CN107227301A - 磁性联合交联酶聚集体生物催化剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,在衍射角度2θ为30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°处有衍射峰。本发明制备方法简单,不需要特殊设备,工艺条件温和,操作方法简单,成本低,适合工业化。使用本发明的磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,用于不对称合成(R)‑3‑奎宁醇,可实现羰基还原和辅酶NADH/NAD+原位再生同时进行;同时能有效克服底物、辅酶和产物的扩散限制,催化活性好,催化效率高,同时大大缩短反应时间,经济价值明显。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种磁性联合交联酶聚集体生物催化剂及其制备方法和应用。
背景技术
(R)-3-奎宁醇(分子式C7H13NO,分子量为127.18,CAS号:25333-42-0)是合成阿地溴铵、索利那新和瑞伐托酯等药物的关键性手性中间体。目前工业上主要是利用手性催化剂,如:XylSkewphos/PICA-Ruthenium(II)复合物或BINAP/IPHAN-Ru(II)复合物等,不对称还原3-奎宁酮合成(R)-3-奎宁醇,但该化学合成方法需筛选手性配体;所使用的过渡金属价格昂贵、毒性较大、难以从产物中去除;而且制备的产物光学纯度较低,需进一步纯化。另一种方法是外消旋拆分,该方法的缺陷在于其理论产率最大只有50%。
相对于化学合成方法,基于酶的生物合成法具有底物特异性;高度化学选择性、区域选择性和立体选择性;反应条件温和;催化活性高;原子经济性好等独特优势。生物方法合成(R)-3-奎宁醇涉及两个过程:一是借助羰基还原酶利用NADH或NADPH将3-奎宁酮还原为(R)-3-奎宁醇;二是借助辅酶再生酶将氧化型NAD+或NADP+转化为还原型NADH或NADPH,实现双酶偶联不对称还原合成(R)-3-奎宁醇。具体过程如下:
生物催化不对称还原合成(R)-3-奎宁醇过程
无论是用野生型微生物全细胞还是重组微生物全细胞作为生物催化剂,由于细胞本身结构的限制,致使底物/产物、辅酶在细胞内外扩散受阻,导致生物转化时间长、催化效率低。而游离酶被认为是化学工业合成中最为有效的手性催化合成工具之一。但在实际的生产应用过程中,由于酶生物催化剂脱离酶所依赖的自然环境,致使其稳定性降低、催化活性低。尽管通过定向进化、基因重排和定点突变等生物分子工程技术能改善酶的稳定性和催化活性,但技术难道大、酶纯化成本高、回收过程复杂、易致产品污染、难以循环利用等问题严重阻碍了酶的商业化以及在工业领域的催化应用。
酶固定化技术既能有效克服游离酶生物催化剂的缺陷,又能提高酶的稳定性和催化活性,易于从反应混合物中分离和循环再利用,实现连续反应,降低生产成本(RobertDicosimo,Joseph Mcauliffe,Ayrookaran J.Pouloseb and Gregory Bohlmann,Industrial use of immobilized enzymes,Chem.Soc.Rev.,2013,42,6437-6474)。但基于载体的物理吸附、化学键结合和包埋等酶固定化方法:需使用高纯度的酶,致使生产成本增加;需使用无催化活性的载体,导致酶的体积活性、时空产率和催化产率降低。基于无载体的交联酶聚集体(CLEAs)是一种快速、简单和低成本的固定化方法:无需高纯度酶,生产成本降低;能直接从发酵液中一步实现纯化和固定化单酶(完成一步反应)或多酶(完成级联反应);能提高酶的长期操作稳定性和催化活性;能循环再利用。但是CLEAs质软、机械性能差、易聚集成块、难以过滤回收,这些缺陷都阻碍了CLEAs的工业化应用。
发明内容
为了解决现有技术中的问题,根据本发明的第一方面,本发明的目的在于提供一种磁性联合交联酶聚集体(combi-CLEAs)生物催化剂,该生物催化剂能用于催化级联反应、长期操作稳定性好、催化活性高、易于磁分离和可循环再利用。
本发明的目的是这样实现的:
一种磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,包含NADH依赖的3-奎宁酮还原酶(QNR)、葡萄糖脱氢酶(GDH)、氨基功能化的磁性纳米粒,其特征在于:在衍射角度2θ为30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°处有衍射峰。
根据本发明的一个实施方案,上述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂在波数为3316±4、2946±4、1659±4、1540±4、1092±4、799±4、583±4、463±4处有红外特征吸收峰。
根据本发明的一个实施方案,上述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂为球形颗粒,粒径为1.5±0.5μm。
根据本发明的一个实施方案,上述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂的酶负载量为5-15%。
根据本发明的一个实施方案,上述氨基功能化的磁性纳米粒为氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒,由以下方法制得:将磁性Fe3O4纳米颗粒用乙醇/水混合溶液分散,在20-80℃以400-1000r/min搅拌1.0-3.0小时。加浓氨水搅拌0.5-1.5小时,再加入适量四乙氧基硅烷,控制转速1000-2000r/min搅拌8-16小时,最后加入适量氨丙基三乙氧基硅烷,pH值8-11,转速1000-2000r/min搅拌8-16小时,然后磁性分离得到氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒。
根据本发明的一个实施方案,上述磁性Fe3O4纳米粒由以下方法制得:将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O以物质的量之比为2:1的比例溶于去离子水中,在氮气保护下以转速500-1500r/min机械搅拌0.5-1.0小时,再加入浓度为8-12M的NaOH溶液,以转速1000-2000r/min机械搅拌1-1.5小时,温度升至70-100℃,熟化0.5-2.0小时;降至室温,磁性分离得到磁性Fe3O4纳米颗粒。
根据本发明的第二方面,本发明的另一目的在于提供上述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂的制备方法。
根据本发明的一个实施方案,上述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂的制备方法,包括磁性Fe3O4纳米颗粒的制备、磁性Fe3O4纳米颗粒氨基功能化、磁性联合交联酶聚集体步骤,其特征在于:所述磁性Fe3O4纳米颗粒的制备为将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O以物质的量之比为2:1的比例溶于去离子水中,在氮气保护以转速500-1500r/min机械搅拌0.5-1.0小时,再加入浓度为8-12M的NaOH溶液,转速1000-2000r/min机械搅拌1-1.5小时,温度升至70-100℃,熟化0.5-2.0小时,降至室温,磁性分离得到磁性Fe3O4纳米颗粒;所述磁性Fe3O4纳米颗粒氨基功能化为将磁性Fe3O4纳米颗粒用乙醇/水混合溶液分散,在20-80℃以转速400-1000r/min搅拌1.0-3.0小时。加浓氨水搅拌0.5-1.5小时后,再加入适量四乙氧基硅烷,控制转速1000-2000r/min搅拌8-16小时,最后加入适量氨丙基三乙氧基硅烷,pH8-11,以转速1000-2000r/min搅拌8-16小时,然后磁性分离得到氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒;所述磁性联合交联酶聚集体为将氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒分散在含有QNR和GDH的磷酸盐缓冲溶液中,在4-25℃,转速400-800r/min搅拌0.5-1.0小时,然后加入沉淀剂,搅拌0.5-1.5小时,再加入戊二醛,以转速200-600r/min搅拌交联1-12h,分离即得。
根据本发明的一个实施方案,上述沉淀剂选自乙醇、异丙醇、饱和硫酸铵、丙酮、乙腈中的一种或几种组合;优选饱和硫酸铵。上述戊二醛的浓度为10-120mM,优选40mM。上述交联时间为1-12小时,优选8小时。
具体的说,一种磁性联合交联酶聚集体生物催化剂的制备方法,其特征在于,采用如下步骤:
步骤(1)
将物质的量比为2:1的FeCl3·6H2O(10.8116g)和FeCl2·4H2O(3.9762g)溶于100-200mL去离子水,氮气保护,转速500-1500r/min机械搅拌0.5-1.0小时;滴加10-30mL浓度为8-12M的NaOH溶液,转速1000-2000r/min机械搅拌1-1.5小时;升温至70-100℃,熟化0.5-2.0小时;降至室温,磁性分离并用去离子水洗涤3-5次,干燥,得磁性Fe3O4纳米颗粒;
步骤(2)
取步骤(1)制备的磁性Fe3O4纳米颗粒100-200mg,分散到体积比为5:2的140-280mL的乙醇/水溶液中,氮气保护,在20-80℃,转速400-1000r/min搅拌1.0-3.0小时;加入2-4mL浓氨水,搅拌0.5-1.5小时后,加入0.4-0.8mL的四乙氧基硅烷,转速1000-2000r/min搅拌8-16小时;滴加0.8-1.6mL氨丙基三乙氧基硅烷,pH 8-11,转速1000-2000r/min搅拌8-16小时;磁铁分离,去离子水洗涤3-5次,得氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒;
步骤(3)
取步骤(2)制备的氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒4-6mg,分散在1.6-2.4mL含有QNR(4.0mg/mL)和GDH(2.0mg/mL)的磷酸盐缓冲溶液(PBS,10mM,pH7.2-7.5)中,在4-25℃,转速400-800r/min搅拌0.5-1.0小时。加入7-12倍体积的冰冷的沉淀剂,搅拌0.5-1.5h;加入0.8-1.2mL的戊二醛,转速200-600r/min搅拌交联1-12h;磁分离,PBS洗3次,得磁性combi-CLEAs。
本发明磁性Fe3O4纳米颗粒的制备中去离子水及氢氧化钠溶液的用量由本领域普通技术人员根据实际情况确定;磁性Fe3O4纳米颗粒氨基功能化步骤中乙醇与水的比例、乙醇与水的用量、四乙氧基硅烷用量以及氨丙基三乙氧基硅烷用量均由本领域普通技术人员根据反应实际情况确定;磁性联合交联酶聚集体步骤中磷酸盐缓冲溶液的用量根据实际情况确定,同时QNR和GDH的用量根据实际情况确定。
根据本发明的第三方面,本发明的再一目的在于提供上述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂在合成(R)-3-奎宁醇中的应用。
根据本发明的第四方面,本发明的再一目的在于提供一种(R)-3-奎宁醇的合成方法,该方法使用上述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂进行酶催化反应,合成(R)-3-奎宁醇。
根据本发明的一个实施方案,一种(R)-3-奎宁醇的合成方法,其特征在于:
将磁性combi-CLEAs分散在PBS中,加入3-奎宁酮,葡萄糖、NAD+和NADH,在室温条件下,pH为7.2-8.0,以50~150rpm转速搅拌,生物转化时间为1-3h。
具体的,一种(R)-3-奎宁醇的生物催化合成方法,包括如下步骤:
步骤(1)
将物质的量比为2:1的FeCl3·6H2O(10.8116g)和FeCl2·4H2O(3.9762g)溶于100-200mL去离子水,氮气保护,转速500-1500r/min机械搅拌0.5-1.0小时。滴加10-30mL浓度为8-12M的NaOH溶液,转速1000-2000r/min机械搅拌1-1.5小时。升温至70-100℃,熟化0.5-2.0小时;降至室温,磁性分离并用去离子水洗涤3-5次,干燥,得磁性Fe3O4纳米颗粒;
步骤(2)
取步骤(1)制备的磁性Fe3O4纳米颗粒100-200mg,分散到体积比为5:2的140-280mL的乙醇/水溶液中,氮气保护,在20-80℃,转速400-1000r/min搅拌1.0-3.0小时。加入2-4mL浓氨水,搅拌0.5-1.5小时后,加入0.4-0.8mL的四乙氧基硅烷,转速1000-2000r/min搅拌8-16小时;滴加0.8-1.6mL氨丙基三乙氧基硅烷,pH 8-11,转速1000-2000r/min搅拌8-16小时;磁铁分离,去离子水洗涤3-5次,得氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒;
步骤(3)
取步骤(2)制备的氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒4-6mg,分散在1.6-2.4mL含有QNR(4.0mg/mL)和GDH(2.0mg/mL)的磷酸盐缓冲溶液(PBS,10mM,pH7.2-7.5)中,在4-25℃,转速400-800r/min搅拌0.5-1.0小时。加入7-12倍体积的冰冷的沉淀剂,搅拌0.5-1.5小时;加入0.8-1.2mL的戊二醛,转速200-600r/min搅拌1-12小时。磁分离,PBS洗3次,得磁性combi-CLEAs。
步骤(4)
取步骤(3)制备的combi-CLEAs生物催化剂40-60mg分散在含有:4-6mM 3-奎宁酮、7.2-10.8mM葡萄糖、0.04-0.06mM NAD+和0.04-0.06mM NADH的PBS中,总体积8-12mL;在4-25℃,pH 7.5-8.0,以转速50-200r/min搅拌,生物转化时间为1-3小时。
有益效果:
1、本发明提供一种磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,该催化剂在衍射角度2θ为30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°处有衍射峰;同时在波数3316±4、2946±4、1659±4、1540±4、1092±4、799±4、583±4、463±4处有红外特征吸收峰。经电镜扫描显示,本发明磁性联合交联酶聚集体生物催化剂具有凹凸不平的球形表面结构,粒径为1.5±0.5μm;热重分析显示,本发明磁性联合交联酶聚集体生物催化剂酶负载量高达5-15%。
2、本发明使用氨基功能化的磁性纳米粒联合交联酶聚集体固定化技术,从细胞裂解上清液中直接固定QNR和GDH,形成磁性combi-CLEAs生物催化剂,不需要高纯度的QNR和GDH,能一步完成靶酶的纯化和固定化;同时可通过磁性回收,制备与分离均不需要特殊设备,工艺条件温和,操作方便,成本低,适合工业化。
3、本发明磁性联合交联酶聚集体生物催化剂(combi-CLEAs)硬度适中,机械性能较好;易于磁分离,可循环利用;循环过程中无QNR和GDH泄露,长期操作稳定性好,适合工业化。
4、使用本发明的磁性combi-CLEAs生物催化剂,用于不对称合成(R)-3-奎宁醇,可实现羰基还原和辅酶NADH/NAD+原位再生同时进行;同时能有效克服底物、辅酶和产物的扩散限制,催化活性好,催化效率高。
5、使用本发明的磁性combi-CLEAs催化剂不对称合成(R)-3-奎宁醇,转化率为100%,收率高达70-85%,对映体值为100%,同时转化时间大大降低(1-3h),经济价值明显。本发明生物催化不对称合成(R)-3-奎宁醇所用介质为水,有利于节约资源,环境友好,符合绿色化学和可持续发展要求。
附图说明
图1是磁性combi-CLEAs的扫描电镜分析;
图2是磁性combi-CLEAs的红外光谱分析;
图3是磁性combi-CLEAs的粉末X衍射分析;
图4是磁性combi-CLEAs的热重分析;
图5是磁性combi-CLEAs的循环再利用;
图2-4中的磁性催化剂为本发明磁性联合交联酶聚集体生物催化剂。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述,在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。除特殊说明外,本发明所述份数均为重量份,所述百分比均为质量百分比。本发明所有原料及试剂均为市售产品,其中缓冲溶液PBS购至北京中杉金桥生物技术有限公司,pH值为7.4。本发明浓氨水,浓度22-25%。本发明所用羰基还原酶为NADH依赖的特异性的3-奎宁酮还原酶(QNR,Accession No:AB733448),辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶(GDH,Accession No:AY930464)。
实施例1
酶活性测定
QNR酶活性测定:
标准反应混合体系:缓冲溶液B(PBS,pH7.2-7.4),3μmol 3-奎宁酮,0.3μmolNADH,适量的酶QNR,总体积1mL。在λ=340nm处测定吸光度值变化。酶活性单位定义:25℃,1min内转化1μmol NADH所需的酶量。
GDH酶活性测定:
标准反应混合体系:缓冲溶液B(PBS,pH7.2-7.4),10μmol葡萄糖,1μmol NAD+,适量的酶GDH,总体积1mL。在λ=340nm处测定吸光度值变化。酶活性单位定义:25℃,1min内转化1μmol NAD+所需的酶量。
实施例2
磁性Fe3O4纳米颗粒的制备:
将物质的量比为2:1的FeCl3·6H2O(10.8116g)和FeCl2·4H2O(3.9762g)溶于100-200mL去离子水,氮气保护,转速500-1500r/min机械搅拌0.5-1.0小时。滴加10-30mL浓度为8-12M的NaOH溶液,转速1000-2000r/min机械搅拌1-1.5小时。升温至70-100℃,熟化0.5-2.0小时;降至室温,磁性分离并用去离子水洗涤3-5次,干燥,得磁性Fe3O4纳米颗粒;
磁性Fe3O4纳米颗粒氨基功能化:
取磁性Fe3O4纳米颗粒100-200mg,分散到体积比为5:2的140-280mL的乙醇/水溶液中,氮气保护,在20-80℃,转速400-1000r/min搅拌1.0-3.0小时。加入2-4mL浓氨水,搅拌0.5-1.5小时后,加入0.4-0.8mL的四乙氧基硅烷,转速1000-2000r/min搅拌8-16小时;滴加0.8-1.6mL氨丙基三乙氧基硅烷,pH 8-11,转速1000-2000r/min搅拌8-16小时;磁铁分离,去离子水洗涤3-5次,得氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒;
实施例3
联合交联固定QNR和GDH:
取实施例2制备的氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒5mg,分散在1.0mL含有QNR(4.0mg/mL)和GDH(2.0mg/mL)的磷酸盐缓冲溶液(PBS,10mM,pH7.2-7.5)中,在4℃,转速600r/min搅拌0.5小时。加入9倍体积的冰冷的沉淀剂(饱和硫酸铵),搅拌1.5小时。加入1.0mL浓度为40mM的戊二醛,转速400r/min搅拌8.0h。磁分离,PBS洗3次,得磁性combi-CLEAs。
对实施例3制备的磁性combi-CLEAs进行扫描电镜分析
将样品溶液滴加于洁净的盖玻片上,40℃真空干燥,喷金覆盖样品,用扫描电镜(SEM,S-3000N型)成像,分析结果见附图1。附图1为combi-CLEAs微球,呈现表面凹凸不平的球形。
对实施例3制备的磁性combi-CLEAs进行红外光谱分析
红外光谱分析:采用KBr压片法制备样品,范扫波长描围4000~400cm-1,底物和产品的红外光谱图见附图2,在波数为3316±4,、2946±4、1659±4、1540±4、1092±4、799±4、583±4、463±4处有红外特征吸收峰。
对实施例3制备的磁性combi-CLEAs进行粉末X衍射(XRD)分析
使用普析XD-2X-ray衍射仪测定样品晶体衍射峰,测试条件:Cu靶 电压30kV,电流15mA,扫描速度2°/min,步长0.02°,扫描范围5°to 50°,分析结果见附图3。从图3中可见:combi-CLEAs的XRD谱中,2θ在30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°处出现特征峰。
对实施例3制备的磁性combi-CLEAs进行热重分析(TGA)
使用Mettler 1100SF系统测定生物催化剂的酶负载量。将约2mg样品置于铝锅中,按20mL/min通入氮气,加热速度为15℃/min,扫描范围为30-600℃。TGA分析结果见附图4。根据失重计算,生物催化剂酶负载量为8.77%。
实验中发现,沉淀剂的种类、戊二醛浓度及联合交联固定QNR和GDH的时间对combi-CLEAs酶活性均有不同程度的影响。
参照实施例3的制备方法,考察不同种类沉淀剂(乙醇、异丙醇、丙酮、饱和硫酸铵、乙腈)对combi-CLEAs酶活性的影响,结果见表1。
表1不同沉淀剂对combi-CLEAs酶活性的影响
使用有机溶剂做沉淀剂,酶活性回收率低。当用饱和硫酸铵为沉淀剂时,QNR和GDH的活性回收率分别为104.0±0.7%和98.1±1.9%,对酶活性影响最小,活性回收率最高。本发明优选的沉淀剂为饱和硫酸铵。
参照实施例3的制备方法,考察戊二醛浓度对combi-CLEAs酶活性的影响,结果见表2。
表2不同戊二醛浓度对combi-CLEAs酶活性的影响
随戊二醛浓度增大,酶活性回收率增加。当浓度达到40mM时,QNR和GDH的活性回收率最高,超过40mM时,活性回收率有减小趋势。本发明优选的交联剂浓度为40mM。
参照实施例3的制备方法,考察交联时间(加入戊二醛后的反应时间)对combi-CLEAs酶活性的影响,考察结果见表3。
表3不同交联时间对combi-CLEAs酶活性的影响
戊二醛浓度为40mM,QNR和GDH的活性回收率随交联时间延长而增大,交联时间为8小时,QNR和GDH的活性回收率最高。本发明优选的交联时间为8小时。
实施例4
磁性combi-CLEAs催化不对称合成(R)-3-奎宁醇:
取50mg磁性combi-CLEAs分散在含有:5mM 3-奎宁酮、9mM葡萄糖、0.05mM NAD+和0.05mM NADH的PBS中,总体积10mL。在20℃,pH 7.5-8.0,以转速150r/min搅拌。选用流动相为V二氯甲烷/V甲醇=9/1,通过TLC监控反应,生物转化时间为2h。反应完成后,磁性分离回收催化剂。上清液用高浓度NaOH调节至pH值大于12,然后在80℃减压浓缩至总体积的1/4。加入等体积的正丁醇抽提3次,收集有机相,减压浓缩蒸干。在90℃,用甲苯溶解固体,难溶物趁热过滤,滤液冷却,有白色针状晶体出现,过滤,得白色固体。
对实施例4制备的白色固体进行红外光谱、1HNMR和质谱分析
红外光谱:1747cm-1左右的羰基特征峰消失,在3103cm-1出现羟基特征峰,表明3-奎宁酮被还原成3-奎宁醇;
1H-NMR(400MHz,DMSO)分析:δ4.946(s,1H),δ3.879(q,1H),δ2.531-3.164(m,6H),δ1.392-2.014(m,5H);
MR分析:产物的理论分子量为:127.18,质谱测定为:127)。
对实施例4制备的白色固体进构型分析
用Clarus580GC系统(Perkin Elmer,USA)测定对映体值,手性柱为(HYDRODEX-β-6-TBDM,25m×0.25mm×0.25μm,Macherey-Nagel),使用火焰离子检测器。从60℃程序升温至180℃,升温速度为5℃/min,保持3min.进样器和检查器的温度分别为220℃和250℃。以标准品(R)和(S)-奎宁醇做对照,测得产品的对映体值为100%,其构型R型。
实施例5
磁性combi-CLEAs的回收和循环再利用。
取50mg磁性combi-CLEAs分散在含有:5mM 3-奎宁酮、9mM葡萄糖、0.05mM NAD+和0.05mM NADH的PBS中,总体积10mL。在20℃,pH 7.5-8.0,以转速150r/min搅拌。TLC监控反应,反应完成后,磁性分离回收催化剂。直接用于下一次转化。发现本发明提供的生物催化剂可循环8次,单次循环的转化率和对映体值均为100%,结果见附图5。循环8次以后,催化效率明显降低。但在循环过程中,无QNR和GDH泄露。
实施例6
取实施例2制备的氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒4-6mg,分散在1.6-2.4mL含有QNR(4.0mg/mL)和GDH(2.0mg/mL)的磷酸盐缓冲溶液(PBS,10mM,pH7.2-7.5)中,在4-25℃,转速400-800r/min搅拌0.5-1.0小时。加入7-12倍体积的冰冷的沉淀剂,搅拌0.5-1.5h;加入0.8-1.2mL的戊二醛,转速200-600r/min搅拌交联2.0-12.0h。磁分离,PBS洗3次,得磁性combi-CLEAs。
使用实施例3的方法进行粉末X衍射(XRD)分析、红外光谱分析、扫描电镜分析及热重分析(TGA),结果显示实施例6制备的磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,在衍射角度2θ为30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°处有衍射峰;同时在波数为3316±4,、2946±4、1659±4、1540±4、1092±4、799±4、583±4、463±4处有红外特征吸收峰。经电镜扫描显示,本发明磁性联合交联酶聚集体生物催化剂具有凹凸不平的球形表面结构,粒径为1.5±0.5μm;热重分析显示,磁性联合交联酶聚集体生物催化剂酶负载量高达5-15%。
实施例7
取实施例6制备的combi-CLEAs生物催化剂40-60mg分散在含有:4-6mM 3-奎宁酮、7.2-10.8mM葡萄糖、0.04-0.06mM NAD+和0.04-0.06mM NADH的PBS中,总体积8-12mL;在4-25℃,pH 7.5-8.0,以转速50-200r/min搅拌,生物转化时间为1-3h。
使用实施例4或5的方法检测实施例7不对称合成(R)-3-奎宁醇的转化效果,结果显示,转化率为100%,收率高达70-85%,对映体值为100%。磁性combi-CLEAs的回收和循环再利用过程中,无QNR和GDH泄露。
实施例8
在不经过本发明生物催化剂处理,直接用表达QNR和表达GDH的重组大肠杆菌处理实验,以作对比。反应体系:0.1g混合湿细胞作生物催化剂,5mM 3-奎宁酮,9mM葡萄糖,0.05mM NAD+和0.05mM NADH,缓冲溶液B(PBS,pH7.2-7.4),总体积10mL。反应温度25℃,以100rpm连续搅拌,反应过程中控制pH在7.5-8.0.用TLC监控反应,流动相为V二氯甲烷/V甲醇=9/1。转化时间明显延长(5.5h),转化率为95%,对映体值100%,不能回收和循环利用。
本发明磁性联合交联酶聚集体生物催化剂用于不对称合成(R)-3-奎宁醇,与实施例8相比,不仅能回收和循环利用,还明显缩短反应时间,经济价值明显。同时本发明生物催化不对称合成(R)-3-奎宁醇所用介质为水,有利于节约资源,环境友好,符合绿色化学和可持续发展要求。
Claims (10)
1.一种磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,包含NADH依赖的3-奎宁酮还原酶(QNR)、葡萄糖脱氢酶(GDH)、氨基功能化的磁性纳米粒,其特征在于:所述生物催化剂在衍射角度2θ为30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°处有衍射峰。
2.如权利要求1所述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,其特征在于:所述生物催化剂在波数为3316±4, 、2946±4、1659±4、1540±4、1092±4、799±4、583±4、463±4处有红外特征吸收峰。
3.如权利要求1或2所述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,其特征在于:所述生物催化剂为球形颗粒,粒径为1.5±0.5μm。
4.如权利要求1或2所述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,其特征在于:所述生物催化剂的酶负载量为5-15%。
5.如权利要求1所述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,其特征在于,所述氨基功能化的磁性纳米粒为氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒,由以下方法制得:将磁性Fe3O4纳米颗粒用乙醇/水混合溶液分散,在20-80℃,转速400-1000r/min搅拌1.0-3.0小时,加入浓氨水搅拌0.5-1.5小时后,再加入四乙氧基硅烷,转速1000-2000r/min搅拌8-16小时,最后加入氨丙基三乙氧基硅烷,pH 8-11,转速1000-2000r/min搅拌8-16小时,然后分离得到氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒。
6.如权利要求1或5所述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂,其特征在于,所述磁性Fe3O4纳米颗粒由以下方法制得:将FeCl3∙6H2O和 FeCl2∙4H2O以物质的量之比为2:1的比例溶于去离子水中,在氮气保护下以转速500-1500 r/min机械搅拌0.5-1.0小时,然后加入浓度为8-12 M的NaOH溶液,转速1000-2000 r/min机械搅拌1-1.5小时;升温至70-100℃,熟化0.5-2.0小时;降至室温,磁性分离得到磁性Fe3O4纳米颗粒。
7.如权利要求1-6任一项所述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂的制备方法,包括磁性Fe3O4纳米颗粒的制备、磁性Fe3O4纳米颗粒氨基功能化、磁性联合交联酶聚集体步骤,其特征在于:所述磁性Fe3O4纳米颗粒的制备为将FeCl3∙6H2O和 FeCl2∙4H2O以物质的量之比为2:1的比例溶于去离子水中,在氮气保护下以转速500-1500r/min机械搅拌0.5-1.0小时,加入浓度为8-12 M的NaOH溶液,转速1000- 2000 r/min机械搅拌1-1.5小时,升温至70-100℃,熟化0.5-2.0小时,降至室温,磁性分离得到磁性Fe3O4纳米颗粒;所述磁性Fe3O4纳米颗粒氨基功能化为将磁性Fe3O4纳米颗粒用乙醇/水混合溶液分散,在20-80℃以转速400-1000r/min搅拌1.0-3.0小时,加入浓氨水搅拌0.5-1.5小时,再加入适量四乙氧基硅烷,控制转速1000-2000 r/ min搅拌8-16小时,最后加入适量氨丙基三乙氧基硅烷,pH 8-11,转速1000- 2000r/min搅拌8-16小时,然后磁性分离得到氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒;所述磁性联合交联酶聚集体为将氨基功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒分散在含有QNR和GDH的磷酸盐缓冲溶液中,在4-25℃,转速400-800 r/min搅拌0.5-1.0小时,然后加入沉淀剂,搅拌0.5-1.5h,再加入戊二醛,以转速200-600 r/min搅拌交联2-12 h,分离即得。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于:所述沉淀剂选自乙醇、异丙醇、丙酮、饱和硫酸铵、乙腈中的一种或几种组合;所述戊二醛的浓度为10-120 mM。
9.如权利要求1-6任一项所述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂在合成(R)-3-奎宁醇中的应用。
10.一种使用权利要求1-6任一项所述磁性联合交联酶聚集体生物催化剂合成(R)-3-奎宁醇的方法,其特征在于:将磁性联合交联酶聚集体生物催化剂分散在PBS中,加入3-奎宁酮,葡萄糖、NAD+ 和NADH,在室温条件下,pH为7.2-8.0,以 50~150 rpm转速搅拌,生物转化时间为1-3 h。
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