CN114921465B - 一种调控元件CsiZ及其在提高萜类化合物合成产量中的应用 - Google Patents
一种调控元件CsiZ及其在提高萜类化合物合成产量中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114921465B CN114921465B CN202210376711.3A CN202210376711A CN114921465B CN 114921465 B CN114921465 B CN 114921465B CN 202210376711 A CN202210376711 A CN 202210376711A CN 114921465 B CN114921465 B CN 114921465B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- csiz
- transformant
- present disclosure
- recombinant
- terpenoid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 title claims abstract description 24
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title abstract description 13
- 230000006872 improvement Effects 0.000 title description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 claims description 31
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 claims description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims description 3
- 235000005473 carotenes Nutrition 0.000 claims description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 claims description 3
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims description 3
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims description 3
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 150000001746 carotenes Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N (+)-Neomenthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@@H]1O NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N 0.000 claims 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 claims 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 abstract description 3
- KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N lutein Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\[C@H]1C(C)=C[C@H](O)CC1(C)C KBPHJBAIARWVSC-RGZFRNHPSA-N 0.000 description 8
- 235000012680 lutein Nutrition 0.000 description 8
- 229960005375 lutein Drugs 0.000 description 8
- ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C ORAKUVXRZWMARG-WZLJTJAWSA-N 0.000 description 8
- 239000001656 lutein Substances 0.000 description 8
- KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N trans-lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N 0.000 description 8
- FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N xanthophyll Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C=C(C)C(O)CC2(C)C FJHBOVDFOQMZRV-XQIHNALSSA-N 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 carotene vitamin K compound Chemical class 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 3
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 2
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 2
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 2
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N vitamin A aldehyde Natural products O=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical group CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010046685 Rho Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 1
- WXYIONYJZVWSIJ-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.CC#N WXYIONYJZVWSIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037358 bacterial metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本公开涉及一种调控元件CsiZ及其在提高萜类化合物合成产量中的应用，该调控元件CsiZ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。诱导该调控元件CsiZ在宿主细胞中的表达，能够在不改变染色体基因的前提下，实现迅速、高通量的基因表达调控。
Description
技术领域
本公开涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种人工非编码RNA分子、一种DNA分子、一种重组载体、一种转化体和人工非编码RNA分子在合成萜类化合物中的应用。
背景技术
非编码RNA(Non-coding RNAs，ncRNAs)是一类大小为40-500个核苷酸不编码蛋白质的RNA分子。近年来的研究表明ncRNAs在许多基因的转录和转录后水平的调控中发挥着重要作用。萜类化合物在自然界广泛存在，是分子式为异戊二烯单位的倍数的烃类及其含氧衍生物。目前发现的萜类化合物超过8万多种，具有重要的药理功能和生物活性，拥有巨大的应用前景与商业价值。利用代谢工程与合成生物学，通过在微生物底盘宿主中构建植物源萜类的合成途径，实现萜类的高效合成已经成为目前主流生产方式。而非编码RNA作为细菌代谢调控网络中的一类新型调控因子，具有反应迅速、控制灵活精确、恢复容易、没有代谢负担等优点。设计人工非编码RNA，可以在不改变染色体基因的前提下，实现迅速、高通量的基因表达调控，在萜类化合物生物合成领域具有更广阔的应用潜力。
发明内容
为了进一步满足实际应用的需求，本公开提供了能够提高萜类化合物合成产量的人工非编码RNA分子、一种DNA分子、一种重组载体、一种转化体以及人工非编码RNA分子在合成萜类化合物中的应用。
一方面，本公开提供了一种人工非编码RNA分子，该RNA分子的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
另一方面，本公开提供了一种DNA分子，该DNA分子转录上述RNA分子。
根据本公开，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另一方面，本公开提供了一种重组载体，所述重组载体中插入有上述DNA分子。
根据本公开，其中，所述重组载体为重组表达载体；所述重组表达载体插入有表达框，所述表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
另一方面，本公开提供了一种转化体，所述转化体的宿主细胞为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括上述DNA分子，或者，所述转化体中导入的重组载体为上述重组载体。
根据本公开，其中，所述基因工程菌为大肠杆菌和酵母菌中的任意一种。
另一方面，本公开提供了第一方面所述RNA分子在合成萜类化合物中的应用。
根据本公开，其中，所述萜类化合物包括胡萝卜素类化合物维生素K类化合物、薄荷酸类化合物、角鲨烯类化合物。
通过上述技术方案，本公开提供了一种能够提高萜类化合物合成产量的人工非编码RNA分子、一种DNA分子、一种重组载体、一种转化体以及人工非编码RNA分子在合成萜类化合物中的应用，在不改变染色体基因的前提下，实现迅速、高通量的基因表达调控，从而显著提高工程菌株萜类化合物的合成产量，在萜类化合物生物合成领域具有更广阔的应用潜力。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是人工非编码RNA分子CsiZ的二级结构图。
图2是人工非编码RNA分子CsiZ的重组表达载体构建图。
图3是转化体BW8-CsiZ中CsiZ诱导前后的表达量。
图4是本公开构建的转化体BW8-CsiZ与对照菌株中合成目标叶黄素的产量测试图。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面提供一种人工非编码RNA分子，该RNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
另一方面，本公开提供一种DNA分子，该DNA分子转录上述的RNA分子。
根据本公开，其中，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另一方面，本公开提供了一种重组载体，所述重组载体中插入有上述DNA分子。
根据本公开，其中，所述重组载体为重组表达载体；所述重组表达载体插入有表达框，所述表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
另一方面，本公开提供了一种转化体，所述转化体的宿主细胞为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括上述DNA分子，或者，所述转化体中导入的重组载体为上述重组载体。
根据本公开，其中，所述基因工程菌为大肠杆菌和酵母菌中的任意一种一种。
另一方面，本公开提供了第一方面所述RNA分子在合成萜类化合物中的应用。
根据本公开，其中，所述萜类化合物包括胡萝卜素类化合物、维生素K类化合物、薄荷酸类化合物和角鲨烯类化合物。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例1
本实施例构建人工非编码RNA元件CsiZ。
利用合成生物学方法设计人工非编码RNA调控元件：将靶标调控序列、假单胞菌属hfq稳定因子结合序列和大肠杆菌不依赖rho因子的转录终止子序列组合。利用The Mfold软件，计算人工非编码RNA分子自由能，评估分子稳定性，预测RNA分子的二级结构，分析靶标调控区在人工非编码R NA分子上的位置(Web Server：http://www.unafold.org/mfold/applications/rn a-folding-form.php)，构建调控RNA元件，并命名为CsiZ，序列如SEQ IDNO.1所示。
人工非编码RNA元件CsiZ全长89bp，如图1所示，该分子含有4个颈环结构。选择将阿拉伯糖诱导启动子与非编码RNA元件CsiZ组装，构建调控模块Para-CsiZ，该调控模块全长240bp，序列如SEQ ID NO.3所示，通过化学合成的方法将设计的人工非编码RNA元件CsiZ与调控模块Para-CsiZ。
实施例2
本实施例构建表达人工非编码RNA分子的转化体。
大肠杆菌表达载体pBAD：购自淼灵生物，商品号为P0079；
克隆大肠杆菌DH5α：购自康为世纪，商品号为CW0808；
工程菌株BW_8：为本实验室保存，按照文献CN113943745A中的方法制备。
以化学合成的模块序列为模板，设计引物扩增目标非编码RNA调控模块Para-CsiZ。将阿拉伯糖诱导启动子与非编码RNA元件CsiZ组装，构建调控模块Para-CsiZ。
扩增引物：
CsiZ-F：AAGCTTTTTGTTACCGCCGGCGCA SEQ ID NO.4，
CsiZ-R：AAGCTTAAAAAAGCTGCGCGTGTA SEQ ID NO.5；
利用pBAD载体的HindIII位点对载体进行酶切，回收载体片段，同时酶切PCR扩增获得的调控模块Para-CsiZ片段，并切胶回收目标片段。室温下将目标片段与载体片段连接，构建融合表达载体pBAD-CsiZ(图2)，转化感受态细胞DH5α，通过PCR测序验证序列正确。
将测序正确的重组子细胞接种于LB培养基中，培养12小时，利用试剂盒提取重组质粒pBAD-CsiZ用于后续研究。
制备大肠杆菌叶黄素生物合成工程菌株BW_8感受态细胞，通过热激法将构建的调控模块重组质粒pBAD-CsiZ转化进入萜类化合物叶黄素生物合成工程菌株BW_8中。挑取重组菌株，进行PCR筛选验证，将正确重组菌株命名为BW8-CsiZ。
利用阿拉伯糖最为信号分子诱导其在宿主菌中非编码RNA元件CsiZ的表达，利用实时定量PCR检测CsiZ的表达情况。
实时定量PCR引物：
RT-csiZ-F：TTGACGCCAGAACCAAACAG SEQ ID NO.6，
RT-csiZ-R：GACAACAACATCGGCACCTT SEQ ID NO.7；
将表达框Para-CsiZ转化进入叶黄素生物合成工程菌株BW_8中，成果构建转化体BW8-CsiZ。实时定量PCR结果显示，非编码RNA元件CsiZ能够在转化体BW8-CsiZ中诱导表达，表达量上调20倍以上(图3)。
实施例3
本实施例用于人工非编码RNA调控元件CsiZ的功能鉴定。
工程菌株BW_8：为本实验室保存，按照文献CN113943745A中的方法制备；工程菌株BW8-CsiZ：本发明实施例2构建。
挑取正确工程菌BW8-CsiZ和对照菌株BW_8接种到LB液体培养基中，振荡培养18h活化菌株。将种子液按1％浓度转接到新的300mL的LB液体培养基中，37℃，220rpm避光振荡培养。菌液的OD600光吸收值达到0.6-0.8时，加入终浓度为2‰的L-阿拉伯糖进行诱导，37℃避光振荡培养24h。
离心10min收集菌体，丙酮溶液重悬菌体，震荡抽提10min，离心10min，将上清抽提液转移至新离心管中，向菌体中加入乙酸乙酯溶液，震荡抽提10min，离心10min。将上清液与丙酮抽提液合并，并加入无菌水，震荡混匀，离心10min，使液体分层，吸取上层液体至新的离心管中。
将抽提液蒸干，得到类胡萝卜素化合物样品，再以色谱纯的甲醇溶解样品，用于HPLC分析检测，HPLC分析条件：Kromasil-C18色谱柱(4.6﹡250nm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-水(80:15:5，V/V/V)，扫描波长：200nm-600nm，检测波长440nm，450nm，470nm，478nm，流速1mL/min，柱温25℃，进样量10μL。
以原始工程菌株BW_8为对照，表达框Para-CsiZ的重组工程菌BW8-CsiZ，利用阿拉伯糖作为信号分子，诱导工程菌株BW8-CsiZ表达CsiZ同时合成叶黄素，收集产物化合物，并通过高效液相色谱(HPLC)对工程菌株BW8-CsiZ及对照菌BW_8合成的叶黄素产量进行定量比较分析，结果显示(图4)，对照菌株BW_8合成目标萜类化合物叶黄素的峰面积为52.90273，而本公开构建的工程菌株BW8-CsiZ合成目标叶黄素峰面积为224.24269。结果表明，诱导人工非编码RNA元件CsiZ的表达能够提高工程菌株合成类胡萝卜素类化合物的产量至4.3倍。
可见，本发明公开提供的人工非编码RNA调控元件CsiZ能够显著提高工程菌株萜类化合物的合成产量。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种调控元件CsiZ及其在提高萜类化合物合成产量中的应用
<130> 20229CAAS-B-ZW
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 89
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cauguuuggc caugcucacg ccguuuuccc agggcacaac aacaauaaca aauguuagca 60
agugagcaag cuacacgcgc agcuuuuuu 89
<210> 2
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgtttggc catgctcacg ccgttttccc agggcacaac aacaataaca aatgttagca 60
agtgagcaag ctacacgcgc agctttttt 89
<210> 3
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttgttaccg ccggcgcatc gttcgtaaca aaaaccggga gcatcggtaa cgacgccccg 60
gttttttctt gccttccgcc aagcctggaa atcacaactc attgaaatat aacgatttcc 120
taaaactggc acggcaactg cttacctaat gcatgtttgg ccatgctcac gccgttttcc 180
cagggcacaa caacaataac aaatgttagc aagtgagcaa gctacacgcg cagctttttt 240
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagctttttg ttaccgccgg cgca 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagcttaaaa aagctgcgcg tgta 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgacgccag aaccaaacag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacaacaaca tcggcacctt 20
Claims (9)
1.一种人工非编码RNA分子，其特征在于，该RNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种DNA分子，其特征在于，该DNA分子转录权利要求1所述的RNA分子。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其中，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中插入有权利要求2或3所述的DNA分子。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其中，所述重组载体为重组表达载体；所述重组表达载体插入有表达框，所述表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.一种转化体，其特征在于，所述转化体的宿主细胞为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括权利要求2或3所述的DNA分子，或者，所述转化体中导入的重组载体为权利要求4或5所述的重组载体。
7.根据权利要求6所述的转化体，其中，所述基因工程菌为大肠杆菌和酵母菌中的任意一种。
8.权利要求1所述的RNA分子在合成萜类化合物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述萜类化合物包括胡萝卜素类化合物、维生素K类化合物、薄荷酸类化合物、角鲨烯类化合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210376711.3A CN114921465B (zh) | 2022-04-11 | 2022-04-11 | 一种调控元件CsiZ及其在提高萜类化合物合成产量中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210376711.3A CN114921465B (zh) | 2022-04-11 | 2022-04-11 | 一种调控元件CsiZ及其在提高萜类化合物合成产量中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114921465A CN114921465A (zh) | 2022-08-19 |
| CN114921465B true CN114921465B (zh) | 2023-12-01 |
Family
ID=82804764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210376711.3A Active CN114921465B (zh) | 2022-04-11 | 2022-04-11 | 一种调控元件CsiZ及其在提高萜类化合物合成产量中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114921465B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0330479A2 (en) * | 1988-02-26 | 1989-08-30 | Lubrizol Genetics Inc. | Plant universal stress-inducible regulatory element |
| CN103087972A (zh) * | 2013-02-01 | 2013-05-08 | 天津工业生物技术研究所 | 生产萜类化合物的重组微生物及构建方法 |
| CN106434506A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-02-22 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种生产番茄红素重组菌的构建方法与应用 |
| CN113943745A (zh) * | 2021-10-15 | 2022-01-18 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种异常球菌叶黄素的合成方法及其应用 |
| CN114134054A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-03-04 | 武汉大学 | 一种高产萜类化合物的米曲霉底盘菌株及萜类天然产物自动化高通量挖掘平台的搭建 |
-
2022
- 2022-04-11 CN CN202210376711.3A patent/CN114921465B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0330479A2 (en) * | 1988-02-26 | 1989-08-30 | Lubrizol Genetics Inc. | Plant universal stress-inducible regulatory element |
| CN103087972A (zh) * | 2013-02-01 | 2013-05-08 | 天津工业生物技术研究所 | 生产萜类化合物的重组微生物及构建方法 |
| CN106434506A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-02-22 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种生产番茄红素重组菌的构建方法与应用 |
| CN113943745A (zh) * | 2021-10-15 | 2022-01-18 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种异常球菌叶黄素的合成方法及其应用 |
| CN114134054A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-03-04 | 武汉大学 | 一种高产萜类化合物的米曲霉底盘菌株及萜类天然产物自动化高通量挖掘平台的搭建 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Genome-wide screening identifies promiscuous phosphatases impairing terpenoid biosynthesis in Escherichia coli;Tianmin Wang等;Applied Microbiology and Biotechnology;1-10 * |
| PolyU tail of rho-independent terminator of bacterial small RNAs is essential for Hfq action;Hironori Otaka等;PNAS;13059-13064 * |
| 多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产;赵婧;刘怡;李清艳;朱欣娜;张学礼;;生物工程学报(01);49-63 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114921465A (zh) | 2022-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109988722B (zh) | 一种重组酿酒酵母菌株及其应用和生产酪醇和/或红景天苷的方法 | |
| CN107287272A (zh) | 一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法 | |
| Xue et al. | Functional expression of an Arabidopsis p450 enzyme, p-coumarate-3-hydroxylase, in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 for the biosynthesis of caffeic acid | |
| EP3103873B1 (en) | Biosynthesis gene cluster of streptomyces xiamenensis, use and bacterial strain | |
| CN114107078A (zh) | 一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| Yuan et al. | Customized optimization of metabolic pathways by combinatorial transcriptional engineering | |
| CN114058525A (zh) | 一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN114107354B (zh) | 构建稳定遗传的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株的方法及其应用 | |
| CN106032525A (zh) | 一种合成白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法 | |
| CN114921465B (zh) | 一种调控元件CsiZ及其在提高萜类化合物合成产量中的应用 | |
| CN110305855B (zh) | 天麻GeCPR基因及其应用 | |
| CN104830888A (zh) | 一种新的新金色分枝杆菌表达体系及其在转化植物甾醇合成add中的应用 | |
| CN114921463B (zh) | 一种调控萜类化合物合成产量的人工非编码RNA分子CsiY及其应用 | |
| CN117229934A (zh) | 一种合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN114921464B (zh) | 一种调控胡萝卜素类化合物合成产量的人工非编码RNA分子CsiX及其应用 | |
| CN114891707A (zh) | 重组菌株及其全细胞催化生产胆红素的方法 | |
| CN113969288A (zh) | 一种高产法尼醇基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN112795587A (zh) | 一株产表面活性素的大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN106434705B (zh) | 一种酰基辅酶A-还原酶基因phsR及其应用 | |
| CN110540943A (zh) | 一种产大黄素的基因工程菌株及其构建方法与应用 | |
| CN112553239B (zh) | 基于非天然氨基酸的基因组重排调控系统和方法 | |
| US8980580B2 (en) | Heterologous expression of fungal polyketide synthetic gene in yeast and a method of preparing a compound produced by a protean encoded by the polyketide synthetic gene by the heterologous expression | |
| CN117210526B (zh) | 强抗氧化叶黄素及其人工合成的方法和核酸片段及其应用 | |
| CN117467638A (zh) | 橄榄色毛壳菌来源的苔色酸合酶及其编码基因和应用 | |
| CN114703171B (zh) | 酯酰辅酶a合成酶变体及其工程化微生物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |