CN107287272A - 一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法 - Google Patents

一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107287272A
CN107287272A CN201610191921.XA CN201610191921A CN107287272A CN 107287272 A CN107287272 A CN 107287272A CN 201610191921 A CN201610191921 A CN 201610191921A CN 107287272 A CN107287272 A CN 107287272A
Authority
CN
China
Prior art keywords
petm6
coli
cholic acid
hsdh
bl21star
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610191921.XA
Other languages
English (en)
Inventor
赵淑娟
王峥涛
杨莉
史杰
周吉燕
胡之璧
张金家
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN201610191921.XA priority Critical patent/CN107287272A/zh
Publication of CN107287272A publication Critical patent/CN107287272A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01159—7-Alpha-hydroxysteroid dehydrogenase (1.1.1.159)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01201—7-Beta-hydroxysteroid dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.201)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及由牛磺熊去氧胆酸的制备方法，属于生物技术领域，采用同时表达7α‑羟基类固醇脱氢酶(7α‑HSDH)和7β‑羟基类固醇脱氢酶(7β‑HSDH)基因的大肠杆菌进行液体发酵，直接将牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸，稳定、可控，转化率高，简单、快捷，条件温和，无污染，牛磺鹅去氧胆酸来源于鸡胆汁、鹅胆汁或鸭胆汁，易于获得，对牛磺熊去氧胆酸的理论研究及其药用价值的广泛利用具有重要意义。

Description

一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法
技术领域
本发明涉及一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，具体说，是涉及一种通过遗传改造的非致病性微生物进行的将牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)原位转化为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的方法，属于生物技术领域。
背景技术
以外源性的天然或合成的有机化合物为底物，添加至处于生长状态的生物体系或酶体系中，在适宜的条件下进行培养，使得底物与生物体系中的酶发生相互作用，从而产生结构改变，这一过程称为生物转化。生物转化以多种不同催化功能的酶体系对中药化学成分进行转化，可以产生新的天然化合物，或提高中药有效成分的水溶性，降低化合物的毒性，再通过与药理筛选手段相结合，可从中找到新的高活性或低毒性的天然活性先导化合物。
牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，是熊胆中的主要胆汁酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶解胆石等作用。2007年以商品名滔罗特(Taurolite)获准在中国销售，临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等常见疾病，且得到较好的疗效。TUDCA与牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)结构上是7位羟基的差向异构，二者的化学结构式如下：
目前，除了采用“活熊引流取胆”法得到牛磺熊去氧胆酸，还可以通过化学合成法来制备。“活熊引流取胆”备受争议，化学合成法也因步骤繁琐，或成本高，或收率低，且要使用大量有机溶剂，不利于分离纯化得到无毒害的下游产物。因此，应用中药生物技术将TUDCA在生物工程菌中高效表达，实现大规模工业化发酵生产是解决问题的有效途径。另一方面，对降低获取TUDCA的成本，简化获取步骤，提高TUDCA的质量也具有重要意义。
TCDCA是一种广泛存在于鸡、鸭、鹅等禽畜胆汁中的胆酸类化合物，利用TCDCA作为原料，直接以遗传改造的大肠杆菌作为转化菌株，制备TUDCA的方法至今尚未见到有关报道，且可以实现资源合理利用。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于采用基因工程方法遗传改造大肠杆菌，并通过微生物发酵，将牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)原位转化为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：为工程菌直接发酵转化法，包括7α-HSDH和7β-HSDH基因密码子优化、工程菌的构建、工程菌培养、底物的转化及产物制备。所述工程菌为同时表达7α-HSDH和7β-HSDH基因的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)；所述底物为牛磺鹅去氧胆酸。
7α-HSDH和7β-HSDH分别为7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶；
两个7α-HSDH分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strainDSM599,GenBank登录号：JN191345.1)和大肠杆菌(Escherichia coli strain TW14359,GenBank登录号：CU928163.2)，
两个7β-HSDH基因分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strainDSM599,GenBank登录号：JN191345.1)和活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strainN53,GenBank登录号：KF052988.1)，
分别采用http://www.jcat.de/在线软件以大肠杆菌为宿主菌，根据密码子偏好性，对全基因序列进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2。
所述的由牛磺鹅去氧胆酸获取牛磺熊去氧胆酸的简便方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
a)双基因表达载体的构建
①两个7α-HSDH和两个7β-HSDH的编码区(ORF)分别进行密码子优化，5’和3’段增加酶切位点，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2；
②合成的四个基因分别进行双酶切并分别连接入pETM6载体的多克隆位点，使每个基因均带有独立的启动子、核糖体结合位点(RBS)和终止子元件，得pETM6-α1、pETM6-α2、pETM6-β1、pETM6-β2；
③将pETM6-α1、pETM6-α2分别酶切作为载体片段；将pETM6-β1、pETM6-β2分别进行酶切，得到“启动子-RBS-β1-终止子”和“启动子-RBS-β2-终止子”的表达盒作为插入子片段；顺次连接，得到pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2。
b)多基因表达载体构建
将pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2重组载体再次进行双酶切，作为载体片段；与③中得到的“启动子-RBS-β1-终止子”和“启动子-RBS-β2-终止子”片段进行连接，得到pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2。
c)工程菌的构建
①将pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2分别转入大肠杆菌，得到四个带有双基因表达载体的工程菌E.coli BL21star-pETM6-α1β1、E.coli BL21star-pETM6-α1β2、E.coli BL21star-pETM6-α2β1、E.coli BL21star-pETM6-α2β2。
pETM6空载体转入大肠杆菌，得到E.coli BL21star-pETM6，作为载体对照工程菌。
②将pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2分别转入大肠杆菌，又得到六个带有多基因表达载体的工程菌：E.coliBL21star-pETM6-α1β1β1、E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、E.coli BL21star-pETM6-α2β1β1、E.coli BL21star-pETM6-α2β1β2、E.coliBL21star-pETM6-α2β2β2。
d)工程菌的培养
①将工程菌接种到LB固体平板培养基中活化，于20～40℃(优选25～37℃)活化培养1～7天(优选1～3天)；
②从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于加有附加50～100mg/L(优选80～100mg/L)氨苄青霉素(Amp+)LB液体培养基的三角瓶中，在75～225rpm/min(优选180～225rpm/min)、20～40℃(优选25～37℃)下震荡培养12～24小时(优选12～16小时)；
③将上述培养物按1:50比例接种到液体M9培养基，在75～225rpm/min(优选180～225rpm/min)、20～40℃(优选25～37℃)下震荡培养3～5小时(优选3.5～4小时)，加入0.1～1mM(优选0.5～1mM)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，继续培养3～5小时(优选3～4小时)；
e)底物发酵转化
①将上述培养物离心，收集菌体，以5～20(优选12～20)倍浓缩至新的附加50～100mg/L(优选80～100mg/L)的Amp+、0.1～1mM(优选0.5～1mM)的IPTG的M9培养基。
②添加底物，于75～225rpm/min(优选180～225rpm/min)、20～40℃(优选25～37℃)下震荡培养1～3天(优选2～3天)，进行底物的发酵转化。
③转化过程如下：
f)牛磺熊去氧胆酸制备
①发酵过程结束，收集转化液，用等体积的正丁醇分三次反复萃取，合并萃取液，减压浓缩挥干正丁醇。
②所得残渣用乙醇溶解后，再次减压浓缩挥干，所得干燥物即为以牛磺熊去氧胆酸为主要成分的转化产物。
③取部分干燥物用甲醇水溶解，0.22μm滤膜过滤，用XBridgeTM C18 5μm色谱柱，对转化产物进行分析。
所述的由牛磺鹅去氧胆酸获取牛磺熊去氧胆酸的简便方法，其特征在于，所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂糖15.0g/L。
所述的由牛磺鹅去氧胆酸获取牛磺熊去氧胆酸的简便方法，其特征在于，所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，氯化钠(NaCl)1g/L。
所述的由牛磺鹅去氧胆酸获取牛磺熊去氧胆酸的简便方法，其特征在于，所述的M9液体培养基的组成如下：Na2HPO4：6.78g/L，KH2PO4：3g/L，NaCl：0.5g/L，NH4Cl：1g/L，2mMMgSO4，0.1mM CaCl2，0.04～20％D-葡萄糖。
所述的由牛磺鹅去氧胆酸获取牛磺熊去氧胆酸的简便方法，其特征在于：步骤c)中的牛磺鹅去氧胆酸以粉末状态或水溶液形式加入。
所述的由牛磺鹅去氧胆酸获取牛磺熊去氧胆酸的简便方法，其特征在于：所述牛磺鹅去氧胆酸溶液的浓度为0.5～20g/L，牛磺鹅去氧胆酸加入量使其终浓度为0.7～10g/L(优选2～20g/L)。
所述的由牛磺鹅去氧胆酸获取牛磺熊去氧胆酸的简便方法，其特征在于：步骤d)中的萃取及减压浓缩挥干。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)选用密码子优化的7α-HSDH和7β-HSDH在表达水平高，转化效率高。
2)选用的非致病性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)易于培养，且发酵过程易于控制。
3)牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)转化速度快，可在较短时间内得到TUDCA。
4)发酵过程无污染，由发酵液制备产物工艺简便，使规模化及低成本制备牛磺熊去氧胆酸成为可能，对TUDCA的理论研究及药用价值的广泛利用具有重要贡献。
摘要附图说明
样品的总离子流图(1.TUDCA 2.T-7-KLCA 3.TCDCA)
附图说明
图1.双基因表达载体图谱pETM6-α2β2
图2.本发明所用TCDCA、TUDCA、T-7K-LCA标准品的总离子流图。
图3.本发明方法所得样品中TCDCA、TUDCA、T-7K-LCA总离子流图。
图4.双基因表达载体工程菌发酵样品HPLC图谱。
A.TCDCA和TUDCA混合标准品；B.底物空白对照样品，即培养体系中加入底物，但无菌株；C.载体空白对照，即工程菌E.coli BL21star-pETM6；D.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α1β1；E.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α1β2；F.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α2β1；G.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α2β2。
图5.多基因表达载体工程菌发酵样品HPLC图谱。
A.载体空白对照，即工程菌E.coli BL21star-pETM6；B.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α1β1β1；C.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2；D.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α1β2β2；E.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α2β1β1；F.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α2β1β2；G.工程菌E.coli BL21star-pETM6-α2β2β2。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细地说明，这些实例和附图仅起说明性作用，并不因此限制本发明的内容。因此，凡不违背本发明精神所做的修改及变形，均应包括在本发明范围内。
实施例1
全基因合成密码子优化的7α-HSDH和7β-HSDH基因
7α-HSDH和7β-HSDH分别为7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶；
两个7α-HSDH分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strainDSM599,GenBank登录号：JN191345.1)和大肠杆菌(Escherichia coli strain TW14359,GenBank登录号：CU928163.2)，
两个7β-HSDH基因分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strainDSM599,GenBank登录号：JN191345.1)和活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strainN53,GenBank登录号：KF052988.1)，
上述序列委托英潍捷基(上海)贸易有限公司采用GeneArt软件根据大肠杆菌密码子偏好性，对基因序列进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2。
密码子优化后的来源于撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense)的7α-HSDH(记为α1)基因序列如SEQ ID No 1所示；密码子优化后的来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的7α-HSDH(记为α2)基因序列如SEQ ID No 2所示；密码子优化后的来源于撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense)的7β-HSDH(记为β1)基因序列如SEQ ID No 3所示；密码子优化后的来源于活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strain N53)的7β-HSDH(记为β2)基因序列如SEQ ID No 4所示；上述密码子优化后的基因序列5’和3’端分别加上NdeI和XhoI酶切位点，委托上海英俊生物科技有限公司进行全基因合成。
实施例2
工程菌的构建
1)扩大培养以pMD为载体、带有合成的目的基因α1、α2、β1、β2的大肠杆菌，以及DH5α-pETM6菌株，取10μl样品，加入10ml的LB(Amp+)培养基，37℃摇床培养12～16个小时，摇床速度为225rpm。
2)用购自上海创英生物科技有限公司的质粒抽提试剂盒抽提以上细菌的质粒，按试剂盒的操作说明操作。
3)双酶切抽提得到的pMD-α1、pMD-α2、pMD-β1、pMD-β2质粒，以及表达载体pETM6，酶切体系如下：
37℃酶切2～4个小时，用胶回收试剂盒纯化目的片段。
4)将回收的850bp的目的基因片段α1、α2、β1、β2、分别和5.6kb的pETM6载体片段连接，连接体系如下：
将体系混匀，22℃连接1-3个小时，
5)连接体系转化大肠杆菌DH5α
Ⅰ.将10μl体系于超净台转入到根据标准方案制备的化学感受态大肠杆菌DH5α中，轻轻混匀，冰上放置30min。
Ⅱ.42℃热击45秒，冰上放置2min，于超净台加入250μl的SOC培养基。
Ⅲ.放置37℃摇床、200～300rpm，活化45min～1个小时，涂至LB(Amp+)固体平板培养基。
Ⅳ.将涂好的平板放入37℃培养箱，培养12～16个小时。
6)菌落PCR筛选阳性菌
Ⅰ.用核酸序列两端15～35bp的包括酶切位点的片段合成引物，扩增α1、α2的正反向引物为T7Promoter、SH3-R，扩增β1、β2的正反向引物为T7Promoter、PDZ-R。
Ⅱ.PCR反应体系如下：
Ⅲ.在超净台用鱼线挑取优势菌落，置入PCR管，简短离心，使鱼线和反应液收集至PCR管底部。
Ⅳ.PCR扩增条件条件如下：
95℃3min；(95℃30s，55℃30s，72℃1min)X 30个循环；72℃10min；4℃保存。
Ⅴ.电泳检测PCR产物，选出带有目的片段的阳性菌落DH5a-pETM6-α1、DH5a-pETM6-α2、DH5a-pETM6-β1、DH5a-pETM6-β2。
7)于超净台挑取以上阳性菌落，加入5ml LB(Amp+)液体培养基，于37℃、200～300rpm摇床，培养12～16个小时。
8)用上海创英生物技术有限公司的质粒抽提试剂盒，抽提扩大培养的阳性菌，并用NheI/SalI双酶切pETM6-α1、pETM6-α2，胶回收约6kb的大片段作为载体；用AvrⅡ/SalI双酶切pETM6-β1、pETM6-β2，胶回收约850bp的小片段作为插入子。酶切体系同上述3。
9)将回收的载体片段pETM6-α1、pETM6-α2，分别与插入子片段β1、β2连接，连接体系同上述4。
10)将连接体系转化大肠杆菌DH5α菌株，操作同上述5。
11)菌落PCR筛选阳性克隆：通过T7Promoter、PDZ-R正反向引物扩增β1、β2，电泳检测PCR产物，筛选出带有目的片段的阳性菌落DH5a-pETM6-α1β1、DH5a-pETM6-α1β2、DH5a-pETM6-α2β1、DH5a-pETM6-α2β2，PCR反应体系及循环条件同上述6。
12)挑取阳性克隆菌，加入5ml LB(Amp+)液体培养基，于37℃、200～300rpm摇床，培养12～16个小时，提取质粒，酶切鉴定，确认载体构建正确。
13)将重组质粒转入(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)表达载体，得到BL21star(DE3)pETM6-α1β1、BL21star(DE3)pETM6-α1β2、BL21star(DE3)pETM6-α2β1、BL21star(DE3)pETM6-α2β2。
实施例3
工程菌的培养及底物的转化
1)将工程菌接种到LB固体平板培养基中，于37℃活化培养12个小时；
2)从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于LB(Amp+)液体培养基的三角瓶中，在225rpm/min、37℃震荡培养14小时；
3)将上述培养物按1:50比例接种到液体M9培养基，在225rpm/min、37℃下震荡培养3.5小时，加入1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，继续培养3小时；
4)将上述培养物5000g/min离心，收集菌体，以15倍浓缩至新的附加100mg/L的Amp+、1mM的IPTG、8mM的TCDCA的M9培养基。于225rpm、37℃下震荡培养2天，进行底物的发酵转化。
实施例4
产物的收集制备
1)发酵过程结束，收集转化液，用等体积的正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，减压浓缩挥干正丁醇。
2)将浓缩得到的残渣用乙醇充分溶解，再次减压浓缩挥干。所得干燥物即为以牛磺熊去氧胆酸为主要成分的转化产物。
3)取部分干燥物溶于甲醇水溶液，用0.22μm滤膜过滤，采用Waters XBridgeTMC18column色谱柱，分析转化产物。
实施例5
产物的鉴定分析
1)HPLC分析
色谱柱：Waters XBridgeTM C18column(5μm，4.6mm×150mm)
Agilent 1100高效液相色谱仪，PL-ELS 1000蒸发光散射检测器；
ELSD参数：漂移管温度为85℃；N2流速1.5L min-1；
柱温：40℃；流速：1ml min-1；进样量25μl；
流动相：A-0.2％的甲酸乙腈；B-0.3％的甲酸水溶液
梯度条件：
时间 A的比例 B的比例
0 20％ 80％
15 27％ 73％
25 35％ 65％
35 37％ 63％
45 90％ 10％
2)LC-MS分析
色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18column(1.7μm，100mm×2.1mm)；
预柱：Acquity UPLC BEH C18Van Guard pre-column(1.7μm，5mm×2.1mm)；
柱温：45℃；样品槽：4℃；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；
流动相：A-0.2％的甲酸乙腈；B-0.3％的甲酸水溶液
梯度条件：
MS分析选用负离子模式，在以下条件下进行：离子源温度(Source temp)：120℃；脱溶剂温度(Desolvation temp)：350度；脱溶剂(N2)流速Desolvation(L/Hr)600；锥孔气(N2)流速Cone(L/Hr)50；毛细管电压Capillary(Kv)2.80；锥孔电压Cone(V)55；全扫描质谱范围母离子为m/z 100～1000，子离子为m/z 50～500。LC-MS数据分析采用仪器随带的Finnigan Xcalibur 1.3软件进行。
实施例6
构建基因拷贝优化的工程菌
1)用NheI/SalI双酶切pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2，胶回收7.1kb大片段；用AvrⅡ/SalI双酶切pETM6-β1、pETM6-β2，胶回收850bp的小片段；酶切体系及连接方式与实施例2中相同。
2)将连接体系转化至(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)表达载体，分别得到E.coli BL21star-pETM6-α1β1β1、E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、E.coli BL21star-pETM6-α2β1β1、E.coli BL21star-pETM6-α2β1β2、E.coliBL21star-pETM6-α2β2β2六个工程菌。
3)按实施例3和4所述方法进行转化实验，按实施例5所述方法检测转化的产物；HPLC检测结果如图2所示。由图2对照A、B都有底物TCDCA峰，而无TUDCA产物峰；图中样品C、D、G、E、F都有新的TUDCA峰，即底物TCDCA向着产物TUDCA方向转化。
实施例7
pH对发酵的影响
按实施例3所述方法进行转化实验，TCDCA的加入量为1g/L时，配制pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的M9培养基。以E.coli BL21star-pETM6-α2β2为例，实验结果见表1所示，不同pH值条件下的产物比例见表2所示。
表1.不同pH值条件下发酵液中产物浓度与得率
表2.不同pH值条件下的发酵液中各成分比例
pH值 TUDCA/T-7K-LCA/TCDCA
5.5 0：2：9
6.0 2：2：5
6.5 2：4：5
7.0 2：5：1
7.5 2：7：1
8.0 3：2：0
8.5 1：7：1
SEQUENCE LISTING的说明

Claims (10)

1.一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：
工程菌直接发酵转化法，包括7α-HSDH和7β-HSDH基因密码子优化、工程菌的构建、工程菌培养、底物的转化及产物制备；所述工程菌为同时表达7α-HSDH和7β-HSDH基因的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)；所述底物为牛磺鹅去氧胆酸。
2.根据权利要求1的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：
7α-HSDH和7β-HSDH分别为7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶；
两个7α-HSDH分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strain DSM599，GenBank登录号：JN191345.1)和大肠杆菌(Escherichia coli strain TW14359，GenBank登录号：CU928163.2)，
两个7β-HSDH基因分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strainDSM599，GenBank登录号：JN191345.1)和活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strainN53，GenBank登录号：KF052988.1)，
分别采用http://www.jcat.de/在线软件以大肠杆菌为宿主菌，根据密码子偏好性，对全基因序列进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2。
3.根据权利要求1的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：，包括如下具体步骤：
a)双基因表达载体构建
①两个7α-HSDH和两个7β-HSDH分别进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2；
②合成的四个基因各自双酶切并分别连接入pETM6载体，得pETM6-α1、pETM6-α2、pETM6-β1、pETM6-β2；
③将pETM6-α1、pETM6-α2、pETM6-β1、pETM6-β2分别进行酶切连接，得到pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2。
b)多基因表达载体构建
在pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2重组载体的基础上，分别酶切重组载体和pETM6-β1、pETM6-β2，再次连接β基因，得到pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2；
c)工程菌的构建
①将pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2分别转入大肠杆菌BL21star感受态细胞，得到四个带有双基因表达载体的工程菌
E.coli BL21star-pETM6-α1β1、
E.coli BL21star-pETM6-α1β2、
E.coli BL21star-pETM6-α2β1、
E.coli BL21star-pETM6-α2β2；
pETM6空载体转入大肠杆菌，得到E.coli BL21star-pETM6，作为载体对照工程菌；
②将pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2分别转入大肠杆菌BL21star感受态细胞，得到六个带有多基因表达载体的工程菌
E.coli BL21star-pETM6-α1β1β1、
E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、
E.coli BL21star-pETM6-α1β1β2、
E.coli BL21star-pETM6-α2β1β1、
E.coli BL21star-pETM6-α2β1β2、
E.coli BL21star-pETM6-α2β2β2；
d)工程菌的培养
①将工程菌接种到LB固体平板培养基中活化，于20～40℃活化培养1～7天；
②从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于加有附加50～100mg/L氨苄青霉素(Amp+)LB液体培养基的三角瓶中，在75～225rpm/min、20～40℃下震荡培养12～24小时；
③将上述培养物按1:50比例接种到液体M9培养基，在75～225rpm/min、20～40℃下震荡培养3～5小时，加入0.1～1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，继续培养3～5小时；
e)底物发酵转化
①将上述培养物离心，收集菌体，以5～20倍浓缩至新的附加50～100mg/L的Amp+、0.1～1mM的IPTG的M9培养基；
②添加底物，于75～225rpm/min、20～40℃下震荡培养1～3天，进行底物的发酵转化；
f)牛磺熊去氧胆酸制备
①发酵过程结束，收集转化液，用等体积的正丁醇分三次反复萃取，合并萃取液，减压浓缩挥干正丁醇；
②所得残渣用乙醇溶解后，再次减压浓缩挥干，所得干燥物即为以牛磺熊去氧胆酸为主要成分的转化产物；
③取部分干燥物用甲醇水溶解，0.22μm滤膜过滤，用XBridgeTM C18 5μm色谱柱，对转化后成分进行分析。
4.根据权利要求3所述的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：，所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂糖15.0g/L。
5.根据权利要求3所述的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
6.根据权利要求3所述的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：所述的M9液体培养基的组成如下：Na2HPO4：6.78g/L，KH2PO4：3g/L，NaCl：0.5g/L，NH4Cl：1g/L，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.04～20％D-葡萄糖。
7.根据权利要求6所述的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：M9液体培养基的pH值为5.5-8.5的水溶液。
8.根据权利要求3所述的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：：步骤e)中的牛磺鹅去氧胆酸以粉末状态或磷酸盐缓冲液形式加入。
9.根据权利要求7所述的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：所述牛磺鹅去氧胆酸溶液的浓度为0.1～50g/L，牛磺鹅去氧胆酸加入量使其终浓度为0.1～25g/L。
10.根据权利要求3所述的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：步骤f)中的制备萃取及减压浓缩挥干。
CN201610191921.XA 2016-03-30 2016-03-30 一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法 Pending CN107287272A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610191921.XA CN107287272A (zh) 2016-03-30 2016-03-30 一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610191921.XA CN107287272A (zh) 2016-03-30 2016-03-30 一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107287272A true CN107287272A (zh) 2017-10-24

Family

ID=60087922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610191921.XA Pending CN107287272A (zh) 2016-03-30 2016-03-30 一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107287272A (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106367465A (zh) * 2016-09-26 2017-02-01 上海中医药大学 一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法
CN108588162A (zh) * 2018-04-26 2018-09-28 上海中医药大学 一种采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺
CN109402212A (zh) * 2018-11-29 2019-03-01 江苏邦泽生物医药技术股份有限公司 生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用
CN110760488A (zh) * 2019-12-12 2020-02-07 四川澄华生物科技有限公司 一种高含量12α-羟基类固醇脱氢酶发酵液的发酵方法
CN110776572A (zh) * 2019-11-14 2020-02-11 无锡佰翱得生物科学有限公司 一种7β-HSDH酶与DPS融合蛋白
CN111944775A (zh) * 2020-08-21 2020-11-17 苏州引航生物科技有限公司 经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶及其应用
CN112725212A (zh) * 2021-01-15 2021-04-30 江南大学 高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用
CN112779175A (zh) * 2021-02-10 2021-05-11 上海中医药大学 一种制备人工熊胆粉的工程酿酒酵母及方法
CN112852652A (zh) * 2021-01-15 2021-05-28 江南大学 高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株、构建与应用
CN113736842A (zh) * 2021-09-02 2021-12-03 四川澄华生物科技有限公司 一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法
CN114592027A (zh) * 2022-03-03 2022-06-07 北京岳达生物科技有限公司 两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法
CN114854653A (zh) * 2022-03-11 2022-08-05 北京岳达生物科技有限公司 一种高活性熊去氧胆酸工程菌发酵工艺

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994604A (zh) * 2012-11-21 2013-03-27 上海凯宝药业股份有限公司 两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994604A (zh) * 2012-11-21 2013-03-27 上海凯宝药业股份有限公司 两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MING-MIN ZHENG等: "Two-step enzymatic synthesis of ursodeoxycholic acid with a new 7β-hydroxysteroid dehydrogenase from Ruminococcus torques", 《PROCESS BIOCHEMISTRY》 *
SHUJUAN ZHAO等: "Improvement of catechin production in Escherichia coli through combinatorial metabolic engineering", 《METABOLIC ENGINEERING》 *
SUN B等: "Multi-enzymatic one-pot reduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts", 《BIOTECHNOL BIOENG.》 *

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106367465A (zh) * 2016-09-26 2017-02-01 上海中医药大学 一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法
CN108588162A (zh) * 2018-04-26 2018-09-28 上海中医药大学 一种采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺
CN108588162B (zh) * 2018-04-26 2021-10-08 上海中医药大学 一种采用工程菌规模化发酵培养制备人工熊胆粉的工艺
JP2021509804A (ja) * 2018-11-29 2021-04-08 江▲蘇▼邦▲澤▼生物医▲薬▼技▲術▼股▲フン▼有限公司 生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法およびその応用
WO2020108327A1 (zh) * 2018-11-29 2020-06-04 江苏邦泽生物医药技术股份有限公司 生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用
KR20200087220A (ko) * 2018-11-29 2020-07-20 노바밴드 바이오메디컬 테크놀로지 아이엔씨. 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용
CN109402212B (zh) * 2018-11-29 2021-01-05 江苏邦泽生物医药技术股份有限公司 生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用
JP7159322B2 (ja) 2018-11-29 2022-10-24 江▲蘇▼邦▲澤▼生物医▲薬▼技▲術▼股▲フン▼有限公司 生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法およびその応用
KR102652526B1 (ko) * 2018-11-29 2024-03-29 노바밴드 바이오메디컬 테크놀로지 아이엔씨. 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용
CN109402212A (zh) * 2018-11-29 2019-03-01 江苏邦泽生物医药技术股份有限公司 生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用
CN110776572A (zh) * 2019-11-14 2020-02-11 无锡佰翱得生物科学有限公司 一种7β-HSDH酶与DPS融合蛋白
CN110776572B (zh) * 2019-11-14 2021-06-29 无锡佰翱得生物科学有限公司 一种7β-HSDH酶突变体及其制备方法
CN110760488A (zh) * 2019-12-12 2020-02-07 四川澄华生物科技有限公司 一种高含量12α-羟基类固醇脱氢酶发酵液的发酵方法
CN111944775A (zh) * 2020-08-21 2020-11-17 苏州引航生物科技有限公司 经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶及其应用
CN111944775B (zh) * 2020-08-21 2023-09-05 苏州引航生物科技有限公司 经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶及其应用
CN112725212A (zh) * 2021-01-15 2021-04-30 江南大学 高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用
CN112852652A (zh) * 2021-01-15 2021-05-28 江南大学 高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株、构建与应用
CN112779175A (zh) * 2021-02-10 2021-05-11 上海中医药大学 一种制备人工熊胆粉的工程酿酒酵母及方法
CN113736842A (zh) * 2021-09-02 2021-12-03 四川澄华生物科技有限公司 一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法
CN113736842B (zh) * 2021-09-02 2024-04-19 四川澄华生物科技有限公司 一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法
CN114592027A (zh) * 2022-03-03 2022-06-07 北京岳达生物科技有限公司 两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法
CN114854653A (zh) * 2022-03-11 2022-08-05 北京岳达生物科技有限公司 一种高活性熊去氧胆酸工程菌发酵工艺

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107287272A (zh) 一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法
KR102652526B1 (ko) 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용
CN106367465A (zh) 一种采用工程菌发酵生产人工熊胆粉的方法
CN112375750B (zh) 一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷a的方法
CN106459985B (zh) 一种分枝杆菌基因工程菌在制备甾体化合物中的应用
CN107099516A (zh) 7β‑羟基甾醇脱氢酶突变体及其在熊脱氧胆酸合成中的应用
CN114015712A (zh) 一种熊去氧胆酸的制备方法
CN108138126B (zh) 一种分枝杆菌基因工程菌及其在制备甾体化合物中的应用
CN111484961B (zh) 一种产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
CN111484962B (zh) 一种高效产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
CN109706189B (zh) 一种d-手性肌醇的制备方法
CN104830888A (zh) 一种新的新金色分枝杆菌表达体系及其在转化植物甾醇合成add中的应用
CN113956990B (zh) 产二氢尼洛替星的重组酿酒酵母及其制备方法和应用
CN108929883A (zh) 芽孢形成相关基因spo ⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用
CN114854751A (zh) 代谢工程方法、产角鲨烯工程菌、产橙花叔醇工程菌及其构建方法、应用
CN112646834A (zh) 一种羽扇豆醇衍生物及其合成方法和应用
CN107903227B (zh) 琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法
CN111808830A (zh) 一种微生物降解植物甾醇生产雄二烯二酮的方法
CN113684191A (zh) 梨头霉甾体11β-羟化酶CYP5311B2突变体构建及其应用
CN105331550B (zh) 一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组真核菌株制备青蒿二烯的方法
CN103981207B (zh) 一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法
CN108587997A (zh) 一种利用重组谷氨酸棒杆菌全细胞转化生产9-oh-ad的方法
CN114395494B (zh) 一株塞伯林德纳氏酵母t52及其应用
CN114921463B (zh) 一种调控萜类化合物合成产量的人工非编码RNA分子CsiY及其应用
CN114921465B (zh) 一种调控元件CsiZ及其在提高萜类化合物合成产量中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20171024