CN109402212A - 生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用，生物转化法包括基因密码子优化、工程菌构建、工程菌培养、底物转化及产物制备；采用工程菌直接发酵转化底物制备牛磺熊去氧胆酸，底物为牛磺鹅去氧胆酸。底物浓度可高达250g/L，反应时间短，对底物的转化率高达98％以上，所获得的产品纯度在99％以上；反应体系中NAD+循环再生，极大降低了辅酶NAD+的使用量，酶催化反应的成本降低，利于工业放大；将类固醇脱氢酶和辅酶再生酶通过柔性多肽序列连接在一起构建成融合蛋白多聚体，与底物和辅酶的结合距离更近，更有利于转化反应的进行，在工业化生产中，减少发酵的次数，简化了工艺，节约时间成本和原料成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种采用基因工程手段对生物酶进行改造后，高效催化牛磺鹅去氧胆酸生物转化的方法，具体为生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用。
背景技术
牛磺熊去氧胆酸，化学名称为3α,7β-二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。牛磺熊去氧胆酸主要是存在于黑熊胆汁中，是熊胆中标志性有效成分。2007年，商品名为滔罗特的牛磺熊去氧胆酸胶囊，获准在中国销售。其主要用于溶解胆固醇结石。熊去氧胆酸，是亲水性的胆汁酸，溶石率有限，安全性好，副作用较少，已被广泛用于临床。牛磺熊去氧胆酸，是熊去氧胆酸与牛磺酸的共轭体，与熊去氧胆酸相比，亲水性更强，溶石速度更快，安全性更好。
牛磺鹅去氧胆酸，广泛存在于鸡、鸭、鹅等禽畜胆汁中，与牛磺熊去氧胆酸是7位羟基上的差向异构体。
起初，牛磺熊去氧胆酸是从“人工引流”的黑熊胆汁中提取的，来源有限，收率低，批次间差异大，对动物不人道。后来，逐渐被人工合成方法所取代。人工化学合成方法，主要分为三类：一是通过形成活性中间体如混合酸酐、活性硫酯等，再与牛磺酸钠反应；二是在缩合剂作用下形成酰胺；三是通过胱胺类物质形成酰硫化物再氧化得到目的产物。这些方法选择性低，使用大量有机试剂，污染环境。
为了解决“人工引流”熊胆汁提取和人工化学合成方法的缺陷，逐渐发展出用生物转化的方法制备牛磺熊去氧胆酸。中国发明专利CN102994604A公开了一种通过7α-类固醇脱氢酶和7β-类固醇脱氢酶两步催化，将牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸的方法。此种方法中，底物浓度较低(50g/L)，底物转化不完全，需要使用大量成本昂贵的辅酶，反应中间体牛磺7-酮石胆酸作为副产物难以去除。中国发明专利CN107287272A公开了一种制备牛磺熊去氧胆酸的方法。其分别构建含有7α-类固醇脱氢酶和7β-类固醇脱氢酶的表达载体或二者的共表达载体，在培养基中加入底物，发酵的同时进行转化，将牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸。但此种方法底物浓度低、转化率低，反应中间体牛磺7-酮石胆酸含量高，转化周期长，不易进行工业化生产。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术中的不足之处，提供生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用，特别是创造性的将类固醇脱氢酶和辅酶再生酶通过柔性多肽序列连接在一起构建成融合蛋白多聚体，与底物和辅酶的结合距离更近，更有利于转化反应的进行，能够实现高收率、高纯度牛磺熊去氧胆酸的制备。
技术方案：生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法，生物转化法包括基因密码子优化、工程菌构建、工程菌培养、底物转化及产物制备；采用工程菌直接发酵转化底物制备牛磺熊去氧胆酸，底物为牛磺鹅去氧胆酸；所述工程菌是表达7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶单表达酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶共表达酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合酶与乳酸脱氢酶共表达酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合酶与7α-类固醇脱氢酶共表达酶；或者，7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶单表达酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶与葡萄糖脱氢酶共表达酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶与7β-类固醇脱氢酶共表达酶的大肠杆菌。
优选的，7α-类固醇脱氢酶基因来源于Campylobacter hyointestinalis(UniProt:CDQ67_02445)，乳酸脱氢酶基因来源于Human(UniProt:P00338)，7β-类固醇脱氢酶基因来源于Collinsella aerofaciens ATCC 25986(UniProt:A4ECA9)和葡萄糖脱氢酶基因来源于Bacillus subtilis(strain 168)(UniProt:P12310)。
优选的，生物转化法的具体步骤如下：
(1)基因密码子优化
对基因序列进行大肠杆菌表达密码子优化，加入亲和标签，并进行全基因合成，分别记为7α-类固醇脱氢酶基因7α-HSDH、乳酸脱氢酶基因LDH、7β-类固醇脱氢酶基因7β-HSDH、葡萄糖脱氢酶基因GDH；
(2)单基因表达载体构建
将7α-HSDH、LDH、7β-HSDH和GDH分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-7α-HSDH，pETDuet-1-LDH，pETDuet-1-7β-HSDH，pETDuet-1-GDH；
(3)双基因表达载体构建
将7α-HSDH和LDH，7β-HSDH和GDH分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-7α-HSDH/LDH，pETDuet-1-7β-HSDH/GDH；
(4)单基因融合蛋白表达载体构建
将7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)；
(5)单基因融合蛋白与脱氢酶共表达载体构建
将7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与乳酸脱氢酶单基因，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与葡萄糖脱氢酶单基因分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH；
(6)单基因融合蛋白与类固醇脱氢酶共表达载体构建
将7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与7α-类固醇脱氢酶单基因，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与7β-类固醇脱氢酶单基因分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH；
(7)工程菌构建
将步骤(2)-步骤(6)构建的所有表达载体分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，得到工程菌；
(8)工程菌小量发酵表达
工程菌菌液涂布氨苄抗性的LB平板，挑选单克隆，接种至5mL含有氨苄的LB培养基中，37℃，220rpm，进行培养，OD值为0.8-1.2时，加入1mM IPTG诱导2h，SDS-PAGE检测表达量，选取表达量高的克隆，进行菌种保藏。20μL菌种接种至200mL氨苄抗性LB培养基中过夜培养，OD值为2.5-4.0，取2mL培养液接种至氨苄抗性培养基中培养，OD值为1时，加入IPTG诱导过夜表达，收集菌体；
(9)工程菌大量发酵表达
挑选工程菌接种至氨苄抗性LB培养基的1L三角瓶中，37℃，220rpm过夜培养，OD600值为2.5-4.0，各取20mL培养液接种至含有10个1L氨苄抗性培养基的3L三角瓶中，37℃，140rpm过夜培养；将10L种子液无菌接种至装有200L大肠杆菌高密度发酵培养基的发酵罐中，37℃，通气搅拌培养8小时，通气搅拌培养8小时后，向发酵罐中加入终浓度为0.1mM的IPTG溶液进行诱导，诱导10-12h后发酵结束，放液，离心收集菌体并4℃保存，取少量菌体重悬于100mM磷酸盐缓冲液中，超声破碎，得到粗酶液；
(10)酶活力测定
7α-类固醇脱氢酶的酶活测定方法：以牛磺鹅去氧胆酸为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.97mL的100mM pH8.0磷酸缓冲液，终浓度0.5mM的牛磺鹅去氧胆酸，10μL的稀释酶液，终浓度0.5mM的NADP+，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值增加；
乳酸脱氢酶的酶活测定方法：以丙酮酸钠为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.7mL的100mM磷酸缓冲液(pH8.0)，0.2mL的100mM丙酮酸钠，50μL的稀释酶液，NADH终浓度为0.2mM，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值减少；
7β-类固醇脱氢酶的酶活测定方法：以牛磺熊去氧胆酸为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.97mL的100mM磷酸缓冲液(pH8.0)，终浓度0.5mM的牛磺熊去氧胆酸，10μL的稀释酶液，终浓度0.5mM的NADP+，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值增加；
葡萄糖脱氢酶的酶活测定方法：以葡萄糖为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.7mL的100mM磷酸缓冲液(pH8.0)，0.2mL的1.5M葡萄糖，50μL的稀释酶液，NADP+终浓度为2mM，在pH8.0和25℃反应2min，在340nm处测定吸光值增加；
(11)牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸
将牛磺鹅去氧胆酸溶解于20-100mM甘氨酸缓冲液中，加入0.01-0.8mM的NAD+，加入5-60g/L的丙酮酸钠，加入纯化后的或部分纯化的或细胞裂解液或菌体重悬液的表达7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的大肠杆菌菌体，补加20-100mM甘氨酸缓冲液至最终体积，用氢氧化钠调节pH至6.5-8.5，25℃，反应6-18h；加入1.8-100g/L的葡萄糖，加入纯化后的或部分纯化的或细胞裂解液或菌体重悬液的表达7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌菌体，用氢氧化钠调节pH至6.5-8.5，25℃，反应6-18h；
(12)牛磺熊去氧胆酸的制备
将步骤(11)转化完成的反应液，旋蒸至膏状，加入2-10倍的无水乙醇或95％乙醇，离心或过滤去除沉淀，上清液经干燥即得牛磺熊去氧胆酸粗品，把牛磺熊去氧胆酸粗品，使用乙腈溶解，0.22um滤膜过滤除去不溶物形成上柱液；将所述上柱液使用制备型高效液相制备设备注入装填硅胶层析填料的高压不锈钢柱中；然后使用不同浓度甲醇-水流动相进行逐步洗脱，将收集的洗脱液倒入旋转蒸发仪内进行旋转蒸发至粘稠状，同时回收甲醇；然后置于真空干燥箱内干燥，采用高效液相色谱法测定样品中牛磺熊去氧胆酸的纯度。
优选的，7α-类固醇脱氢酶的DNA序列为SEQ ID NO:1，乳酸脱氢酶的DNA序列为SEQID NO:3，7β-类固醇脱氢酶DNA序列为SEQ ID NO:5和葡萄糖脱氢酶的DNA序列为SEQ IDNO:7。
优选的，7α-类固醇脱氢酶的蛋白质序列为SEQ ID NO:2，乳酸脱氢酶的蛋白质序列为SEQ ID NO:4，7β-类固醇脱氢酶蛋白质序列为SEQ ID NO:6和葡萄糖脱氢酶的蛋白质序列为SEQ ID NO:8。
优选的，对7β-类固醇脱氢酶基因的A78和V116位点进行突变。
优选的，7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因的DNA序列为SEQ ID NO:9，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因的DNA序列为SEQ ID NO:11。
优选的，7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因的蛋白质序列为SEQ ID NO:10，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因的蛋白质序列为SEQ ID NO:12。
以上任一所述方法在制备熊去氧胆酸中的应用。
优选的，所述制备过程如下：在转化生成的牛磺熊去氧胆酸溶液中加入氢氧化钠调节pH至8-11，升温至80-100℃，反应18-24h，降温至10-15℃，加盐酸调节pH至3-5，析出熊去氧胆酸。
以上生物转化反应过程中，底物的浓度为20-250g/L。
以上所有酶均可以为液体酶或固定化酶，也可以是全细胞、未经纯化的酶或纯化的酶。
本发明所述方法的原理如附图1所示。以牛磺鹅去氧胆酸为底物，通过使用基因工程手段改造后的7α-类固醇脱氢酶，转化为牛磺7-酮石胆酸，同时共表达或融合表达的乳酸脱氢酶在丙酮酸钠存在的情况下将辅酶NAD+循环再生；然后7β-类固醇脱氢酶将牛磺7-酮石胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸，同时共表达或融合表达的葡萄糖脱氢酶在葡萄糖存在的情况下将NAD+循环再生。上述方法中融合表达蛋白是将类固醇脱氢酶和辅酶再生酶通过柔性多肽序列连接在一起构建成融合蛋白多聚体，使底物和辅酶的结合距离更近，更有利于转化反应的进行，能够实现高收率、高纯度牛磺熊去氧胆酸的制备。
有益效果：(1)底物浓度可高达250g/L，反应时间短，对底物的转化率高达98％以上，所获得的产品纯度在99％以上；(2)反应中间物牛磺7-酮石胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸的效率高，最终产品中几乎不含有副产物；(3)使用7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶以及7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，在反应体系中使NAD+循环再生，极大降低了辅酶NAD+的使用量，使酶催化反应的成本降低，利于工业放大；(4)将类固醇脱氢酶和辅酶再生酶通过柔性多肽序列连接在一起构建成融合蛋白多聚体，与底物和辅酶的结合距离更近，更有利于转化反应的进行，在工业化生产中，减少发酵的次数，简化了工艺，节约时间成本和原料成本；(5)可以使用7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶以及7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的全细胞进行牛磺鹅去氧胆酸的转化，避免了破碎细胞、细胞液澄清、酶的亲和纯化等工业成本大的步骤，节约大量成本，且过程简单可控。
附图说明
图1本发明利用生物转化方法制备牛磺熊去氧胆酸的原理图；
图2类固醇脱氢酶与辅酶再生酶融合表达催化底物示意图；
图3是本发明方法制备所得的牛磺熊去氧胆酸的HPLC图谱；
具体实施方式
重组质粒的构建方法具体如下：
1.单基因表达载体的构建
a)含有7α-类固醇脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-7α-HSDH的制备
将来源于Campylobacter hyointestinalis的7α-类固醇脱氢酶基因(DNA序列：SEQ ID NO:1，编码的蛋白质序列：SEQ ID NO:2)，用引物对(SEQ ID NO:13)5′-CGGGATCCATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQ ID NO:14)5′-CGGAATTCTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3′通过PCR进行扩增，用BamH I和EcoR I酶切，用Dpn I酶消化模板。用BamH I和EcoR I酶切pETDuet-1载体。用连接酶连接7α-类固醇脱氢酶基因片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mLLB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
b)含有乳酸脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-LDH的制备
将来源于Human的乳酸脱氢酶基因(DNA序列：SEQ ID NO:3，编码的蛋白质序列：SEQ ID NO:4)用引物对(SEQ ID NO:15)5′-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQID NO:16)5′-TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3′通过PCR进行扩增，用Nde I和Ava I酶切，用Dpn I酶消化模板。将pETDuet-1质粒用Nde I和Ava I酶切，用连接酶连接乳酸脱氢酶基因片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
c)含有7β-类固醇脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-7β-HSDH的制备
将来源于Collinsella aerofaciens ATCC 25986的7β-类固醇脱氢酶基因的突变子(A78C，V116C)(DNA序列：SEQ ID NO:5，编码的蛋白质序列：SEQ ID NO:6)用引物对(SEQID NO:17)5′-CGGGATCCATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQ ID NO:18)
5′-CGGAATTCTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3′通过PCR进行扩增，用BamH I和EcoR I酶切，用Dpn I酶消化模板。用BamH I和EcoR I酶切pETDuet-1载体。用连接酶连接7β-类固醇脱氢酶基因片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
d)含有葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-GDH的制备
将来源于Bacillus subtilis(strain 168)的葡萄糖脱氢酶基因(DNA序列：SEQID NO:7，编码的蛋白质序列：SEQ ID NO:8)用引物对(SEQ ID NO:15)5′-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQ ID NO:19)5′-TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3′通过PCR进行扩增，用Nde I和Ava I酶切，用Dpn I酶消化模板。将pETDuet-1质粒用Nde I和Ava I酶切，用连接酶连接乳酸脱氢酶片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
2.双基因共表达载体的构建
a)含有7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-7α-HSDH/LDH的制备
将来源于Human的乳酸脱氢酶基因用引物对(SEQ ID NO:15)5′-GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQ ID NO:16)5′-TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3′通过PCR进行扩增，用Nde I和Ava I酶切，用Dpn I酶消化模板。将上述测序正确的pETDuet-1-7α-HSDH质粒用Nde I和Ava I酶切，用连接酶连接乳酸脱氢酶基因片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
b)含有7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-7β-HSDH/GDH的制备
将来源于Bacillus subtilis(strain 168)的葡萄糖脱氢酶基因用引物对(SEQID NO:15)5′-GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQ ID NO:19)5′-TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3′通过PCR进行扩增，用Nde I和Ava I酶切，用Dpn I酶消化模板。将上述测序正确的pETDuet-1-7β-HSDH质粒用Nde I和Ava I酶切，用连接酶连接乳酸脱氢酶片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
3.单基因表达融合蛋白载体的构建
a)7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因重组质粒pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)的制备
将7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因(DNA序列：SEQ ID NO:9，编码的蛋白质序列：SEQ ID NO:10)用引物对(SEQ ID NO:15)5′-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQ ID NO:14)5′-CGGAATTCTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3′通过PCR进行扩增，用BamH I和EcoR I酶切，用Dpn I酶消化模板。用BamH I和EcoR I酶切pETDuet-1载体。用连接酶连接7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因基因片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
b)7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因重组质粒pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)的制备
将7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因(DNA序列：SEQ ID NO:11，编码的蛋白质序列：SEQ ID NO:12)用引物对(SEQ ID NO:15)5′-GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和5′-(SEQ ID NO:18)CGGAATTCTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3′通过PCR进行扩增，用BamH I和EcoR I酶切，用Dpn I酶消化模板。用BamH I和EcoR I酶切pETDuet-1载体。用连接酶连接7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因基因片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
4.单基因融合蛋白与脱氢酶共表达表达载体的构建
a)含有7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与乳酸脱氢酶基因共表达的重组质粒pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH的制备
将来源于Human的乳酸脱氢酶基因用引物对(SEQ ID NO:15)5′-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQ ID NO:16)5′-TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3′通过PCR进行扩增，用Nde I和Ava I酶切，用Dpn I酶消化模板。将pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)质粒用Nde I和Ava I酶切，用连接酶连接乳酸脱氢酶基因片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
b)含有7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与葡萄糖脱氢酶基因共表达的重组质粒pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH的制备
将来源于Bacillus subtilis(strain 168)的葡萄糖脱氢酶基因用引物对(SEQID NO:15)5′-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQ ID NO:19)5′-TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3′通过PCR进行扩增，用Nde I和Ava I酶切，用Dpn I酶消化模板。将pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)质粒用Nde I和Ava I酶切，用连接酶连接葡萄糖脱氢酶片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
5.单基因融合蛋白与类固醇脱氢酶共表达表达载体的构建
a)含有7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与7α-类固醇脱氢酶基因共表达的重组质粒pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH的制备
将来源于Campylobacter hyointestinalis的7α-类固醇脱氢酶基因，用引物对(SEQ ID NO:15)5′-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQ ID NO:20)5′-TCCCTCGAGTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3′通过PCR进行扩增，用Nde I和Ava I酶切，用Dpn I酶消化模板。将pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)质粒用Nde I和Ava I酶切，用连接酶连接7α-类固醇脱氢酶基因片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
b)含有7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与7β-类固醇脱氢酶基因共表达的重组质粒pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH的制备
将来源于Collinsella aerofaciens ATCC 25986的7β-类固醇脱氢酶基因的突变子(A78C，V116C)用引物对(SEQ ID NO:15)5′-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′和(SEQ ID NO:21)5′-TCCCTCGAGTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3′通过PCR进行扩增，用Nde I和AvaI酶切，用Dpn I酶消化模板。将pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)质粒用Nde I和Ava I酶切，用连接酶连接7β-类固醇脱氢酶片段和载体。连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒。
实施例1含有重组质粒的大肠杆菌在三角瓶中发酵表达
取20μL含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌种，接种至200mL氨苄抗性LB培养基中，37℃，220rpm，过夜培养，OD600值为2.5-4.0。取20mL培养液接种至1L氨苄抗性培养基中，37℃，140rpm，培养3小时，OD600值为1时，加入0.5mM IPTG诱导过夜表达。离心收集菌体。取少量菌体重悬于100mM磷酸盐缓冲液中，超声破碎，得到粗酶液。按照技术方案中的方法测定酶活。
实施例2含有重组质粒的大肠杆菌在发酵罐中发酵表达
取20μL含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌种，接种至200mL氨苄抗性LB培养基中，37℃，220rpm，过夜培养，OD600值为2.5-4.0。取20mL培养液接种至1L氨苄抗性培养基中，37℃，140rpm，过夜培养。将10L种子液无菌接种至装有200L大肠杆菌高密度发酵培养基的发酵罐中，37℃，通气搅拌培养8小时。大肠杆菌高密度发酵培养基含有：18g/L的十二水磷酸氢二钾，6.8g/L的磷酸二氢钾，0.7g/L的无水硫酸钠，0.48g/L的硫酸镁，2.25g/L的甘油，2.5g/L的酵母粉，5g/L的蛋白胨。通气搅拌培养8小时后，向发酵罐中加入终浓度为0.1mM的IPTG溶液进行诱导，诱导10-12h后发酵结束，放液，离心收集菌体并4℃保存。取少量菌体重悬于100mM磷酸盐缓冲液中，超声破碎，得到粗酶液。按照技术方案中的方法测定酶活。
实施例3 1L反应体系中用单基因表达蛋白转化牛磺熊去氧胆酸
将250g牛磺鹅去氧胆酸溶解于700mL的100mM甘氨酸缓冲液中，加入0.25mM的NAD+，加入60g/L的丙酮酸钠，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的7α-类固醇脱氢酶(含纯酶约5g)和乳酸脱氢酶(含纯酶约2g)，补加100mM甘氨酸缓冲液至1L，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。加入100g/L的葡萄糖，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的7β-类固醇脱氢酶(含纯酶约5g)和葡萄糖脱氢酶(含纯酶约2g)的大肠杆菌，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。底物转化率在98％以上，成品含量在96.8％以上，收率大于85％。
实施例4 1L反应体系中用双基因共表达蛋白转化牛磺熊去氧胆酸
将250g牛磺鹅去氧胆酸溶解于700mL的100mM甘氨酸缓冲液中，加入0.25mM的NAD+，加入60g/L的丙酮酸钠，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的共表达7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶(含酶量共约10g)，补加100mM甘氨酸缓冲液至1L，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。加入100g/L的葡萄糖，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的共表达7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶(含酶量共约10g)，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。底物转化率在98％以上，成品含量在96.8％以上，收率大于85％。
实施例5 1L反应体系中用单基因表达融合蛋白转化牛磺熊去氧胆酸
将250g牛磺鹅去氧胆酸溶解于700mL的100mM甘氨酸缓冲液中，加入0.25mM的NAD+，加入60g/L的丙酮酸钠，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶(含酶量约5g)，补加100mM甘氨酸缓冲液至1L，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。加入100g/L的葡萄糖，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶(含酶量约5g)，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。底物转化率在99.7％以上，成品含量在96.8％以上，收率大于85％。
实施例6 1L反应体系中用单基因融合蛋白与脱氢酶共表达蛋白转化牛磺熊去氧胆酸
将250g牛磺鹅去氧胆酸溶解于700mL的100mM甘氨酸缓冲液中，加入0.20mM的NAD+，加入60g/L的丙酮酸钠，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的共表达7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶与乳酸脱氢酶(含酶量共约7g)，补加100mM甘氨酸缓冲液至1L，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。加入100g/L的葡萄糖，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的共表达7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶与葡萄糖脱氢酶(含酶量共约7g)，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。底物转化率在98.5％以上，成品含量在96.8％以上，收率大于85％。
实施例7 1L反应体系中用单基因融合蛋白与类固醇脱氢酶共表达蛋白转化牛磺熊去氧胆酸
将250g牛磺鹅去氧胆酸溶解于700mL的100mM甘氨酸缓冲液中，加入0.50mM的NAD+，加入60g/L的丙酮酸钠，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的共表达7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶与7α-类固醇脱氢酶(含酶量共约7g)，补加100mM甘氨酸缓冲液至1L，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。加入100g/L的葡萄糖，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的共表达7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶与7β-类固醇脱氢酶(含酶量共约7g)，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。底物转化率在99.5％以上，成品含量在96.8％以上，收率大于85％。
实施例8 100L反应体系中单基因表达融合蛋白转化牛磺熊去氧胆酸
将25Kg牛磺鹅去氧胆酸溶解于70L的100mM甘氨酸缓冲液中，加入0.25mM的NAD+，加入60g/L的丙酮酸钠，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶(含酶量约500g)，补加100mM甘氨酸缓冲液至100L，用5MNaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。加入100g/L的葡萄糖，加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶(含酶量约500g)，用5M NaOH调节pH至7.5。25℃，反应6-18h。底物转化率在99.5％以上，成品含量在96.8％以上，收率大于85％。
实施例3-8结果汇总表
实施例9牛磺熊去氧胆酸的制备
将上述转化完成的反应液，旋蒸至膏状，加入10倍体积的无水乙醇或95％乙醇，离心或过滤去除沉淀。上清液经真空干燥即得牛磺熊去氧胆酸粗品。把反应后的牛磺熊去氧胆酸粗品，使用乙腈溶解粗品，0.22um滤膜过滤除去不溶物形成上柱液；将所述上柱液使用制备型HPLC注入装填C18硅胶填料的高压不锈钢柱中(柱子规格15*255mm)；然后使用30％甲醇-水溶液配制的流动相A注入不锈钢柱中进行洗脱，洗脱速度为240mL/h，洗脱时间为175分钟，收集洗脱液1；再将流动相梯度在50分钟内线性提升至50％流动相B(80％甲醇-水溶液)进行洗脱，保持50％流动相B洗脱75分钟，收集洗脱液2；将洗脱梯度在40分钟内线性提升至100％流动相B，保持100％流动相B洗脱70分钟，收集洗脱液3；将收集的洗脱液倒入旋转蒸发仪内进行旋转蒸发至粘稠状，同时回收甲醇；然后置于真空干燥箱内干燥，采用高效液相色谱法测定样品中牛磺熊去氧胆酸胆酸的纯度，以质量分数计，其中洗脱液1中牛磺熊去氧胆酸含量为5.77％，回收率为8.2％，洗脱液2中牛磺熊去氧胆酸含量为99.3％，回收率为81.5％，洗脱液3中牛磺熊去氧胆酸含量为14.9％，回收率为10.3％。
实施例10熊去氧胆酸的制备
向上述转化完成的反应液中，pH至10，升温至100℃，反应24h，降温至10℃，加盐酸调节pH至4，析出熊去氧胆酸。即得熊去氧胆酸粗品。
序列表
<110> 江苏邦泽生物医药技术股份有限公司
<120> 生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 840
<212> DNA
<213> Campylobacter hyointestinalis
<400> 1
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catgagttgc 60
tataacgatg agtttaaagg taaaaccctg gttattagcg gtggcacccg cggtattggt 120
cgcgccattg ttctggaatt tgccaatgca ggtgcaaata ttgcattcac ttttaatagc 180
aacaaggaaa tggccgaaga acaggcccgt gaactggaaa ataagtttgg tattaaggcc 240
cgcgcctatg cactgaatat tctggaaccg gaaagttata aagaactgtt tctgcagatt 300
gatgaagatt ttgatcgtgt ggatttcttt attagcaatg ccattattag cggccgtgcc 360
gttgcaggcg gttataccaa attcatgaaa ctgaaaccgc gcggtattaa taatattttt 420
accgccaccg tgaatgcatt tgtttgcggt acacaggaag ccgccaaacg tatggaaaaa 480
gttggtggtg gtagcgttat tagtctgagc agtaccggca atctggtgta tattgaacat 540
tatagcggcc atggcaccgc caaagcagca gtggaagcca tggcccgcta tgcagcaacc 600
gaactgggcg ataaaaatat tcgtgttaat gttgttagcg gcggtccgat tgaaaccgat 660
gcactgcgtg cctttaccaa ttatgaagaa gtgcgcgatg caaccgcagc cctgagcccg 720
ctgggtcgta tgggccagcc gaccgatctg gccggcgcat gtctgtttct gtgtagcagc 780
aaagccagtt gggtgaccgg tcataccttt attattgatg gtggcaccac ctttaaataa 840
<210> 2
<211> 279
<212> PRT
<213> Campylobacter hyointestinalis
<400> 2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Gly Met Ser Cys Tyr Asn Asp Glu Phe Lys Gly Lys Thr Leu Val Ile
20 25 30
Ser Gly Gly Thr Arg Gly Ile Gly Arg Ala Ile Val Leu Glu Phe Ala
35 40 45
Asn Ala Gly Ala Asn Ile Ala Phe Thr Phe Asn Ser Asn Lys Glu Met
50 55 60
Ala Glu Glu Gln Ala Arg Glu Leu Glu Asn Lys Phe Gly Ile Lys Ala
65 70 75 80
Arg Ala Tyr Ala Leu Asn Ile Leu Glu Pro Glu Ser Tyr Lys Glu Leu
85 90 95
Phe Leu Gln Ile Asp Glu Asp Phe Asp Arg Val Asp Phe Phe Ile Ser
100 105 110
Asn Ala Ile Ile Ser Gly Arg Ala Val Ala Gly Gly Tyr Thr Lys Phe
115 120 125
Met Lys Leu Lys Pro Arg Gly Ile Asn Asn Ile Phe Thr Ala Thr Val
130 135 140
Asn Ala Phe Val Cys Gly Thr Gln Glu Ala Ala Lys Arg Met Glu Lys
145 150 155 160
Val Gly Gly Gly Ser Val Ile Ser Leu Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val
165 170 175
Tyr Ile Glu His Tyr Ser Gly His Gly Thr Ala Lys Ala Ala Val Glu
180 185 190
Ala Met Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Glu Leu Gly Asp Lys Asn Ile Arg
195 200 205
Val Asn Val Val Ser Gly Gly Pro Ile Glu Thr Asp Ala Leu Arg Ala
210 215 220
Phe Thr Asn Tyr Glu Glu Val Arg Asp Ala Thr Ala Ala Leu Ser Pro
225 230 235 240
Leu Gly Arg Met Gly Gln Pro Thr Asp Leu Ala Gly Ala Cys Leu Phe
245 250 255
Leu Cys Ser Ser Lys Ala Ser Trp Val Thr Gly His Thr Phe Ile Ile
260 265 270
Asp Gly Gly Thr Thr Phe Lys
275
<210> 4
<211> 1050
<212> DNA
<213> human
<400> 4
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catggcaacc 60
ctgaaagatc agctgatcta taatctgctg aaagaagaac agaccccgca gaataagatt 120
accgtggtgg gcgtgggtgc agtgggcatg gcctgcgcaa ttagcattct gatgaaagat 180
ctggcagatg aactggcact ggtggatgtg attgaagata aactgaaagg cgaaatgatg 240
gatctgcagc atggtagtct gtttctgcgt accccgaaaa ttgtgagtgg taaagattat 300
aatgtgaccg caaatagcaa actggttatt attaccgcag gcgcccgtca gcaggaaggt 360
gaaagtcgtc tgaatctggt gcagcgtaat gtgaatattt ttaaattcat catccctaac 420
gtggttaaat atagcccgaa ttgcaaactg ctgattgtga gcaatccggt ggatattctg 480
acctatgttg cctggaaaat tagtggtttt ccgaaaaatc gtgttattgg cagcggctgt 540
aatctggata gtgcacgttt tcgctatctg atgggcgaac gtctgggcgt tcatccgctg 600
agttgccacg gttgggtgct gggtgaacat ggtgacagca gcgttccggt ttggagcggc 660
atgaatgtgg ccggtgttag tctgaaaacc ctgcatccgg atctgggtac agataaagat 720
aaagaacagt ggaaagaagt tcataaacag gtggttgaaa gtgcatacga agtgattaag 780
ctgaaaggct ataccagctg ggcaattggt ctgagcgttg cagatctggc agaaagtatt 840
atgaaaaatc tgcgccgtgt gcatccggtt agcaccatga ttaagggcct gtatggtatt 900
aaggatgatg tgtttctgag cgtgccgtgc attctgggcc agaatggtat tagtgatctg 960
gttaaagtta ccctgaccag tgaagaagaa gcacgtctga aaaaatctgc agataccctg 1020
tggggcattc agaaagaact gcagttttaa 1050
<210> 4
<211> 349
<212> PRT
<213> human
<400> 4
Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Gly Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Glu
20 25 30
Glu Gln Thr Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val
35 40 45
Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu
50 55 60
Leu Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met
65 70 75 80
Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser
85 90 95
Gly Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr
100 105 110
Ala Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln
115 120 125
Arg Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr
130 135 140
Ser Pro Asn Cys Lys Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu
145 150 155 160
Thr Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile
165 170 175
Gly Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly
180 185 190
Glu Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Val Leu Gly
195 200 205
Glu His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Met Asn Val Ala
210 215 220
Gly Val Ser Leu Lys Thr Leu His Pro Asp Leu Gly Thr Asp Lys Asp
225 230 235 240
Lys Glu Gln Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Glu Ser Ala Tyr
245 250 255
Glu Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser
260 265 270
Val Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His
275 280 285
Pro Val Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Asp Asp Val
290 295 300
Phe Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Leu
305 310 315 320
Val Lys Val Thr Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ala Arg Leu Lys Lys Ser
325 330 335
Ala Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe
340 345
<210> 5
<211> 843
<212> DNA
<213> Collinsella aerofaciens
<400> 5
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catgaacctg 60
cgtgaaaaat acggtgaatg gggtctgatc ctgggtgcta ccgaaggtgt tggtaaagct 120
ttctgcgaaa aaatcgctgc tggtggtatg aacgttgtta tggttggtcg tcgtgaagaa 180
aaactgaacg ttctggctgg tgaaatccgt gaaacctacg gtgttgaaac caaagttgtt 240
cgtgctgact tctctcagcc gggtgctgct gaaaccgttt tctgcgctac cgaaggtctg 300
gacatgggtt tcatgtctta cgttgcttgc ctgcactctt tcggtaaaat ccaggacacc 360
ccgtgggaaa aacacgaagc tatgatcaac gttaactgcg ttaccttcct gaaatgcttc 420
caccactaca tgcgtatctt cgctgctcag gaccgtggtg ctgttatcaa cgtttcttct 480
atgaccggta tctcttcttc tccgtggaac ggtcagtacg gtgctggtaa agctttcatc 540
ctgaaaatga ccgaagctgt tgcttgcgaa tgcgaaggta ccggtgttga cgttgaagtt 600
atcaccctgg gtaccaccct gaccccgtct ctgctgtcta acctgccggg tggtccgcag 660
ggtgaagctg ttatgaaaat cgctctgacc ccggaagaat gcgttgacga agctttcgaa 720
aaactgggta aagaactgtc tgttatcgct ggtcagcgta acaaagactc tgttcacgac 780
tggaaagcta accacaccga agacgaatac atccgttaca tgggttcttt ctaccgtgac 840
taa 843
<210> 6
<211> 280
<212> PRT
<213> Collinsella aerofaciens
<400> 6
Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Gly Met Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Leu Ile Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Lys Ile Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Asn Val
50 55 60
Leu Ala Gly Glu Ile Arg Glu Thr Tyr Gly Val Glu Thr Lys Val Val
65 70 75 80
Arg Ala Asp Phe Ser Gln Pro Gly Ala Ala Glu Thr Val Phe Cys Ala
85 90 95
Thr Glu Gly Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Leu His
100 105 110
Ser Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Ala Met
115 120 125
Ile Asn Val Asn Cys Val Thr Phe Leu Lys Cys Phe His His Tyr Met
130 135 140
Arg Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser
145 150 155 160
Met Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln Tyr Gly Ala Gly
165 170 175
Lys Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Cys Glu
180 185 190
Gly Thr Gly Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Leu Thr
195 200 205
Pro Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln Gly Glu Ala Val
210 215 220
Met Lys Ile Ala Leu Thr Pro Glu Glu Cys Val Asp Glu Ala Phe Glu
225 230 235 240
Lys Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ala Gly Gln Arg Asn Lys Asp
245 250 255
Ser Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Glu Tyr Ile Arg
260 265 270
Tyr Met Gly Ser Phe Tyr Arg Asp
275 280
<210> 7
<211> 837
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 7
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catgtacccg 60
gatctgaaag gcaaagttgt tgcaattacc ggtgccgcca gtggcctggg caaagccatg 120
gcaattcgtt ttggcaaaga acaggccaaa gtggttatta attattatag caacaagcag 180
gacccgaatg aagttaaaga agaagtgatt aaggccggtg gtgaagcagt tgttgttcag 240
ggtgacgtga ccaaagaaga agatgttaaa aatatcgtgc agaccgccat taaggaattt 300
ggcaccctgg atattatgat taataatgcc ggcctggaaa atccggttcc gagccatgaa 360
atgccgctga aagattggga taaagttatt ggcaccaatc tgaccggcgc atttctgggt 420
agtcgtgaag ccattaagta ttttgtggaa aatgatatta agggcaacgt tattaacatg 480
agcagcgtgc atgaagtgat tccgtggccg ctgtttgttc attatgcagc aagcaaaggt 540
ggtattaagc tgatgaccga aaccctggca ctggaatatg caccgaaagg tattcgcgtg 600
aataatattg gcccgggtgc cattaatacc ccgattaatg cagaaaaatt cgccgatccg 660
aaacagaaag cagatgtgga aagtatgatt ccgatgggct atattggtga accggaagaa 720
attgccgcag tggcagcatg gctggcaagc aaagaagcaa gctatgttac cggtattacc 780
ctgtttgcag atggcggtat gacccagtat ccgagctttc aggccggtcg tggttaa 837
<210> 8
<211> 278
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 8
Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Gly Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala
20 25 30
Ala Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln
35 40 45
Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu
50 55 60
Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln
65 70 75 80
Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu
100 105 110
Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys
115 120 125
Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala
130 135 140
Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met
145 150 155 160
Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu
180 185 190
Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile
195 200 205
Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala
210 215 220
Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu
225 230 235 240
Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val
245 250 255
Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser
260 265 270
Phe Gln Ala Gly Arg Gly
275
<210> 9
<211> 1881
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catggcaacc 60
ctgaaagatc agctgatcta taatctgctg aaagaagaac agaccccgca gaataagatt 120
accgtggtgg gcgtgggtgc agtgggcatg gcctgcgcaa ttagcattct gatgaaagat 180
ctggcagatg aactggcact ggtggatgtg attgaagata aactgaaagg cgaaatgatg 240
gatctgcagc atggtagtct gtttctgcgt accccgaaaa ttgtgagtgg taaagattat 300
aatgtgaccg caaatagcaa actggttatt attaccgcag gcgcccgtca gcaggaaggt 360
gaaagtcgtc tgaatctggt gcagcgtaat gtgaatattt ttaaattcat catccctaac 420
gtggttaaat atagcccgaa ttgcaaactg ctgattgtga gcaatccggt ggatattctg 480
acctatgttg cctggaaaat tagtggtttt ccgaaaaatc gtgttattgg cagcggctgt 540
aatctggata gtgcacgttt tcgctatctg atgggcgaac gtctgggcgt tcatccgctg 600
agttgccacg gttgggtgct gggtgaacat ggtgacagca gcgttccggt ttggagcggc 660
atgaatgtgg ccggtgttag tctgaaaacc ctgcatccgg atctgggtac agataaagat 720
aaagaacagt ggaaagaagt tcataaacag gtggttgaaa gtgcatacga agtgattaag 780
ctgaaaggct ataccagctg ggcaattggt ctgagcgttg cagatctggc agaaagtatt 840
atgaaaaatc tgcgccgtgt gcatccggtt agcaccatga ttaagggcct gtatggtatt 900
aaggatgatg tgtttctgag cgtgccgtgc attctgggcc agaatggtat tagtgatctg 960
gttaaagtta ccctgaccag tgaagaagaa gcacgtctga aaaaatctgc agataccctg 1020
tggggcattc agaaagaact gcagtttggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 1080
ggcggcggca gcatgagttg ctataacgat gagtttaaag gtaaaaccct ggttattagc 1140
ggtggcaccc gcggtattgg tcgcgccatt gttctggaat ttgccaatgc aggtgcaaat 1200
attgcattca cttttaatag caacaaggaa atggccgaag aacaggcccg tgaactggaa 1260
aataagtttg gtattaaggc ccgcgcctat gcactgaata ttctggaacc ggaaagttat 1320
aaagaactgt ttctgcagat tgatgaagat tttgatcgtg tggatttctt tattagcaat 1380
gccattatta gcggccgtgc cgttgcaggc ggttatacca aattcatgaa actgaaaccg 1440
cgcggtatta ataatatttt taccgccacc gtgaatgcat ttgtttgcgg tacacaggaa 1500
gccgccaaac gtatggaaaa agttggtggt ggtagcgtta ttagtctgag cagtaccggc 1560
aatctggtgt atattgaaca ttatagcggc catggcaccg ccaaagcagc agtggaagcc 1620
atggcccgct atgcagcaac cgaactgggc gataaaaata ttcgtgttaa tgttgttagc 1680
ggcggtccga ttgaaaccga tgcactgcgt gcctttacca attatgaaga agtgcgcgat 1740
gcaaccgcag ccctgagccc gctgggtcgt atgggccagc cgaccgatct ggccggcgca 1800
tgtctgtttc tgtgtagcag caaagccagt tgggtgaccg gtcatacctt tattattgat 1860
ggtggcacca cctttaaata a 1881
<210> 10
<211> 626
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Gly Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Glu
20 25 30
Glu Gln Thr Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val
35 40 45
Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu
50 55 60
Leu Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met
65 70 75 80
Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser
85 90 95
Gly Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr
100 105 110
Ala Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln
115 120 125
Arg Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr
130 135 140
Ser Pro Asn Cys Lys Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu
145 150 155 160
Thr Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile
165 170 175
Gly Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly
180 185 190
Glu Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Val Leu Gly
195 200 205
Glu His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Met Asn Val Ala
210 215 220
Gly Val Ser Leu Lys Thr Leu His Pro Asp Leu Gly Thr Asp Lys Asp
225 230 235 240
Lys Glu Gln Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Glu Ser Ala Tyr
245 250 255
Glu Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser
260 265 270
Val Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His
275 280 285
Pro Val Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Asp Asp Val
290 295 300
Phe Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Leu
305 310 315 320
Val Lys Val Thr Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ala Arg Leu Lys Lys Ser
325 330 335
Ala Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe Gly Gly Gly
340 345 350
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Cys Tyr
355 360 365
Asn Asp Glu Phe Lys Gly Lys Thr Leu Val Ile Ser Gly Gly Thr Arg
370 375 380
Gly Ile Gly Arg Ala Ile Val Leu Glu Phe Ala Asn Ala Gly Ala Asn
385 390 395 400
Ile Ala Phe Thr Phe Asn Ser Asn Lys Glu Met Ala Glu Glu Gln Ala
405 410 415
Arg Glu Leu Glu Asn Lys Phe Gly Ile Lys Ala Arg Ala Tyr Ala Leu
420 425 430
Asn Ile Leu Glu Pro Glu Ser Tyr Lys Glu Leu Phe Leu Gln Ile Asp
435 440 445
Glu Asp Phe Asp Arg Val Asp Phe Phe Ile Ser Asn Ala Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Arg Ala Val Ala Gly Gly Tyr Thr Lys Phe Met Lys Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Gly Ile Asn Asn Ile Phe Thr Ala Thr Val Asn Ala Phe Val Cys
485 490 495
Gly Thr Gln Glu Ala Ala Lys Arg Met Glu Lys Val Gly Gly Gly Ser
500 505 510
Val Ile Ser Leu Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Tyr Ile Glu His Tyr
515 520 525
Ser Gly His Gly Thr Ala Lys Ala Ala Val Glu Ala Met Ala Arg Tyr
530 535 540
Ala Ala Thr Glu Leu Gly Asp Lys Asn Ile Arg Val Asn Val Val Ser
545 550 555 560
Gly Gly Pro Ile Glu Thr Asp Ala Leu Arg Ala Phe Thr Asn Tyr Glu
565 570 575
Glu Val Arg Asp Ala Thr Ala Ala Leu Ser Pro Leu Gly Arg Met Gly
580 585 590
Gln Pro Thr Asp Leu Ala Gly Ala Cys Leu Phe Leu Cys Ser Ser Lys
595 600 605
Ala Ser Trp Val Thr Gly His Thr Phe Ile Ile Asp Gly Gly Thr Thr
610 615 620
Phe Lys
625
<210> 11
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac gaaaacctgt attttcaggg catgtacccg 60
gatctgaaag gcaaagttgt tgcaattacc ggtgccgcca gtggcctggg caaagccatg 120
gcaattcgtt ttggcaaaga acaggccaaa gtggttatta attattatag caacaagcag 180
gacccgaatg aagttaaaga agaagtgatt aaggccggtg gtgaagcagt tgttgttcag 240
ggtgacgtga ccaaagaaga agatgttaaa aatatcgtgc agaccgccat taaggaattt 300
ggcaccctgg atattatgat taataatgcc ggcctggaaa atccggttcc gagccatgaa 360
atgccgctga aagattggga taaagttatt ggcaccaatc tgaccggcgc atttctgggt 420
agtcgtgaag ccattaagta ttttgtggaa aatgatatta agggcaacgt tattaacatg 480
agcagcgtgc atgaagtgat tccgtggccg ctgtttgttc attatgcagc aagcaaaggt 540
ggtattaagc tgatgaccga aaccctggca ctggaatatg caccgaaagg tattcgcgtg 600
aataatattg gcccgggtgc cattaatacc ccgattaatg cagaaaaatt cgccgatccg 660
aaacagaaag cagatgtgga aagtatgatt ccgatgggct atattggtga accggaagaa 720
attgccgcag tggcagcatg gctggcaagc aaagaagcaa gctatgttac cggtattacc 780
ctgtttgcag atggcggtat gacccagtat ccgagctttc aggccggtcg tggtggcggc 840
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagca tgaacctgcg tgaaaaatac 900
ggtgaatggg gtctgatcct gggtgctacc gaaggtgttg gtaaagcttt ctgcgaaaaa 960
atcgctgctg gtggtatgaa cgttgttatg gttggtcgtc gtgaagaaaa actgaacgtt 1020
ctggctggtg aaatccgtga aacctacggt gttgaaacca aagttgttcg tgctgacttc 1080
tctcagccgg gtgctgctga aaccgttttc tgcgctaccg aaggtctgga catgggtttc 1140
atgtcttacg ttgcttgcct gcactctttc ggtaaaatcc aggacacccc gtgggaaaaa 1200
cacgaagcta tgatcaacgt taactgcgtt accttcctga aatgcttcca ccactacatg 1260
cgtatcttcg ctgctcagga ccgtggtgct gttatcaacg tttcttctat gaccggtatc 1320
tcttcttctc cgtggaacgg tcagtacggt gctggtaaag ctttcatcct gaaaatgacc 1380
gaagctgttg cttgcgaatg cgaaggtacc ggtgttgacg ttgaagttat caccctgggt 1440
accaccctga ccccgtctct gctgtctaac ctgccgggtg gtccgcaggg tgaagctgtt 1500
atgaaaatcg ctctgacccc ggaagaatgc gttgacgaag ctttcgaaaa actgggtaaa 1560
gaactgtctg ttatcgctgg tcagcgtaac aaagactctg ttcacgactg gaaagctaac 1620
cacaccgaag acgaatacat ccgttacatg ggttctttct accgtgacta a 1671
<210> 12
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Gly Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala
20 25 30
Ala Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln
35 40 45
Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu
50 55 60
Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln
65 70 75 80
Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu
100 105 110
Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys
115 120 125
Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala
130 135 140
Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met
145 150 155 160
Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu
180 185 190
Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile
195 200 205
Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala
210 215 220
Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu
225 230 235 240
Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val
245 250 255
Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser
260 265 270
Phe Gln Ala Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Met Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly
290 295 300
Leu Ile Leu Gly Ala Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Lys
305 310 315 320
Ile Ala Ala Gly Gly Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu
325 330 335
Lys Leu Asn Val Leu Ala Gly Glu Ile Arg Glu Thr Tyr Gly Val Glu
340 345 350
Thr Lys Val Val Arg Ala Asp Phe Ser Gln Pro Gly Ala Ala Glu Thr
355 360 365
Val Phe Cys Ala Thr Glu Gly Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val
370 375 380
Ala Cys Leu His Ser Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys
385 390 395 400
His Glu Ala Met Ile Asn Val Asn Cys Val Thr Phe Leu Lys Cys Phe
405 410 415
His His Tyr Met Arg Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile
420 425 430
Asn Val Ser Ser Met Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln
435 440 445
Tyr Gly Ala Gly Lys Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala
450 455 460
Cys Glu Cys Glu Gly Thr Gly Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly
465 470 475 480
Thr Thr Leu Thr Pro Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln
485 490 495
Gly Glu Ala Val Met Lys Ile Ala Leu Thr Pro Glu Glu Cys Val Asp
500 505 510
Glu Ala Phe Glu Lys Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ala Gly Gln
515 520 525
Arg Asn Lys Asp Ser Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp
530 535 540
Glu Tyr Ile Arg Tyr Met Gly Ser Phe Tyr Arg Asp
545 550 555
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgggatccat gggcagcagc catcatca 28
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cggaattctt atttaaaggt ggtgcca 27
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggaattccat atgggcagca gccatcatca 30
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tccctcgagt taaaactgca gttctttct 29
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgggatccat gggcagcagc catcatca 28
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cggaattctt agtcacggta gaaagaac 28
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tccctcgagt taaccacgac cggcctgaaa gct 33
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tccctcgagt tatttaaagg tggtgcca 28
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tccctcgagt tagtcacggt agaaagaac 29
Claims (10)
1.生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，生物转化法包括基因密码子优化、工程菌构建、工程菌培养、底物转化及产物制备；采用工程菌直接发酵转化底物制备牛磺熊去氧胆酸，底物为牛磺鹅去氧胆酸；所述工程菌是表达7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶单表达酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶共表达酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合酶与乳酸脱氢酶共表达酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合酶与7α-类固醇脱氢酶共表达酶；或者，7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶单表达酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶与葡萄糖脱氢酶共表达酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶与7β-类固醇脱氢酶共表达酶的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，7α-类固醇脱氢酶基因来源于Campylobacter hyointestinalis(UniProt:CDQ67_02445)，乳酸脱氢酶基因来源于Human(UniProt:P00338)，7β-类固醇脱氢酶基因来源于Collinsellaaerofaciens ATCC 25986(UniProt:A4ECA9)和葡萄糖脱氢酶基因来源于Bacillussubtilis(strain 168)(UniProt:P12310)。
3.根据权利要求1所述的生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，生物转化法的具体步骤如下：
(1)基因密码子优化
对基因序列进行大肠杆菌表达密码子优化，加入亲和标签，并进行全基因合成，分别记为7α-类固醇脱氢酶基因7α-HSDH、乳酸脱氢酶基因LDH、7β-类固醇脱氢酶基因7β-HSDH、葡萄糖脱氢酶基因GDH；
(2)单基因表达载体构建
将7α-HSDH、LDH、7β-HSDH和GDH分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-7α-HSDH，pETDuet-1-LDH，pETDuet-1-7β-HSDH，pETDuet-1-GDH；
(3)双基因表达载体构建
将7α-HSDH和LDH，7β-HSDH和GDH分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-7α-HSDH/LDH，pETDuet-1-7β-HSDH/GDH；
(4)单基因融合蛋白表达载体构建
将7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)；
(5)单基因融合蛋白与脱氢酶共表达载体构建
将7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与乳酸脱氢酶单基因，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与葡萄糖脱氢酶单基因分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH；
(6)单基因融合蛋白与类固醇脱氢酶共表达载体构建
将7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与7α-类固醇脱氢酶单基因，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与7β-类固醇脱氢酶单基因分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH；
(7)工程菌构建
将步骤(2)-步骤(6)构建的所有表达载体分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，得到工程菌；
(8)工程菌小量发酵表达
工程菌菌液涂布氨苄抗性的LB平板，挑选单克隆，接种至5mL含有氨苄的LB培养基中，37℃，220rpm，进行培养，OD值为0.8-1.2时，加入1mM IPTG诱导2h，SDS-PAGE检测表达量，选取表达量高的克隆，进行菌种保藏。20μL菌种接种至200mL氨苄抗性LB培养基中过夜培养，OD值为2.5-4.0，取2mL培养液接种至氨苄抗性培养基中培养，OD值为1时，加入IPTG诱导过夜表达，收集菌体；
(9)工程菌大量发酵表达
挑选工程菌接种至氨苄抗性LB培养基的1L三角瓶中，37℃，220rpm过夜培养，OD600值为2.5-4.0，各取20mL培养液接种至含有10个1L氨苄抗性培养基的3L三角瓶中，37℃，140rpm过夜培养；将10L种子液无菌接种至装有200L大肠杆菌高密度发酵培养基的发酵罐中，37℃，通气搅拌培养8小时，通气搅拌培养8小时后，向发酵罐中加入终浓度为0.1mM的IPTG溶液进行诱导，诱导10-12h后发酵结束，放液，离心收集菌体并4℃保存，取少量菌体重悬于100mM磷酸盐缓冲液中，超声破碎，得到粗酶液；
(10)酶活力测定
7α-类固醇脱氢酶的酶活测定方法：以牛磺鹅去氧胆酸为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.97mL的100mM pH8.0磷酸缓冲液，终浓度0.5mM的牛磺鹅去氧胆酸，10μL的稀释酶液，终浓度0.5mM的NADP+，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值增加；
乳酸脱氢酶的酶活测定方法：以丙酮酸钠为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.7mL的100mM磷酸缓冲液(pH8.0)，0.2mL的100mM丙酮酸钠，50μL的稀释酶液，NADH终浓度为0.2mM，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值减少；
7β-类固醇脱氢酶的酶活测定方法：以牛磺熊去氧胆酸为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.97mL的100mM磷酸缓冲液(pH8.0)，终浓度0.5mM的牛磺熊去氧胆酸，10μL的稀释酶液，终浓度0.5mM的NADP+，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值增加；
葡萄糖脱氢酶的酶活测定方法：以葡萄糖为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.7mL的100mM磷酸缓冲液(pH8.0)，0.2mL的1.5M葡萄糖，50μL的稀释酶液，NADP+终浓度为2mM，在pH8.0和25℃反应2min，在340nm处测定吸光值增加；
(11)牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸
将牛磺鹅去氧胆酸溶解于20-100mM甘氨酸缓冲液中，加入0.01-0.8mM的NAD+，加入5-60g/L的丙酮酸钠，加入纯化后的或部分纯化的或细胞裂解液或菌体重悬液的表达7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的大肠杆菌菌体，补加20-100mM甘氨酸缓冲液至最终体积，用氢氧化钠调节pH至6.5-8.5，25℃，反应6-18h；加入1.8-100g/L的葡萄糖，加入纯化后的或部分纯化的或细胞裂解液或菌体重悬液的表达7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌菌体，用氢氧化钠调节pH至6.5-8.5，25℃，反应6-18h；
(12)牛磺熊去氧胆酸的制备
将步骤(11)转化完成的反应液，旋蒸至膏状，加入2-10倍的无水乙醇或95％乙醇，离心或过滤去除沉淀，上清液经干燥即得牛磺熊去氧胆酸粗品，把牛磺熊去氧胆酸粗品，使用乙腈溶解，0.22um滤膜过滤除去不溶物形成上柱液；将所述上柱液使用制备型高效液相制备设备注入装填硅胶层析填料的高压不锈钢柱中；然后使用不同浓度甲醇-水流动相进行逐步洗脱，将收集的洗脱液倒入旋转蒸发仪内进行旋转蒸发至粘稠状，同时回收甲醇；然后置于真空干燥箱内干燥，采用高效液相色谱法测定样品中牛磺熊去氧胆酸的纯度。
4.根据权利要求2或3所述的生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，7α-类固醇脱氢酶的DNA序列为SEQ ID NO:1，乳酸脱氢酶的DNA序列为SEQ ID NO:3，7β-类固醇脱氢酶DNA序列为SEQ ID NO:5和葡萄糖脱氢酶的DNA序列为SEQ ID NO:7。
5.根据权利要求2或3所述的生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，7α-类固醇脱氢酶的蛋白质序列为SEQ ID NO:2，乳酸脱氢酶的蛋白质序列为SEQ ID NO:4，7β-类固醇脱氢酶蛋白质序列为SEQ ID NO:6和葡萄糖脱氢酶的蛋白质序列为SEQ ID NO:8。
6.根据权利要求2或3所述的生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，对7β-类固醇脱氢酶基因的A78和V116位点进行突变。
7.根据权利要求3所述的生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因的DNA序列为SEQ ID NO:9，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因的DNA序列为SEQ ID NO:11。
8.根据权利要求3所述的生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因的蛋白质序列为SEQ ID NO:10，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因的蛋白质序列为SEQ ID NO:12。
9.权利要求1或2所述方法在制备熊去氧胆酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述制备过程如下：在转化生成的牛磺熊去氧胆酸溶液中加入氢氧化钠调节pH至8-11，升温至80-100℃，反应18-24h，降温至10-15℃，加盐酸调节pH至3-5，析出熊去氧胆酸。
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