将含有交联脂肪酶聚集体的混合液在6000rmp/min的条件下，离心分离，将分离后得到的交联脂肪酶聚集体用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定5次。交联脂肪酶聚集体的相对酶活仅保留56.3％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
（1）活化的磁性壳聚糖复合微球的制备：用磷酸盐缓冲液将磁性壳聚糖复合微球充分溶胀；接着加入戊二醛溶液进行活化，戊二醛的最终体积浓度为0.03～3.0%；
（2）磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备：将交联脂肪酶聚集体置于磷酸盐缓冲液中，充分振荡，使交联脂肪酶聚集体均匀分布在磷酸盐缓冲液中；接着加入步骤（1）制备的活化的磁性壳聚糖复合微球，于400～1000r/min的搅拌速度下交联5～10小时；将液体和固体分离，取固体，蒸馏水洗涤，真空冷冻干燥，得到磁性固定化交联脂肪酶聚集体；
所述的交联脂肪酶聚集体为通过包含如下步骤的制备方法制备得到：
A、将脂肪酶冻干酶粉溶解于磷酸盐缓冲液中制成浓度为10～100mg/mL酶液，往酶液中滴加有机溶剂进行沉淀，有机溶剂滴加完毕后于4～10℃下静置0.5～4.0小时，使脂肪酶沉淀；
B、接着加入戊二醛溶液，控制戊二醛终浓度为体积百分比0.1～5.0%，于4 ～10℃下搅拌，使脂肪酶交联2～5小时；将所得悬浊液的固体和液体分离，取固体，用磷酸盐缓冲液充分洗涤，直至上清液中检不出脂肪酶，将固体进行真空冷冻干燥，得到交联脂肪酶聚集体；
步骤（1）中所述的磁性壳聚糖复合微球通过包含如下步骤的制备方法制备得到：
①将壳聚糖溶解在体积浓度为1.0～3.0%醋酸溶液中，得到均一透明的壳聚糖浓度为1.0～4.0%的胶体溶液；接着加入Fe3O4纳米颗粒，Fe3O4纳米颗粒的用量相当于前述胶体溶液中壳聚糖质量的1/4～1，超声作用下分散10～40min，得到分散均匀的磁性壳聚糖胶体溶液，放置待用；
②配制含司班及吐温的液体石蜡油相溶液；司班与吐温按质量比2～4:1配比，液体石蜡占液体石蜡油相溶液的质量百分比85～95%；
③将步骤①制备的磁性壳聚糖胶体溶液滴入在搅拌状态下的液体石蜡油相溶液，磁性壳聚糖胶体溶液与液体石蜡油相溶液按体积比1: 2～4配比；接着搅拌10～40min后加入戊二醛溶液，控制戊二醛最终浓度为体积百分比0.1～1.0%，继续搅拌40～120分钟，调节pH值为8～12，于60～80℃条件下反应60～120分钟，最后经磁铁吸附，洗涤，干燥，得到磁性壳聚糖复合微球；
步骤①中所述的Fe3O4纳米颗粒的粒径为100nm。
2.根据权利要求1所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液为浓度0.1～1.0mol/L、pH值5.8～9.0的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备方法，其特征在于：
步骤①中所述的超声的频率为20～40KHz；
步骤②中所述的司班为司班-80或司班-65；
步骤②中所述的吐温为吐温-80或吐温-65；
步骤③中所述的洗涤为依次用丙酮、石油醚、无水乙醇和蒸馏水反复洗涤；
步骤③中所述的干燥为真空干燥。
4.根据权利要求1所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的磷酸盐缓冲液的用量为按每1g磁性壳聚糖复合微球配比20～50mL磷酸盐缓冲液计算；
步骤（1）中所述的溶胀的时间为10～24小时；
步骤（1）中所述的戊二醛的用量为每10g磁性壳聚糖复合微球使用1.0～5.0mL戊二醛进行活化。
5.根据权利要求1所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备方法，其特征在于：步骤A中所述的有机溶剂为叔丁醇、丙酮或乙腈中的一种或至少两种；
步骤A中所述的有机溶剂的浓度为质量浓度50～100%；
步骤A中所述的有机溶剂的用量为每1mL酶液配比3～30mL有机溶剂；
步骤B中所述的将所得悬浊液的固体和液体分离的方式为离心；
所述的磷酸盐缓冲液为浓度0.1～1.0mol/L、pH值5.8～9.0的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的磷酸盐缓冲液的用量为按每1g交联脂肪酶聚集体配比10～100mg磷酸盐缓冲液计算；
步骤（2）中所述的磁性壳聚糖复合微球和所述的交联脂肪酶聚集体按质量比10～30：1配比；
步骤（2）中所述的交联的温度为20～40℃；
步骤（2）中所述的将液体和固体分离的方式为离心。
7.一种磁性固定化交联脂肪酶聚集体，通过权利要求1～6任一项所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体的制备方法得到。
8.权利要求7所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体的应用，其特征在于：所述的磁性固定化交联脂肪酶聚集体作为生物酶催化剂进行应用。
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