CN109055473A - 一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度d-氨基酸的方法 - Google Patents

一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度d-氨基酸的方法 Download PDF

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CN109055473A CN201810950848.9A CN201810950848A CN109055473A CN 109055473 A CN109055473 A CN 109055473A CN 201810950848 A CN201810950848 A CN 201810950848A CN 109055473 A CN109055473 A CN 109055473A
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Abstract

本发明公开了一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D‑氨基酸的方法，该方法是将鹅去氧胆酸和α‑酮酸置于含7α‑HSDH和DAADH及NADP的溶液体系中进行酶催化反应，反应液采用超滤膜分离得到浓缩混合酶液，透析液经过调节pH进行结晶，过滤分离，得到7‑KLCA湿粉和滤液；滤液通过层析处理得到D‑氨基酸；7‑KLCA湿粉置于含葡萄糖、NADP、7β‑HSDH及GDH溶液体系中进行酶催化反应，反应液采用超滤膜分离，得到浓缩的混合酶液，透析液通过结晶、过滤分离，得到熊去氧胆酸。该方法可以同时获得UDCA和高手性纯度的D‑氨基酸，且酶利用率高，简化了合成步骤，成本降低，同时，反应过程不需加入金属还原试剂和有机溶剂，条件温和，环境友好，适于工业化生产。

Description

一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基 酸的方法
技术领域
本发明涉及一种熊去氧胆酸和D-氨基酸的合成方法，特别涉及一种利用酶法偶联技术合成熊去氧胆酸(UDCA)和高手性纯度D-氨基酸的方法，属于生物催化技术领域。
背景技术
熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid，UDCA)，化学名为3α，7β-二羟基-5β-胆烷酸，被人们从熊胆中被发现。目前，UDCA在临床上被广泛用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，同时也能提高肝脏移植手术后的成活率。
天然熊去氧胆酸来源于熊胆汁，即活熊胆汁引流。然而随着市场的需求量不断增加以及活熊取胆有违野生动物保护法，天然熊去氧胆酸早已不能满足市场需求。因此，通过人工合成获得熊去氧胆酸变得越来越重要。
目前，国内外主要以鹅去氧胆酸(CDCA)为原料，通过化学法或酶法制备UDCA。化学法通过对CDCA的氧化和还原反应，制备UDCA，中间用到了大量的有机溶剂和氧化还原试剂，且处理过程复杂，产生的废水很难处理。中国专利CN105861613A报道了采用酶法制备UDCA的方法，但是反应体系中加入了大量有机试剂，生产过程中需要对溶剂进行回收处理。其主要目的是利用高温的条件下酶蛋白在有机溶剂中变性从而可以与UDCA分离开，达到纯化的目的。氨基酸是非天然氨基酸的一类，具有非天然氨基酸所不具备的优良性能，已经在药物合成(医药和农药)、食品、饲料等方面有广泛的用途。目前，主要有化学法和酶法制备D-氨基酸两种途径，其中化学法反应条件比较剧烈，对环境污染大，成本高，不适应大规模工业化生产。酶法制备技术又主要分为以下两种：第一，以D，L氨基酸为原料，采用酶法拆分技术，该方法需要拆分试剂，收率不高；第二种是以海因为原料，通过海因酶和氨甲酰水解酶共同作用制备，该方法的缺点是产品有局限性，比较适应于带苯环的D-氨基酸，且所用到的酶容易被氧化而失活。
发明内容
针对现有技术中传统的熊去氧胆酸和D-氨基酸合成过程中存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种环境友好、收率高、成本低的同时制备熊去氧胆酸和D-氨基酸的方法，该方法以CDCA和α-酮酸为原料，利用7α-HSDH、DAADH、7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)以及辅酶NADP+等催化剂，巧妙地通过辅酶再生体系偶联了7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)催化鹅去氧胆酸(CDCA)脱氢氧化和D-氨基酸脱氢酶(DAADH)催化α-酮酸羰基氨化过程，并且设计了较完美的分离纯化过程，以回收重复利用酶催化剂，同时获得高纯度的熊去氧胆酸和D-氨基酸目标产物。相对现有的酶合成方法，可以大大降低辅酶的成本，在同一体系中合成两种产物，可以降低生产的分摊成本，且酶催化反应过程不需有机试剂，水相反应，条件温和，转化率高，是一种环保、绿色、高效的催化合成新技术。
本发明提供了一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，该方法包括以下步骤：
1)将鹅去氧胆酸和α-酮酸置于含7α-HSDH和DAADH及NADP的溶液体系中进行酶催化反应，得到含7-KLCA和D-氨基酸的酶反应液；
2)将含7-KLCA和D-氨基酸的酶反应液采用超滤膜分离，膜内为浓缩的混合酶液，膜外透析液经过调解pH至3.0～6.0进行结晶，过滤分离，得到7-KLCA湿粉和滤液；
3)所述滤液调节pH至5～9后，采用树脂进行层析处理，得到D-氨基酸；
4)所述7-KLCA湿粉置于含葡萄糖、NADP、7β-HSDH及GDH溶液体系中进行酶催化反应，得到含熊去氧胆酸的酶反应液；
5)将含熊去氧胆酸的酶反应液采用超滤膜分离，膜内为浓缩的混合酶液，膜外透析液调解pH至3.0～6.0进行结晶，过滤分离，得到熊去氧胆酸。
本发明的酶法偶联技术中关键是构建了辅酶再生体系，在体系中CDCA在NADP和7α-HSDH的催化作用下，被转化成7-KLCA，同时NADP生成NADPH；而α-酮酸在NADPH和DAADH的催化下生成D-氨基酸，此时NADPH又生成了NADP，在体系中，辅酶能够循环再生。同样，在体系中7-KLCA在NADPH和7α-HSDH的作用下，被转化成UDCA，同时NADPH生成NADP；而NADP在GDH和葡萄糖的作用下又生成了NADP，在体系中，辅酶能够循环再生。
本发明通过大量实验表明7α-HSDH和DAADH存在同一反应体系中并不表现出拮抗作用，是保证两种酶在同一反应体系中顺利催化不同反应的前提条件。
优选的方案，步骤1)中，α-酮酸用量为鹅去氧胆酸摩尔量的1～2倍。
优选的方案，步骤1)中，7α-HSDH用量为鹅去氧胆酸质量的0.4～1.0倍*1Mu/kg。
优选的方案，步骤1)中，DAADH用量为鹅去氧胆酸质量的0.4～1.0倍*1Mu/kg。
优选的方案，步骤1)中，NADP用量为鹅去氧胆酸质量的1‰～5‰。
本发明的技术方案中α-酮酸与鹅去氧胆酸的比例，以及7α-HSDH和DAADH的用量及比例在上述优选范围内，以保证体系中NADP与NADPH达到平衡，使得α-酮酸和鹅去氧胆酸的酶催化反应均能顺利协同完成。
较优选的方案，所述α-酮酸具有式1结构：
其中，R为脂肪烃基或芳基。脂肪烃基主要是指烷基、或者是含双键或三键的不饱和碳氢化合物，脂肪烃基一般为小分子脂肪烃基，如碳原子数小于8的脂肪烃基，以烷烃基为例，如甲基、乙基、丙基、丁基等等。芳基主要是苯环或取代苯环，取代苯环中苯环上可以含一些常见的取代基，如烷基、卤素等等。
较优选的方案，所述鹅去氧胆酸在溶液体系中的质量百分比浓度为4～8％。
优选的方案，步骤1)中的酶催化反应条件为：温度为20～30℃，pH为8.0～9.0。在优选的范围内，可以保证7α-HSDH及DAADH等酶均具有较高的反应活性。
优选的方案，步骤2)和步骤3)中超滤膜的孔径在5K～20K之间。
优选的方案，所述树脂包括离子交换树脂(比如732树脂、HZ-016树脂等)，或大孔吸附树脂(比如HP20大孔吸附树脂)。
优选的方案，步骤4)中，葡萄糖用量为鹅去氧胆酸摩尔量的1.2～1.5倍。
优选的方案，步骤4)中，7β-HSDH用量为鹅去氧胆酸质量的0.5～1.0倍*1Mu/kg。
优选的方案，步骤4)中，GDH用量为鹅去氧胆酸质量的1.0～2.0倍*1Mu/kg。
优选的方案，步骤4)中，NADP用量为鹅去氧胆酸质量的1‰～5‰。
优选的方案，步骤4)中，7-KLCA湿粉在溶液体系中的浓度为4～6％。
优选的方案，步骤4)中，酶催化反应的条件：温度为20～30℃，pH为7.5～8.0。
本发明的技术方案中7-KLCA湿粉、葡萄糖、7β-HSDH及GDH的用量及比例在上述优选范围内，以保证体系中NADP与NADPH达到平衡，使得7-KLCA和葡萄糖的酶催化反应均能顺利协同完成。
本发明中涉及的酶制剂如7α-HSDH、DAADH、7β-HSDH和GDH等均为非致病微生物中的表达产物，其具体存在形式包括液态酶或者固定化酶。这些酶均为市面上常规购买的酶制剂。
本发明的同时制备熊去氧胆酸和D-氨基酸的合成路径(反应方程式)如下：
本发明提供的一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸(UDCA)和高手性纯度D-氨基酸的方法，技术方案包括如下具体步骤：
A、将CDCA和α-酮酸加入反应器中，搅拌溶解，再加入一定量7α-HSDH和DAADH以及少量NADP，控制反应的温度和pH，将CDCA转化为7-KLCA，将α-酮酸转化为D-氨基酸；
B、将步骤A的转化物料采用超滤膜进行分离，浓缩的酶液催化下一批次反应的CDCA，调节透析液的pH，进行结晶；过滤后得到含有7-KLCA的湿粉，滤液中含有D-氨基酸；
C、将步骤B中得到的滤液，调节pH后，采用树脂进行层析处理，收集洗脱液，并进行蒸发浓缩结晶，得到高手性纯度的D-氨基酸；
D、将步骤B中得到的湿粉，投入到反应器中，加水溶解，先加入一定量的葡萄糖和少量的NADP，先加入一定量的7β-HSDH和GDH，搅拌反应，控制反应的温度和pH，7-KLCA被转化为熊去氧胆酸；
E、将步骤D的转化物料采用超滤膜进行分离，浓缩的酶液催化下一批次反应的7-KLCA，滤液经加酸后结晶干燥，可以得到熊去氧胆酸。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
1、本发明首次巧妙地设计辅酶再生体系，利用两种酶催化反应过程中辅酶NADP和NADPH的相互转化来构建酶联反应，大大减少了辅酶的用量，提高辅酶的利用率，很大程度降低了生产成本，使7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)催化鹅去氧胆酸(CDCA)脱氢氧化和D-氨基酸脱氢酶(DAADH)催化α-酮酸羰基氨化，这两种不同酶催化反应在同一体系中完成，获得不同的目标产物，将两种酶催化反应偶联后，在生产熊去氧胆酸的同时，可以生产出手性纯度较高的D-氨基酸，大大简化了酶催化反应工艺，降低了两个产品的生产成本。
2、本发明的酶催化反应体系无需采用有机溶剂，和氧化还原试剂，反应条件温和，该工艺绿色环保；
3、本发明的酶联反应关键在于提出了理想的分离纯化方法，不但能将酶制剂分离回收并重复使用，有利于降低酶的成本；而且可以将目标产物高效分离，获得高纯度目标产物。
4、本发明制备的D-氨基酸手性纯度高，产物光学纯度>98.5％。
附图说明
图1为UDCA相关物质液相图谱。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制权利要求保护的范围。
本发明制备的产品采用液相检测条件：
1、流动相
称取2.31g乙酸铵，加680ml超纯水溶解后，用乙酸调pH至4.5，用0.45μm的水系微孔滤膜过滤后，加380ml色谱级乙腈(38％乙腈)，超声脱气20min。
2、检测器：RID
3、进样量：100μL
4、流速：1ml/min
5、出峰时间：
UDCA 4.6min左右
7-KLCA 6.4min左右
CDCA 12.0min左右
6、色谱柱：shim-pack XR-ODS,2.2um，4.6*30mm
7、UDCA相关物质液相图谱及数据如图1和表1所示。
表1UDCA相关物质液相图谱数据
名称 保留时间/min 峰高 面积 面积％
UDCA 4.653 78382.164 2486045.750 36.7298
7-KLCA 6.472 57879.484 2102338.500 31.0607
CDCA 12.035 28887.541 2180090.750 32.2095
仪器试剂：
7α-HSDH液酶和固定化酶购于湖南福来格生物技术有限公司；DAADH液酶和固定化酶购于湖南福来格生物技术有限公司；7β-HSDH液酶和固定化酶购于湖南福来格生物技术有限公司；GDH液酶和固定化酶购于湖南福来格生物技术有限公司；CDCA购于常德云港生物科技有限公司；丁酮酸购于湖南福来格生物技术有限公司；丙酮酸购于济南蓬勃生物技术有限公司；苯丙酮酸购于上海瀚鸿科技股份有限公司；葡萄糖购于长沙裕全饲料有限公司；氨水购于长沙利威化工有限公司；盐酸购于株洲衡源化工有限公司；HPLC检测器购于Shodex R1-201H；HPLC高压输液泵购于岛津LC-10AT；HPLC工作站购于浙大N2000双通道色谱工作站。
实施例1：
1、将40.0g CDCA加入反应器中，加入部分去离子水进行搅拌，用液碱调节pH至8.0溶解，然后加入1.2倍CDCA摩尔量的丁酮酸，加入去离子水定容至CDCA的浓度为4％，再加入7α-HSDH液酶、DAADH液酶以及NADP进行反应，其中7α-HSDH液酶加量为CDCA质量的0.5倍*1Mu/kg，DAADH液酶加量为CDCA质量的0.5倍*1Mu/kg，NADP投量为CDCA质量的2‰,其中控制反应温度30℃，pH8.0，过程采用HPLC监测至CDCA反应浓度≤0.1mg/ml，共反应6h。
2、将上述转化液采用5K的超滤膜进行分离，浓缩得到的液酶用于催化下一批次的CDCA。将透析液调节pH至3结晶，经过滤后，得到含有7-KLCA的湿粉。
3、收集滤液，调节pH至6，采用阳离子离子交换树脂进行吸附，氨水溶液进行洗脱，然后收集洗脱液，进行蒸发浓缩、结晶，得到手性纯度大于99％的D-氨基丁酸7.5g；
4、将步骤2中得到的7-KLCA湿粉，投入到反应器中，加入部分去离子水，用液碱调节pH至8并保证物料溶解，然后用去离子水定容至7-KLCA的浓度为4％。先加入7β-HSDH液酶、GDH液酶以及NADP，其中7β-HSDH加量为CDCA质量的1倍*1Mu/kg，GDH加量为CDCA质量的1倍*1Mu/kg，NADP投量为CDCA质量的1‰，再加入1.2倍CDCA质量的葡萄糖，搅拌反应，控制反应温度25℃，反应pH控制为7.5，反应6h将7-KLCA转化为熊去氧胆酸。
5、将步骤4中得到的反应终止液采用5K的超滤膜进行分离。浓缩得到的液酶用于催化下一批次的7-KLCA，透析液用稀盐酸调节pH至3.0结晶，然后经过滤干燥，得到熊去氧胆酸35.2g，收率88.0％。
实施例2：
1、将50.0g CDCA加入反应器中，加入部分去离子水进行搅拌，用液碱调节pH至8.0溶解，然后加入2.5倍CDCA摩尔量的丙酮酸，加入去离子水定容至CDCA的浓度为5％，再加入7α-HSDH液酶、DAADH液酶以及NADP进行反应，其中7α-HSDH液酶加量为CDCA质量的0.6倍*1Mu/kg，DAADH液酶加量为CDCA质量的0.6倍*1Mu/kg，NADP投量为CDCA质量的2‰,其中控制反应温度30℃，pH8.0，过程采用HPLC监测至CDCA反应浓度≤0.1mg/ml，共反应3h。
2、将上述转化液采用5K的超滤膜进行分离，浓缩得到的液酶用于催化下一批次的CDCA。将透析液调节pH至3结晶，经过滤后，得到含有7-KLCA的湿粉。
3、收集滤液，调节pH至6，采用阳离子离子交换树脂进行吸附，氨水溶液进行洗脱，然后收集洗脱液，进行蒸发浓缩、结晶，得到手性纯度大于98.5％的D-丙氨酸8.3g；
4、将步骤2中得到的7-KLCA湿粉，投入到反应器中，加入部分去离子水，用液碱调节pH至8并保证物料溶解，然后用去离子水定容至7-KLCA的浓度为4％。先加入7β-HSDH液酶、GDH液酶以及NADP，其中7β-HSDH加量为CDCA质量的1倍*1Mu/kg，GDH加量为CDCA质量的1倍*1Mu/kg，，NADP投量为CDCA质量的1‰，再加入1.2倍CDCA质量的葡萄糖，搅拌反应，控制反应温度25℃，反应pH控制为7.5，反应3h将7-KLCA转化为熊去氧胆酸。
5、将步骤4中得到的反应终止液采用5K的超滤膜进行分离。浓缩得到的液酶用于催化下一批次的7-KLCA，透析液用稀盐酸调节pH至3.0结晶，然后经过滤干燥，得到熊去氧胆酸44.5g，收率89.0％。
实施例3：
1、将40.0g CDCA加入反应器中，加入部分去离子水进行搅拌，用液碱调节pH至8.0溶解，然后加入1.2倍CDCA摩尔量的苯丙酮酸，加入去离子水定容至CDCA的浓度为4％，再加入7α-HSDH液酶、DAADH液酶以及NADP进行反应，其中7α-HSDH液酶加量为CDCA质量的0.6倍*1Mu/kg，DAADH液酶加量为CDCA质量的0.6倍*1Mu/kg，NADP投量为CDCA质量的2‰,其中控制反应温度25℃，pH8.0，过程采用HPLC监测至CDCA反应浓度≤0.1mg/ml，共反应4h。
2、将上述转化液采用5K的超滤膜进行分离，浓缩得到的液酶用于催化下一批次的CDCA。将透析液调节pH至6结晶，经过滤后，得到含有7-KLCA的湿粉。
3、收集滤液，调节pH至5.5，采用大孔吸附树脂进行吸附，氨水溶液进行洗脱，然后收集洗脱液，进行蒸发浓缩、结晶，得到手性纯度大于99％的D-苯丙氨酸15.2g；
4、将步骤2中得到的7-KLCA湿粉，投入到反应器中，加入部分去离子水，用液碱调节pH至8并保证物料溶解，然后用去离子水定容至7-KLCA的浓度为4％。先加入7β-HSDH液酶、GDH液酶以及NADP，其中7β-HSDH加量为CDCA质量的1倍*1Mu/kg，GDH加量为CDCA质量的1倍*1Mu/kg，NADP投量为CDCA质量的1‰，再加入1.2倍CDCA质量的葡萄糖，搅拌反应，控制反应温度25℃，反应pH控制为7.5，反应4h将7-KLCA转化为熊去氧胆酸。
4、将步骤4中得到的反应终止液采用5K的超滤膜进行分离。浓缩得到的液酶用于催化下一批次的7-KLCA，透析液用稀盐酸调节pH至3.0结晶，然后经过滤干燥，得到熊去氧胆酸35.8g，收率89.5％。
实施例4：
1、将40g CDCA加入反应器中，加入部分去离子水进行搅拌，用液碱调节pH至8.0溶解，然后加入1.2倍CDCA摩尔量的丁酮酸，加入去离子水定容至CDCA的浓度为4％，再加入固定化7α-HSDH和固定化DAADH进行反应，其中固定化7α-HSDH加量为CDCA质量的0.6倍*1Mu/kg，固定化DAADH加量为CDCA质量的0.6倍*1Mu/kg，控制反应温度25℃，pH8.0，过程采用HPLC监测至CDCA反应浓度≤0.1mg/ml，共反应4h。
2、将上述转化液采用300目筛网进行过滤，固定化酶用于转化下一批次的CDCA。将滤液调节pH至3结晶，结晶粉经过滤后，得到含有7-KLCA湿粉。
3、收集步骤2的滤液，调节pH至6，采用阳离子离子交换树脂进行吸附，氨水溶液进行洗脱，然后收集洗脱液，进行蒸发浓缩、结晶，得到手性纯度大于99％的D-氨基丁酸9.8g；
4、将步骤2中得到的7-KLCA湿粉，投入到反应器中，加入部分去离子水，用液碱调节pH至8并保证物料溶解，然后用去离子水定容至7-KLCA的浓度为4％。先加入固定化7β-HSDH和固定化GDH，其中7β-HSDH加量为CDCA质量的0.6倍*1Mu/kg，GDH加量为CDCA质量的0.6倍*1Mu/kg，再加入1.2倍CDCA质量的葡萄糖，搅拌反应，控制反应温度25℃，反应pH控制为7.5，反应4h将7-KLCA转化为熊去氧胆酸。
5、将步骤4中得到的反应终止液采用300目筛网进行过滤，收集的滤液用稀盐酸调节pH至3.0结晶，然后经过滤，得到熊去氧胆酸36.6g，收率91.5％。

Claims (10)

1.一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将鹅去氧胆酸和α-酮酸置于含7α-HSDH和DAADH及NADP的溶液体系中进行酶催化反应，得到含7-KLCA和D-氨基酸的酶反应液；
2)将含7-KLCA和D-氨基酸的酶反应液采用超滤膜分离，膜内为浓缩的混合酶液，膜外透析液经过调解pH至3.0～6.0进行结晶，过滤分离，得到7-KLCA湿粉和滤液；
3)所述滤液调节pH至5～9后，采用树脂进行层析处理，得到D-氨基酸；
4)所述7-KLCA湿粉置于含葡萄糖、NADP、7β-HSDH及GDH溶液体系中进行酶催化反应，得到含熊去氧胆酸的酶反应液；
5)将含熊去氧胆酸的酶反应液采用超滤膜分离，膜内为浓缩的混合酶液，膜外透析液调解pH至3.0～6.0进行结晶，过滤分离，得到熊去氧胆酸。
2.根据权利要求1所述的一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，其特征在于：步骤1)中，
α-酮酸用量为鹅去氧胆酸摩尔量的1～2倍；
7α-HSDH用量为鹅去氧胆酸质量的0.4～1.0倍*1Mu/kg；
DAADH用量为鹅去氧胆酸质量的0.4～1.0倍*1Mu/kg；
NADP用量为鹅去氧胆酸质量的1‰～5‰。
3.根据权利要求2所述的一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，其特征在于：所述α-酮酸具有式1结构：
其中，R为脂肪烃基或芳基。
4.根据权利要求2所述的一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，其特征在于：所述鹅去氧胆酸在溶液体系中的质量百分比浓度为4～8％。
5.根据权利要求1～4任一项所述的一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，其特征在于：步骤1)中的酶催化反应条件为：温度为20～30℃，pH为8.0～9.0。
6.根据权利要求1所述的一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，其特征在于：步骤2)和步骤3)中超滤膜的孔径在5K～20K之间。
7.根据权利要求1所述的一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，其特征在于：所述树脂包括离子交换树脂或大孔吸附树脂。
8.根据权利要求1所述的一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，其特征在于：步骤4)中，
葡萄糖用量为鹅去氧胆酸摩尔量的1.2～1.5倍；
7β-HSDH用量为鹅去氧胆酸质量的0.5～1.0倍*1Mu/kg；
GDH用量为鹅去氧胆酸质量的1.0～2.0倍*1Mu/kg；
NADP用量为鹅去氧胆酸质量的1‰～5‰。
9.根据权利要求1所述的一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，其特征在于：步骤4)中，7-KLCA湿粉在溶液体系中的浓度为4～6％。
10.根据权利要求1、7～9任一项所述的一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，其特征在于：步骤4)中，酶催化反应的条件：温度为20～30℃，pH为7.5～8.0。
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