CN108246214B - 一步吸附法制备多肽微胶囊的方法 - Google Patents

一步吸附法制备多肽微胶囊的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种一步吸附法制备多肽微胶囊的方法，属于生物材料领域。其特点在于：利用多酚掺杂碳酸钙微米颗粒，在温和的条件下吸附多肽，再将吸附在颗粒表面的多肽进行交联，最后去除碳酸钙，得到多肽微胶囊。本发明的优点是制备微胶囊的条件温和，无需进行多次自组装，工艺简单，制备高效，且不易引入杂质。此外，制备的多肽微胶囊具有良好的生物相容性和可生物降解性，有望在体内实现在特定位点对胶囊的降解以及药物的可控释放。因此，在医药载体方面具有潜在的研究与应用前景。

Description

一步吸附法制备多肽微胶囊的方法
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种多肽微胶囊的制备方法，特别是指一步吸附法制备多肽微胶囊的方法。
背景技术
层层自组装（LBL）是上世纪90年代快速发展起来的一种简易、多功能的表面修饰方法，最初利用带电基板在带相反电荷的聚电解质溶液中交替沉积制备聚电解质自组装多层膜。随着该技术在制膜方面的发展，组装材料的选择范围变得广泛，可以是聚电解质，也可以是多肽、多糖、DNA等带荷电的生物活性大分子；制备工艺简单，通过简单的交替浸涂技术，可在材料表面上实现纳米、亚微米尺度的有规结构设计；制备条件温和，可在常温水溶液中进行，可以保证生物分子具有维持生物活性的天然构象；此外，该方法适用的基体材料种类多，对基体材料的体型结构适应性强，并可在具有复杂体型结构的装置和材料上实现。
以碳酸钙为模板，利用LBL技术在其表面交替组装聚电解质薄膜，再加入稀酸分解或乙二胺四乙酸（EDTA）络合钙离子，去除CaCO3胶体粒子制备微胶囊。制备的载体胶囊生物毒性低，可以达到高效包载药物，保护药物疗效的同时，有效实现药物的缓释。此类药物载体由于具有诸多优点而备受各个研究领域的人员关注。
文献[Lomova M V, Brichkina A I, Kiryukhin M V, et al. Multilayercapsules of bovine serum albumin and tannic acid for controlled release byenzymatic degradation [J]. ACS applied materials & interfaces, 2015, 7(22):11732-11740]表明，胰蛋白酶可在赖氨酸和精氨酸的羧基处切断肽键，从而胶囊壁含有较多该种氨基酸组成的多肽将被快速降解，导致胶囊也因此破裂。而对于不同类型的蛋白而言，其所含氨基酸的种类和数量均有所不同，很难做到蛋白质组装的药物载体在特定蛋白酶的分解下单一降解。通过设计多肽的序列，利用多肽代替蛋白质制备药物载体，有望实现在体内不同位点，特定的蛋白酶作用载体而致其破裂，从而达到药物的特定区域释放。
然而，层层自组装技术在具体制备多肽微胶囊时，需要根据组装层数进行多次组装和清洗，操作步骤繁琐且耗时，工艺难度较大且损耗较多。目前国内外在温和条件下，对于一步吸附法制备多肽微胶囊的研究还没有报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种无需多次自组装、制备效率高的一步吸附法制备多肽微胶囊。
为实现上述目的，本发明的技术方案是一步吸附法制备多肽微胶囊的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）多酚掺杂碳酸钙颗粒的制备：在10～40℃下，将浓度为0.1～1M的钙盐溶液和浓度为2～50mg/mL的多酚溶液混合，搅拌均匀，之后剧烈搅拌或超声摇晃下，快速加入与钙盐溶液等摩尔量的碳酸盐溶液，搅拌或超声摇晃30～60秒，静置10～30分钟，离心,超纯水洗涤，收集多酚掺杂碳酸钙颗粒；
（2）多肽的吸附：将步骤（1）所得颗粒至于离心管中，加入2～10mg/mL的多肽溶液，通过调解缓冲溶液pH为6.2～11.0之间，在4～40℃下孵育0.5～12小时，离心，用该pH缓冲溶液洗涤，得到表面吸附多肽的颗粒；
（3）多肽的交联：将步骤（2）吸附了多肽的颗粒用相同pH缓冲溶液分散于离心管中，加入2～10mg/mL的京尼平溶液，室温下进行多肽交联2～12小时，离心，用超纯水洗涤；
（4）去核：将第（3）步制备的多肽交联的颗粒，加入0.01～0.1M盐酸或者0.05～0.5M的乙二胺四乙酸二钠溶液孵育，离心，用超纯水洗涤，得到多肽微胶囊。
进一步设置是所述步骤（1）中钙盐溶液、多酚和碳酸盐溶液的体积比为：（0.5～1.5）：（1～3）：（2～4）。
进一步设置是所述步骤（1）中的多酚包括：单宁酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸或多巴胺中一种或多种组合。
进一步设置是所述步骤（1）中钙盐包括氯化钙或硝酸钙；碳酸盐包括碳酸氢铵、碳酸钠或碳酸钾中的一种或多种组合。
进一步设置是所述步骤（1）中剧烈搅拌速度在400～1500转/分钟；超声频率是指频率在20～60kHz。
进一步设置是所述步骤（2）中多肽包括：聚鸟氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸的一种或多种组合。
进一步设置是所述步骤（3）中所加入的颗粒、多肽、京尼平的质量比为（0.5～1.5）：（0.1～2）：（0.1～0.4）。
进一步设置是所述方法制备的多肽微胶囊，其大小分布窄，直径为1～6μm，且分散性良好。
本发明的优点是：
（1）制备工艺无需多步层层自组装，利用多肽与多酚之间的相互作用力，只需要一步吸附就能在多酚修饰的碳酸钙颗粒外形成多肽层，交联多肽层后，去除内核，即可获得多肽微胶囊。制备工艺简单、高效、条件温和，且不易引入杂质。
（2）制备的囊壁为多肽的微胶囊，具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且可以控制特定酶对微胶囊的降解。
（3）制备的多肽胶囊具有很好的穿透细胞膜的能力，作为新的药物载体有良好的研究与应用前景。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1是一步吸附法制备多肽微胶囊的制备示意图。
图2是实施例1中单宁酸掺杂碳酸钙颗粒的扫描电镜图。
图3是实施例1一步吸附法制备的聚赖氨酸微胶囊的扫描电镜图。
图4是实施例2一步吸附法制备的聚鸟氨酸微胶囊的扫描电镜图。
图5是实施例3一步吸附法制备的聚精氨酸微胶囊的激光扫描共聚焦显微镜图。
图6是实施例4一步吸附法制备的聚组氨酸微胶囊的激光扫描共聚焦显微镜图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
在25℃下，将1mL浓度为1M的氯化钙溶液和2mL浓度为2mg/mL的单宁酸溶液搅拌均匀，调节转速为1200转/分钟后，快速加入3mL浓度为0.33M碳酸钠溶液，搅拌30s，静置10min，离心，用超纯水洗涤三次，得到单宁酸掺杂碳酸钙颗粒。
将收集的单宁酸掺杂的碳酸钙颗粒在烘箱中60℃过夜烘干，采用扫描电子显微镜（FESEM, SU8010 HITACHI，下同）观察颗粒形貌，见图2所示。
将收集的颗粒至于离心管中，加入10mL浓度为2mg/mL的聚赖氨酸溶液，调节其缓冲溶液pH=8.0，在20℃下孵育2小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，并重新分散于离心管中，加入10mL浓度为2mg/mL的京尼平溶液（pH=8.0），孵育5小时，离心，超纯水洗涤三次。
用0.5M的乙二胺四乙酸二钠溶液浸渍8小时，离心，用超纯水洗涤，得到聚赖氨酸的微胶囊，其扫描电子显微镜照片如图3所示。
实施例2
在10℃下，将1mL浓度为1M的硝酸钙溶液和2mL浓度为5mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯溶液混合，搅拌均匀，调节转速为450转/分钟后，快速加入3mL浓度为0.33M的碳酸钾溶液，超声摇晃35s，静置10min，离心，用超纯水洗涤三次，得到单宁酸掺杂碳酸钙颗粒。
将颗粒至于离心管中，加入8mL浓度为5mg/mL的聚鸟氨酸溶液，调节其缓冲溶液pH=11.0，在40℃下孵育0.5小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，并重新分散于离心管中，加入5mL浓度为3mg/mL的京尼平溶液（pH=11.0），孵育8小时，离心，超纯水洗涤三次。
用0.01M盐酸浸渍15小时，离心，用超纯水洗涤，得到聚鸟氨酸的微胶囊，其扫描电子显微镜照片如图4所示。
实施例3
在20℃下，将1mL浓度为0.01M的氯化钙和2mL浓度为20mg/mL的单宁酸溶液混合，搅拌均匀，调节转速为900转/分钟后，快速加入3mL浓度为0.033M碳酸氢铵溶液，搅拌40s，静置30min，离心，超纯水洗涤三次，得到单宁酸掺杂碳酸钙颗粒。
将收集的颗粒至于离心管中，加入10mL浓度为10mg/mL的聚精氨酸溶液，调节其缓冲溶液pH=6.2，在30℃下孵育2小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，并重新分散于离心管中，加入3mL浓度为10mg/mL的京尼平溶液（pH=6.2），孵育2小时，离心，超纯水洗涤三次。
用0.1M盐酸浸渍4小时，离心，用超纯水洗涤，得到聚精氨酸的微胶囊，其激光共聚焦显微镜（Nikon，A1，下同）照片如图5所示。
实施例4
在40℃下，将1mL浓度为0.33M的硝酸钙溶液和2mL浓度为50mg/mL的单宁酸溶液混合，搅拌均匀，调节转速为650转/分钟后，快速加入3mL浓度为0.33M碳酸钠溶液，搅拌60s，静置20min，离心，用超纯水洗涤三次，得到单宁酸掺杂碳酸钙颗粒。
将收集的颗粒至于离心管中，加入8mL浓度为8mg/mL的聚组氨酸溶液，调节其缓冲溶液pH=9.0，在4℃下孵育12小时，离心，用该缓冲溶液洗涤，并重新分散于离心管中，加入5mL浓度为5mg/mL的京尼平溶液（pH=9.0），孵育12小时，离心，超纯水洗涤三次。
用0.05M的乙二胺四乙酸二钠溶液浸渍15小时，离心，用超纯水洗涤，得到聚组氨酸的微胶囊，其激光共聚焦显微镜照片如图6所示。
本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点开看，本发明的上述实验方案都只能认为是对本发明的说明，权利要求指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出发明的范围。因此，在与本发明的权利要求说明书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (8)

1.一步吸附法制备多肽微胶囊的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）多酚掺杂碳酸钙颗粒的制备：在10～40℃下，将浓度为0.1～1M的钙盐溶液和浓度为2～50mg/mL的多酚溶液混合，搅拌均匀，之后剧烈搅拌或超声摇晃下，快速加入与钙盐溶液等摩尔量的碳酸盐溶液，搅拌或超声摇晃30～60秒，静置10～30分钟，离心，超纯水洗涤，收集多酚掺杂碳酸钙颗粒；
（2）多肽的吸附：将步骤（1）所得颗粒至于离心管中，加入2～10mg/mL的多肽溶液，通过调解缓冲溶液pH为6.2～11.0之间，在4～40℃下孵育0.5～12小时，离心，用该pH缓冲溶液洗涤，得到表面吸附多肽的颗粒；
（3）多肽的交联：将步骤（2）吸附了多肽的颗粒用相同pH缓冲溶液分散于离心管中，加入2～10mg/mL的京尼平溶液，室温下进行多肽交联2～12小时，离心，用超纯水洗涤；
（4）去核：将第（3）步制备的多肽交联的颗粒，加入0.01～0.1M盐酸或者0.05～0.5M的乙二胺四乙酸二钠溶液孵育，离心，用超纯水洗涤，得到多肽微胶囊。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中钙盐、多酚和碳酸盐的溶液体积比为：（0.5～1.5）：（1～3）：（2～4）。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的多酚包括：单宁酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸或多巴胺中一种或多种组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中钙盐包括氯化钙或硝酸钙；碳酸盐包括碳酸氢铵、碳酸钠或碳酸钾中的一种或多种组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中剧烈搅拌速度在450～1500转/分钟；超声频率是指频率在20～60kHz。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中多肽包括：聚鸟氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸的一种或多种组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的颗粒、所述步骤（2）中加入的多肽、所述步骤（3）中加入的京尼平的质量比为（0.5～1.5）：（0.1～2）：（0.1～0.4）。
8.一种如权利要求1～7之一所述方法所制备的多肽微胶囊，其特征在于：其大小分布窄，直径为1～6μm，且分散性良好。
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