CN108451924B - 一步吸附法制备蛋白质微胶囊的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种一步吸附法制备蛋白质微胶囊的方法，属于生物材料领域。其特点在于：利用多酚掺杂碳酸钙微米颗粒，在温和的条件下吸附蛋白质，再将吸附在颗粒表面的蛋白质进行交联，最后去除碳酸钙，得到蛋白质微胶囊。本发明的优点是制备微胶囊使用的蛋白质具有广泛的普适性，且制备微胶囊无需进行多次组装，工艺简单，制备高效，条件温和，不易引入杂质。此外，制备的蛋白质微胶囊具有良好的生物相容性和可生物降解性，在医药方面具有良好的研究与应用前景。

Description

一步吸附法制备蛋白质微胶囊的方法
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种蛋白质微胶囊的制备方法，特别是指一步吸附法制备蛋白质微胶囊的方法。
背景技术
层层自组装（LBL）是上世纪90年代快速发展起来的一种简易、多功能的表面修饰方法。该技术最初是利用带电基板在带相反电荷的聚电解质溶液中交替沉积制备聚电解质自组装多层膜。随着它在制膜方面的发展，使其具有以下优点：1、组装材料的选择范围广泛，可以是聚电解质，也可以是蛋白质、多糖、DNA等带荷电的生物活性大分子；2、制备工艺简单，通过简单的交替浸涂即可在材料表面组装纳米、亚微米尺度的有规结构膜层；3、制备条件温和，在常温水溶液中即可进行，如此可以最大限度地保证生物分子具有维持生物活性的天然构象；此外，该方法还有适用的基体材料种类多、对基体材料的体型结构适应性强、并可在具有复杂型结构的装置和材料上实现组装等优点。
碳酸钙是一种非常重要的新型无机材料，具有材料来源易得、价格低廉、安全无毒、无臭无味、环境友好、应用广泛，材料分散性良好等优点，目前已被广泛地应用于工农业等多个领域，如橡胶、塑料、涂料、油漆、油墨、电缆、饲料、纺织、陶瓷、密封剂、胶粘剂、杀虫剂、农药载体和烟道除硫、水处理以及食品、制糖、制药、卫生用品等各个方面。
将安全易得的碳酸钙材料与LBL技术结合，实现医药载体领域的新应用。
此法以碳酸钙为模板，利用LBL技术在其表面组装薄膜，再加入稀酸分解或乙二胺四乙酸（EDTA）络合钙离子，去除CaCO3胶体粒子制备微胶囊载体。制备得到的载体生物毒性低，且可以达到高效地包载药物，保护药物疗效的同时，有效实现药物的缓释。尤其选用生物大分子作为胶囊材料（比如蛋白质等），制备的载体可以具备良好的生物相容性和生物可降解性。
文献[Velmurugan P, Singam E R A, Jonnalagadda R R, et al.Investigation on interaction of tannic acid with type I collagen and itseffect on thermal, enzymatic, and conformational stability for tissueengineering applications[J]. Biopolymers, 2014, 101(5): 471-483.]和文献[Edelmann A, Lendl B. Toward the Optical Tongue: Flow-Through Sensing ofTannin-Protein Interactions Based on FTIR Spectroscopy[J]. Journal of theAmerican Chemical Society, 2002, 124(49): 14741-14747.]均表明，多酚和蛋白质有很好的相互作用。而文献[Maria V. Lomova, Anna I. Brichkina, Maxim V. Kiryukhin,et al. Multilayer Capsules of Bovine Serum Albumin and Tannic Acid forControlled Release by Enzymatic Degradation[J]. ACS Applied materials &interfaces, 2015, 7 (22), pp 11732-11740]表明，以碳酸钙为模板，可以采用牛血清蛋白和多酚材料制备胶囊，且该胶囊可被特定的酶降解。可见，利用蛋白质作为材料制备载体胶囊具有重大意义。
然而，层层自组装技术在具体制备蛋白质微胶囊时，需要根据组装层数进行多次组装和清洗，操作步骤繁琐且耗时，工艺难度较大且损耗较多。目前国内外在温和条件下，一步吸附法制备蛋白质胶囊的研究还没有报道。
发明内容
本发明的主要目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种无需进行多次自组装、制备效率高的一步吸附法制备蛋白质微胶囊的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案是一步吸附法制备蛋白质微胶囊，其特征在于包括以下步骤：
（1）多酚掺杂碳酸钙颗粒的制备：在10～40℃下，将浓度为0.1～1M的钙盐溶液和浓度为2～50mg/mL的多酚溶液混合，搅拌均匀，之后剧烈搅拌或超声摇晃下，快速加入与钙盐溶液等摩尔量的碳酸盐溶液，搅拌或超声摇晃30～60秒，静置10～30分钟，离心，用超纯水洗涤，并收集该多酚掺杂碳酸钙颗粒；
（2）蛋白质的吸附：将第（1）步制备的颗粒至于离心管中，加入0.1～20mg/mL的蛋白质溶液，并调节其缓冲溶液pH为6.2～11.0之间，在4～40℃下孵育0.5～12小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，得到表面吸附蛋白质的颗粒；
（3）蛋白质的交联：将第（2）步制备的吸附蛋白质的颗粒用相同缓冲溶液重新分散于离心管中，加入4～60mg/mL的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶液，室温下孵育2～12小时，离心，用水洗涤；
（4）去核：将第（3）步制备的蛋白质交联的颗粒，加入0.01～0.1M盐酸或者0.05～0.5M的乙二胺四乙酸二钠溶液孵育，离心，用超纯水洗涤，得到蛋白质微胶囊。
进一步设置是所述第（1）步中的多酚包括：单宁酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸或多巴胺中任意一种或多种。
进一步设置是所述第（1）步中的钙盐包括氯化钙或硝酸钙；碳酸盐包括碳酸氢铵、碳酸钠或碳酸钾中的任意一种或多种。
进一步设置是所述第（1）步中钙盐溶液、多酚和碳酸盐溶液的体积比为：（0.5～1.5）：（1～3）：（2～4）。
进一步设置是所述第（1）步中剧烈搅拌速度在400～1500转/分钟；超声频率是指频率在20～60kHz。
进一步设置是所述第（2）步中蛋白质包括：溶菌酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、明胶、免疫球蛋白G、卵清蛋白、葡萄糖氧化酶、大豆蛋白、牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、淀粉酶、过氧化氢酶、猪胃蛋白酶或蚕丝蛋白中的任意一种或多种。
进一步设置是所述第（1）步中所收集的多酚掺杂碳酸钙颗粒、第（2）步中所加入的蛋白质、第（3）步中所加入的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐的质量比为（0.5～1.5）：（0.02～3）：（1.5～5）。
进一步设置是所述方法制备的蛋白质微胶囊，其大小分布窄，直径为1～6μm，且分散性良好。
综上所述，本发明的优点是：
（1）制备工艺无需多步层层自组装，利用蛋白质与多酚之间的强相互作用力，只需要一步吸附就能在多酚修饰的碳酸钙颗粒外形成蛋白质层，交联蛋白质层后，再去除碳酸钙，即可获得蛋白质微胶囊。制备工艺简单，高效，条件温和，且不易引入杂质。
（2）制备胶囊的蛋白质可采用酸性蛋白质、中性蛋白质或碱性蛋白质，甚至可以选择单一蛋白质或多种蛋白质的复合物。因此，该方法在制备不同种类的蛋白质微胶囊方面，具有很好的普适性。
（3）制备胶囊的囊壁材料为蛋白质。因此，利用该方法制备的蛋白质微胶囊，具有良好的生物相容性和可生物降解性。在医药方面具有良好的研究与应用前景。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1是一步吸附法制备蛋白质微胶囊的制备示意图。
图2是实施例1中单宁酸掺杂碳酸钙颗粒的扫描电镜图。
图3是实施例1一步吸附法制备的牛血清白蛋白微胶囊的扫描电镜图。
图4是实施例2一步吸附法制备的甲状腺球蛋白微胶囊的扫描电镜图。
图5是实施例3一步吸附法制备的明胶微胶囊的扫描电镜图。
图6是实施例4一步吸附法制备的α-胰凝乳蛋白酶微胶囊的扫描电镜图。
图7是实施例5一步吸附法制备的卵白蛋白微胶囊的扫描电镜图。
图8是实施例6一步吸附法制备的溶菌酶微胶囊的扫描电镜图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
实施例1
在25℃下，将1mL浓度为1M的氯化钙溶液和2mL浓度为2.5mg/mL的单宁酸溶液搅拌均匀，调节转速为1200转/分钟后，快速加入3mL浓度为0.33M碳酸钠溶液，搅拌30s，静置10min，离心，用超纯水洗涤三次，得到单宁酸掺杂碳酸钙颗粒。
将收集的单宁酸掺杂的碳酸钙颗粒在烘箱中60℃过夜烘干，采用扫描电子显微镜（FESEM, SU8010 HITACHI，下同）观察颗粒形貌，见图2所示。
将收集的颗粒至于离心管中，加入15mL浓度为20mg/mL的牛血清白蛋白溶液，调节其缓冲溶液pH=9.5，在20℃下孵育2小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，重新分散于离心管中，加入10mL浓度为60mg/mL的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶液，孵育3小时，离心，超纯水洗涤三次。
用0.2M的乙二胺四乙酸二钠溶液浸渍5小时，离心，用超纯水洗涤，得到牛血清白蛋白的微胶囊，如图3所示。
实施例2
在15℃下，将1mL浓度为0.1M的硝酸钙溶液和2mL浓度为2mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯溶液混合，搅拌均匀，调节转速为450转/分钟后，快速加入3mL浓度为0.033M的碳酸钾溶液，搅拌35s，静置10min，离心，用超纯水洗涤三次，得到表没食子儿茶素没食子酸酯掺杂碳酸钙颗粒。
将颗粒至于离心管中，加入20mL浓度为0.1mg/mL的甲状腺球蛋白溶液，调节其缓冲溶液pH=7.0，在25℃下孵育6小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，重新分散于离心管中，加入10mL浓度为20mg/mL的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶液，孵育6小时，离心，超纯水洗涤三次。
用0.01M盐酸浸渍5小时，离心，用超纯水洗涤，得到甲状腺球蛋白的微胶囊，如图4所示。
实施例3
在20℃下，将1mL浓度为0.33M的氯化钙和2mL浓度为10mg/mL的单宁酸溶液混合，搅拌均匀，调节超声频率为20kHz后，快速加入3mL浓度为0.33M碳酸氢铵溶液，超声摇晃40s，静置20min，离心，超纯水洗涤三次，得到单宁酸掺杂碳酸钙颗粒。
将收集的颗粒至于离心管中，加入20mL浓度为10mg/mL的明胶溶液，调节其缓冲溶液pH=8.0，在15℃下孵育4小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，重新分散于离心管中，加入80mL浓度为5mg/mL的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶液，孵育2小时，离心，超纯水洗涤三次。
用0.05M盐酸浸渍5小时，离心，用超纯水洗涤，得到明胶的微胶囊，如图5所示。
实施例4
在30℃下，将1mL浓度为0.33M的硝酸钙溶液和2mL浓度为50mg/mL的单宁酸溶液混合，搅拌均匀，调节转速为650转/分钟后，快速加入3mL浓度为0.33M碳酸钠溶液，搅拌45s，静置20min，离心，用超纯水洗涤三次，得到单宁酸掺杂碳酸钙颗粒。
将收集的颗粒至于离心管中，加入20mL浓度为3mg/mL的α-胰凝乳蛋白酶溶液，调节其缓冲溶液pH=7.5，在4℃下孵育12小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，重新分散于离心管中，加入40mL浓度为4mg/mL的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶液，孵育4小时，离心，超纯水洗涤三次。
用0.05M的乙二胺四乙酸二钠溶液浸渍5小时，离心，用超纯水洗涤，得到α-胰凝乳蛋白酶的微胶囊，如图6所示。
实施例5
在10℃下，将1mL浓度为1M的氯化钙溶液和2mL浓度为50mg/mL的没食子酸溶液混合，搅拌均匀，调节超声频率为60kHz后，快速加入3mL浓度为0.33M的碳酸钾溶液，超声摇晃30s，静置25min，离心，用超纯水洗涤三次，得到没食子酸掺杂碳酸钙颗粒。
将收集的颗粒至于离心管中，加入20mL浓度为1mg/mL的卵白蛋白溶液，调节其缓冲溶液pH=6.2，在10℃下孵育8小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，重新分散于离心管中，加入10mL浓度为40mg/mL的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶液，孵育12小时，离心，超纯水洗涤三次。
用0.5M的乙二胺四乙酸二钠溶液浸渍6小时，离心，用超纯水洗涤，得到卵白蛋白的微胶囊，如图7所示。
实施例6
在40℃下，将1mL浓度为1M的硝酸钙溶液和2mL浓度为20mg/mL的1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖溶液混合，搅拌均匀，调节转速为1500转/分钟后，快速加入3mL浓度为0.33M的碳酸氢铵溶液，搅拌60s，静置30min，离心，用超纯水洗涤三次，得到1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖掺杂碳酸钙颗粒。
将收集的颗粒至于离心管中，加入20mL浓度为6mg/mL的溶菌酶溶液，调节其缓冲溶液pH=11，在40℃下孵育0.5小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，重新分散于离心管中，加入30mL浓度为20mg/mL的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶液，孵育8小时，离心，超纯水洗涤三次。
用0.1M盐酸浸渍5小时，离心，用超纯水洗涤，得到溶菌酶的微胶囊，如图8所示。
本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点开看，本发明的上述实验方案都只能认为是对本发明的说明，权利要求指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出发明的范围。因此，在与本发明的权利要求说明书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (8)

1.一步吸附法制备蛋白质微胶囊的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）多酚掺杂碳酸钙颗粒的制备：在10～40℃下，将浓度为0.1～1M的钙盐溶液和浓度为2～50mg/mL的多酚溶液混合，搅拌均匀，之后剧烈搅拌或超声摇晃下，快速加入与钙盐溶液等摩尔量的碳酸盐溶液，搅拌或超声摇晃30～60秒，静置10～30分钟，离心，用超纯水洗涤，并收集该多酚掺杂碳酸钙颗粒；
（2）蛋白质的吸附：将第（1）步制备的颗粒至于离心管中，加入浓度为0.1～20mg/mL的蛋白质溶液，并调节其缓冲溶液pH为6.2～11.0之间，在4～40℃下孵育0.5～12小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，得到表面吸附蛋白质的颗粒；
（3）蛋白质的交联：将第（2）步制备的吸附蛋白质的颗粒用相同缓冲溶液重新分散于离心管中，加入4～60mg/mL的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶液，室温下孵育2～12小时，离心，用水洗涤；
（4）去核：将第（3）步制备的蛋白质交联的颗粒，加入0.01～0.1M盐酸或者0.05～0.5M的乙二胺四乙酸二钠溶液孵育，离心，用超纯水洗涤，得到蛋白质微胶囊。
2.根据权利要求1所述的一步吸附法制备蛋白质微胶囊的方法，其特征在于：所述第（1）步中的多酚包括：单宁酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸或多巴胺中任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一步吸附法制备蛋白质微胶囊的方法，其特征在于：所述第（1）步中钙盐包括氯化钙或硝酸钙；碳酸盐包括碳酸氢铵、碳酸钠或碳酸钾中的任意一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一步吸附法制备蛋白质微胶囊的方法，其特征在于：所述第（1）步中钙盐、多酚和碳酸盐的溶液体积比为：（0.5～1.5）：（1～3）：（2～4）。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第（1）步中剧烈搅拌速度在450～1500转/分钟；超声频率是指频率在20～60kHz。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第（2）步中蛋白质包括：溶菌酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、免疫球蛋白G、卵清蛋白、葡萄糖氧化酶、明胶、大豆蛋白、牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、淀粉酶、猪胃蛋白酶或蚕丝蛋白中的任意一种或多种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第（1）步中所收集的多酚掺杂碳酸钙颗粒、第（2）步中所加入的蛋白质、第（3）步中所加入的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐的质量比为（0.5～1.5）：（0.02～3）：（1.5～5）。
8.一种如权利要求1～7之一所述方法所制备的蛋白质微胶囊，其特征在于：其大小分布窄，直径为1～6μm，且分散性良好。
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