CN108642038A - 一种兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶及其制备方法 - Google Patents

一种兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶及其制备方法，该凝胶固定化酶既具备酶的催化反应活性，又有抗菌性，酶催化反应过程中不易染菌。此外，该凝胶固定化酶易回收，便于重复使用。

Description

一种兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶及其制备方法，属于酶的固定化领域。
背景技术
固定化酶与游离酶相比具有稳定性高、易从反应系统中分离、能重复使用、利于实现自动化生产等优点，因此获得性能优异的固定化酶对实现工业环境下酶的高效利用，促进生物催化产业的快速发展具有重要意义。交联酶聚集体是一种无载体固定化酶，其制备原理为：向酶液中添加盐、有机溶剂、非离子聚合物等沉淀剂，可以使酶蛋白通过非共价键形成超分子结构－不溶性的物理聚集体，然后再利用交联剂对聚集体进行共价捆绑，就得到交联酶聚集体。交联酶聚集体单位酶活高，对高温、有机溶剂、酸碱、金属离子等具有较高的耐受性，但是交联酶聚集体机械强度差，粒径较小（通常为微米级）、不易回收，外观为无定形结构，限制了其在工业上的应用。此外，交联酶聚集体等固定化酶在溶液中长时间连续使用时，因催化反应条件通常适于微生物生长，反应过程中容易染菌，严重影响催化反应效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶，易回收，便于重复使用，反应过程中不易染菌；还提供该凝胶固定化酶的制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶，该凝胶固定化酶含有交联酶聚集体和具有抗菌功能的纳米粒子。其制备方法为：先制备出交联酶聚集体，然后将其与能够形成凝胶但尚未形成凝胶的聚合物以及具有抗菌功能的纳米粒子混匀，得到混合物，对混合物进行凝胶化处理。
所述凝胶固定化酶还含有磁性物质。其制备方法为：先制备出交联酶聚集体，然后将其与能够形成凝胶但尚未形成凝胶的聚合物、磁性物质以及具有抗菌功能的纳米粒子混匀，得到混合物，对混合物进行凝胶化处理。
作为优选的，所述的聚合物为海藻酸钠。
作为优选的，所述的聚合物为壳聚糖。
本发明的优点和积极效果是：
1．将交联酶聚集体包含于凝胶内，因凝胶具有一定强度和固定形态，易回收，便于连续使用，克服了单纯交联酶聚集体机械稳定性差、不易回收重复使用的缺陷。
2．本发明的凝胶固定化酶既具备交联酶聚集体的催化反应活性，又有抗菌功能，可解决酶催化反应过程中的染菌问题。
3．本发明的凝胶固定化酶含有磁性物质时，可以利用外部磁场从不溶性底物或产物反应体系中分离回收。
附图说明
图1为凝胶固定化酶的抗菌效果。
图2为凝胶固定化酶的连续催化反应效果。
具体实施方式
结合实施例对本发明进一步说明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义。
按照下述方法制备兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶：先制备出交联酶聚集体，然后将交联酶聚集体与能够形成凝胶但尚未形成凝胶的聚合物以及具有抗菌功能的纳米粒子混匀，得到混合物，对混合物进行凝胶化处理；或者于所得混合物中再加入磁性物质后进行凝胶化处理。
交联酶聚集体的制备可以参考文献[Schoevaart R, Wolbers M W, GolubovicM, Ottens M, Kieboom A P, van Rantwijk F, van der Wielen L A, Sheldon R A.Preparation, optimization, and structures of cross-linked enzyme aggregates(CLEAs). Biotechnology and Bioengineering, 2004, 87(6):754-762.]。其中，酶包括但不限于蛋白酶、青霉素酰化酶、脲酶、果胶酶、乳糖酶、海藻糖合酶、葡萄糖异构酶、糖苷酶、淀粉酶、普鲁兰酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、漆酶、植酸酶、有机磷水解酶等或它们的组合物。
能够形成凝胶的聚合物包括但不限于明胶、果胶、琼脂、聚乙烯醇，海藻酸钠、卡拉胶、魔芋胶、壳聚糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺、硅胶等。可以只用一种聚合物，也可以将两种或两种以上聚合物共混使用。聚合物预先溶解后使用。例如，当聚合物为海藻酸钠时，用水溶解后使用；当聚合物为壳聚糖时，用乙酸溶液溶解后使用。
具有抗菌功能的纳米粒子包括但不限于纳米Ag、纳米Cu、纳米ZnO、纳米Ag-MgO、纳米Ag-Cu等。
磁性物质包括但不限于Fe3O4、γ-Fe2O3、MnFe2O3、CoFe2O4和NiFe2O4等磁性纳米粒子，可以自制，也可以购买。
混合物中交联酶聚集体与聚合物、磁性物质以及具有抗菌功能的纳米粒子的比例根据需要确定。
凝胶化处理是指采用物理或化学方法使所得含有聚合物的混合物变成具有一定形状的凝胶。根据混合物中所含聚合物的种类，采用相应的凝胶化处理方法。例如，当聚合物为壳聚糖时，可以用氢氧化钠或三聚磷酸钠作为胶凝剂使混合物变成凝胶；当聚合物为聚乙烯醇时，可以用硼砂或戊二醛作为胶凝剂或通过冻融使混合物变成凝胶。凝胶化处理过程中，当采用针头注射法、高压喷枪喷射法、气体剪切法、毛细管破碎法等方法将混合物以微小液滴形式加入到适宜浓度的胶凝剂溶液中时，可得凝胶微球。
实施例一
在本实施例中，使用的酶为海藻糖合酶，使用的聚合物为壳聚糖，使用的具有抗菌功能的纳米粒子为纳米Ag。
用50mmol/L、pH7.0的磷酸缓冲液配制5mL海藻糖合酶溶液，其蛋白含量为5mg/mL，于酶液中加入葡萄糖，使葡萄糖终浓度为2%（w/v），逐步加入1.2g的PEG 6000，待PEG溶解后，加入戊二醛，戊二醛终浓度为0.2%（v/v），充分混匀后于25℃交联反应2h，然后于3000r/min离心20min，所得沉淀以10mmol/L、pH7.0的磷酸缓冲液离心清洗3次后，即得海藻糖合酶的交联酶聚集体，将其悬浮于5mL水中备用。
于乙酸溶液配制的壳聚糖溶液中加入硝酸银溶液，壳聚糖终浓度为1%（w/v），乙酸终浓度为2%（v/v），硝酸银终浓度为20mM，然后进行微波处理，微波处理条件为微波功率700W，微波辐射10秒，间歇20秒，微波处理6分钟后即得含有纳米Ag的溶液。
将1mL所得交联酶聚集体悬浮液与一定量壳聚糖溶液和纳米Ag溶液混合，得4mL混合物，混合物中壳聚糖终浓度为2%（w/v），纳米Ag终浓度为2mM。将混合物用注射器逐滴加入到40mL、5%（w/v）三聚磷酸钠溶液中，磁力搅拌，待微球成形后静置固化1小时，用水清洗，即得兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶。该凝胶固定化酶外形为凝胶微球，具有海藻糖合酶的催化活性。
实施例二
制备方法同实施例一，只是于所得4mL混合物中再加入0.02g的Fe3O4磁粉，所得凝胶固定化酶可以利用外部磁场分离回收。
实施例三
在本实施例中，使用的酶为β-葡萄糖苷酶，使用的聚合物为海藻酸钠，使用的具有抗菌功能的纳米粒子同实施例一。
用水配制β-葡萄糖苷酶溶液5mL，其蛋白含量为10mg/mL，于酶液中逐步加入1.5g的PEG 6000，待PEG溶解后，加入戊二醛，戊二醛终浓度为0.5%（v/v），充分混匀后于25℃交联反应2h，然后于3000r/min离心20min，所得沉淀离心清洗，即得β-葡萄糖苷酶的交联酶聚集体，将其悬浮于5mL水中备用。
将1mL所得交联酶聚集体悬浮液与一定量海藻酸钠水溶液和纳米Ag溶液混合，得4mL混合物，混合物中海藻酸钠终浓度为2%（w/v），纳米Ag终浓度为5mM。将混合物用注射器逐滴加入到40mL、3%（w/v）的氯化钙溶液中，磁力搅拌，待微球成形后静置固化1小时，用水清洗，即得兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶。该凝胶固定化酶外形为凝胶微球，具有β-葡萄糖苷酶的催化活性。
测试例及测试结果：
以实施例一制备得到的凝胶固定化酶为样品进行性能测试。
1．凝胶固定化酶的抗菌性
于100mL三角瓶中装入20mL大肠杆菌液体培养基，加入1mL预先培养好的大肠杆菌菌液，加入1g实施例一制备的凝胶固定化酶，置摇床中，30℃、150r/min条件下培养24h，结果见图1的左图。另取1g不含有纳米Ag的凝胶固定化酶（制备方法同实施例一，只是不添加纳米Ag）作为对照，实验方法同上，结果见图1的右图。
在图1的左图中大肠杆菌生长被严重抑制，培养液仍澄清；在图1的右图中，凝胶固定化酶不含有纳米Ag，大肠杆菌繁殖旺盛，培养液浑浊。说明实施例一制备的凝胶固定化酶具有显著的抗菌性。
2．凝胶固定化酶的连续催化反应效果
以实施例一制备的凝胶固定化酶为催化剂，以实施例一制备的交联酶聚集体为对照催化剂，以5%（w/v）的麦芽糖为底物，于50℃下进行酶促反应，两种催化剂按相同海藻糖合酶活性添加。反应24小时后，用高效液相色谱法测定生成的海藻糖含量，计算反应转化率，回收相应催化剂，清洗，重新进行反应，如此反应10批次。
按下述方法测定海藻糖合酶活性：将lmL或1g固定化酶加入到lmL以10mmol/L、pH7.0的磷酸缓冲液配制的20%（w/v）的麦芽糖溶液中，混匀后，将该混合物溶液于60℃保温60min，离心取上清液，用高效液相色谱法测定生成的海藻糖含量。酶活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟转化麦芽糖生成lμmol海藻糖所需的酶量为l单位。
高效液相色谱法测定海藻糖的条件如下：
色谱柱：Hypersil NH2，4.6mm×250mm，填料粒径5μm；检测器：示差折光检测器；流动相：乙腈/水＝75/25（v/v）；柱温：室温；进样量：20μL；流速：1.0mL/min。
反应转化率定义为海藻糖的生成量与起始麦芽糖添加量的百分比。
结果表明，交联酶聚集体和凝胶固定化酶第1次反应时转化率分别为52%和50%，但反应第10批时，交联酶聚集体的反应转化率约为30%，下降了22%，而凝胶固定化酶的反应转化率为41%，仅下降了9%（见图2）。此外，交联酶聚集体在连续反应第6次时，反应液略浑浊有异味，出现染菌现象。说明尽管两种催化剂第1次反应时酶活性相同、反应转化率接近，但是在重复使用过程中，交联酶聚集体因机械稳定性差、不易回收，回收清洗时酶活损失较大，并且由于染菌影响了催化效果，因此反应转化率下降较大。而凝胶固定化酶稳定性好、易回收，回收清洗时酶活损失小，并且因具有抗菌性，避免了反应过程中的染菌问题，反应转化率下降不大，具有更好的重复使用性能。

Claims (6)

1.一种兼具催化与抗菌功能的凝胶固定化酶，其特征是该凝胶固定化酶含有交联酶聚集体和具有抗菌功能的纳米粒子。
2.权利要求1所述的凝胶固定化酶，其特征是该凝胶固定化酶还含有磁性物质。
3.权利要求1所述的凝胶固定化酶的制备方法，其特征是：先制备出交联酶聚集体，然后将其与能够形成凝胶但尚未形成凝胶的聚合物以及具有抗菌功能的纳米粒子混匀，得到混合物，对混合物进行凝胶化处理。
4.权利要求2所述的凝胶固定化酶的制备方法，其特征是：先制备出交联酶聚集体，然后将其与能够形成凝胶但尚未形成凝胶的聚合物、磁性物质以及具有抗菌功能的纳米粒子混匀，得到混合物，对混合物进行凝胶化处理。
5.权利要求3和4所述的制备方法，其中所述的聚合物为海藻酸钠。
6.权利要求3和4所述的制备方法，其中所述的聚合物为壳聚糖。
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