CN114921464B

CN114921464B - 一种调控胡萝卜素类化合物合成产量的人工非编码RNA分子CsiX及其应用

Info

Publication number: CN114921464B
Application number: CN202210376703.9A
Authority: CN
Inventors: 林敏�; 周正富; 张维; 陈梦茹
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2022-04-11
Filing date: 2022-04-11
Publication date: 2023-12-01
Anticipated expiration: 2042-04-11
Also published as: CN114921464A

Abstract

本公开涉及一种人工非编码RNA分子，该RNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。诱导该RNA分子CsiX在宿主细胞中的表达，能够在不改变染色体基因的前提下，实现迅速、高通量的基因表达调控。

Description

一种调控胡萝卜素类化合物合成产量的人工非编码RNA分子 CsiX及其应用

技术领域

本公开涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种人工非编码RNA分子、一种DNA分子、一种重组载体、一种转化体和人工非编码RNA分子在合成胡萝素类化合物中的应用。

背景技术

类胡萝卜素是一类主要由8个类异戊二烯单位组成的C40类萜化合物及其衍生物，如番茄红素(Lycopene)、β-胡萝卜素(β-carotene)、虾青素(Astaxanthin)或角黄素(Canthaxanthin)等，通常呈红色、橙红色或黄色，大多存在两侧对称的多个双键结构，因此具有较强抗氧化能力，能够清除生物体内的活性氧自由基，保护脂质和蛋白质免受氧化损伤，从而起到预防心脑血管疾病、抑制肿瘤、防止癌变等作用。在医药、食品、化妆品等领域具有巨大的应用市场。据统计，全球类胡萝卜素市场在2017年达到15亿美元，到2022年将达到20亿美元，具有巨大的商业应用价值。

近年来，在微生物中生产类胡萝卜素因为成本低、污染小、培养周期短、易于产业化等优点逐渐取代了天然萃取法和化学合成法。随着合成类胡萝卜素的相关基因被陆续分离、测序，通过构建基因工程菌提高类胡萝卜素产量引起研究者的关注。而非编码RNA作为细菌代谢调控网络中的一类新型调控因子，具有反应迅速、控制灵活精确、恢复容易、没有代谢负担等优点。利用合成生物学理念，设计人工非编码RNA，可以在不改变染色体基因的前提下，实现迅速、高通量的基因表达调控。但目前人工非编码RNA仅在生物燃料(丁醇、丙烷等)、谷氨酸、N-乙酰氨基葡萄糖等生物制品的代谢工程中应用。人工非编码RNA在类胡萝卜素生物合成领域具有更广阔的应用潜力。

发明内容

为了进一步满足实际应用的需求，本公开提供了能够提高胡萝素类化合物合成产量的人工非编码RNA分子、一种DNA分子、一种重组载体、一种转化体以及人工非编码RNA分子在合成胡萝素类化合物中的应用。

一方面，本公开提供了一种人工非编码RNA分子，该RNA分子的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

另一方面，本公开提供了一种DNA分子，该DNA分子转录上述RNA分子。

根据本公开，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

另一方面，本公开提供了一种重组载体，所述重组载体中插入有上述DNA分子。

根据本公开，其中，所述重组载体为重组表达载体；所述重组表达载体插入有表达框，所述表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

另一方面，本公开提供了一种转化体，所述转化体的宿主细胞为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括上述DNA分子，或者，所述转化体中导入的重组载体为上述重组载体。

根据本公开，其中，所述基因工程菌为大肠杆菌和酵母菌中的任意一种。

另一方面，本公开提供了第一方面所述RNA分子在合成胡萝卜素类化合物中的应用。

根据本公开，其中，所述胡萝卜素类化合物包括番茄红素类化合物、β-胡萝卜素类化合物、虾青素类化合物、角黄素类化合物和叶黄素类化合物。

通过上述技术方案，本公开提供了一种能够提高胡萝卜素类化合物合成产量的人工非编码RNA分子、一种DNA分子、一种重组载体、一种转化体以及人工非编码RNA分子在合成胡萝素类化合物中的应用，在不改变染色体基因的前提下，实现迅速、高通量的基因表达调控，从而显著提高工程菌株胡萝素类化合物的合成产量，在胡萝素类化合物生物合成领域具有更广阔的应用潜力。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是人工非编码RNA分子CsiX的二级结构图。

图2是人工非编码RNA分子CsiX的重组表达载体构建图。

图3是转化体BW8-CsiX中CsiX诱导前后的表达量。

图4是本公开构建的转化体BW8-CsiX与对照菌株中合成目标叶黄素的产量测试图。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面提供一种人工非编码RNA分子，该RNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

另一方面，本公开提供一种DNA分子，该DNA分子转录上述的RNA分子。

根据本公开，其中，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本公开，其中，所述基因工程菌为大肠杆菌和酵母菌中的任意一种一种。

另一方面，本公开提供了第一方面所述RNA分子在合成胡萝素类化合物中的应用。

根据本公开，其中，所述胡萝素类化合物包括番茄红素类化合物、β-胡萝卜素类化合物、虾青素类化合物、角黄素类化合物和叶黄素类化合物。

下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

实施例1

本实施例构建人工非编码RNA元件CsiX。

利用合成生物学方法设计人工非编码RNA调控元件：将靶标调控序列、假单胞菌属hfq稳定因子结合序列和大肠杆菌不依赖rho因子的转录终止子序列组合。利用The Mfold软件，计算人工非编码RNA分子自由能，评估分子稳定性，预测RNA分子的二级结构，分析靶标调控区在人工非编码RNA分子上的位置(Web Server：http://www.unafold.org/mfold/applications/rn a-folding-form.php)，构建调控RNA元件，并命名为CsiX，序列如SEQIDNO.1所示。

人工非编码RNA元件CsiX全长88bp，如图1所示，该分子含有3个颈环结构。选择将阿拉伯糖诱导启动子与非编码RNA元件CsiX组装，构建调控模块Para-CsiX，该调控模块全长239bp，序列如SEQ ID NO.3所示，通过化学合成的方法将设计的人工非编码RNA元件CsiX与调控模块Para-CsiX。

实施例2

本实施例构建表达人工非编码RNA分子的转化体。

大肠杆菌表达载体pBAD：购自淼灵生物，商品号为P0079；

克隆大肠杆菌DH5α：购自康为世纪，商品号为CW0808；

工程菌株BW_8：为本实验室保存，按照文献CN113943745A中的方法制备。

以化学合成的模块序列为模板，设计引物扩增目标非编码RNA调控模块Para-CsiX。将阿拉伯糖诱导启动子与非编码RNA元件CsiX组装，构建调控模块Para-CsiX。

扩增引物：

CsiX-F：AAGCTTTTTGTTACCGCCGGCGCA SEQ ID NO.4，

CsiX-R：AAGCTTAAAAAAGCTGCGCGTGTA SEQ ID NO.5；

利用pBAD载体的HindIII位点对载体进行酶切，回收载体片段，同时酶切PCR扩增获得的调控模块Para-CsiX片段，并切胶回收目标片段。室温下将目标片段与载体片段连接，构建融合表达载体pBAD-CsiX(图2)，转化感受态细胞DH5α，通过PCR测序验证序列正确。

将测序正确的重组子细胞接种于LB培养基中，培养12小时，利用试剂盒提取重组质粒pBAD-CsiX用于后续研究。

制备大肠杆菌叶黄素生物合成工程菌株BW_8感受态细胞，通过热激法将构建的调控模块重组质粒pBAD-CsiX转化进入胡萝素类化合物叶黄素生物合成工程菌株BW_8中。挑取重组菌株，进行PCR筛选验证，将正确重组菌株命名为BW8-CsiX。

利用阿拉伯糖最为信号分子诱导其在宿主菌中非编码RNA元件CsiX的表达，利用实时定量PCR检测CsiX的表达情况。

实时定量PCR引物：

RT-CsiX-F：GCATTCCAAAAGAGGTCGCT SEQ ID NO.6，

RT-CsiX-R：GGTTTATCGCCCGCAAAGAT SEQ ID NO.7；

将表达框Para-CsiX转化进入叶黄素生物合成工程菌株BW_8中，成果构建转化体BW8-CsiX。实时定量PCR结果显示，非编码RNA元件CsiX能够在转化体BW8-CsiX中诱导表达，表达量上调20倍以上(图3)。

实施例3

本实施例用于人工非编码RNA调控元件CsiX的功能鉴定。

工程菌株BW_8：为本实验室保存，按照文献CN113943745A中的方法制备；工程菌株BW8-CsiX：本发明实施例2构建。

挑取正确工程菌BW8-CsiX和对照菌株BW_8接种到LB液体培养基中，振荡培养18h活化菌株。将种子液按1％浓度转接到新的300mL的LB液体培养基中，37℃，220rpm避光振荡培养至菌液的OD₆₀₀光吸收值达到0.6-0.8时，加入终浓度为2‰的L-阿拉伯糖进行诱导，37℃避光振荡培养24h。

离心10min收集菌体，丙酮溶液重悬菌体，震荡抽提10min，离心10min，将上清抽提液转移至新离心管中，向菌体中加入乙酸乙酯溶液，震荡抽提10min，离心10min。将上清液与丙酮抽提液合并，并加入无菌水，震荡混匀，离心10min，使液体分层，吸取上层液体至新的离心管中。

将抽提液蒸干，得到类胡萝卜素化合物样品，再以色谱纯的甲醇溶解样品，用于HPLC分析检测，HPLC分析条件：Kromasil-C18色谱柱(4.6﹡250nm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-水(80:15:5，V/V/V)，扫描波长：200nm-600nm，检测波长440nm，450nm，470nm，478nm，流速1mL/min，柱温25℃，进样量10μL。

以原始工程菌株BW_8为对照，表达框Para-CsiX的重组工程菌BW8-CsiX，利用阿拉伯糖作为信号分子，诱导工程菌株BW8-CsiX表达CsiX同时合成叶黄素，收集产物化合物，并通过高效液相色谱(HPLC)对工程菌株BW8-CsiX及对照菌BW_8合成的叶黄素产量进行定量比较分析，结果显示(图4)，对照菌株BW_8合成目标胡萝素类化合物叶黄素的峰面积为52.90273，而本公开构建的工程菌株BW8-CsiX合成目标叶黄素峰面积为191.57513。结果表明，诱导人工非编码RNA元件CsiX的表达能够提高工程菌株合成类胡萝卜素类化合物的产量至3.6倍。

可见，本发明公开提供的人工非编码RNA调控元件CsiX能够显著提高工程菌株胡萝素类化合物的合成产量。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种调控胡萝素类化合物合成产量的人工非编码RNA分子CsiX及其应用

<130> 24948CAAS-B-ZW

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 88

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cauucccuaa auagucagua uguugaaacu uuugcacaac aacaauaaca aauguaacgg 60

cuccagcaag cuacacgcgc agcuuuuu 88

<210> 2

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cattccctaa atagtcagta tgttgaaact tttgcacaac aacaataaca aatgtaacgg 60

ctccagcaag ctacacgcgc agcttttt 88

<210> 3

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgttaccg ccggcgcatc gttcgtaaca aaaaccggga gcatcggtaa cgacgccccg 60

gttttttctt gccttccgcc aagcctggaa atcacaactc attgaaatat aacgatttcc 120

taaaactggc acggcaactg cttacctaat gcattcccta aatagtcagt atgttgaaac 180

ttttgcacaa caacaataac aaatgtaacg gctccagcaa gctacacgcg cagcttttt 239

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagctttttg ttaccgccgg cgca 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagcttaaaa aagctgcgcg tgta 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcattccaaa agaggtcgct 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtttatcgc ccgcaaagat 20

Claims

1.一种人工非编码RNA分子，其特征在于，该RNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种DNA分子，其特征在于，该DNA分子转录权利要求1所述的RNA分子。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其中，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中插入有权利要求2或3所述的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其中，所述重组载体为重组表达载体；所述重组表达载体插入有表达框，所述表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.一种转化体，其特征在于，所述转化体的宿主细胞为基因工程菌；所述转化体中导入的基因包括权利要求2或3所述的DNA分子，或者，所述转化体中导入的重组载体为权利要求4或5所述的重组载体。

7.根据权利要求6所述的转化体，其中，所述基因工程菌为大肠杆菌和酵母菌中的任意一种。

8.权利要求1所述的RNA分子在合成胡萝卜素类化合物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述胡萝卜素类化合物包括番茄红素类化合物、β-胡萝卜素类化合物、虾青素类化合物、角黄素类化合物和叶黄素类化合物。