CN114940964A

CN114940964A - 工程菌及其高效催化cdca生产udca的方法

Info

Publication number: CN114940964A
Application number: CN202210556251.2A
Authority: CN
Inventors: 朱俊歌; 吴胜; 陶勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2022-05-20
Filing date: 2022-05-20
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2042-05-20
Also published as: CN114940964B

Abstract

本发明属于生物催化技术领域，本发明公开了一种工程菌及其高效催化CDCA生产UDCA的方法。本发明以大肠杆菌BW25113作为出发菌株，通过敲除基因，得到两株能够显著提高内源辅酶NAD(P)H转换效率的底盘菌株ΔmazG BW25113和Δpgi BW25113。在此基础上，将7α‑HSDH‑LDH和7β‑HSDH‑GDH在底盘菌株中异源表达，并构建辅酶循环再生体系，串联高效催化生产熊去氧胆酸(UDCA)。底物是鹅去氧胆酸(CDCA)，投料高达150g/L，转化率≥99.0％，产物纯度≥98.5％，且无任何副产物生成。本发明技术方案通过高效生物催化CDCA生产UDCA的方法，具有生产成本低、反应温和、转化率高、生产效率高等特点，是熊去氧胆酸工业化生产的优选之路。

Description

工程菌及其高效催化CDCA生产UDCA的方法

技术领域

本发明属于生物催化技术领域。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)，化学名称为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，在临床上主要用于治疗各种胆石疾病，急性、慢性肝病，是美国FDA批准治疗原发性胆汁性肝硬化疾病的唯一药物。近年来，随着对UDCA的深入研究，发现其还具有细胞保护、免疫调节及抗癌作用，因此，UDCA作为保健品应用在日常保健领域。鉴于UDCA在治疗肝胆类等疾病方面疗效强、副作用小的优点，UDCA的市场需求每年呈递增趋势。

传统获得UDCA的方式是从人工养殖熊胆汁中提取，由最初的“有管引流”发展到“无管引流”，鉴于熊胆中获取UDCA含量有限，且有违于动物保护，因此如何实现UDCA的人工合成具有重要意义。目前UDCA的合成主要有两种方式：1)化学合成，包括常规的化学合成和电化学催化两种方法。如专利CN111072744A以胆酸作为原料，经过保护基团、氧化、还原等步骤合成UDCA。专利CN106868534A则以纯金反应电极，纳米钯作为催化剂，通过电催化的方式制备UDCA。化学合成的特点是涉及步骤较多、立体选择性差、或需要使用重金属作为催化剂。2)生物合成，即以胆酸或鹅去氧胆酸作为原料，通过酶/细胞催化制备UDCA。目前关于生物合成UDCA的报道较多，如专利CN105861613A、CN112725212A等均以鹅去氧胆酸为底物，在添加辅因子的前提下，通过7α-HSDH和7β-HSDH催化生成UDCA。生物合成相比于化学合成成本较低，且有步骤少、污染小、易操作等特点，是规模化生产UDCA的发展方向。目前报道的绝大多数生物合成UDCA的方法，需要额外添加辅因子来提高底物的投料量，鉴于辅因子在生产UDCA的重要性以及其居高不下的市场价格，迫切需要开发新的工艺实现高投料，低成本的模式生产UDCA。

发明内容

有鉴于此，本发明克服现有技术中的不足，以大肠杆菌BW25113为出发菌株，通过敲除关键基因获得提高内源辅因子转换效率的底盘菌株，实现7α-HSDH-LDH和7β-HSDH-GDH的异源表达，并构建辅因子再生循环体系串联高效生产UDCA。

本发明的目的是提供了一株工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113，所述工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113由含有7α-HSDH基因片段和LDH基因片段的质粒载体转入敲除mazG基因片段的底盘菌株中获得；所述含有7α-HSDH基因片段和LDH基因片段的质粒载体是由7α-HSDH基因和LDH基因导入pBAD质粒载体获得；所述敲除mazG基因片段的底盘菌株是由大肠杆菌BW25113菌株敲除mazG基因获得；所述敲除mazG基因的技术为Red-同源重组技术；所述7α-HSDH基因具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述LDH基因具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；所述mazG基因具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明另外一个目的还提供了一种全细胞催化CDCA生产UDCA的方法，包括如下步骤：权利要求1所述工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113催化鹅去氧胆酸转变成中间体7-酮石胆酸；工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113催化中间体7-酮石胆酸转变成熊去氧胆酸。

在本发明的具体实施方式中，所述工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113催化鹅去氧胆酸转变成中间体7-酮石胆酸包括如下步骤：PB缓冲溶液中加入全细胞催化剂菌体7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113，加入CDCA和丙酮酸钠，控制反应条件生成中间体7-酮石胆酸。

在本发明的具体实施方式中，所述工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113催化中间体7-酮石胆酸转变成熊去氧胆酸包括如下步骤：在中间体7-酮石胆酸的反应溶液中加入工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113，加入葡萄糖，控制反应条件生成熊去氧胆酸。

在本发明的具体实施方式中，所述工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113由含有7β-HSDH基因片段和GDH基因片段的质粒载体转入敲除pgi基因片段的底盘菌株中获得；所述含有7β-HSDH基因片段和GDH基因片段的质粒载体是由7β-HSDH基因和GDH基因导入pBAD质粒载体获得；所述敲除pgi基因片段的底盘菌株是由大肠杆菌BW25113菌株敲除pgi基因获得；所述敲除pgi基因的技术为Red-同源重组技术；所述7β-HSDH基因具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；所述GDH基因具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列；所述pgi基因具有SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列。

本发明与现有的技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明以大肠杆菌BW25113为出发菌株，通过敲除靶基因ΔmazG、Δpgi，增加了细胞中内源辅酶NAD(P)H的产量，并构建辅酶再生体系高效全细胞催化生产UDCA，因此无需额外添加昂贵的辅酶，比现有已报道的生物催化的成本明显减低。

(2)底物浓度高达150g/L，反应时间短，操作简单，底物转化率≥99％，纯度≥98.5％，且无任何副产物生成。

(3)底物投料高、生产成本低、反应温和、转化率高、生产效率高。

附图说明

图1.催化鹅去氧胆酸生产熊去氧胆酸的原理图。

图2. 7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113共表达蛋白图。

图3. 7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113共表达蛋白图。

图4. 7-酮石胆酸熊高效液相色谱图。

图5.UDCA高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

大肠杆菌BW25113菌株购自上海泽叶生物科技有限公司。

pKD46和pCP20质粒购自北京润泽康生物科技有限公司。

pBAD载体购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

5×蛋白胶上样缓冲液购自北京华博德亿生物技术有限公司。

SDS-PAGE蛋白分离胶制备参考《分子生物学实验指南》。

未特别说明的实验步骤均按照试剂说明书操作。

实施例1

底盘菌株ΔmazG BW25113、Δpgi BW25113的构建

利用Red-同源重组技术，将按照以下步骤构建相应底盘菌株

1.ΔmazG BW25113底盘菌株的构建，步骤如下：

(1)准备打靶片段。

以大肠杆菌BW25113菌株为模板，设计基于mazG基因的PCR扩增引物。所述mazG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。打靶片段的PCR扩增引物上下游均含有长约30bp的同源序列。

(2)制备pKD46-BW25113电转感受态细胞。

将质粒pKD46转入BW25113感受态细胞中。按照电转化操作流程，获得pKD46-BW25113电转感受态细胞。

(3)电转化打靶片段。

按照电转操作流程，将步骤(1)中的打靶片段转入步骤(2)中制备的pKD46-BW25113感受态细胞中，30℃、150r/min培养1h后，涂含卡那抗性的LB平板，30℃静置培养过夜。

(4)消除抗性。

按照化转感受态制备过程获得kana-ΔmazG BW25113感受态细胞，转入含氨苄抗性pCP20质粒，LB平板静置培养过夜后，随机挑取单菌落转入5mlLLB液体试管中，加入质量浓度0.5％L-阿拉伯糖培养10h后涂卡那抗性LB平板，无菌斑明显出现的平板表明ΔmazG基因敲除成功。

2.Δpgi BW25113底盘菌株的构建，步骤如下：

(1)准备打靶片段。

以大肠杆菌BW25113菌株为模板，设计基于pgi基因的PCR扩增引物。所述pgi基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。打靶片段的PCR扩增引物上下游均含有长约30bp的同源序列。

(2)制备pKD46-BW25113电转感受态细胞。

将质粒pKD46转入BW25113感受态细胞中，按照电转化操作流程，获得pKD46-BW25113电转感受态细胞。

(3)电转化打靶片段。

(4)消除抗性。

按照化转感受态制备过程获得kana-ΔmazG BW25113感受态细胞，转入含氨苄抗性pCP20质粒，LB平板静置培养过夜后，随机挑取单菌落转入5mlLLB液体试管中，加入质量浓度0.5％L-阿拉伯糖培养10h后涂卡那抗性LB平板，无菌斑明显出现的平板表明Δpgi基因敲除成功。

实施例2

工程菌的构建

1.pBAD-7α-HSDH-LDH质粒载体的构建

Psychrobacter sp.G的7α-HSDH基因；所述7α-HSDH基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示和氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

Escherichia coli K-12的LDH基因，所述LDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示和氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

分别设计7α-HSDH基因引物对5’-catgccatggattctccgcagagtcatttt-3’和5’-ccctcgagttaatccagggtctgaacaccg-3’，以及LDH基因引物对5’-ccctcgagtctagagaaagaggggacaaactagatgaaactcgccgtttatagcacaaaa-3’和5’-ggaattcttaaaccagttcgttcgggcaggtttcgcctttttccagattgcttaagttt-3’，通过PCR进行扩增，用NcoI、XhoI和XhoI、EcoRI进行酶切，PCR得到的基因序列两端分别带有NcoI、XhoI和XhoI、EcoRI两个酶切位点，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。NcoI、EcoRI酶切pBAD载体，用T4连接酶连接7α-HSDH、LDH片段和pBAD线性载体，连接产物转化DH5α后涂卡那霉素抗性平板，过夜培养后挑单菌落至装有5mL LB的试管培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，PCR扩增确定插入基因条带大小正确的质粒送测序，保存测序正确的质粒并命名为pBAD-7α-HSDH-LDH。

2.pBAD-7β-HSDH-GDH质粒载体的构建

Ruminococcus gnavu(ATCC 29149)的7β-HSDH基因，所述7β-HSDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示和氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

Bacillus megateriu(ATCC 14581)的GDH基因，所述GDH基因的核苷酸序列如SEQID NO.11所示和氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

分别设计7β-HSDH基因引物对5’-ctagctagcatgacattgagagaaaaatat-3’和5’-ccctcgagttcttgatagaaagatcccata-3’，以及GDH基因引物对5’-ccctcgagtctagagaaagaggggacaaactagatgtatacagatttaaaagataaag-3’和5’-ggggtaccttagcctcttcctgcttggaaagaagggtacagcgtcataccaccatcagca-3’，通过PCR进行扩增，用NheI、XhoI和XhoI、KpnI进行酶切，PCR得到的基因序列两端分别带有NheI、XhoI和XhoI、KpnI两个酶切位点，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。NheI、KpnI酶切pBAD载体，用T4连接酶7β-HSDH、GDH片段和pBAD线性载体，连接产物转化DH5α后涂卡那霉素抗性平板，过夜培养后挑单菌落至装有5mL LB的试管培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，PCR扩增确定插入基因条带大小正确的质粒送测序，保存测序正确的质粒并命名为pBAD-7β-HSDH-GDH。

3.工程菌的转化

按照质粒化学转化常规方法，将构建的表达载体分别转入ΔmazG BW25113和Δpgi BW25113感受态细胞中，得到工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113和7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113。

(1)工程菌7α-HSDH-LDH-BW25113的构建

取100μL的感受态细胞ΔmazG BW25113，将1μL的pBAD-7α-HSDH-LDH质粒加入感受态细胞中，轻柔混匀。后冰浴30min，42℃热激90s后，再迅速冰浴2min。向每个离心管中加入500μL无菌无抗的LB培养基，混匀后置于37℃摇床恒温振荡培养45min使菌体复苏；吸取100μL涂布LB固体培养基(kan抗性)，37℃培养12～16h，获得7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113工程菌，以甘油管形式保存菌种。

(2)7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113工程菌的构建

取100μL的感受态细胞Δpgi BW25113，将1μL的pBAD-7β-HSDH-GDH质粒加入感受态细胞中，轻柔混匀。后冰浴30min，42℃热激90s后，再迅速冰浴2min。向每个离心管中加入500μL无菌无抗的LB培养基，混匀后置于37℃摇床恒温振荡培养45min使菌体复苏；吸取100μL涂布LB固体培养基(kan抗性)，37℃培养12～16h，获得7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113工程菌并以甘油管形式保存菌种。

实施例3

工程菌的发酵培养

1.工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113的制备

(1)种子培养基活化：吸取甘油菌种管中7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113于5mL，含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm过夜活化。

(2)发酵培养：将过夜活化的种子液分别按1％体积比比例接种到800mL，含100μg/mL卡那霉素的TB发酵培养基，37℃、200rpm培养至对数中期OD₆₀₀＝0.6左右。

(3)诱导培养：25℃、200rpm下加入质量浓度1％L-阿拉伯糖进行诱导培养8-10h，离心收集细胞。

(4)SDS-PAGE：取诱导完成的发酵液0.5mL，12000rpm离心90s，加入200μL上样缓冲液；SDS-PAGE分离胶浓度为12.5％，每孔上样5μL。

工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113共表达蛋白见图2。

2.工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113的制备

(1)种子培养基活化：吸取甘油菌种管中7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113于5mL，含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm过夜活化。

工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113共表达蛋白见图3。

实施例4

全细胞催化CDCA生产UDCA

(1)工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113催化鹅去氧胆酸转变成中间体7-酮石胆酸

在50mM，pH7.5、10mL的PB缓冲溶液中加入实施例3制备的全细胞催化剂菌体7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113 0.5g，加入底物CDCA 1.5g，加入底物CDCA投料量5倍的丙酮酸钠(摩尔比)，控制pH在7.5、30℃的条件反应进行，HPLC监控反应进程中7-酮石胆酸的生成。

7-酮石胆酸的检测分析方法：取上述样品溶液300μl，12000rpm/min离心后取上清溶液，用0.22um水相过滤器过滤，使用高效液相色谱仪分析，所用色谱柱为Agilent ZORBAXC18 3.5μm色谱柱，流动相为乙腈：甲酸水溶液(pH 4.0)＝50：50，流速1.0mL/min，色谱柱温度为40℃，λmax＝210nm。

(2)工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113催化中间体7-酮石胆酸转变成熊去氧胆酸

在实施例4(1)制备的中间体7-酮石胆酸的反应溶液中加入实施例3制备的工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113 0.5g，加入1倍于底物CDCA投料量的葡萄糖(摩尔比)，保持反应体系在pH7.5、30℃的条件下继续进行，HPLC监控反应进程中7-酮石胆酸完全转变成熊去氧胆酸，终止反应。

熊去氧胆酸的检测分析方法：取上述样品溶液300μl，12000rpm/min离心后取上清溶液，用0.22um水相过滤器过滤，使用高效液相色谱仪分析，所用色谱柱为Agilent ZORBAXC18 3.5μm色谱柱，流动相为乙腈：甲酸水溶液(pH 5.0＝50：50，流速1.0ml/min，色谱柱温度为40℃，λmax＝210nm。

(3)熊去氧胆酸的制备

反应后的溶液加入等量终反应体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，加入无水Na₂SO₄过夜干燥后旋蒸至恒重，即可得到熊去氧胆酸粗品147.7g。将粗品溶于丙酮，回流1h后缓慢冷却结晶即可获得熊去氧胆酸纯品145.2g，纯度为98.5％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 工程菌及其高效催化CDCA生产UDCA的方法

<130> IM2022027I

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 792

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(bacillus coli)

<400> 1

atgaatcaaa tcgaccgttt gctcactatt atgcagcgcc tgcgcgatcc ggaaaacggc 60

tgcccgtggg ataaagagca gacatttgcc accattgcgc cttacaccct tgaagaaacc 120

tacgaagtgc tggacgccat cgcccgtgaa gattttgacg atcttcgcgg tgaactgggc 180

gatctgctat tccaggtggt gttttacgcg caaatggctc aggaagaagg gcgctttgac 240

tttaatgata tttgcgctgc tattagcgat aaattagagc gtcgccatcc gcatgttttt 300

gctgatagtt ctgccgaaaa cagtagtgaa gtgcttgccc gttgggagca aatcaaaacc 360

gaagagcgcg cgcagaaagc gcagcattcg gcgctggacg atattcctcg tagtttaccg 420

gctttaatgc gtgcgcaaaa aatccagaaa cgttgcgcca acgttggctt cgattggacg 480

acgcttggtc cggtagtcga taaagtctac gaagagatcg acgaggtgat gtacgaagcg 540

cggcaggctg ttgtcgacca ggctaaactg gaggaggaaa tgggggacct gctgtttgcc 600

acggttaatc tggctcgcca tttagggacg aaagcagaaa tcgcattgca aaaagcgaac 660

gaaaaattcg agcgtcgttt tcgcgaagtg gagcgtattg ttgccgcgcg tggactggaa 720

atgacaggtg ttgacctcga aacaatggaa gaagtctggc aacaggtaaa acggcaggaa 780

attgatctct aa 792

<210> 2

<211> 263

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(bacillus coli)

<400> 2

Met Asn Gln Ile Asp Arg Leu Leu Thr Ile Met Gln Arg Leu Arg Asp

1 5 10 15

Pro Glu Asn Gly Cys Pro Trp Asp Lys Glu Gln Thr Phe Ala Thr Ile

20 25 30

Ala Pro Tyr Thr Leu Glu Glu Thr Tyr Glu Val Leu Asp Ala Ile Ala

35 40 45

Arg Glu Asp Phe Asp Asp Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asp Leu Leu Phe

50 55 60

Gln Val Val Phe Tyr Ala Gln Met Ala Gln Glu Glu Gly Arg Phe Asp

65 70 75 80

Phe Asn Asp Ile Cys Ala Ala Ile Ser Asp Lys Leu Glu Arg Arg His

85 90 95

Pro His Val Phe Ala Asp Ser Ser Ala Glu Asn Ser Ser Glu Val Leu

100 105 110

Ala Arg Trp Glu Gln Ile Lys Thr Glu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Gln

115 120 125

His Ser Ala Leu Asp Asp Ile Pro Arg Ser Leu Pro Ala Leu Met Arg

130 135 140

Ala Gln Lys Ile Gln Lys Arg Cys Ala Asn Val Gly Phe Asp Trp Thr

145 150 155 160

Thr Leu Gly Pro Val Val Asp Lys Val Tyr Glu Glu Ile Asp Glu Val

165 170 175

Met Tyr Glu Ala Arg Gln Ala Val Val Asp Gln Ala Lys Leu Glu Glu

180 185 190

Glu Met Gly Asp Leu Leu Phe Ala Thr Val Asn Leu Ala Arg His Leu

195 200 205

Gly Thr Lys Ala Glu Ile Ala Leu Gln Lys Ala Asn Glu Lys Phe Glu

210 215 220

Arg Arg Phe Arg Glu Val Glu Arg Ile Val Ala Ala Arg Gly Leu Glu

225 230 235 240

Met Thr Gly Val Asp Leu Glu Thr Met Glu Glu Val Trp Gln Gln Val

245 250 255

Lys Arg Gln Glu Ile Asp Leu

260

<210> 3

<211> 1650

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(bacillus coli)

<400> 3

atgaaaaaca tcaatccaac gcagaccgct gcctggcagg cactacagaa acacttcgat 60

gaaatgaaag acgttacgat cgccgatctt tttgctaaag acggcgatcg tttttctaag 120

ttctccgcaa ccttcgacga tcagatgctg gtggattact ccaaaaaccg catcactgaa 180

gagacgctgg cgaaattaca ggatctggcg aaagagtgcg atctggcggg cgcgattaag 240

tcgatgttct ctggcgagaa gatcaaccgc actgaaaacc gcgccgtgct gcacgtagcg 300

ctgcgtaacc gtagcaatac cccgattttg gttgatggca aagacgtaat gccggaagtc 360

aacgcggtgc tggagaagat gaaaaccttc tcagaagcga ttatttccgg tgagtggaaa 420

ggttataccg gcaaagcaat cactgacgta gtgaacatcg ggatcggcgg ttctgacctc 480

ggcccataca tggtgaccga agctctgcgt ccgtacaaaa accacctgaa catgcacttt 540

gtttctaacg tcgatgggac tcacatcgcg gaagtgctga aaaaagtaaa cccggaaacc 600

acgctgttct tggtagcatc taaaaccttc accactcagg aaactatgac caacgcccat 660

agcgcgcgtg actggttcct gaaagcggca ggtgatgaaa aacacgttgc aaaacacttt 720

gcggcgcttt ccaccaatgc caaagccgtt ggcgagtttg gtattgatac tgccaacatg 780

ttcgagttct gggactgggt tggcggccgt tactctttgt ggtcagcgat tggcctgtcg 840

attgttctct ccatcggctt tgataacttc gttgaactgc tttccggcgc acacgcgatg 900

gacaagcatt tctccaccac gcctgccgag aaaaacctgc ctgtactgct ggcgctgatt 960

ggcatctggt acaacaattt ctttggtgcg gaaactgaag cgattctgcc gtatgaccag 1020

tatatgcacc gtttcgcggc gtacttccag cagggcaata tggagtccaa cggtaagtat 1080

gttgaccgta acggtaacgt tgtggattac cagactggcc cgattatctg gggtgaacca 1140

ggcactaacg gtcagcacgc gttctaccag ctgatccacc agggaaccaa aatggtaccg 1200

tgcgatttca tcgctccggc tatcacccat aacccgctct ctgatcatca ccagaaactg 1260

ctgtctaact tcttcgccca gaccgaagcg ctggcgtttg gtaaatcccg cgaagtggtt 1320

gagcaggaat atcgtgatca gggtaaagat ccggcaacgc ttgactacgt ggtgccgttc 1380

aaagtattcg aaggtaaccg cccgaccaac tccatcctgc tgcgtgaaat cactccgttc 1440

agcctgggtg cgttgattgc gctgtatgag cacaaaatct ttactcaggg cgtgatcctg 1500

aacatcttca ccttcgacca gtggggcgtg gaactgggta aacagctggc gaaccgtatt 1560

ctgccagagc tgaaagatga taaagaaatc agcagccacg atagctcgac caatggtctg 1620

attaaccgct ataaagcgtg gcgcggttaa 1650

<210> 4

<211> 549

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(bacillus coli)

<400> 4

Met Lys Asn Ile Asn Pro Thr Gln Thr Ala Ala Trp Gln Ala Leu Gln

1 5 10 15

Lys His Phe Asp Glu Met Lys Asp Val Thr Ile Ala Asp Leu Phe Ala

20 25 30

Lys Asp Gly Asp Arg Phe Ser Lys Phe Ser Ala Thr Phe Asp Asp Gln

35 40 45

Met Leu Val Asp Tyr Ser Lys Asn Arg Ile Thr Glu Glu Thr Leu Ala

50 55 60

Lys Leu Gln Asp Leu Ala Lys Glu Cys Asp Leu Ala Gly Ala Ile Lys

65 70 75 80

Ser Met Phe Ser Gly Glu Lys Ile Asn Arg Thr Glu Asn Arg Ala Val

85 90 95

Leu His Val Ala Leu Arg Asn Arg Ser Asn Thr Pro Ile Leu Val Asp

100 105 110

Gly Lys Asp Val Met Pro Glu Val Asn Ala Val Leu Glu Lys Met Lys

115 120 125

Thr Phe Ser Glu Ala Ile Ile Ser Gly Glu Trp Lys Gly Tyr Thr Gly

130 135 140

Lys Ala Ile Thr Asp Val Val Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu

145 150 155 160

Gly Pro Tyr Met Val Thr Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Lys Asn His Leu

165 170 175

Asn Met His Phe Val Ser Asn Val Asp Gly Thr His Ile Ala Glu Val

180 185 190

Leu Lys Lys Val Asn Pro Glu Thr Thr Leu Phe Leu Val Ala Ser Lys

195 200 205

Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Met Thr Asn Ala His Ser Ala Arg Asp

210 215 220

Trp Phe Leu Lys Ala Ala Gly Asp Glu Lys His Val Ala Lys His Phe

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ser Thr Asn Ala Lys Ala Val Gly Glu Phe Gly Ile Asp

245 250 255

Thr Ala Asn Met Phe Glu Phe Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser

260 265 270

Leu Trp Ser Ala Ile Gly Leu Ser Ile Val Leu Ser Ile Gly Phe Asp

275 280 285

Asn Phe Val Glu Leu Leu Ser Gly Ala His Ala Met Asp Lys His Phe

290 295 300

Ser Thr Thr Pro Ala Glu Lys Asn Leu Pro Val Leu Leu Ala Leu Ile

305 310 315 320

Gly Ile Trp Tyr Asn Asn Phe Phe Gly Ala Glu Thr Glu Ala Ile Leu

325 330 335

Pro Tyr Asp Gln Tyr Met His Arg Phe Ala Ala Tyr Phe Gln Gln Gly

340 345 350

Asn Met Glu Ser Asn Gly Lys Tyr Val Asp Arg Asn Gly Asn Val Val

355 360 365

Asp Tyr Gln Thr Gly Pro Ile Ile Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly

370 375 380

Gln His Ala Phe Tyr Gln Leu Ile His Gln Gly Thr Lys Met Val Pro

385 390 395 400

Cys Asp Phe Ile Ala Pro Ala Ile Thr His Asn Pro Leu Ser Asp His

405 410 415

His Gln Lys Leu Leu Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Glu Ala Leu Ala

420 425 430

Phe Gly Lys Ser Arg Glu Val Val Glu Gln Glu Tyr Arg Asp Gln Gly

435 440 445

Lys Asp Pro Ala Thr Leu Asp Tyr Val Val Pro Phe Lys Val Phe Glu

450 455 460

Gly Asn Arg Pro Thr Asn Ser Ile Leu Leu Arg Glu Ile Thr Pro Phe

465 470 475 480

Ser Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His Lys Ile Phe Thr Gln

485 490 495

Gly Val Ile Leu Asn Ile Phe Thr Phe Asp Gln Trp Gly Val Glu Leu

500 505 510

Gly Lys Gln Leu Ala Asn Arg Ile Leu Pro Glu Leu Lys Asp Asp Lys

515 520 525

Glu Ile Ser Ser His Asp Ser Ser Thr Asn Gly Leu Ile Asn Arg Tyr

530 535 540

Lys Ala Trp Arg Gly

545

<210> 5

<211> 768

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

gtgtttaatt ctgacaacct gagactcgac ggaaaatgcg ccatcatcac aggtgcgggt 60

gcaggtattg gtaaagaaat cgccattaca ttcgcgacag ctggcgcatc tgtggtggtc 120

agtgatatta acgccgacgc agctaaccat gttgtagacg aaattcaaca actgggtggt 180

caggcatttg cctgccgttg tgatattact tccgaacagg aactctctgc actggcagac 240

tttgctatca gtaagctggg taaagttgat attctggtta acaacgccgg tggcggtgga 300

cctaaaccgt ttgatatgcc aatggcggat tttcgccgtg cttatgaact gaatgtgttt 360

tcttttttcc atctgtcaca acttgttgcg ccagaaatgg aaaaaaatgg cggtggcgtt 420

attctgacca tcacttctat ggcggcagaa aataaaaata taaacatgac ttcctatgca 480

tcatctaaag ctgcggccag tcatctggtc agaaatatgg cgtttgacct gggtgaaaaa 540

aatattcggg taaatggcat tgcgccgggg gcaatattaa ccgatgccct gaaatccgtt 600

attacaccag aaattgaaca aaaaatgtta cagcacacgc cgatcagacg tctgggccaa 660

ccgcaagata ttgctaacgc agcgctgttc ctttgctcgc ctgctgcgag ctgggtaagc 720

ggacaaattc tcaccgtctc cggtggtggg gtacaggagc tcaattaa 768

<210> 6

<211> 255

<212> PRT

<213> 大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

Met Phe Asn Ser Asp Asn Leu Arg Leu Asp Gly Lys Cys Ala Ile Ile

1 5 10 15

Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ile Gly Lys Glu Ile Ala Ile Thr Phe Ala

20 25 30

Thr Ala Gly Ala Ser Val Val Val Ser Asp Ile Asn Ala Asp Ala Ala

35 40 45

Asn His Val Val Asp Glu Ile Gln Gln Leu Gly Gly Gln Ala Phe Ala

50 55 60

Cys Arg Cys Asp Ile Thr Ser Glu Gln Glu Leu Ser Ala Leu Ala Asp

65 70 75 80

Phe Ala Ile Ser Lys Leu Gly Lys Val Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala

85 90 95

Gly Gly Gly Gly Pro Lys Pro Phe Asp Met Pro Met Ala Asp Phe Arg

100 105 110

Arg Ala Tyr Glu Leu Asn Val Phe Ser Phe Phe His Leu Ser Gln Leu

115 120 125

Val Ala Pro Glu Met Glu Lys Asn Gly Gly Gly Val Ile Leu Thr Ile

130 135 140

Thr Ser Met Ala Ala Glu Asn Lys Asn Ile Asn Met Thr Ser Tyr Ala

145 150 155 160

Ser Ser Lys Ala Ala Ala Ser His Leu Val Arg Asn Met Ala Phe Asp

165 170 175

Leu Gly Glu Lys Asn Ile Arg Val Asn Gly Ile Ala Pro Gly Ala Ile

180 185 190

Leu Thr Asp Ala Leu Lys Ser Val Ile Thr Pro Glu Ile Glu Gln Lys

195 200 205

Met Leu Gln His Thr Pro Ile Arg Arg Leu Gly Gln Pro Gln Asp Ile

210 215 220

Ala Asn Ala Ala Leu Phe Leu Cys Ser Pro Ala Ala Ser Trp Val Ser

225 230 235 240

Gly Gln Ile Leu Thr Val Ser Gly Gly Gly Val Gln Glu Leu Asn

245 250 255

<210> 7

<211> 990

<212> DNA

<213> Streptococcus

<400> 7

atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60

gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120

actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180

ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240

aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300

gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360

caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420

actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480

cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcagcg 540

gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600

atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactatcatc tgttgaacga agccgccttc 660

gaacagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720

caggcagcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtgtat 780

gagaacgaac gcgatctatt ctttgaagat aaatccaacg acgtgatcca ggatgacgta 840

ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctgtttaccg ggcaccaggc attcctgaca 900

gcagaagctc tgaccagtat ttctcagact acgctgcaaa acttaagcaa tctggaaaaa 960

ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa 990

<210> 8

<211> 329

<212> PRT

<213> Streptococcus

<400> 8

Met Lys Leu Ala Val Tyr Ser Thr Lys Gln Tyr Asp Lys Lys Tyr Leu

1 5 10 15

Gln Gln Val Asn Glu Ser Phe Gly Phe Glu Leu Glu Phe Phe Asp Phe

20 25 30

Leu Leu Thr Glu Lys Thr Ala Lys Thr Ala Asn Gly Cys Glu Ala Val

35 40 45

Cys Ile Phe Val Asn Asp Asp Gly Ser Arg Pro Val Leu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Lys His Gly Val Lys Tyr Ile Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn

65 70 75 80

Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Lys Glu Leu Gly Leu Lys Val Val Arg

85 90 95

Val Pro Ala Tyr Asp Pro Glu Ala Val Ala Glu His Ala Ile Gly Met

100 105 110

Met Met Thr Leu Asn Arg Arg Ile His Arg Ala Tyr Gln Arg Thr Arg

115 120 125

Asp Ala Asn Phe Ser Leu Glu Gly Leu Thr Gly Phe Thr Met Tyr Gly

130 135 140

Lys Thr Ala Gly Val Ile Gly Thr Gly Lys Ile Gly Val Ala Met Leu

145 150 155 160

Arg Ile Leu Lys Gly Phe Gly Met Arg Leu Leu Ala Phe Asp Pro Tyr

165 170 175

Pro Ser Ala Ala Ala Leu Glu Leu Gly Val Glu Tyr Val Asp Leu Pro

180 185 190

Thr Leu Phe Ser Glu Ser Asp Val Ile Ser Leu His Cys Pro Leu Thr

195 200 205

Pro Glu Asn Tyr His Leu Leu Asn Glu Ala Ala Phe Glu Gln Met Lys

210 215 220

Asn Gly Val Met Ile Val Asn Thr Ser Arg Gly Ala Leu Ile Asp Ser

225 230 235 240

Gln Ala Ala Ile Glu Ala Leu Lys Asn Gln Lys Ile Gly Ser Leu Gly

245 250 255

Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Arg Asp Leu Phe Phe Glu Asp Lys Ser

260 265 270

Asn Asp Val Ile Gln Asp Asp Val Phe Arg Arg Leu Ser Ala Cys His

275 280 285

Asn Val Leu Phe Thr Gly His Gln Ala Phe Leu Thr Ala Glu Ala Leu

290 295 300

Thr Ser Ile Ser Gln Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser Asn Leu Glu Lys

305 310 315 320

Gly Glu Thr Cys Pro Asn Glu Leu Val

325

<210> 9

<211> 792

<212> DNA

<213> Ruminococcus

<400> 9

atgacattga gagaaaaata tggagaatgg ggaattattt taggcgctac tgaaggtgtc 60

ggaaaagcat tttgtgaaag gcttgccaaa gaaggtatga atgtcgtaat ggtcggacgc 120

cgtgaagaaa aattaaaaga gctcggtgag gaactaaaaa acacttatga gattgattat 180

aaagtcgtaa aagcagactt ttcgctgcca gatgctactg acaaaatttt tgctgcaaca 240

gaaaatctgg atatgggatt tatggcctat gtagcctgct tacactcttt tggcaaaatc 300

caggatacac cttgggaaaa gcatgaggca atgatcaacg taaacgttgt tacatttatg 360

aaatgcttct atcactatat gaaaatcttt gctgcacagg atcgcggtgc tgtcatcaac 420

gtatcttcta tgactggaat ttccagttca ccatggaatg gccaatatgg tgcaggaaag 480

gcattcattt taaaaatgac agaggctgtt gcctgtgaaa cggaaaagac caatgttgat 540

gtggaagtca tcactttggg aactactctg acaccaagtc ttttaagcaa cctgcctggc 600

ggaccacagg gggaagctgt tatgaagact gctcaaacac cggaagaagt tgtggacgaa 660

gcttttgaaa aattaggaaa agaactgtct gtcatttccg gagagcgtaa taaagccagc 720

gtccatgact ggaaagcgaa tcatacagaa gatgactata tccgctatat gggatctttc 780

tatcaagaat aa 792

<210> 10

<211> 263

<212> PRT

<213> Ruminococcus

<400> 10

Met Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala

1 5 10 15

Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Arg Leu Ala Lys Glu Gly

20 25 30

Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Lys Glu Leu

35 40 45

Gly Glu Glu Leu Lys Asn Thr Tyr Glu Ile Asp Tyr Lys Val Val Lys

50 55 60

Ala Asp Phe Ser Leu Pro Asp Ala Thr Asp Lys Ile Phe Ala Ala Thr

65 70 75 80

Glu Asn Leu Asp Met Gly Phe Met Ala Tyr Val Ala Cys Leu His Ser

85 90 95

Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Ala Met Ile

100 105 110

Asn Val Asn Val Val Thr Phe Met Lys Cys Phe Tyr His Tyr Met Lys

115 120 125

Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Met

130 135 140

Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln Tyr Gly Ala Gly Lys

145 150 155 160

Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Thr Glu Lys

165 170 175

Thr Asn Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Leu Thr Pro

180 185 190

Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln Gly Glu Ala Val Met

195 200 205

Lys Thr Ala Gln Thr Pro Glu Glu Val Val Asp Glu Ala Phe Glu Lys

210 215 220

Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ser Gly Glu Arg Asn Lys Ala Ser

225 230 235 240

Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Asp Tyr Ile Arg Tyr

245 250 255

Met Gly Ser Phe Tyr Gln Glu

260

<210> 11

<211> 786

<212> DNA

<213> Bacillus

<400> 11

atgtatacag atttaaaaga taaagtagtt gtaattacag gtggatcaac aggtttagga 60

cgcgcaatgg ctgttcgttt cggtcaagaa gaagcaaaag ttgttattaa ctattacaac 120

aatgaagaag aagctttaga tgcgaaaaaa gaagtagaag aagcaggcgg acaagcaatc 180

atcgttcaag gcgacgtaac aaaagaagaa gatgttgtaa accttgttca aacagctatt 240

aaagaattcg gtacattaga cgttatgatt aataacgctg gtgttgaaaa cccagttcct 300

tctcatgagt tatctttaga caactggaat aaagtaatcg atacaaactt aacgggcgca 360

tttttaggaa gccgcgaagc gattaaatat tttgttgaaa acgacattaa aggaaacgtt 420

attaacatgt ctagtgttca tgaaatgatt ccttggccat tatttgttca ttacgcagca 480

agtaaaggcg gtatgaaact aatgacgaaa acattggctc ttgaatatgc gccaaaaggt 540

atccgcgtaa ataacattgg accaggtgcg atgaacacac caattaacgc agagaaattt 600

gcagatcctg tacaacgtgc agacgtagaa agcatgattc caatgggtta catcggtaaa 660

ccagaagaag tagcagcagt tgcagcattc ttagcatcat cacaagcaag ctatgtaaca 720

ggtattacat tatttgctga tggtggtatg acgctgtacc cttctttcca agcaggaaga 780

ggctaa 786

<210> 12

<211> 261

<212> PRT

<213> Bacillus

<400> 12

Met Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Lys Val Val Val Ile Thr Gly Gly Ser

1 5 10 15

Thr Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Val Arg Phe Gly Gln Glu Glu Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Asn Asn Glu Glu Glu Ala Leu Asp Ala

35 40 45

Lys Lys Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Gln Ala Ile Ile Val Gln Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Val Asn Leu Val Gln Thr Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Val Glu

85 90 95

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu Asp Asn Trp Asn Lys Val

100 105 110

Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Met Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Lys Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Met Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Val Gln Arg Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Lys Pro Glu Glu Val

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Phe Leu Ala Ser Ser Gln Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

Claims

1.工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113，其特征在于，

所述工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113由含有7α-HSDH基因片段和LDH基因片段的质粒载体转入敲除mazG基因片段的底盘菌株中获得；

所述含有7α-HSDH基因片段和LDH基因片段的质粒载体是由7α-HSDH基因和LDH基因导入pBAD质粒载体获得；

所述敲除mazG基因片段的底盘菌株是由大肠杆菌BW25113菌株敲除mazG基因获得；

所述7α-HSDH基因具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；

所述LDH基因具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；

所述mazG基因具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.全细胞催化CDCA生产UDCA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

权利要求1所述工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113催化鹅去氧胆酸转变成中间体7-酮石胆酸；

工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113催化中间体7-酮石胆酸转变成熊去氧胆酸。

3.依据权利要求2所述的全细胞催化CDCA生产UDCA的方法，其特征在于，

所述工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113催化鹅去氧胆酸转变成中间体7-酮石胆酸包括如下步骤：

PB缓冲溶液中加入全细胞催化剂菌体7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113，加入CDCA和丙酮酸钠，控制反应条件生成中间体7-酮石胆酸。

4.依据权利要求2所述的全细胞催化CDCA生产UDCA的方法，其特征在于，

所述工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113催化中间体7-酮石胆酸转变成熊去氧胆酸包括如下步骤：

在中间体7-酮石胆酸的反应溶液中加入工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113，加入葡萄糖，控制反应条件生成熊去氧胆酸。

5.依据权利要求2所述的全细胞催化CDCA生产UDCA的方法，其特征在于，

所述工程菌7α-HSDH-LDH-ΔmazG BW25113与CDCA加入的质量比为1:3。

6.依据权利要求2所述的全细胞催化CDCA生产UDCA的方法，其特征在于，

所述反应条件的pH值为7.5、温度为30℃。

7.依据权利要求2所述的全细胞催化CDCA生产UDCA的方法，其特征在于，

所述工程菌7β-HSDH-GDH-Δpgi BW25113由含有7β-HSDH基因片段和GDH基因片段的质粒载体转入敲除pgi基因片段的底盘菌株中获得；

所述含有7β-HSDH基因片段和GDH基因片段的质粒载体是由7β-HSDH基因和GDH基因导入pBAD质粒载体获得；

所述敲除pgi基因片段的底盘菌株是由大肠杆菌BW25113菌株敲除pgi基因获得；

所述7β-HSDH基因具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；

所述GDH基因具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列；

所述pgi基因具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。