CN115851525B - 一种氯霉素降解菌、氯霉素脱氢酶、编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

生物工程技术、应用于污染环境微生物修复技术领域，涉及一种高效去除氯霉素的菌株、氯霉素脱氢酶、编码基因及其应用。本发明从污水处理厂的活性污泥中分离获得了一种高效降解氯霉素的菌株Sphingobium sp.WTD‑1，保藏编号为CCTCC NO：M20221515，还采用比较转录组学分析克隆和制备得到了该菌株中能够降解氯霉素的氯霉素脱氢酶，能够120 min内完全降解30 mg/L的氯霉素，本发明获得氯霉素降解菌和氯霉素脱氢酶可用于去除环境中氯霉素污染，具有非常重要的理论价值和应用前景。

Description

一种氯霉素降解菌、氯霉素脱氢酶、编码基因及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术、应用于污染环境微生物修复技术领域，涉及一种高效去除氯霉素的菌株、氯霉素脱氢酶、编码基因及其应用。

背景技术

抗生素是世界范围内使用率和消费量较高的一类药物活性化合物，也是一种能干扰其他细胞生长、发育的化学物质。目前全球有250多种人类或动物使用的抗生素，全球抗生素年消费量高达10-20万吨，其中我国是抗生素的主要生产国和消费国。由于抗生素的广泛使用甚至滥用，且大部分抗生素(10%-90%)在被人类和牲畜使用后（或以代谢物的形式）通过粪便和尿液排出，导致其在全球各地水体、沉积物和土壤中被频繁检出，对人类身体健康和生态系统安全造成潜在的不利影响。因而，近年来抗生素作为最重要的新兴环境污染物群体之一，已受到了科学界和公众的广泛关注。

氯霉素(D-苏式-(-)-N-[α-(羟基甲基)-β-羟基-对硝基苯乙基]-2,2-二氯乙酰胺)(CAP)是第一个用化学合成方法大规模生产的广谱性抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体、衣原体及立克次氏体等都有抑制作用。氯霉素抑菌机理是通过与核糖体的50 S亚基结合阻碍肽酰转移酶的作用，导致胺酰-tRNA终端与50Ｓ亚基无法结合，抑制蛋白质合成，从而达到杀菌效果。氯霉素广泛用于治疗人类和动物感染疾病的药物，其中兽用主要包括农业畜禽以及水产养殖等领域。由于大量使用、利用率低和难降解等原因，使得氯霉素广泛残留于土壤、河流以及地表水、地下水等环境系统中，造成环境污染，如我国珠江三角洲地区的珠江水和污水处理厂检测出氯霉素残留量为17-266ng/L。目前，尽管联合国粮食及农业组织建议禁止在畜牧业中使用氯霉素，但由于其价格低廉，氯霉素仍被非法使用。

最新研究表明，长期暴露于氯霉素会影响人类、动物的健康，如氯霉素对于动物可导致生殖/肝毒性、神经毒性，肠上皮紊乱，继发性左心室收缩功能障碍等疾病；对人类而言，氯霉素可导致可逆性骨髓抑制、再生障碍性贫血和心血管衰竭（灰婴综合征），并具有潜在的遗传毒性等。因此，高效降解消除环境中残留的氯霉素具有重要意义。微生物降解被认为是绿色高效消除氯霉素的途径，而获得氯霉素高效降解菌株及关键功能基因和酶具有重要的创新性和应用前景。CN202110174866.4公开了分离得到一种海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)能够降解氯霉素，在10mg/L氯霉素1h内降解率为92.5％；CN201710152873.8公开了一种类诺卡氏菌属的菌株能够降解氯霉素，能够将无机盐培养基中的氯霉素残留降解90%以上，制备成为菌剂能够降解土壤和水体中的高浓度氯霉素残留。然而，获得更多的能够降解氯霉素的菌株以扩大微生物的应用仍然是人们普遍追求的目标。

获得氯霉素降解菌株和降解基因在消除氯霉素残留的环境污染的技术研发中具有以下作用和功能：1.通过现代微生物发酵技术将氯霉素降解菌株应用于氯霉素污染环境的修复与去除；2.通过现代酶催化和转化技术，制成酶蛋白降解菌剂或酶制剂高效消除氯霉素残留，

减少环境污染。

发明内容

本发明目的是提供一种对氯霉素具有降解功能的菌株Sphingobiumsp.WTD-1、氯霉素脱氢酶基因cdh及其编码的蛋白质及其应用，该菌株以及氯霉素脱氢酶酶能高效的降解氯霉素，因此，该菌株以及氯霉素脱氢酶可通过发酵工艺生产降解菌剂或酶制剂应用于氯霉素污染环境的修复与去除。

一个方面，本发明本发明从活性污泥中筛选分离到一株高效降解氯霉素的菌株Sphingobium sp.WTD-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年09月27日，保藏编号为CCTCC NO：M20221515，保藏地址：中国武汉。

本发明针对降解氯霉素的菌株Sphingobium sp.WTD-1通过基因组测序和比较转录组比对方法成功克隆到氯霉素脱氢酶基因cdh，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1617bp，编码538个氨基酸。

一个方面，本发明提供了一种对氯霉素具有高效降解功能的氯霉素脱氢酶基因cdh，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。

一个方面，本发明提供了由氯霉素脱氢酶基因编码的氯霉素脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。

本发明还提供了含有所述的氯霉素脱氢酶基因的重组表达载体。优选的，所述的重组表达载体，是将所述的氯霉素脱氢酶基因cdh插入pET-30a (+)的BamHI和XhoI位点之间，并保留N和C端的组氨酸标签纯化蛋白。

一个方面，本发明提供了含有所述的氯霉素脱氢酶基因cdh的基因工程菌。所述基因工程菌中含有氯霉素脱氢酶基因的重组表达载体；优选的，所述的基因工程菌的表达菌株选自大肠杆菌BL21(DE3)。

一个方面，本发明提供了菌株Sphingobium sp.WTD-1或本发明所述的氯霉素脱氢酶在降解氯霉素中的应用。

一个方面，本发明提供了所述的氯霉素脱氢酶在去除环境中氯霉素的应用。

一个方面，本发明所述了重组表达载体在降解氯霉素中的应用。

一个方面，本发明提供了菌株Sphingobium sp.WTD-1或本发明所述的氯霉素脱氢酶在制备降解氯霉素的制剂中的应用。所述制剂可以是菌株冻干粉、菌株发酵培养物、包含菌株的混悬液、菌株的的固定化制剂等任何有助于保持菌株活力并发挥其降解氯霉素的剂型。所述剂型可以是本发明所述的氯霉素脱氢酶的冻干粉、氯霉素脱氢酶表达上清液、氯霉素脱氢酶表达裂解液、氯霉素脱氢酶表达纯化产物、氯霉素脱氢酶的固定化试剂等任何有助于氯霉素脱氢酶发挥降解氯霉素的作用的剂型。

一个方面，本发明提供了一种氯霉素降解产物的检测方法，所述方法包括如下步骤：

（1）应用本发明所述的菌株、本发明所述的氯霉素脱氢酶或包含本发明所述菌株（氯霉素脱氢酶）的制剂对样品中的氯霉素进行降解；

（2）取降解后的部分样品，在其中加入等体积的甲醇，振荡混匀后，12000rpm/min离心2min，样品用0 .22μm尼龙滤膜过滤 ，利用HPLC进行检测；HPLC色谱条件为 ：AgilentZORBAX StableBond Phenyl，4.6 x 250 mm, 5µm，SN / LN：USUU019677 / B09145，流动相为乙腈：0.5%磷酸水溶液=28:72（v/v），流速为1 mL/min；检测波长为278 nm；柱温为35℃，进样量为20 μL。

有益效果

1. 本发明的氯霉素降解菌株Sphingobium sp.WTD-1能够高效的降解氯霉素，在含50 mg/L氯霉素的基础培养基中60h对于氯霉素的降解率达到100%。

2.本发明提供的Cdh纯酶能在120 min内完全降解30 mg/L的氯霉素，可用于去除

环境中氯霉素污染，具有非常重要的理论价值和应用前景。

附图说明

图1Sphingobiumsp.WTD-1降解氯霉素的降解曲线。

图2 菌株WTD-1降解氯霉素降解氯霉素的HPLC图谱。

图3 菌株WTD-1降解氯霉素代谢产物的UPLC-Q-TOF-MS图谱。

图4 推测的菌株WTD-1降解氯霉素代谢途径。

图5氯霉素脱氢酶Cdh的SDS-PAGE图。M：蛋白marker，1-6，依次为300、250、200、150、100、50 mM咪唑洗脱液；7，粗酶穿透液，8，IPTG诱导的BL21 (Cdh)粗酶

图6氯霉素脱氢酶Cdh降解氯霉素代谢产物的UPLC-Q-TOF-MS图谱。

图7 氯霉素脱氢酶Cdh降解氯霉素的HPLC图谱。

图8氯霉素脱氢酶Cdh降解氯霉素代谢途径。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。本发明所述技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方式，所述试剂或材料，如未特别说明，均为常规试剂，来源于商业渠道。

实施例1

1.1氯霉素降解菌株WTD-1的分离筛选

从安徽合肥某生活污水处理厂采集活性污泥。取活性污泥10.0 g加入100mL基础盐培养基中，加入终浓度为10 mg/L的氯霉素，30℃，150 rpm/min培养7天，以10％ (V/V)的接种量转接到新鲜无菌的基础盐培养基中，连续转接两次（氯霉素终浓度分别提高到30mg/L和50 mg/L），利用高效液相色谱仪（HPLC）检测第三代富集液中氯霉素的含量。对有降解效果的富集液进行梯度稀释,取10^-4至10^-7梯度稀释富集液各100μL，分别涂布于加有20mg/L 氯霉素的1/10 LB固体培养基上，30℃培养3d，挑取平板上的单菌落于LB试管中培养至指数期，再将得到的菌液接种于加有50 mg/L氯霉素的基础盐液体培养基中，30℃，150rpm/min培养7天，然后验证各单菌落是否具有氯霉素降解功能。

基础盐培养基(1L)配方为： NaCl，1 g/L；NH₄Cl，1 g/L；K₂HPO4，1.5 g/L；KH₂PO4，0.5 g/L；MgSO4·7H2O，0.5 g/L，固体培养基加入18g琼脂粉。

LB培养基(1L)配方为：5.0g NaCl，5.0g酵母粉，10g蛋白胨，加入去离子水至1L，pH7.0。

1/10 LB培养基(1L)配方为：0.5g NaCl，0.5g酵母粉，1g蛋白胨，加入加去离子水

至1L，pH 7.0。固体培养基加入18g琼脂粉。

通过连续富集培养分离筛选到一株氯霉素降解菌株，命名为WTD-1。该菌在60 h内对氯霉素降解率达到100％。

1.2氯霉素降解菌株WTD-1的鉴定和生物学特性

菌株WTD-1在LB（含20mg/L CAP）平板上培养2天后，菌落形态呈黄色、圆形、不透明、整洁、凸起、潮湿和粘性，电镜照S片显示WTD-1为棒状。菌株WTD-1的16S rRNA基因序列在 EzBioCloud 16S数据库(https://www.ezbiocloud .net)中进行比对，结果表明菌株WTD-1与鞘氨醇菌ATCC 51230T（GenBankno.JH992904）具有99.6%的同源性相似性。基于上述结果，菌株WTD-1被鉴定为鞘氨菌 (Sphingobium sp.)，命名为Sphingobium sp.WTD-1。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年09月27日，保藏编号为CCTCCNO：M20221515。

1.3菌株WTD-1（Sphingobium sp.WTD-1）的降解特性

降解特性的研究：将菌株WTD-1接种至100mL LB液体培养基中，30℃，150rpm/min，培养至指数期，8000rpm/mim离心8 min收集菌体，菌体用新鲜、无菌基础盐培养基洗涤2遍，重悬于2ml基础盐培养基中，接种至40mL无机盐液体培养基(含终浓度为50 mg/L的氯霉素)中，调节OD600约为0.2左右，于30℃，150 rpm/min摇床振荡培养，分别于0 h、12 h、24 h、36h、42 h、45 h、48 h、54 和60 h进行取样用于后续检测，绘制菌株的降解曲线。

定时取样培养液加入等体积的甲醇，振荡混匀后，12000rpm/min离心2min，样品用0 .22μm尼龙滤膜过滤 ，利用HPLC进行检测。HPLC色谱条件为 ：Agilent ZORBAXStableBond Phenyl（4.6 x 250 mm, 5µm，SN / LN：USUU019677 / B09145），流动相为乙腈：0.5%磷酸水溶液=28:72（v/v），流速为1 mL/min；检测波长为278 nm；柱温为35℃，进样量为20 μL。

参见图1，实验结果表明菌株WTD-1能在60 h内将50 mg/L的氯霉素完全降解。

1.4菌株WTD-1的降解氯霉素的代谢产物的确定

在降解过程的不同时间点收集1.3中的培养液体，用冷冻干燥器（FD5-4，Gold SIMChina Co.，Ltd.）冷冻干燥成粉末，并在丙酮中重新溶解。使用HPLC和超高效液相色谱-三重四极飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）鉴定浓缩的代谢物。UPLC-Q-TOF-MS条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm × 100 mm；1.7 μm）,流动相为色谱甲醇（流动相A）和0.075%甲酸水溶液（流动相B）,梯度洗脱程序如下：

时间	流动相A%	流动相B%	流速
				0.000	2	98	0.2
0.000	2	98	0.2
				30.000	95	5	0.2
33.000	2	98	0.2
				36.000	2	98	0.2

进样量为2 μL，柱温为30℃；离子源ESI⁺和ESI^-，扫描范围为50-700m/z。

如图2-图3所示，代谢产物鉴定结果表明，菌株WTD-1降解氯霉素产生了对硝基苯甲醇（PNPM）、对硝基苯甲酸（PNBA）、(2S,3S)-2-(2,2-二氯乙酰胺)-3羟基-3-(4-硝基苯基)丙酸(O-CAP)、2-(2,2-二氯乙酰胺)-3-羟基-1-(4-硝基苯基)丙酯乙酸酯(DHNA-1)、2-(2,2-二氯乙酰胺基)-3-羟基-3-(4-硝基苯基)丙酯乙酸酯(DHNA-3)、原儿茶酸(PCA)和二氯乙酸(DCA)等7个代谢产物，推测菌株WTD-1具有3条途径，分别为乙酰化、C3位羟基氧化以及C1-C2键断裂(参见图4)。

1.5降解特性的研究：将菌株WTD-1接种至100mL LB液体培养基中，30℃，150rpm/min，培养至指数期，8000rpm/mim离心8 min收集菌体，菌体用新鲜、无菌基础盐培养基洗涤2遍，重悬于2ml基础盐培养基中，接种至40mL无机盐液体培养基(含终浓度为50 mg/L的氯霉素)中，调节OD₆₀₀约为0.2左右，于30℃，150 rpm/min摇床振荡培养，分别于0 h、12 h、24h、36 h、42 h、45 h、48 h、54 和60 h进行取样，绘制菌株的降解曲线。定时取样培养液加入等体积的甲醇，振荡混匀后，12000rpm/min离心2min，样品用0.22μm尼龙滤膜过滤 ，利用HPLC进行检测（检测方法和条件同1.4）。如图1所示，实验结果表明菌株WTD-1能在60 h内将50 mg/L的氯霉素完全降解。

实施例2氯霉素降解基因cdh的克隆及功能验证

2.1细菌基因组总DNA的测序分析

2.1.1细菌基因组总DNA的提取及测序结果分析

菌株WTD-1全基因组总DNA采用CTAB法进行提取，基因组总DNA溶于无菌超纯水中送生工生物工程(上海)股份有限公司进行细菌基因组完成图测序。菌株WTD-1全基因组完成图信息为：菌株WTD-1基因组全长5,674,265 bp，含有1条染色体（5,078,332 bp）和5个质粒1（碱基数分别为449985 bp、76967 bp、57709 bp、6362 bp、4910 bp），基因组G + C含量为64.05%。

2.1.2菌株WTD-1比较转录组学研究

菌株WTD-1降解过程中受到氯霉素诱导作用，因此可通过比较分析经氯霉素诱导菌株在降解过程中的转录组学找到降解的关键功能基因。比较转录组样品制备步骤如下：

（1）将适量菌株WTD-1接种到两组40mL的无菌基础盐培养基中，使培养基OD600 nm值调至0.2，均添加终浓度为0.5 g/L的葡萄糖。

（2）将步骤（1）中的样品分为对照组和处理组，其中处理组额外添加终浓度为50mg/L的氯霉素，于30℃、150 rpm的摇床中培养，每隔1 h对处理组进行取样，并利用HPLC检测氯霉素含量。试验对照组和处理组均设置三个重复。

（3）当处理组氯霉素浓度降解至25 mg/L以下时，同时将对照组和处理组菌液于8000 rpm、5 min离心收集菌体，并立即将菌体放置于液氮中速冻，后放置于-80℃冰箱保存。

（4）将（3）中冷冻样品寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司，委托该公司进行样品转录RNA提取、测序，使用DESeq2软件（V1.26.0）进行基因表达差异分析，使用 topGO软件（V2.24.0）对差异表达基因进行富集分析，使用clusterProfiler软件（V3.0.5）进行KEGG通路和COG分类富集分析。

（5）在比较转录组的预测分析结果中，对上调表达的相关功能基因进行检索，找到注释为可能的脱氢酶的orf， 在NCBI上比较分析，并进一步进行功能验证。

2.1.3推测的脱氢酶基因的异源表达及功能验证

以菌株WTD-1基因组DNA作为模板，设计引物用来扩增推测的脱氢酶基因片段。所用引物如下表：

引物名称	序列 (5' 到3')
		pET-cdh_F	gccatggctgatatcggatccATGGAGGGCATTGTGCAAGA (SEQ ID NO.3)
pET-cdh_R	gtggtggtggtggtgctcgagGTGGCTTCTTCGGATCAGATCG (SEQ ID NO.4)

PCR扩增体系

组分	体积
		2×Phanta Max Master Mix	25 mL
上游引物（pET-orf cdh_F,20 mM）	1 mL
		下游引物（pET-orf cdh_R,20 mM）	1 mL
WTD-1菌基因组DNA	1 mL
		ddH2O	22 mL

PCR扩增程序

提取的pET30a(+)质粒用BamHI和XhoI双酶切。酶切体系如下：

组分	体积
		10× K Buffer	5 mL
BamHI	1 mL
		XhoI	1 mL
pET30 a(+)	1 mg
		ddH2O	22 mL

上述反应体系于37℃水域酶切3h，用胶纯化试剂盒纯化。

利用快速克隆试剂盒（ClonExpress® II One Step Cloning Kit）将双酶切且纯化后的载体pET30a (+)和PCR扩增的产物进行同源重组，重组反应体系(20 mL)如下：

组分	体积
		5×CE II Buffer	4 mL
Exnase II	2 mL
		线性化载体	1 mL
基因orf01637 PCR产物	1 mL
		ddH2O	12 mL

于PCR仪器上37℃反应30 min，立即置于冰上冷却。

将上述重组质粒转化至E. coliBL21(DE3)感受态细胞中，构建重组表达菌株。

将重组表达菌株按照1%（v/v）比例接种至40 mL的LB培养基中（含50 mg/L的Km），于37℃、150 rpm摇床中培养，待菌液OD值为0.6-0.8左右时，向LB培养基中添加终浓度为1.0 mM IPTG和30 mg/L的CAP，同时设置不加菌液和不加CAP的对照组，于30℃、150 rpm摇床中培养24 h，后利用HPLC检测培养基中氯霉素及产物生成情况。

通过酶活力验证，有一个重组菌株粗酶能够降解氯霉素，将该基因命名为cdh，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，其编码的氯霉素脱氢酶氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在E.coli BL21(DE3-p ET-30a(+)-cdh)中的表达及纯化

1.将测序验证正确的表达菌株E. coliBL21(pET-orfcdh)接种到3 ml LB试管中（含有终浓度为50 mg/L的Km），放置于37℃、150 rpm摇床培养至对数期；

2.按照1%（v/v）比例转接至100 ml LB三角瓶中（含有终浓度为50 mg/L的Km），并于37℃、150 rpm摇床进行扩大培养；

3.当菌液OD值到达0.6-0.8左右时，向三角瓶中添加终浓度为1 mM的IPTG，然后放置于16℃、150 rpm摇床进行过夜诱导表达；

4.将诱导表达的菌液于10000 rpm、8 min进行离心，弃上清液，用20 mL 50 mMTris-HCl(pH=7.4)缓冲液重悬洗涤菌体一次，再用遇冷的20 mL Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃、10000 rpm条件下离心25 min，收集上清液，即为粗酶液。

5.用镍离子亲和层析柱对Cdh进行纯化，SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化效果，条带大小和理论预测的大小相一致(见图5)。

降解氯霉素的活力测定

向500 mL的PBS缓冲液(pH6.0)酶促反应体系中（含20 mg/mL Cdh纯酶和0.1 mM抗坏血酸）分别添加不同终浓度的氯霉素(5 mg/L 、10 mg/L 、15mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40mg/L、50mg/L、55 mg/L、60mg/L、70 mg/L)，于40℃温度条件下反应15 min，后于沸水煮沸3min终止反应。反应液冷却后加入等体积甲醇，充分混匀，12000rpm/min离心5min，过0.22μm尼龙膜滤器，利用 HPLC测定氯霉素的残留量。根据米氏方程原理，通过GraphPad Prism软件对不同底物浓度和反应速率进行非线性拟合，进而得到脱氢酶Cdh酶对CAP的Km、Vmax和Kcat值。所有处理均设三个平行。一个酶活力单位定义为：在pH6.0，温度40℃条件下，每分钟催化1.0 umol氯霉素降解所需的酶量。

酶学试验表明Cdh对氯霉素的Km值为39.02±3.20 (mM·min^-1) ，Kcat值为12.57±0.29 (min^-1) ， Kcat/ Km值为0.32±0.01(min-1·mM^-1)。

降解氯霉素的代谢产物的确定

运用HPLC和UPLC-Q-TOF-MS对2.3中的氯霉素的酶反应液代谢产物进行分析和鉴定。HPLC和UPLC-Q-TOF-MS检测分别条件同上1.3和1.4所示,其中HPLC所用色谱柱子为Agilent ZORBAX StableBond Phenyl（4.6 x 250 mm, 5µm，SN / LN：USUU049682 /B21272）。

UPLC-Q-TOF-MS的结果表明，其产物的质谱图(见图6)显示其有m/z为334.9845（ESI^-）和152.0342（ESI⁺）的离子峰，经过HPLC比对（见图7），确认酶促反应产物分别为(2S,3S)-2-(2,2-二氯乙酰胺)-3羟基-3-(4-硝基苯基)丙酸(O-CAP)和对硝基苯甲醛（PNBD）。因此，根据酶Cdh代谢产物的鉴定结果表明降解氯霉素的生化反应分别是C3位羟基氧化以及C1-C2键断裂断酰胺键生成O-CAP和对硝基苯甲醛（PNBD）(见图8)。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims (3)

1.一种降解氯霉素的菌株，其特征在于，所述菌株为鞘氨醇菌（Sphingobium sp.）WTD-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2022年09月27日，保藏编号CCTCC NO：M20221515。

2.根据权利要求1所述的菌株在降解氯霉素中的应用。

3.根据权利要求1所述的菌株在制备降解氯霉素的制剂中的应用。