CN106520889A

CN106520889A - 一种3α‑羟基‑7氧代‑5β‑胆烷酸的制备方法及其制备用酶3

Info

Publication number: CN106520889A
Application number: CN201710012411.6A
Authority: CN
Inventors: 傅荣昭; 刘立辉; 刘滔滔; 曹磊
Original assignee: BONTAC BIO-ENGINEERING (SHENZHEN) Co Ltd; Meishan New Biological Technology Co Ltd
Current assignee: BONTAC BIO-ENGINEERING (SHENZHEN) Co Ltd; Meishan New Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-01-09
Filing date: 2017-01-09
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2037-01-09
Also published as: CN106520889B

Abstract

本发明涉及一种利用生物酶催化技术制备3α‑羟基‑7氧代‑5β‑胆烷酸的方法及其制备用7α‑类固醇脱氢酶。该方法以鹅去氧胆酸为底物，在NAD、乳酸脱氢酶、丙酮酸钠以及缓冲溶液存在的条件下，用7α‑类固醇脱氢酶催化鹅去氧胆酸制备3α‑羟基‑7氧代‑5β胆烷酸，其中7α‑类固醇脱氢酶来源于Brevundimonas naejangsanensis。该方法操作简单、反应条件温和易控、反应时间短、对底物的转化率高达99.8%以上，所获得的产品的含量在96.8%以上。

Description

一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶3

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物技术领域，特别涉及一种利用生物酶催化技术制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法及其制备用7α-类固醇脱氢酶。

背景技术

3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸又名7-酮石胆酸，是制备熊去氧胆酸的重要中间体。而熊去氧胆酸是名贵中药熊胆的主要有效成分，具有增加胆汁酸分泌、并使胆汁成分改变、降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂等功效，主要用于治疗胆石疾病。众所周知，熊胆是一种非常稀缺的资源，原因在于其获取的传统途径主要是依赖于人工养殖活熊取胆的方法。目前，这种周期长、收率低且不人道的传统途径逐渐被人工合成方法所取代，而现知的人工合成熊去氧胆酸的方法中，3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸都是极为重要的中间体。

目前3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的工业化生产多采用化学法，但是存在操作条件苛刻、选择性低、污染环境、使用大量有机溶剂、存在有机溶剂残留、有毒有害等缺点。为了解决化学法存在的诸多缺点，人们另辟蹊径，寻找更好的生产途径。中国发明专利CN1912192B公开了一种采用电化学合成制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法，但是此种方法依然需要使用有机溶剂，并且成本较高。中国发明专利申请CN105368828A公开了一种采用全细胞催化制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法，但是此种方法需进行细胞发酵培养，存在反应时间长、操作繁琐、产物复杂等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的新的制备方法，以解决上述背景技术中提到的现有制备方法所存在的有机溶剂残留、条件苛刻、反应时间长、操作繁琐、成本较高、污染环境等缺点，本发明同时提供了该新制备方法适用的生物酶。

为实现上述目的，发明人经过长期大量的实验摸索，在经历上百次的失败尝试之后，终于筛选出适用于细胞外生物催化制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的生物酶，并在此序列基础上进行优化，获得了活性提高和去除底物抑制的突变体酶，从而开发出一种新的制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法，其特征在于：以鹅去氧胆酸为底物，在NAD、乳酸脱氢酶、丙酮酸钠以及缓冲溶液存在的条件下，用7α-类固醇脱氢酶催化鹅去氧胆酸制备3α-羟基-7氧代-5β胆烷酸，所述7α-类固醇脱氢酶来源于Brevundimonas naejangsanensis，所述乳酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，在整个催化反应体系中，所述底物的浓度为50～100mg/mL，所述NAD的浓度为0.01～0.25mg/mL，所述丙酮酸钠的浓度为10～30mg/mL。

上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包括液态酶、固态酶以及各种固定化酶，可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。

优选地，控制所述催化过程在温度为25～35℃，pH值为7.5～8.5的条件下进行。

优选地，所述缓冲溶液为50～100mM磷酸钾缓冲液。

优选地，上述制备方法还包括如下提纯步骤：待所述催化过程反应结束后，调节pH值为1.0～2.0，搅拌20～30min，待冷却后再经过滤水洗干燥后即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸成品。

更优选地，上述制备方法还包括如下精制步骤：将获得的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸成品用8-15倍无水乙醇50-60℃水浴条件下搅拌回流0.5-1h，过滤，取滤液进行真空减压浓缩至1/4-1/5体积，再加入4-5倍纯水搅拌1h，过滤，将滤饼真空干燥过夜，即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸精制品。

优选地，上述制备方法中所使用的7α-类固醇脱氢酶为如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质，

（b）在（a）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且在NAD存在下以鹅去氧胆酸为底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的亲本高的7α-类固醇脱氢酶催化活性的由（a）衍生的蛋白质。

更优选地，所述7α-类固醇脱氢酶与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第40位、第41位、第66位、第67位、第144位、第157位、第190位以及第192位。

更优选地，所述7α-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变：D40K、L41R、D66K、V67R、S144A、Y157W、I190R以及T192A。

本发明还提供了一种7α-类固醇脱氢酶，所述7α-类固醇脱氢酶来源于Brevundimonas naejangsanensis，用于催化鹅去氧胆酸制备3α-羟基-7氧代-5β胆烷酸，所述7α-类固醇脱氢酶为如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质，

优选地，所述7α-类固醇脱氢酶与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第40位、第41位、第66位、第67位、第144位、第157位、第190位以及第192位。

优选地，所述7α-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变：D40K、L41R、D66K、V67R、S144A、Y157W、I190R以及T192A。

有益效果：

1、与现有的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法相比，本发明提供的方法具有操作简单、反应条件温和易控、反应时间短、不使用有机溶剂、无毒无污染且成本低廉的优点，经实践证明，本发明提供的方法的反应时长仅需4～12小时，其对底物的转化率高达99.8%以上，所获得的产品的含量在96.8%以上。

2、本发明筛选出了适用于细胞外生物催化制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的7α-类固醇脱氢酶基因，并在此序列基础上进行优化，获得了活性提高和去除底物抑制的突变体酶，这些突变体酶表现出高的选择性使得该方法不会形成副产物，这些突变体酶的高催化活性和高专一性使得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸酶法大规模生产的成本更低，具有较高的工业应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或者制造商建议的条件进行。

本发明提供的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法的具体实施过程如下：

将鹅去氧胆酸悬浮于50～100mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）中，用10M的NaOH调节pH到8.0，再加入终浓度为10～30mg/mL的丙酮酸钠并用10M的NaOH调节pH到8.0，加入7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶，最后加入终浓度为0.01～0.25mg/mL的NAD，底物终浓度为50～100mg/mL，反应在温度25～35℃、200～400rpm和pH7.5～8.5进行，反应时间为4h～12h。每隔一定时间取反应液用流动相稀释50～100倍，微孔过滤后进样进行液相分析。液相检测使用Phenomenx Gemini 5μmNX-C18 110A 250×4.6mm为分析柱，流动相为乙腈:缓冲溶液（取磷酸二氢钠0.78g,溶解1L水中，用磷酸调 pH值为3，即可）:甲醇=30:37:40，用0.45um滤膜过滤后备用。柱温为40℃，示差检测器（RID），流速为0.8mL/min。待催化过程反应结束后，在快速搅拌的情况下加入盐酸至pH为1.0～2.0，继续搅拌20～30min，待冷却后过滤、经水洗三次后真空干燥后即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸成品。成品再用8-15倍无水乙醇50-60℃水浴条件下搅拌回流0.5-1h，过滤，取滤液进行真空减压浓缩至1/4-1/5体积，再加入4-5倍纯水搅拌1h，过滤，将滤饼真空干燥过夜，即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸精制品。

实施例1

含有亲本基因的共表达重组质粒pET22b-AH1-LDH的制备

将来源于Brevundimonas naejangsanensis的7α-类固醇脱氢酶基因AH1和来源于魏斯氏菌（Weissella sp）的乳酸脱氢酶基因LDH分别利用引物对5'CGCCATATGATGGACGCACATTTCCGACT3'和5'CCGGAATTCTCAGTCCAGCTCCTGAACGC3' 以及引物对5'CCGGAATTCAAGGAGATATACATATGAAGATCTTCGCGTACGGTA3'和5'CCGCTCGAGTTAATATTCCACCGCAATGC3'通过PCR扩增技术获得PCR产物后经过酶切处理，同时插入到表达载体pET22b（+）的Nde I和EcoR I位点以及EcoR I位点和Xho I位点，得到共表达重组质粒pET22b-AH1-LDH。经DNA测序，确定该被克隆的亲本7α-类固醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；确定该被克隆的亲本乳酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例2

含有7α-类固醇脱氢酶突变体的共表达重组质粒的制备

通过反向PCR技术对7α-类固醇脱氢酶亲本进行定点突变，在突变位置通过设计反向引物，利用上下游突变引物扩增目的片段，并在引物上引入相应突变，以重组质粒pET22b-AH1-LDH作为模板进行反向PCR，PCR产物经Dpn I酶消化模板处理后转化到大肠杆菌Rosetta(de3)，经过Amp的筛选后挑取菌落送测序。突变位点及引物设计如表1所示。

PCR体系为：TaKaRa EX Taq HS 0.25ul；10×Ex Taq Buffer 5ul；模板质粒1ul；dNTP（2.5mM each）4ul；上游引物 1ul;下游引物1ul；无菌水up to 50 ul。

PCR程序为：首先98℃2min；然后98℃10s，55-56℃30s，72℃7min，30个循环；最后72℃10min。

表1

引物名称	引物序列（5′至 3′）
		D40K+L41R上游	GCC GTC ACC AAA AGG GAC GCG GCC
D40K+L41R下游	GGC CGC GTC CCT TTT GGT GAC GGC
		D66K+V67R上游	CTG GCC TGC AAA AGG ACC GAT GAA
D66K+V67R下游	TTC ATC GGT CCT TTT GCA GGC CAG
		S144A上游	AAC ATC ACC GCG ATG GCG GGC
S144A下游	GCC CGC CAT CGC GGT GAT GTT
		Y157W上游	ATG GCG TCC TAT GGC TCG TCC
Y157W下游	GGA CGA GCC ATA GGA CGC CAT
		I190R+T192A上游	GGC GCC AGA AAG GCC GAC GCC
I190R+T192A下游	GCC GTC GGC CTT TCT GGC GCC

实施例3

酶液的制备

将实施例1和实施例2制备的亲本和突变体共表达重组质粒分别转入大肠杆菌Rosetta(de3)，再将获得的重组大肠杆菌接种在小体积的LB培养基（含有100μg/mL的Amp），30～37℃过夜培养后，以1～5%的接种量转接到一定体积的LB培养基中（含有100μg/mL的Amp），在30～37℃继续培养OD₆₀₀达到0.6～1.0加入终浓度为0.1mM～1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20～37℃诱导表达10～20h后离心收集菌体。发酵菌体悬浮于一定体积的50～100mM的磷酸钾缓冲液（pH8.0）中并超声波破胞，离心即得含有乳酸脱氢酶与7α-类固醇脱氢酶亲本或者与7α-类固醇脱氢酶突变体的粗酶液，可用于酶活力的测定以及3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的生物催化制备。

实施例4

酶活力的测定

7α-类固醇脱氢酶的酶活测定方法：以鹅去氧胆酸为底物，在一个3mL的反应体系中加入10uL的150mM鹅去氧胆酸，100uL的稀释酶液，NAD+终浓度为0.2mM，在pH8.0和25℃反应一定时间，在340nm处测定吸光值增加。

乳酸脱氢酶的酶活测定方法：以丙酮酸钠为底物，在一个3mL的反应体系中加入100uL的50mM丙酮酸钠，100uL的稀释酶液，NADH终浓度为0.2mM，在pH8.0和25℃反应一定时间，在340nm处测定吸光值减少。

酶活力的测定结果如表2所示，其中LDH为乳酸脱氢酶，7α-HSDH为7α-类固醇脱氢酶。

表2

类型	酶活力U/ml	温度稳定性	pH 稳定性
				LDH	1089.5±15.8	4-45℃	6.0-9.0
7α-HSDH亲本	712.2±24.3	4-50℃	6.0-9.0
				D40K+L41R	756.8±15.9	4-50℃	6.0-9.5
D66K+V67R	1026.2±25.4	4-45℃	6.5-9.0
				S144A	726.4±22.5	4-50℃	6.0-9.0
Y157W	789.6±17.2	4-55℃	6.0-9.5
				I190R+T192A	918.8±26.7	4-45℃	6.0-9.0

实施例5

3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备

参照前述3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法的具体实施过程，使用实施例3制备的粗酶液，酶液的投入量以酶液的重量占整个反应体系的体积计，控制底物鹅去氧胆酸的终浓度为100mg/mL，其余各具体参数如表3所示。反应4h～12h后测得，底物转化率在99.8%以上，成品含量在96.8%以上，收率为85～95%。

表3

类型	酶液投入量（W/V）	丙酮酸钠投入量	NAD⁺投入量	反应温度	反应pH
						亲本	20%	20mg/ml	0.1mg/ml	25℃	8.0
D40K+L41R	20%	20mg/ml	0.075mg/ml	25℃	8.0
						D66K+V67R	15%	15mg/ml	0.05mg/ml	30℃	8.5
S144A	20%	20mg/ml	0.1mg/ml	25℃	8.0
						Y157W	20%	20mg/ml	0.1mg/ml	25℃	8.0
I190R+T192A	18%	18mg/ml	0.075mg/ml	30℃	8.0

实施例6

3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备

总体系1L，取50g含量为99%的鹅去氧胆酸，悬浮于100mM的磷酸钾缓冲液（pH8.0），用10M NaOH的调节pH到8.0后加入终浓度30g/L的丙酮酸钠，并依次加入0.09g7α-类固醇脱氢酶冻干粉（Y157W突变体酶）和0.07g乳酸脱氢酶冻干粉，最后加入终浓度为0.1g/L的NAD，底物终浓度为50g/L。在25℃、250rpm和pH8.0左右进行反应6h，转化率达99.8%。反应结束后，反应液滴加盐酸溶液至pH为1.2，继续搅拌30min后待冷却过滤、经水洗三次后真空干燥得到3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸成品58g。成品用900ml无水乙醇60℃水浴条件下搅拌回流1h，过滤取滤液进行真空减压浓缩至200ml体积，再加入1L纯水搅拌1h，过滤，将滤饼真空干燥过夜即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸精制品52g。

SEQUENCE LISTING

<110> 眉山市新功生物科技有限公司、邦泰生物工程（深圳）有限公司

<120> 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶3

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 762

<212> DNA

<213> Brevundimonas naejangsanensis

<400> 1

atggacgcac atttccgact ggatgggcac gtcgccctgg tgacgggggc tggcgctgga 60

atcggccgcg ccatcgctga gaccttcgct gcggcgggcg ccgcggtggc cgtcaccgat 120

ctggacgcgg ccaaggccct ggctgtggcg gacggggtta cgcaggcggg cggacgcgcc 180

gtcggcctgg cctgcgacgt caccgatgaa gaccagcgca tcgccgccgt tcaggccgtc 240

gtggcggcct ttggcaagct gaccctgctg gtgaacaatg cgggcggcgg cggacccaag 300

ccgttcgaca tgccgatgag cgatttcgag cgcgcctatc agctcaacgt cttcgccccc 360

ttccgtttca tgcagctgac ggcgccgcat atgcaggccg caggcggcgg ggcggtgctg 420

aacatcacct cgatggcggg cgacaacaag aacgcccgca tggcgtccta cggctcgtcc 480

aaggcggcgg tcagccacct gacccgcaac gtcgccttcg atctcggccc cgccggaatc 540

cgcgtcaacg ccatcgcgcc gggcgccatc aagaccgacg ccctggccag cgtcctgacg 600

ccgcagatcg aagaggccat gctgaagcac accccgctgg ggcggctcgg aacggccgac 660

gacatcgccc gggcggcgct gttcctgtgt tcgcccgccg cgtcctggat cagcggccag 720

attctgacgg tctccggcgg cggcgttcag gagctggact ga 762

<210> 2

<211> 253

<212> PRT

<213> Brevundimonas naejangsanensis

<400> 2

Met Asp Ala His Phe Arg Leu Asp Gly His Val Ala Leu Val Thr Gly

1 5 10 15

Ala Gly Ala Gly Ile Gly Arg Ala Ile Ala Glu Thr Phe Ala Ala Ala

20 25 30

Gly Ala Ala Val Ala Val Thr Asp Leu Asp Ala Ala Lys Ala Leu Ala

35 40 45

Val Ala Asp Gly Val Thr Gln Ala Gly Gly Arg Ala Val Gly Leu Ala

50 55 60

Cys Asp Val Thr Asp Glu Asp Gln Arg Ile Ala Ala Val Gln Ala Val

65 70 75 80

Val Ala Ala Phe Gly Lys Leu Thr Leu Leu Val Asn Asn Ala Gly Gly

85 90 95

Gly Gly Pro Lys Pro Phe Asp Met Pro Met Ser Asp Phe Glu Arg Ala

100 105 110

Tyr Gln Leu Asn Val Phe Ala Pro Phe Arg Phe Met Gln Leu Thr Ala

115 120 125

Pro His Met Gln Ala Ala Gly Gly Gly Ala Val Leu Asn Ile Thr Ser

130 135 140

Met Ala Gly Asp Asn Lys Asn Ala Arg Met Ala Ser Tyr Gly Ser Ser

145 150 155 160

Lys Ala Ala Val Ser His Leu Thr Arg Asn Val Ala Phe Asp Leu Gly

165 170 175

Pro Ala Gly Ile Arg Val Asn Ala Ile Ala Pro Gly Ala Ile Lys Thr

180 185 190

Asp Ala Leu Ala Ser Val Leu Thr Pro Gln Ile Glu Glu Ala Met Leu

195 200 205

Lys His Thr Pro Leu Gly Arg Leu Gly Thr Ala Asp Asp Ile Ala Arg

210 215 220

Ala Ala Leu Phe Leu Cys Ser Pro Ala Ala Ser Trp Ile Ser Gly Gln

225 230 235 240

Ile Leu Thr Val Ser Gly Gly Gly Val Gln Glu Leu Asp

245 250

<210> 3

<211> 996

<212> DNA

<213> 魏斯氏菌（Weissella sp）

<400> 3

atgaagatct tcgcgtacgg tattcgtgaa gacgagcagc cggcgctgaa agcgtggatc 60

gcggcgcacc cggaagtgac cgttgaattc accgaccaac tgctggatcc ggagaccgcg 120

aagctggcgg aaggctttga cgcggtgaac gtttaccagc aactggatta tacccgtgag 180

accctgaccg cgctgcacga actgggtatc aacaaaatga gcctgcgtaa cgttggcacc 240

gacaacattg actttgatgc ggcgcgtgag ttcgatttta gcatcagcaa cgtgccggtt 300

tatagcccga acgcgattgc ggaacacagc atcattcaga tgagccgtct gctgcgtcgt 360

accaaggcga tggacgcgaa ggtggcgaaa cacgatctgc gttgggcgcc gaccatcggt 420

cgtgagatgc gtatgcaaac cgtgggtgtt atcggtaccg gcaacattgg ccgtgttgcg 480

atgaagatcc tgaaaggttt cggcgcgaaa gtgattgcgt acgacctgta tcacaacgcg 540

gaagttgagg cggaaggtct gtacgtggac accctggagg aactgtatgc gcaggcggat 600

gttattaccc tgtacgtgcc gggcgttccg gcgaatcacc acatgatcaa cgcggacagc 660

attgcgaaga tgaaagatgg tgtggttatc gttaactgca gccgtggcaa cctgatggac 720

atcgacgatg tgattgcggg tctggatagc ggcaagatta gcgactttgc gatggatgtg 780

tatgaggaag aggttggtct gttcaacgtg gattggagca acaaggagtt tccggacgcg 840

aaaatcgcgg atctgattgc gcgtgaaaac gtgctggtta ccccgcacac cgcgttctac 900

accaccaagg cggtgctgga aatggttacc caaagcatga acgcgagcct ggcgtttatc 960

aacggcgaga aaccgagcat tgcggtggaa tattaa 996

<210> 4

<211> 331

<212> PRT

<213> 魏斯氏菌（Weissella sp）

<400> 4

Met Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Glu Asp Glu Gln Pro Ala Leu

1 5 10 15

Lys Ala Trp Ile Ala Ala His Pro Glu Val Thr Val Glu Phe Thr Asp

20 25 30

Gln Leu Leu Asp Pro Glu Thr Ala Lys Leu Ala Glu Gly Phe Asp Ala

35 40 45

Val Asn Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Thr Leu Thr Ala

50 55 60

Leu His Glu Leu Gly Ile Asn Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly Thr

65 70 75 80

Asp Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Arg Glu Phe Asp Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Ile Ile

100 105 110

Gln Met Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Met Asp Ala Lys Val

115 120 125

Ala Lys His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met Arg

130 135 140

Met Gln Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Asn Ile Gly Arg Val Ala

145 150 155 160

Met Lys Ile Leu Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Leu

165 170 175

Tyr His Asn Ala Glu Val Glu Ala Glu Gly Leu Tyr Val Asp Thr Leu

180 185 190

Glu Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Thr Leu Tyr Val Pro Gly

195 200 205

Val Pro Ala Asn His His Met Ile Asn Ala Asp Ser Ile Ala Lys Met

210 215 220

Lys Asp Gly Val Val Ile Val Asn Cys Ser Arg Gly Asn Leu Met Asp

225 230 235 240

Ile Asp Asp Val Ile Ala Gly Leu Asp Ser Gly Lys Ile Ser Asp Phe

245 250 255

Ala Met Asp Val Tyr Glu Glu Glu Val Gly Leu Phe Asn Val Asp Trp

260 265 270

Ser Asn Lys Glu Phe Pro Asp Ala Lys Ile Ala Asp Leu Ile Ala Arg

275 280 285

Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Ala

290 295 300

Val Leu Glu Met Val Thr Gln Ser Met Asn Ala Ser Leu Ala Phe Ile

305 310 315 320

Asn Gly Glu Lys Pro Ser Ile Ala Val Glu Tyr

325 330

Claims

1.一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于：以鹅去氧胆酸为底物，在NAD、乳酸脱氢酶、丙酮酸钠以及缓冲溶液存在的条件下，用7α-类固醇脱氢酶催化鹅去氧胆酸制备3α-羟基-7氧代-5β胆烷酸，所述7α-类固醇脱氢酶来源于Brevundimonas naejangsanensis，所述乳酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，在整个催化反应体系中，所述底物的浓度为50～100mg/mL，所述NAD的浓度为0.01～0.25mg/mL，所述丙酮酸钠的浓度为10～30mg/mL。

2.根据权利要求1所述的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于：控制所述催化过程在温度为25～35℃，pH值为7.5～8.5的条件下进行。

3.根据权利要求1所述的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为50～100mM磷酸钾缓冲液。

4.根据权利要求1所述的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下提纯步骤：待所述催化过程反应结束后，调节pH值为1.0～2.0，搅拌20～30min，待冷却后再经过滤水洗干燥后即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸成品。

5.根据权利要求1至4任一项所述的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于所述7α-类固醇脱氢酶为如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质，

6.根据权利要求5所述的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于所述7α-类固醇脱氢酶与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第40位、第41位、第66位、第67位、第144位、第157位、第190位以及第192位。

7.根据权利要求6所述的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于所述7α-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变：D40K、L41R、D66K、V67R、S144A、Y157W、I190R以及T192A。

8.一种7α-类固醇脱氢酶，其特征在于：所述7α-类固醇脱氢酶来源于Brevundimonas naejangsanensis，用于催化鹅去氧胆酸制备3α-羟基-7氧代-5β胆烷酸，所述7α-类固醇脱氢酶为如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质，

9.根据权利要求8所述的7α-类固醇脱氢酶，其特征在于所述7α-类固醇脱氢酶与如SEQID NO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第40位、第41位、第66位、第67位、第144位、第157位、第190位以及第192位。

10.根据权利要求9所述的7α-类固醇脱氢酶，其特征在于所述7α-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变：D40K、L41R、D66K、V67R、S144A、Y157W、I190R以及T192A。