CN114606220A - 固定化经修饰的7α-羟基甾体脱氢酶及其应用 - Google Patents

固定化经修饰的7α-羟基甾体脱氢酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用固定化酶催化剂及其合成7‑酮‑石胆酸的方法。固定化酶包含7α‑羟基甾体脱氢酶或其突变体，醇脱氢酶以及氨基固定化树脂。固定化酶相比自由酶而言提高了产品7‑酮‑石胆酸的纯度，降低了后续反应的纯化成本。

Description

固定化经修饰的7α-羟基甾体脱氢酶及其应用
技术领域
本发明涉及酶工程及固定化酶领域。具体而言，本发明涉及固定化经修饰的7α-羟基甾体脱氢酶催化合成7-酮-石胆酸的应用。
背景技术
熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，为甾体化合物，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，是一种胆酸类似物，有利胆作用。在临床上用于治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。
UDCA可以从人工养殖的熊的胆中获得，但是收率低，来源有限，而且有动物保护问题。因此，人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学合成和化学-酶促合成的方法，起始原料为动物来源的胆酸(CA)或去氧胆酸(如CDCA)。
UDCA的经典化学合成方法包括如式I所示的步骤:
Figure BDA0002798247260000011
其中，原料7-酮-石胆酸(7-keto-LCA)的合成传统上依靠化学氧化法，该方法污染大。现有技术中有尝试用7α-羟基甾体脱氢酶(7α-HSDH)催化鹅去氧胆酸氧化得到7-酮-石胆酸，反应步骤如下：
Figure BDA0002798247260000021
但是，本反应用到的自由酶会使产品带入残留宿主蛋白和核酸，影响产品的纯度，同时由于酶不能回收利用，造成浪费。因此，本领域需要提供一种能够合成高纯度产品以及能回收套用的酶催化剂。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种固定化酶催化剂，以及使用该催化剂催化合成7-酮-石胆酸的方法。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶催化剂，该固定化酶催化剂包括活化的树脂以及共价结合在所述活化的树脂上的酶；所述酶单独为7α-羟基甾体脱氢酶，或者7α-羟基甾体脱氢酶和辅酶再生酶；
进一步地，所述活化的树脂为戊二醛活化的带有氨基的树脂。
进一步地，戊二醛溶液的浓度为1％-2％。
进一步地，7α-羟基甾体脱氢酶和辅酶再生酶被同时共价固定到一种树脂上。
进一步地，所述辅酶再生酶选自：醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或多种。
进一步地，所述7α-羟基甾体脱氢酶来源于Escherichia coli，所述醇脱氢酶来源于Rhodococcus ruber。
本发明还发现，可以对7α-羟基甾体脱氢酶进行定点突变，突变后的7α-羟基甾体脱氢酶在树脂上的负载量以及负载牢固度得到大幅提升；
进一步地，含突变体的固定化酶催化剂反应30次后仍然保持65％以上的反应活性。
进一步地，含突变体的固定化酶催化剂反应30次后仍然保持90％以上的反应活性。
进一步地，含突变体的固定化酶催化剂反应30次后仍然保持99％以上的反应活性。
进一步地，所述突变发生在7α-羟基甾体脱氢酶第57和/或第204个氨基酸位置；
进一步地，所述突变体为Q57K、E204K或Q57K/E204K，上述突变后的7α-羟基甾体脱氢酶分别具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的氨基酸序列。
进一步地，酶蛋白与树脂质量比为1:15到1:8。
根据本发明的另一个方面，提供了一种合成7-酮-石胆酸的方法，所述方法以鹅去氧胆酸为原料，经过氧化反应得到7-酮-石胆酸，其特征在于，使用了如前所述的固定化酶催化剂。
应用本发明的技术方案，通过将酶高效地固定于树脂上，避免了在反应液中残留宿主核酸和蛋白，提高了产品纯度，降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：
材料和方法
如无特别说明，本发明中使用的实验方法均为常规方法。
i)试剂和仪器：
LX-1000NH购自蓝晓科技；
鹅去氧胆酸(CDCA)购自阿拉丁，货号C104902，纯度98％；
氧化型烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)购自阿拉丁，货号N196974，纯度95％。
ii)载体和菌株：所使用的表达载体为pET-30a(+)，质粒购自Novagen公司，所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，购自天根生化科技(北京)有限公司。
iii)测序、引物合成和基因合成由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。其中基因合成后，构建到载体pET-30a中。
iv)定点突变：
设计特异性引物对，在所需突变的氨基酸位置对应碱基引入所需的取代。用提取的突变前质粒(包含野生型7α-羟基甾体脱氢酶编码序列，pET-30a(+)骨架)为模版，利用Packer和Liu描述的方法制备突变体(Methods for the directed evolution ofproteins.Nat Rev Genet,2015,16(7):379-394)。
定点突变的突变策略如下：
Figure BDA0002798247260000051
v)蛋白表达及酶液的制备：
将用含有目的基因的质粒转化的大肠杆菌细胞接种至含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，37℃震荡温育过夜。将培养物转接至TB液体培养基(蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4mL/L，磷酸二氢钾2.31g/L，磷酸氢二钾12.54g/L)中，37℃震荡温育至OD600达到0.6-0.8，加入IPTG(终浓度为0.4mM)在30℃温育过夜以诱导蛋白质表达。
温育后，将培养物以4,000g在4℃离心10min，弃上清，收集大肠杆菌细胞。将收集的大肠杆菌细胞重悬于预冷的20mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在4℃超声破碎大肠杆菌细胞。细胞破碎液以6,000g在4℃离心15min去除沉淀，得到的上清为含有重组酶的酶液，用于催化反应。也可以将酶液冷冻干燥成酶粉，保存于4℃备用。
vi)固定化反应：
将树脂LX-1000NH预先用2％戊二醛溶液活化过夜，用水清洗干净。
将含0.5g 7α-羟基甾体脱氢酶(SEQ ID No.1或突变体)和0.5g醇脱氢酶(SEQ IDNo.2)的蛋白溶液与10g活化后的树脂LX-1000NH混合，25度搅拌24h。固定结束后过滤固定化酶，用水清洗三次，保存于4℃备用。固定化反应后，活性自由酶被固定在树脂上，而酶粉中带有的残留宿主蛋白和核酸则无法被树脂固定，随之被清洗掉。
vii)HPLC分析
HPLC参数如下：
柱 Aliglent TC-C18柱(250mm*4.6mm*5μm)；
流动相
洗脱条件
运行时间 流动相A：0.1％H3PO4；流动相B：ACN；
流动相A/流动相B＝40:60等梯度洗脱
10min
流速 1mL/min；
柱温 30℃；
检测波长 192nm；。
实施例2：
固定化酶制备7-酮-石胆酸
配制如下1L反应体系：鹅去氧胆酸40g/L，丙酮40g/L，氧化型烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)0.05g/L，上述实施例1中步骤vi)制备的固定化酶30g，三乙醇胺缓冲液(TEA)0.1M，pH8.5。在30℃反应24小时，然后通过HPLC测定生成的7-酮-石胆酸转化率，结果如下所述：
酶编号 突变 首次反应转化率 套用第30次后转化率
SEQ ID No.1 无 99％ 55％
SEQ ID No.3 Q57K 99％ 68％
SEQ ID No.4 E204K 99％ 93％
SEQ ID No.5 Q57K/E204K 99％ 99％
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南引航生物科技有限公司
<120> 固定化经修饰的7α-羟基甾体脱氢酶及其应用
<130> 2020
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 255
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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Ser Ser Lys Ala Ala Ala Ser His Leu Val Arg Asn Met Ala Phe Asp
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210 215 220
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225 230 235 240
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<210> 2
<211> 345
<212> PRT
<213> Rhodococcus ruber
<400> 2
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Asp Ile Pro Thr Pro Thr Pro Gly Pro Gly Glu Ile Leu Leu Lys Val
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225 230 235 240
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225 230 235 240
Gly Gln Ile Leu Thr Val Ser Gly Gly Gly Val Gln Glu Leu Asn
245 250 255

Claims (10)

1.一种固定化酶催化剂，其特征在于，所述固定化酶催化剂包括活化的树脂以及共价结合在所述活化的树脂上的酶；所述酶单独为7α-羟基甾体脱氢酶，或者为7α-羟基甾体脱氢酶和辅酶再生酶。
2.如权利要求1所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述活化的树脂为戊二醛溶液活化的带有氨基的树脂。
3.如权利要求1所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述7α-羟基甾体脱氢酶和辅酶再生酶被同时共价固定到一种树脂上。
4.如权利要求1所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述辅酶再生酶选自：醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述对7α-羟基甾体脱氢酶被定点突变。
6.如权利要求5所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述定点突变发生在7β-羟基甾体脱氢酶第57和/或第204个氨基酸位置。
7.如权利要求5所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述固定化酶催化剂反应30次后仍然保持65％以上的反应活性。
8.如权利要求5所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述固定化酶催化剂反应30次后仍然保持90％或99％以上的反应活性。
9.如权利要求5所述的固定化酶催化剂，其特征在于，所述7α-羟基甾体脱氢酶定点突变所得的突变体为Q57K、E204K或Q57K/E204K，分别具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQID No.5的氨基酸序列。
10.一种合成7-酮-石胆酸的方法，所述方法以鹅去氧胆酸为原料，经过氧化反应得到7-酮-石胆酸，其特征在于，使用了如权利要求1-9任一项所述的固定化酶催化剂。
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