CN103756992A - 一种巧克力微杆菌磁性细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种巧克力微杆菌磁性细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种巧克力微杆菌磁性细胞及其制备方法和应用，所述巧克力微杆菌磁性细胞，即首先制备壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料、然后制备巧克力微杆菌的细胞悬浮液，最后将所得的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料加入到的巧克力微杆菌细胞悬浮液中，控制温度为30℃下，搅拌吸附10-600min即得巧克力微杆菌磁性细胞。该巧克力微杆菌磁性细胞用于催化内消旋二甲酯不对称水解反应生成(4S,5R)-半酯,可以重复利用，并且重复利用10次后，巧克力微杆菌磁性细胞对底物生物素二甲酯的催化转化率仍有70%以上。该巧克力微杆菌磁性细胞制备方法简单，酶活回收率高，稳定性好，可以在磁场中方便快速的回收和重复利用。

Description

一种巧克力微杆菌磁性细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及的是一种巧克力微杆菌磁性细胞及其制备方法和应用，更具体地说是涉及一种利用壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒固定巧克力微杆菌制备的巧克力微杆菌磁性细胞及其在催化内消旋二甲酯不对称水解反应生成(4S, 5R)-半酯中的应用。
背景技术
细胞固定化是指利用化学或物理的手段将游离的细胞定位于有限空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术。
相比于游离细胞而言，固定化细胞具有显著的优势，例如固定化细胞能具有更高的稳定性，可以重复利用，而且固定化方法较简单，成本低。常用的固定化细胞的方法有包埋法、吸附法等。包埋法是通过一些有机或无机聚合物将菌体包裹在载体内的一种方法，该方法的优点是固定化效率高，但由于菌体被包裹造成传质阻力大，固定化细胞的催化效率较低。吸附法是利用载体与菌体表面之间的物理作用力，将菌体固定于载体表面，该方法的优点是对菌体的活性回收率高，缺点是固定化效率不高，菌体与载体之间弱的作用力导致菌体易脱落而影响固定化细胞的重复利用率。
巧克力微杆菌所产的酯酶可以高立体选择性的不对称水解生物素中间体二甲酯，生成(4S, 5R)-半酯。但目前游离细胞的稳定性较差，无法重复利用，限制了其工业用途。
运用磁性高分子微球作为结合细胞或酶的载体，具有以下优点:①有利于固定化酶或细胞从反应体系中分离和回收，操作简便;②磁性载体固定化酶或细胞放入磁性稳定地流化床反应器中，可以减少持续反应的操作，适合大规模持续化生产;③利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶或细胞的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶或细胞的催化效率。因此利用磁性材料固定细胞具有很好的应用前景。申请公布号为CN103205413A的中国专利申请公开了一种碳-Fe3O4纳米细胞固定材料并利用其固定巧克力微杆菌细胞，该材料是通过物理吸附的原理将细胞与磁性纳米材料结合，能应用于发酵液中细胞的分离。然而，单纯通过物理吸附的方法得到的固定化细胞，细胞与材料的结合力较弱，稳定性较低，在重复利用的批次反应的过程中容易脱落而无法重复利用。
利用壳聚糖包裹四氧化三铁制备的磁性纳米材料具有性质稳定，生物相容性好等优点。截止到目前为止，尚未有利用该种材料固定化巧克力微杆菌细胞的报道。
发明内容
本发明的目的之一在于为了解决上述的细胞与材料的结合力较弱，稳定性较低，在重复利用的批次反应过程中容易脱落而无法重复利用等技术问题而提供一种巧克力微杆菌磁性细胞。
本发明的目的之二在于提供上述的一种巧克力微杆菌磁性细胞的制备方法。
本发明的目的之三在于将上述的一种巧克力微杆菌磁性细胞用于催化内消旋二甲酯不对称水解反应生成(4S, 5R)-半酯。
本发明的技术原理
首先制备一种带有醛基的壳聚糖-Fe3O4磁性纳米材料，该带有醛基的壳聚糖-Fe3O4磁性纳米材料的表面的醛基可以与细胞表面的氨基形成牢固的共价结合，因此可获得稳定性高的磁性细胞并用于多批次生物催化反应。
本发明的技术方案
一种巧克力微杆菌磁性细胞，具体通过包括如下步骤的方法制备而成：
（1）、利用壳聚糖和Fe3O4磁性纳米颗粒为原料制备壳聚糖包裹Fe3O4的磁性纳米材料；
所述的壳聚糖包裹Fe3O4的磁性纳米材料的制备过程如下：
首先，将壳聚糖溶于质量百分比浓度为5%的醋酸水溶液中，待壳聚糖完全溶解后，加入Fe3O4颗粒，超声混合均匀得到混合液；
然后，强烈搅拌下将所得的混合液分散于装有液体石蜡和司班80的容器中，在40℃下搅拌30min后加入质量百分比浓度为25%的戊二醛水溶液，机械快速搅拌反应4h后，即得壳聚糖包裹Fe3O4磁性纳米材料粗品；
最后，用石油醚充分超声洗涤所得的壳聚糖包裹Fe3O4磁性纳米材料粗品，每次用磁铁分离，并用丙酮洗涤脱水，再用乙醇和蒸馏水各洗涤3次，即得纯化的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料；
因为上述所得的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料本身含有一定量水，所以此时称重即为壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重；
所述的壳聚糖、质量百分比浓度为5%的醋酸水溶液、Fe3O4颗粒、液体石蜡、司班80和质量百分比浓度为25%的戊二醛水溶液的用量，按壳聚糖：质量百分比浓度为5%的醋酸水溶液：Fe3O4颗粒：液体石蜡：司班 80：质量百分比浓度为25%的戊二醛水溶液为0.2g：20ml：0.2g：40ml：5ml：3ml的比例计算；
所述的壳聚糖，其粘度为400-600mPa.s； 
（2）、培养巧克力微杆菌，然后将所得的细胞离心洗涤后重新悬浮于缓冲溶液中，获得巧克力微杆菌细胞悬浮液；
所述的巧克力微杆菌为产酯酶的巧克力微杆菌SIT101 CGMCC No.4436；
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲溶液，其浓度为0.1M，pH为7.0；
（3）、将步骤（1）所得的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料加入到步骤（2）所得的巧克力微杆菌细胞悬浮液中，控制温度为30℃下，搅拌吸附10-600min，即得巧克力微杆菌磁性细胞；
所用的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料、巧克力微杆菌细胞悬浮液的量，按壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重：巧克力微杆菌细胞的干重：磷酸盐缓冲溶液为10～300g：10g：1L的比例计算，优选为150～300g：10g：1L。
利用上述的一种巧克力微杆菌磁性细胞催化内消旋二甲酯不对称水解反应生成(4S, 5R)-半酯。催化内消旋二甲酯不对称水解反应结束后的巧克力微杆菌磁性细胞经磁场分离收集后即可用于下一批次催化内消旋二甲酯不对称水解的反应，即可实现巧克力微杆菌磁性细胞的重复利用，重复利用10次后，巧克力微杆菌磁性细胞对底物生物素二甲酯的催化转化率仍有70%。
本发明的有益效果
本发明的一种巧克力微杆菌磁性细胞，由于在制备壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料过程中添加适量的戊二醛，使得制备获得的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料表面带有一定量的游离醛基。壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料与巧克力微杆菌细胞表面的结合既有醛基的交联作用又有吸附作用，这可以使得制备的巧克力微杆菌磁性细胞足够的牢固而又对活性影响较小，使得巧克力微杆菌细胞内酶活得到较好的保持。
进一步，本发明的一种巧克力微杆菌磁性细胞的制备方法，最终所得的一种巧克力微杆菌磁性细胞的固定化率可达到100%，活力回收率达92%。在催化合成（4S, 5R）-半酯的反应中，连续使用10批次以上，巧克力微杆菌磁性细胞依然保持70%以上的活性，而巧克力微杆菌游离细胞只剩余10%活性。
本发明的一种巧克力微杆菌磁性细胞的制备方法，简单易行，只需将壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料与巧克力微杆菌细胞在水溶液中混合吸附即可制得、巧克力微杆菌细胞的固定化率、活力回收率和稳定性高的巧克力微杆菌磁性细胞，并且在制备过程中无需外加任何化学试剂。该磁性细胞只需外加磁场即可方便的分离，简化了操作步骤。克服了传统固定化方法活性回收率低或细胞容易脱落等问题，因此具有相当的应用前景。
附图说明
图1、巧克力微杆菌磁性细胞作为催化剂催化内消旋二酯不对称水解产生(4S, 5R)-半酯的反应过程示意图；
图2、实施例2所得的巧克力微杆菌磁性细胞和实施例2中步骤（2）所得的巧克力微杆菌游离细胞在水相中连续10批次催化内消旋二酯不对称水解产生(4S, 5R)-半酯的催化转化率的曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述，但并不限制本发明。
本发明所用的试剂皆为分析纯或化学纯规格。磁性纳米Fe3O4颗粒来源于商品化的试剂公司。
本发明所用的巧克力微杆菌为产酯酶的巧克力微杆菌SIT101（CGMCC No.4436）,关于该菌株的培养方法和产物(4S, 5R)-半酯的分析方法参见中国专利“一种巧克力微杆菌及利用其制备(4S, 5R)-半酯的方法，专利号：ZL 201010603789”。
本发明的巧克力微杆菌细胞的固定化率的计算公式如下：
AD=(A0-A1)/A0×100%；
其中AD为巧克力微杆菌细胞的固定化率，A0为未加入壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料前巧克力微杆菌细胞缓冲溶液在600nm处的OD值，A1为加入壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料后获得的巧克力微杆菌磁性细胞经磁场分离后，上清液在600nm处测定的OD值。
实施例1
一种巧克力微杆菌磁性细胞，具体通过包括如下步骤的方法制备而成： 
（1）、壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的制备
将0.2g壳聚糖（粘度为400-600mPa.s）溶于20ml质量百分比浓度为5%的醋酸水溶液中，待壳聚糖完全溶解后，加入Fe3O4颗粒0.2g，超声20min混合均匀得到混合液；
然后在40℃水浴中强烈搅拌下将所得的混合液分散于装有40ml液体石蜡和5ml司班80的三口烧瓶中，搅拌30min后加入质量百分比浓度为25%的戊二醛水溶液3ml，机械搅拌反应4h，即得壳聚糖包裹Fe3O4磁性纳米材料粗品；
用石油醚充分超声洗涤所得的壳聚糖包裹Fe3O4磁性纳米材料粗品，每次用磁铁分离，并用丙酮洗涤脱水，再用乙醇和蒸馏水各洗涤3次，得纯化的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料；
因为上述所得的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料本身含有一定量水，所以此时称重即为壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重；
（2）、巧克力微杆菌细胞悬浮液的制备；
取4℃保存的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum SIT101，CGMCC NO.4436)斜面菌种，挑取一环接种至装有50ml培养基的250ml摇瓶中，在30℃下，160rpm振摇培养48h，离心收获巧克力微杆菌细胞；
然后将所得的上述巧克力微杆菌细胞置于缓冲溶液中，得巧克力微杆菌细胞的浓度为10g/L的巧克力微杆菌细胞悬浮液；
所述的培养基按每升计算，由葡萄糖15.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，MgSO4 1g和余量的水组成，pH7.0；
所述的缓冲溶液为浓度为0.1M的磷酸盐缓冲溶液，pH为7.0；
（3）、巧克力微杆菌磁性细胞的制备
取干重为0.1g的巧克力微杆菌细胞悬浮在10mL磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.0）中，加入湿重为2g的磁性壳聚糖Fe3O4纳米材料，在室温下搅拌4h，即得巧克力微杆菌磁性细胞溶液；
即上述所用的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料、巧克力微杆菌细胞的量，按壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重：巧克力微杆菌细胞的干重：磷酸盐缓冲溶液为200g：10g：1L的比例计算。
用磁铁吸附上述产生的巧克力微杆菌磁性细胞溶液，与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料结合的巧克力微杆菌细胞，即巧克力微杆菌磁性细胞会被吸附在磁铁的附近，而未与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料结合的巧克力微杆菌细胞将会被转移到洗涤液中，通过测定加入壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料前后巧克力微杆菌细胞在缓冲溶液中OD值的变化，计算巧克力微杆菌细胞的固定化率。通过固定化率公式计算出巧克力微杆菌磁性细胞的固定化率为100%，酶活回收率达92%。
实施例2
一种巧克力微杆菌磁性细胞，具体通过包括如实施例1所述的步骤的方法制备而成：
只是步骤（3）中所用的巧克力微杆菌细胞与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的重量比和搅拌时间与实施例1不同，其它均同实施例1；
所用的巧克力微杆菌细胞与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的重量比：即所用的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料、巧克力微杆菌细胞的量，按壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重：巧克力微杆菌细胞的干重：磷酸盐缓冲溶液为150g：10g：1L的比例计算;
搅拌时间为1h。
其他同实施例1。
通过固定化率公式计算出巧克力微杆菌磁性细胞的固定化率为38.9%。
实施例3
一种巧克力微杆菌磁性细胞，具体通过包括如实施例1所述的步骤的方法制备而成：
只是步骤（3）中所用的巧克力微杆菌细胞与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的重量比和搅拌时间与实施例1不同，其它均同实施例1；
所用的巧克力微杆菌细胞与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的重量比：即所用的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料、巧克力微杆菌细胞的量，按壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重：巧克力微杆菌细胞的干重：磷酸盐缓冲溶液为150g：10g：1L的比例计算;
搅拌时间为3h。
其他同实施例1。
通过固定化率公式计算出巧克力微杆菌磁性细胞的固定化率为70.8%。
实施例4
一种巧克力微杆菌磁性细胞，具体通过包括如实施例1所述的步骤的方法制备而成：
只是步骤（3）中所用的巧克力微杆菌细胞与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的重量比和搅拌时间与实施例1不同，其它均同实施例1；
所用的巧克力微杆菌细胞与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的重量比：即所用的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料、巧克力微杆菌细胞的量，按壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重：巧克力微杆菌细胞的干重：磷酸盐缓冲溶液为150g：10g：1L的比例计算;
搅拌时间为4h。
其他同实施例1。
通过固定化率公式计算出巧克力微杆菌磁性细胞的固定化率为100%。
实施例5
一种巧克力微杆菌磁性细胞，具体通过包括如实施例1所述的步骤的方法制备而成：
只是步骤（3）中所用的巧克力微杆菌细胞与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的重量比和搅拌时间与实施例1不同，其它均同实施例1；
所用的巧克力微杆菌细胞与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的重量比：即所用的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料、浓度为10g/L的巧克力微杆菌细胞的量，按壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重：巧克力微杆菌细胞的干重：磷酸盐缓冲溶液为100g：10g：1L的比例计算;
搅拌时间为4h。
其他同实施例1。
通过固定化率公式计算出巧克力微杆菌磁性细胞的固定化率为80.5%。
实施例6
一种巧克力微杆菌磁性细胞，具体通过包括如实施例1所述的步骤的方法制备而成：
只是步骤（3）中所用的巧克力微杆菌细胞与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的重量比和搅拌时间与实施例1不同，其它均同实施例1；
所用的巧克力微杆菌细胞与壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的重量比：即所用的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料、巧克力微杆菌细胞的量，按壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重：巧克力微杆菌细胞的干重：磷酸盐缓冲溶液为50g：10g：1L的比例计算;
搅拌时间为4h。
其他同实施例1。
通过固定化率公式计算出巧克力微杆菌磁性细胞的固定化率为49.3%。
通过上述实施例2-6进行对比，可以看出，壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料与巧克力微杆菌细胞的重量比和搅拌时间对固定化率有显著的影响，当壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重与巧克力微杆菌细胞的干重的比达到15：1以上，搅拌时间为4h，固定化率可以达到100%。
应用实施例1
利用实施例2所得的巧克力微杆菌磁性细胞催化生物素二甲酯水解生成(4S, 5R)-半酯，其催化水解反应过程示意图如图1所示，其催化水解过程的具体步骤如下：
在2份10mL磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH 8.0)中，分别加入生物素二甲酯100mg，然后将实施例2最终所得的含有100mg干重巧克力微杆菌细胞的巧克力微杆菌磁性细胞、实施例2步骤（2）所得的100mg干重巧克力微杆菌游离细胞分别加入到10mL上述含有底物的溶液中，控制温度为40℃分别进行反应24h，分别得到含有巧克力微杆菌磁性细胞的反应液和含有巧克力微杆菌游离细胞的反应液；
上述所得的含有巧克力微杆菌磁性细胞的反应液通过磁铁分离，上清液取样后用HPLC测定(4S, 5R)-半酯含量并计算转化率，巧克力微杆菌磁性细胞用适量磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH8.0)洗涤三次后用于下一批次巧克力微杆菌磁性细胞催化生物素二甲酯水解生成(4S, 5R)-半酯的反应，具体步骤同上，如此将巧克力微杆菌磁性细胞循环利用10次；每一次反应结束后计算巧克力微杆菌磁性细胞催化生物素二甲酯水解生成(4S, 5R)-半酯的转化率，其结果见图2中的固定化细胞曲线所示；
上述所得的含有巧克力微杆菌游离细胞的反应液通过离心分离，上清液取样后用HPLC测定(4S, 5R)-半酯含量并计算转化率，巧克力微杆菌游离细胞用适量磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH 8.0)洗涤三次后用于下一批次巧克力微杆菌细胞催化生物素二甲酯水解生成(4S, 5R)-半酯的反应，具体步骤同上，如此将巧克力微杆菌游离细胞循环利用10次；每一次反应结束后计算巧克力微杆菌游离细胞催化生物素二甲酯水解生成(4S, 5R)-半酯的转化率，其结果见图2中的游离细胞曲线所示。
上述所得的含有巧克力微杆菌磁性细胞的反应液和含有巧克力微杆菌游离细胞的反应液中产物(4S, 5R)-半酯含量的检测方法为：
取离心分离后的上清液300μL，加入600μL甲醇，混匀后常温, 12000 rpm, 离心10min ，取上清液微孔滤膜过滤，高效液相色谱法分析。
采用反相液相色谱分析，采用岛津LC-20A液相色谱仪，色谱柱为C18柱，分析条件为流动相为甲醇：水=65：35，紫外检测波长210nm，流速1ml/min。
从图2中可以看出，相对于巧克力微杆菌游离细胞而言，巧克力微杆菌磁性细胞具有更好的操作稳定性。经过5次重复使用后，巧克力微杆菌游离细胞的转化率迅速下降，到反应到第10批时，转化率仅有10%左右，而此时巧克力微杆菌磁性细胞对底物生物素二甲酯的催化转化率仍有70%。由此表明了本发明的一种巧克力微杆菌磁性细胞具有更高的操作稳定性。
以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (7)

1.一种巧克力微杆菌磁性细胞，其特征在于所述的巧克力微杆菌磁性细胞通过如下步骤的方法制备而成：
（1）、利用壳聚糖和Fe3O4磁性纳米颗粒为原料制备壳聚糖包裹Fe3O4的磁性纳米材料；
（2）、培养巧克力微杆菌，然后将所得的巧克力微杆菌细胞离心洗涤后重新悬浮于缓冲溶液中，获得巧克力微杆菌细胞悬浮液；
（3）、将步骤（1）所得的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料加入到步骤（2）所得的巧克力微杆菌细胞悬浮液中，控制温度为30℃下，搅拌吸附10-600min，即得巧克力微杆菌磁性细胞。
2.如权利要求1所述的巧克力微杆菌磁性细胞，其特征在于其制备过程步骤（1）所述的壳聚糖包裹Fe3O4的磁性纳米材料的制备过程如下：
首先，将壳聚糖溶于质量百分比浓度为5%的醋酸水溶液中，待壳聚糖完全溶解后，加入Fe3O4颗粒，超声混合均匀后得到混合液；
然后，在强烈的搅拌下将所得的混合液分散于装有液体石蜡和司班80的容器中，在40℃下搅拌30min后加入质量百分比浓度为25%的戊二醛水溶液，机械快速搅拌反应4h后即得壳聚糖包裹Fe3O4磁性纳米材料粗品；
最后，用石油醚充分超声洗涤所得的壳聚糖包裹Fe3O4磁性纳米材料粗品，每次用磁铁分离，并用丙酮洗涤脱水，再用乙醇和蒸馏水各洗涤3次，即得纯化的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料；
所述的壳聚糖、质量百分比浓度为5%的醋酸水溶液、Fe3O4颗粒、液体石蜡、司班80和质量百分比浓度为25%的戊二醛水溶液的用量，按壳聚糖：质量百分比浓度为5%的醋酸水溶液：Fe3O4颗粒：液体石蜡：司班80：质量百分比浓度为25%的戊二醛水溶液为0.2g：20ml：0.2g：40ml：5ml：3ml的比例计算；
所述的壳聚糖，其粘度为400-600mPa.s。
3.如权利要求1所述的一种巧克力微杆菌磁性细胞，其特征在于其制备过程步骤（2）中所述的巧克力微杆菌为产酯酶的巧克力微杆菌SIT101 CGMCC No.4436；
所述的巧克力微杆菌细胞悬浮液的制备过程如下：
取4℃保存的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum SIT101，CGMCC NO.4436)斜面菌种，挑取一环接种至装有50ml培养基的250ml摇瓶中，在30℃下，160rpm振摇培养48h，离心收获巧克力微杆菌细胞；
然后将上述所得的巧克力微杆菌细胞置于缓冲溶液中，即得细胞浓度为10g/L的巧克力微杆菌细胞悬浮液；
所述的培养基按每升计算，由葡萄糖15.0 g，酵母膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，MgSO4 1g和余量的水组成，pH7.0；
所述的缓冲溶液为浓度为0.1M的磷酸盐缓冲溶液，pH为7.0。
4.如权利要求1所述的一种巧克力微杆菌磁性细胞，其特征在于其制备过程步  骤（3）中所用的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料、巧克力微杆菌细胞悬浮液的量，按壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重：巧克力微杆菌细胞的干重：磷酸盐缓冲溶液为10～300g：10g：1L的比例计算。
5.如权利要求4所述的一种巧克力微杆菌磁性细胞，其特征在于所用的壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料、巧克力微杆菌细胞悬浮液的量，按壳聚糖包裹的Fe3O4磁性纳米材料的湿重：巧克力微杆菌细胞的干重：磷酸盐缓冲溶液为150～300g：10g：1L的比例计算。
6.如权利要求1、2、3、4或5所述的一种巧克力微杆菌磁性细胞用于催化内消旋二甲酯不对称水解反应生成(4S, 5R)-半酯。
7.如权利要求6所述的一种巧克力微杆菌磁性细胞用于催化内消旋二甲酯不对称水解反应生成(4S,5R)-半酯，其特征在于所述的巧克力微杆菌磁性细胞在水相中能连续10批次催化内消旋二甲酯不对称水解反应生成(4S, 5R)-半酯的反应。
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