JP2021517828A - チロソール及びヒドロキシチロソールを生産する酵母及びその作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の第3の課題は、チロソールを生産する酵母の作製方法を提供することにある。
本発明の第4の課題は、ヒドロキシチロソールを生産する酵母の作製方法を提供することにある。
本発明の第6の課題は、前記ヒドロキシチロソールを生産する酵母又はその作製方法の、ヒドロキシチロソールの生産における使用を提供することにある。
好ましくは、前記PcAAS−ADH組換え酵母にpdc1遺伝子ノックアウトカセットを導入してPcAAS−ADH−Δpdc1組換え酵母を得る。
チロソールを生産する酵母の作製方法であって、具体的に、
(1)PcAASとADHのDNA配列を発現ベクターに挿入して、ベクター−PcAAS−ADH組換え発現プラスミドを作製する工程と、
さらに、好ましくは、ベクターがpJFE3である。
ヒドロキシチロソールを生産する酵母の作製方法であって、具体的に、
(1)HpaBとHpaCの遺伝子を合成してHpaBC発現カセットを作製する工程と、
また、前記チロソールを生産する酵母とチロソールを生産する酵母の作製方法の、チロソールの生産における使用を提供する。
pJFE3−PcAAS−ADH組換え発現プラスミドの作製
SEQ ID NO.1及びSEQ ID NO.2に示すアミノ酸配列をホストの出芽酵母コドン選択性によってコドン最適化を行い、SEQ ID NO.1及びSEQ ID NO.2に対応する最適化後のヌクレオチド配列を取得した後、遺伝子合成を行った。プライマーを選択し、TOYOBO社のKOD FXDNAポリメラーゼを用いて増幅し、目的遺伝子を得た。アガロースゲル電気泳動にてバンドの大きさが正確であるのを検証した後、バンドを切取り、OMEGAゲル抽出キットで遺伝子断片を回収した。PCR増幅用プライマーは以下の通りである。
(2)T4 DNAポリメラーゼを用いて断片の接合を行った。反応系は表2に示した。
(6)塩を除去した後の工程(4)における溶液と工程(5)にて処理した菌液を均一に混合して氷上に1min間放置した。
(7)全部の混合物を吸込みエレクトロポレーション(エレクトロポレーションパラメータ:1350V、200Ω、25mA、1μF)を行った。
(10)単クローンを選抜し、PCR及びシーケンシングを行って検証した。
実施例2
pdc1ノックアウトカセットの作製
プライマーの配列:
tyrA発現カセットの作製
出芽酵母のゲノムをテンプレートとし、プライマーのPDC1F−YZ/PDC1UF1及び上流500bpのホモロジーアームを用い、実施例2で作製したpdc1ノックアウトカセットをテンプレートとし、プライマーG418F1/PDCIR−YZを用いてtyrA及びpdc1下流500bpの断片を増幅し、大腸菌BL−21(DE(3)ゲノムをテンプレートとし、プライマーtyrAF1/tyrAR1を用いて遺伝子tyrA断片を増幅し、融合PCR法を採用して、tyrA発現カセットを作製し、シーケンシングを行って検証した。
PDC1F−YZの配列はSEQ ID NO.19であり、PDC1UF1の配列はSEQ ID NO.20であり、TYRAF1の配列はSEQ ID NO.21であり、TYRAR1の配列はSEQ ID NO.22であり、G418F1の配列はSEQ ID NO.23であり、PDCIR−YZの配列はSEQ ID NO.24である。
実施例4
HpaBC発現カセットの作製
実施例5
出芽酵母を例としてのチロソールを微生物異種合成する菌株の作製方法:
YZ1Fの配列はSEQ ID NO.25であり、YZ1Rの配列はSEQ ID NO.26である。
実施例6
出芽酵母を例としてのチロソールを合成する微生物の発酵:
チロソールを生産するPcAAS−ADH菌株及びPcAAS−ADH−Δpdc1−tyrA菌株のプレート上でその単クローンを取り、5mLの酵母選択栄養欠陥型培地(SD培地、Synthetic Dropout Media)に播種し、30−32 oC、200rpm条件下で24h培養した後、50mLのSD培地に最初播種のOD600が0.2になるように再播種し、30oC、200rpm条件下で12h培養した後、100mLのSD培地に最初播種のOD600が0.2になるように再播種し、グルコース、フラクトース、スクロース又はグルコースとチロシン等をそれぞれ添加して72時間発酵実験を行った。文献(Satoh, Tajima et al.201(2)に報告されたHPLC法により発酵液中のチロソールの濃度を測定した。異なる炭素源の培養条件下でのチロソール生産量は表4に示した。
実施例7
出芽酵母を例としてのヒドロキシチロソールを合成する微生物の発酵:
ヒドロキシチロソールを生産するPcAAS−ADH−Δpdc1−tyrA−HpaBC菌株のプレート上でその単クローンを取って5mLの酵母選択栄養欠陥型培地(SD培地、Synthetic Dropout Media)に播種し、30−32oC、200rpm条件下で24h培養した後、50mLのSD培地に最初播種のOD600が0.2になるように再播種し、30oC、200rpmの条件下で12h培養した後、100mLのSD培地に最初播種のOD600が0.2になるように再播種し、発酵実験を行った。文献(Satoh, Tajima et al.201(2)に報告されたHPLC法により発酵液中のヒドロキシチロソールの濃度を測定した。発酵72h後、得られたヒドロキシチロソールの生産量は978mg/Lであった。
Claims (10)
- パセリ由来のチロシンデカルボキシラーゼとエンテロバクター属由来のアルコールデヒドロゲナーゼのDNA配列を酵母BY4741に導入してPcAAS−ADH組換え酵母を得る操作を備える、ことを特徴とするチロソールを生産する酵母。
- チロシンデカルボキシラーゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO.1であり、SEQ ID NO.2に示すチロシンデカルボキシラーゼのDNA配列が、SEQ ID NO.1に示すアミノ酸配列をコードし、アルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO.3であり、SEQ ID NO.4に示すアルコールデヒドロゲナーゼのDNA配列が、SEQ ID NO.3に示すアミノ酸配列をコードする、ことを特徴とする請求項1に記載のチロソールを生産する酵母。
- 請求項1における前記PcAAS−ADH組換え酵母にpdc1遺伝子ノックアウトカセットを導入してPcAAS−ADH−pdc1組換え酵母を得、その中、前記pdc1遺伝子ノックアウトカセットの作製方法が、酵母BY4741のゲノムをテンプレートとし、プライマーを用いてpdc1断片の上流及び下流500bpのホモロジーアームをそれぞれ増幅し、プライマーを用いてG418耐性遺伝子断片を増幅し、前記上流及び下流500bpのホモロジーアームと前記G418耐性遺伝子断片とを融合させてpdc1ノックアウトカセットを得る操作を備える、ことを特徴とする請求項1に記載のチロソールを生産する酵母。
- 請求項3における前記PcAAS−ADH−Δpdc1組換え酵母にtyrA発現カセットを導入してPcAAS−ADH−Δpdc1−tyrA組換え酵母を得、その中、前記tyrA発現カセットの作製方法が、酵母BY4741のゲノムをテンプレートとし、プライマー用いて上流500bpのホモロジーアームを増幅し、請求項4における前記pdc1ノックアウトカセットをテンプレートとし、プライマーを用いてtyrA断片を増幅し、上流500bpのホモロジーアームとtyrA断片を融合させてtyrA発現カセットを作製する操作を備える、ことを特徴とする請求項3に記載のチロソールを生産する酵母。
- 大腸菌由来の4−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼDNA配列遺伝子クラスターを請求項4における前記PcAAS−ADH−Δpdc1−tyrA組換え酵母に導入してヒドロキシチロソールを生産するPcAAS−ADH−HpaBC−Δpdc1−tyrA組換え酵母を得る、ことを特徴とするヒドロキシチロソールを生産する酵母。
- 前記4−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼのアミノ酸配列遺伝子クラスターがSEQ ID NO.5及びSEQ ID NO.7を含み、SEQ ID NO.6及びSEQ ID NO.8に示す4−ハイドロキシフェニルアセテートハイドロキシラーゼのDNA配列遺伝子クラスターは、それぞれSEQ ID NO.5に示すアミノ酸配列及びSEQ ID NO.7に示すアミノ酸配列をコードする、ことを特徴とする請求項5に記載のヒドロキシチロソールを生産する酵母。
- (1)PcAASとADHのDNA配列を発現ベクターに挿入して、ベクター−PcAAS−ADH組換え発現プラスミドを作製する操作と、
(2)請求項3における前記pdc1ノックアウトカセットを作製する操作と、
(3)請求項4における前記tyrA発現カセットを作製する操作と、
(4)前記工程(2)で得られたpdc1ノックアウトカセット及び前記工程(3)で得られたtyrA発現カセットを工程(1)で得られたベクター−PcAAS−ADHプラスミドに挿入してPcAAS−ADH−Δpdc1−tyrAプラスミドを得、それを酵母BY4741に導入して組換えPcAAS−ADH−Δpdc1−tyrA酵母株を得る操作と、を備え、
前記工程(1)における発現ベクターが、pJFE3、pUC19、pΔBLE2.0、pGK系ベクター、pXP318であり、
前記工程(1)の発現ベクターが、pJFE3である、ことを特徴とするチロソールを生産する酵母の的作製方法。 - (1)HpaBとHpaCの遺伝子を合成してHpaBC発現カセットを作製する操作と、
(2)HpaBC発現カセットを組換えPcAAS−ADH−Δpdc1−tyrA酵母に導入して組換えPcAAS−ADH−Δpdc1−tyrA−HpaBC酵母を得る工程と、を備える、ことを特徴とするヒドロキシチロソールを生産する酵母の的作製方法。 - 請求項1〜4の何れか1項に記載のチロソールを生産する酵母及び請求項7に記載のチロソールを生産する酵母の作製方法の、チロソールの生産における使用であって、
前記使用の具体的形態が、前記チロソールを生産する酵母の発酵培養を行うことでチロソールを得、前記発酵培養の培養液がグルコース、フラクトース、スクロース又はグルコースとチロシンの混合物の中の一つ又はそれらの混合物である、請求項1〜4の何れか1項に記載のチロソールを生産する酵母及び請求抗7に記載のチロソールを生産する酵母の作製方法の、チロソールの生産における使用。 - 請求項5又は6に記載のヒドロキシチロソールを生産する酵母及び請求項8に記載のヒドロキシチロソールを生産する酵母の作製方法の、ヒドロキシチロソールの生産における使用であって、
前記使用の具体的形態が、前記ヒドロキシチロソールを生産する酵母の発酵培養を行うことでヒドロキシチロソールを得、前記発酵培養の培養液がグルコース、フラクトース、スクロース又はグルコースとチロシンの混合物の中の一つ又はそれらの混合物である、請求項5又は6に記載のヒドロキシチロソールを生産する酵母及び請求項8に記載のヒドロキシチロソールを生産する酵母の作製方法の、ヒドロキシチロソールの生産における使用。
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