CN115896083A - 芳樟醇合成酶突变体、重组表达载体、重组菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过蛋白质理性设计获得的芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变基因和其编码的蛋白。本发明还公开了含有所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变基因和蛋白的重组载体和重组菌，及其构建方法和应用。本发明公开的包含芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体的重组菌，可以用于高效生产芳樟醇。本发明构建的酿酒酵母双倍体菌株，充分利用细胞质和细胞器中的前体物质乙酰辅酶A，在酿酒酵母细胞质和过氧化物酶体同时引入了芳樟醇合成途径，协调调控细胞质和过氧化物酶体，在生产芳樟醇时更为高效，可作为芳樟醇合成工程菌。

Description

芳樟醇合成酶突变体、重组表达载体、重组菌及其应用

技术领域

本发明属于酶工程与代谢工程领域，具体涉及一种通过蛋白质理性设计获得活性提高的芳樟醇合成酶突变体编码它的核酸序列、含有该突变体基因的重组表达载体，以及在酿酒酵母中的表达及其应用。

背景技术

芳樟醇是含有10个碳原子的链状单萜烯醇类化合物，主要存在于植物精油如芳樟油、薰衣草油、香柠檬油等中。由于其具有特殊的香气，是目前工业上用量最大的香精香料之一，占据了60-80％的香料市场。此外芳樟醇还具有抗菌、驱避杀虫、消炎止痛以及镇静等多种生物学功效，具有重要的研究和应用价值。目前，芳樟醇主要来源于植物提取和化学合成。由于天然提取芳樟醇产量很低，分离提纯复杂，成本相对较高，并不能满足人们对天然香料日益增长的需求。化学法生产芳樟醇不可避免的会产生大量工业“三废”。随着合成生物学技术的高速发展，利用微生物细胞工厂进行各种生物产品的选择性合成已经成为可能。前期申请人通过在酿酒酵母中过表达甲羟戊酸途径中的限速酶以及引入异源的芳樟醇合酶，获得了一株产芳樟醇的酿酒酵母单倍体菌株(Biochemical Engineering Journal,2020,161:107655.)，并通过芳樟醇合成酶的定向进化以及表达调控，构建了一株产量达到了80.9mg/L的酿酒酵母菌株，是目前报道中酵母产芳樟醇的最高产量(Journal ofAgricultural and Food Chemistry，2021,69,1003-1010)，但该产量远未达到工业化水平。在此过程中，利用番茄红素的颜色变化建立了高通量筛选方法，对芳樟醇合成酶t67OMcLIS进行定向进化，最终筛选到了一株活性提高了52.7％的突变体t67OMcLISE343D/E352H(专利CN202010416910.3)。但是利用颜色变浅进行突变株高通量筛选时，由于颜色会达到饱和，假阳性效率高，很难进一步筛选到活性提高的突变体。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种通过蛋白质理性设计获得的芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变基因和其编码的蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供含有上述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变基因和蛋白的重组载体和重组菌，及其构建方法和应用。

技术方案：为了解决上述技术变基因的核苷酸问题，本发明提供了一种芳樟醇合成酶t67OMcLISM突变体，所述突变体在野生型芳樟醇合成酶的第447位氨基酸发生突变。

进一步地，所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体包括以下几种之一：

(1)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447E，其氨基酸序列如SEQID NO:7所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS_M(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了谷氨酸；

(2)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447A，其氨基酸序列如SEQID NO:8所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS_M(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了丙氨酸；

(3)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447M，其氨基酸序列如SEQID NO:9所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS_M(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了甲硫氨酸；

(4)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447Q，其氨基酸序列如SEQID NO:10所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS_M(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了谷氨酰胺；

(5)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447G，其氨基酸序列如SEQID NO:11所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS_M(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了甘氨酸；

(6)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447S，其氨基酸序列如SEQID NO:12所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS_M(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了丝氨酸。

本发明还提供了上述突变体的突变型基因或核酸。

进一步地，上述突变型基因或核酸，即所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列；

(2)序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列；

(3)序列表中SEQ ID NO:3的核苷酸序列；

(4)序列表中SEQ ID NO:4的核苷酸序列；

(5)序列表中SEQ ID NO:5的核苷酸序列；

(6)序列表中SEQ ID NO:6的核苷酸序列。

本发明还提供了表达盒、重组载体、重组菌株，其含有上述的突变型基因或核酸。

进一步地，所述重组载体为酿酒酵母载体，所述重组菌株为酿酒酵母菌。

本发明还提供了上述重组载体或重组菌株在高效合成芳樟醇中的应用。

本发明还提供了一种重组菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1)芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变基因的获得；

(2)构建含有上述t67OMcLIS_M突变基因的pUMRI-16-t67OMcLIS_M-ERG20^F96W/N127W重组质粒；

(3)将重组质粒整合到酿酒酵母菌株中即得。

本发明还提供了一种重组菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD质粒的获得；

(2)将步骤(1)中获得的质粒导入酿酒酵母YXWP113-C01菌株中得到YLin-17；

(3)将pUMRI-13-IDI1-tHMG1和pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^{F96W /N127W}-RIDD质粒导入酿酒酵母YXWP-114菌株中得到YLin114-C2；

(4)将C端含有ePTS1序列的甲羟戊酸途径基因、ERG20^F96W/N127W-ePTS1和SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-ePTS1导入到YLin-17中，得到YLin-PC-01；

(5)将YLin-PC-01与YLin114-C2杂交得到原养型双倍体菌株YLin-DiPC-03。

其中，具体地，pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD质粒含有ERG20^F96W/N127W-RIDD和SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD基因，其中，SKIK为Ser-Lys-Ile-Lys四个氨基酸组成的短肽，在N端与t67OMcLIS_M ^F447E融合表达，可以提高基因的表达量。RIAD(LEQYANQLADQIIKEATEGC)通过Linker(GGGGSGGGGSGGGGCG)与t67OMcLIS_M ^F447E C端融合，RIDD(SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK)通过Linker(GGGGSGGGGSGGGGCG)与ERG20^F96W/N127W融合。由于RIAD与RIDD短肽在细胞内会形成复合物，从而会引导t67OMcLIS_M ^F447E和ERG20^F96W/N127W形成融合蛋白。

其中，具体地，步骤(1)所述pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD质粒的构建方法为：以pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD质粒为模板，采用QuickChangeTM方法扩增得到含有SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD和ERG20^F96W/N127W-RIDD基因的重组质粒。

其中，具体地，步骤(4)通过CRISPR/Cas9系统将C端含有过氧化物媒体定位序列ePTS1(ePTS1：LGRGRRSKL)的甲羟戊酸(MVA)途径基因、ERG20^F96W/N127W-ePTS1和SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-ePTS1导入到YLin-17中，得到YLin-PC-01重组菌株。

进一步地，所述甲羟戊酸途径基因包括：ERG10，HMGS，tHMG1，ERG12，ERG8，MVD1，IDI1。

进一步地，所述ERG10编码的是乙酰乙酰-CoA硫解酶,所述HMGS编码的是3-羟-3-甲戊二酸单酰辅酶A合酶，所述tHMG1编码的是3-羟基-3-甲基-辅酶A还原酶的催化区段，所述ERG12编码的是甲羟戊酸激酶，所述ERG8编码的是甲羟戊酸磷酸激酶，所述MVD1编码的是甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶，所述IDI1基因编码异戊烯基焦磷酸(IPP)异构酶。

本发明还提供了所述重组菌在提高芳樟醇产量中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明提供的包含芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体的重组菌，可以用于高效生产芳樟醇。本发明构建的酿酒酵母双倍体菌株，充分利用细胞质和细胞器中的前体物质乙酰辅酶A，在酿酒酵母细胞质和过氧化物酶体同时引入了芳樟醇合成途径，协调调控细胞质和过氧化物酶体，在生产芳樟醇时更为高效，可作为芳樟醇合成工程菌。

附图说明

图1为细胞质和过氧化物酶体双调控的示意图；

图2为芳樟醇合成酶突变体对芳樟醇合成的影响示意图，其中WT为野生型t67OMcLIS_M；

图3为重组菌株摇瓶培养中芳樟醇的产量示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例所用培养基、储存液配方：

卡那霉素储存液(50mg/mL)：取0.5g卡那霉素溶于10mL ddH₂O中，过滤除菌，于-20℃保存，使用时稀释1000倍使终浓度为50μg/mL。

Luria-Bertani(LB)培养基：LB肉汤培养基、LB肉汤琼脂购于上海生物工程有限公司，121℃灭菌15min。

遗传霉素(G418)储存液(20mg/mL)：取0.2g G418溶于10mL ddH₂O中，过滤除菌，于-20℃保存，使用时稀释100倍使终浓度为200μg/mL。

5-氟乳清酸(FOA)储存液(100mg/mL)：取0.1g5-FOA溶于1mL二甲基亚砜中，使用时直接取1mL母液加到100mLSD固体培养基中，用于制作SD-FOA平板。

10×YNB储存液：称取1.7％YNB和5％(NH4)₂SO₄溶于ddH₂O中，用0.22μm无菌针式过滤器过滤除菌，于4℃冰箱保存，使用时稀释10倍。

10×氨基酸混合储存液：按以下配方称取各种氨基酸混合并溶于ddH₂O中，浓度为：L-腺嘌呤硫酸盐200mg/L，L-精氨酸200mg/L，L-组氨酸200mg/L，L-异亮氨酸300mg/L，L-亮氨酸1000mg/L，L-赖氨酸300mg/L，L-蛋氨酸200mg/L，L-苯丙氨酸500mg/L，L-苏氨酸2000mg/L，L-色氨酸200mg/L，L-酪氨酸300mg/L，L-尿嘧啶200mg/L，L-缬氨酸1500mg/L(注：配制上述氨基酸母液时，根据营养筛选的不同，缺失相应的氨基酸)。用0.22μm无菌针式过滤器过滤除菌，于4℃冰箱存放。使用时稀释10倍。

Yeast Extract Peptone Dextrose(YPD)培养基：10g/L酵母浸出粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，固体YPD培养基添加1.5-2％的琼脂粉，115℃灭菌21min。

SyntheticDefined(SD)培养基：2％葡萄糖，10％(V/V)的10×YNB储存液，10％(V/V)的10×氨基酸混合母液。配置100mLSD培养基具体流程如下：取2g葡萄糖溶于80mL水中，115℃高压灭菌21min中，待培养基冷却到60℃以下，加入10mL的10×YNB母液和10mL的10×氨基酸混合母液。固体SD培养基添加1.5-2％的琼脂粉。其中SD-URA-表示缺尿嘧啶的SD培养基。注：如果在SD平板中需要添加G418，则不能用硫酸铵作为氮源(会使G418失效)，将硫酸铵改用终浓度0.1％的谷氨酸钠作为氮源。

CaCl₂-MgCl₂溶液(含80mmol/L MgCl₂，20mmol/L CaCl₂)：取MgCl₂·6H₂O 16.26g，CaCl₂ 2.22g，定容于1L ddH₂O中，121℃灭菌15min，冷却后于4℃冰箱保存。

甘油-CaCl₂溶液(含0.1mol/L的CaCl₂和20％的甘油)：取CaCl₂ 11.1g，用20％的甘油溶液溶解定容至1L，121℃灭菌15min，冷却后于4℃冰箱保存。

Single-stranded carrier DNA(2.0mg/L)：40mg溶解于20mL 1×TE Buffer，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于-20℃保存。

PEG MW 3350(50％w/v)：称取50g PEG 3350定容于100mL无菌去离子水中，搅拌均匀，121℃灭菌15min，冷却后于4℃冰箱保存。

1.0M醋酸锂：称取10.2g二水醋酸锂溶解于100mL水中，搅拌均匀后，121℃灭菌15min，冷却后于4℃冰箱保存。

实施例所用试剂：

高保真酶DNA聚合酶(Prime STARTM HS DNA polymeras)、DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶均购于大连宝生物公司(Takara，大连)；2×Taq Plus Master Mix II、DNAmarker购于南京诺唯赞生物技术有限公司；细菌质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒购于杭州Axygen公司；PCR引物合成及测序服务由上海生物工程有限公司或者南京擎科生物技术有限公司提供。

实施例所用常规的技术方法：

1、大肠杆菌感受态制备：

(1)将E.coli BL21在LB固体平板上划线，37℃过夜培养15h左右；然后挑取单菌落接种到5mL LB液体培养基中，220rpm，37℃过夜培养，取1mL种子液转接至50mL LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600约为0.35-0.40；

(2)每管分装50mL菌液至预冷的50mL离心管中，冰浴10min后，用3000rpm 4℃离心10min，收集菌体，弃上清；

(3)每管菌体中加入30mL预冷的CaCl₂-MgCl₂溶液，重悬菌体(冰上操作)，用3000rpm低温离心10min收集菌体，弃上清；

(4)用2mL预冷的0.1M甘油-CaCl₂溶液重悬菌体，混匀后按每管100μL分装于预冷的1.5mL离心管，-80℃保存备用。

2、大肠杆菌化转方法：

(1)将大肠杆菌感受态从-80℃冰箱取出，冰上融化。

(2)加入10μL重组质粒，冰上放置20min。

(3)42℃热击90s，立即冰浴5min。

(4)加入1mL LB混匀，37℃摇床复苏50min。

(5)8000rpm离心1min，去上清，留100μL重悬，涂含有相应抗性的LB平板，37℃培养过夜。

3、菌落PCR鉴定和质粒抽提

(1)在转化后的大肠杆菌平板上挑单个菌落，接种到含有相应抗生素的300uL LB溶液中37℃培养1.5h左右。

(2)以菌液作为模板，用2×Taq Plus Master Mix II进行菌液PCR验证。

(3)对含有目的大小条带的菌液转接LB试管进行质粒抽提，并对克隆区段进行DNA测序鉴定。

4、酿酒酵母感受态细胞的制备及醋酸锂转化法：

(1)挑取单克隆接种到5mL YPD试管，30℃，220rpm培养过夜，取1mL的种子液转接到含有50mL YPD的250mL三角瓶中，30℃，220rpm培养5h左右，OD600约为2。

(2)将菌液转移到50mL灭过菌的离心管中，5000×g，离心5min后去上清。

(3)加40mL灭菌水洗涤菌体，5000×g离心5min后去上清。

(4)加800μL灭菌水重悬菌体，混匀后按每管100μL分装于1.5mL EP管，12000×g离心1min后去上清，备用。

(5)在上述1.5mL EP管的菌体中依次加入240μL PEG MW 3350(50％w/v)，36μL的1.0M醋酸锂，30μL灭菌水，50μL的单链DNA(Single-strandedcarrier DNA，2.0mg/mL)，质粒片段4μL，重悬菌体，充分混匀。

(6)将1.5mL EP管放置42℃水浴锅中热击40min。

(7)热击结束后，12000×g离心1min，去上清。

(8)加入1mL YPD培养基，混匀细胞后放置于30℃，220rpm摇床复苏1.5-2h。

(9)复苏后的细胞，12000×g离心1min，去上清培养基，再用1mL灭菌纯净水水洗沉淀，12000×g离心1min，去上清，最后加入1mL灭菌纯净水重悬细胞，取20μL涂到相应抗性的筛选平板上涂布均匀，于30℃培养箱培养3天。

5、产芳樟醇重组菌摇瓶培养和产量分析方法

将本专利中所构建的产芳樟醇重组菌株在YPD平板上划线培养3天后，挑单菌落至5mL YPD试管中，30℃、220rpm过夜培养15h左右，然后转接到含有5mL十四酸异丙酯的50mLYPD培养基中，使摇瓶中的初始OD600为0.05，放置30℃，220rpm的恒温摇床中培养84h。培养结束后，取2mL发酵液置于2mL EP管，12000×g离心1分钟，去上清，加入2mL纯净水清洗细胞，12000×g离心1分钟，去上清后，将离心管放置110℃烘箱烘至恒重用于干重测量。随后将摇瓶静置，使两相自然分层，取上层有机相于2mL离心管中，12000rpm离心5min，取上清500μl于新的1.5mL离心管中，在离心管中加入20μL的481.4mg/L正辛醇作为内标。采用气相色谱，分析芳樟醇的含量。气相色谱仪型号为福立9790II，色谱柱为HP-5(30m×0.320mm，0.25Micron,Agilent Technologies,Lnc.)，载气：N₂；进样量：1μL；采用程序升温：初始温度80℃，保持2min，以10℃/min升温至110℃，然后以40℃/min升至250℃，保持10min。正辛醇保留时间：3.9min；芳樟醇保留时间4.4min。

实施例1含芳樟醇合酶突变体的质粒构建

以含有突变点的寡核苷酸片段为引物，具体序列见表1，以pUMRI-16-t67OMcLIS^E343D/E352H-ERG20^F96W/N127W质粒(Biochemical Engineering Journal 161(2020)107655)为模板，采用QuickChange^TM方法(Stratagene,La Jolla,CA)扩增含有t67OMcLIS_M突变体基因的pUMRI-16-t67OMcLIS_M-ERG20^F96W/N127W重组质粒。

表1引物列表

PCR反应体系：5×PrimeSTAR buffer(Mg²⁺plus)，5μL；dNTPs(各2.5mM)，2.0μL；上游引物(10μM)，1.0μL；下游引物(10μM)，1.0μL；重组质粒模板，0.5μL；PrimeSTARpolymerase^TM HS(2.5U/μL)，0.5μL；加ddH₂O至总体积为25μL。

PCR程序：(1)98℃，1min；(2)98℃，10s；(3)55℃，10s；(4)72℃，8.5min。步骤(2)-(4)循环20次后冷却至4℃。PCR产物经清洗后，利用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶DpnI进行消化以降解模板质粒。酶切反应体系及条件：17μL经清洗处理的PCR产物，2.0μL10×缓冲液，1.0μL限制性内切酶DpnI，37℃保温1.5h。限制性内切酶消化过程结束后，产物直接转化E.coli DH5α感受态细胞，方法参考上述“大肠杆菌化转方法”。

分别得到以下重组质粒：pUMRI-16-t67OMcLIS_M ^F447A-ERG20^F96W/N127W、pUMRI-16-t67OMcLIS_M ^F447M-ERG20^F96W/N127W、pUMRI-16-t67OMcLIS_M ^F447G-ERG20^F96W/N127W、pUMRI-16-t67OMcLIS_M ^F447Y-ERG20^F96W/N127W、pUMRI-16-t67OMcLIS_M ^F447W-ERG20^F96W/N127W、pUMRI-16-t67OMcLIS_M ^F447R-ERG20^F96W/N127W、pUMRI-16-t67OMcLIS_M ^F447K-ERG20^F96W/N127W、pUMRI-16-t67OMcLIS_M ^F447E-ERG20^F96W/N127W、pUMRI-16-t67OMcLIS_M ^F447S-ERG20^F96W/N127W、pUMRI-16-t67OMcLIS_M ^F447Q-ERG20^F96W/N127W。

实施例2芳樟醇合成酶突变对芳樟醇产量的影响

首先将实施例2构建的重组质粒分别用Sfi I限制性内切酶进行线性化酶切，酶切体系如下：质粒，43.5μL；10×Quick cut Buffer，5μL；Sfi I限制性内切酶，1.5μL。酶切3h后进行纯回收备用。以YXWP113-C01(Biochemical Engineering Journal,2020,161:107655)为宿主菌，将上述Sfi I酶线性化后的质粒分别通过醋酸锂转化法整合到其基因组上，得到含有不同t67OMcLIS_M突变体的酿酒酵母重组菌，并按照实施例所用常规的技术方法进行摇瓶发酵培养和芳樟醇产量分析，结果如图2所示(WT为野生型t67OMcLIS_M)。t67OMcLIS_M ^F447E、t67OMcLIS_M ^F447A、t67OMcLIS_M ^F447M、t67OMcLIS_M ^F447Q、t67OMcLIS_M ^F447G、t67OMcLIS_M ^F447S突变体分别使得芳樟醇产量提高了121.3％、92.8％、45.1％、42.6％、34.6％、17.2％。因此在后面实施例芳樟醇合成菌株构建中优选了t67OMcLIS_M ^F447E突变体。

实施例3ERG20 ^F96W/N127W和t67OMcLIS_M ^F447E融合表达质粒的构建

以表1中F447E-F/F447E-R为引物，以pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M-RIAD-ERG20^{F96W /N127W}-RIDD(即为pUMRI-16-Kt67OMcLIS^E343D/E352HA-ERG20^F96W/N127WD(J.Agric.FoodChem.2021,69,1003-1010))质粒为模板，采用QuickChangeTM方法(Stratagene,La Jolla,CA)扩增得到含有SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD和ERG20^F96W/N127W-RIDD基因的pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD重组质粒。PCR反应体系和程序如实施例2，并按照实施例2进行DpnI酶消化后，产物直接转化E.coli DH5α感受态细胞中，复制得到pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD质粒。

实施例4过氧化物酶体定位所需质粒和元件的构建

酿酒酵母Crispr/Cas9基因编辑相关质粒P426-SpSgH、P426-CCdB和p416-Cas9-G418由浙江大学化学工程与生物工程学院于洪巍教授课题组馈赠(MetabolicEngineering,2021,67:19-28)。

(1)含gRNA的编辑质粒构建

P426-SPSgH-gYPL062W单位点编辑质粒构建方法如下：各取5μL gYPL062W-F(BsaI)和gYPL062W-R(Bsa I)引物(浓度10μM)于PCR管中，混匀后在PCR仪上进行缓慢退火(以每秒降低0.1℃的速度从95℃降至4℃)，结束后保存于4℃备用。用BsaI-HFv2对质粒P426-SpSgH进行单酶切，37℃酶切2h后，清洗得到线性化质粒，按照以下体系将上述退火引物和线性化质粒进行连接，22℃连接30-50min后转入大肠杆菌感受态。

连接体系

同理，P426-SPSgH-gHO、P426-SPSgH-gDPP1、P426-SPSgH-gLPP1、P426-SPSgH-gROX1质粒构建同上。

P426-CCdB-gYPL062W-gHO双位点质粒构建方法如下：以P426-SPSgH-gYPL062W为模板，4gRNA-F1、4gRNA-R1为引物，利用高保真酶PCR扩增得到含gYPL062W的片段一；以P426-SPSgH-gHO为模板，4gRNA-F2、4gRNA-R4为引物，利用高保真酶PCR扩增得到含gHO的片段二。利用Golden Gate克隆方法，将含gYPL062W片段一和含gHO片段二，与质粒骨架P426-CCdB进行Golden Gate组装，组装体系和PCR反应程序如下。组装后转化大肠感受态细胞，放置于37℃培养箱培养过夜得到的阳性克隆用于P426-SPSgH-gYPL062W质粒抽提。

golden-gate组装体系

Golden-gate PCR反应程序如下：

P426-CCdB-gDPP1-gLPP1双位点质粒构建方法如下:以P426-SPSgH-gDPP1为模板，4gRNA-F1、4gRNA-R1为引物，利用高保真酶PCR扩增得到含gDPP1的片段一；以P426-SPSgH-gLPP1为模板，4gRNA-F2、4gRNA-R4为引物,利用高保真酶PCR扩增得到含gLPP1的片段二。利用Golden Gate克隆方法，将含gDPP1片段一和含gLPP1片段二，与质粒骨架P426-CCdB进行Golden Gate组装，组装体系和程序如上述所示。组装后转化大肠感受态细胞，放置于37℃培养箱培养过夜得到的阳性克隆用于P426-CCdB-gDPP1-gLPP1质粒抽提。

构建上述质粒所需引物序列如表2所示。

表2引物列表

(2)整合片段的构建

分别以ERG10-ePTS1-F(Not I)/ERG10-ePTS1-R(Sac I)、ERG13-ePTS1-F(BamHI)/ERG13-ePTS1-R(Xho I)、ERG12-ePTS1-F(Not I)/ERG12-ePTS1-R(Sac I)、ERG8-ePTS1-F(EcoR I)/ERG8-ePTS1-R(Sac I)、MVD1-ePTS1-F(BamH I)/MVD1-ePTS1-R(XhoI)、tHMG1-ePTS1-F(SmaI)/tHMG1-ePTS1-R(XhoI)、IDI1-F2(EcoRI)/IDI1-ePTS1-R(BglII)为引物，酿酒酵母BY4741基因组(本实验室提供)为模板，通过高保真酶PCR扩增，得到C端融合了过氧化物酶体定位序列ePTS1的基因ERG10-ePTS1、ERG13-ePTS1、ERG12-ePTS1、ERG8-ePTS1、MVD1-ePTS1、tHMG1-ePTS1和IDI1-ePTS1；分别以ERG20M-F2(BamH I)/ERG20M-ePTS1-R(XhoI)、SKIK-F/SKIK-LISM-ePTS1-R(Sac I)为引物，以质粒pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20 ^F96W/N127W-RIDD(实施例4得到)为模板，通过高保真酶PCR扩增得到C端融合了过氧化物酶体定位序列ePTS1的基因ERG20 ^F96W/N127W-ePTS1和SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-ePTS1。ERG10-ePTS1基因片段用Not I和Sac I双酶切，然后与相同双酶切的质粒PUMRI-20(J.Agric.Food Chem.2019,67,1072-1080)相连接，经大肠杆菌转化，得到质粒PUMRI-20-ERG10-ePTS1；ERG13-ePTS1基因用BamH I和XhoI双酶切，然后与相同双酶切的质粒PUMRI-20-ERG10-ePTS1相连接，经大肠杆菌转化，得到质粒PUMRI-20-ERG10-ePTS1-ERG13-ePTS1。同理，经过两轮酶切和连接，得到质粒pUMRI-10-ERG12-ePTS1-tHMG1-ePTS1、pUMRI-11-ERG8-ePTS1-MVD1-ePTS1、pUMRI-13-IDI1-ePTS1-tHMG1-ePTS1、pUMRI-16-ERG20 ^F96W/N127W-ePTS1-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-ePTS1。

以UP-YPL062W-ERG10-R/DN-YPL062W-ERG13-R为引物，以上述质粒PUMRI-20-ERG10-ePTS1-ERG13-ePTS1为模板，通过高保真酶PCR扩增，得到upYPL062W-ERG10-ePTS1-ERG13-ePTS1-dnYPL062W基因整合片段；以UPHO-ERG12-R/DNHO-tHMG1-R为引物,以pUMRI-10-ERG12-ePTS1-tHMG1-ePTS1为模板，通过高保真酶PCR扩增，得到upHO-ERG12-ePTS1-tHMG1-ePTS1-dnHO基因整合片段。以UPDPP1-ERG8-R/DNDPP1-MVD1-R为引物，以pUMRI-11-ERG8-ePTS1-MVD1-ePTS1为模板，通过高保真酶PCR扩增，得到upDPP1-ERG8-ePTS1-MVD1-ePTS1-dnDPP1基因整合片段；以UPLPP1-IDI1-R/DNLPP1-tHMG1-R为引物，以pUMRI-15-IDI1-ePTS1-tHMG1-ePTS1为模板，通过高保真酶PCR扩增，得到upLPP1-IDI1-ePTS1-tHMG1-ePTS1-dnLPP1基因整合片段；以UPROX1-ERG20-R/DNROX1-OMcLIS-R为引物，以pUMRI-16-ERG20 ^F96W/N127W-ePTS1-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-ePTS1为模板，通过高保真酶PCR扩增，得到upROX1-ERG20 ^F96W/N127W-ePTS1-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-ePTS1-dnROX1基因整合片段。构建上述基因整合片段所需的引物如表3所示。

表3引物序列表

实施例5芳樟醇合成重组菌株的构建

将实施例4构建的质粒pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD同实施例3中，先用Sfi I限制性内切酶进行线性化酶切，然后将线性化的质粒用酿酒酵母醋酸锂转化法整合到YXWP113-C01菌株中，得到芳樟醇所产菌株YLin-17。通过在摇瓶中进行两相发酵，经GC分析后，检测到芳樟醇产量为46.7mg/L。

利用CRISPR/Cas9系统将定位到过氧化物酶体表达的基因整合到YLin-17基因组中，具体流程如下：

(1)将Cas9表达质粒(p416-Cas9-G418)转入到YLin-17酿酒酵母菌株中，在YPD-G418平板上生长2-3天；

(2)在含G418的YPD液体培养基中培养，进行第二次化转，将gRNA 表达质粒P426-CCdB-gYPL062W-gHO和upYPL062W-ERG10-ePTS1-ERG13-ePTS1-dnYPL062W和upHO-ERG12-ePTS1-tHMG1-ePTS1-dnHO基因整合片段共同转入到步骤(1)菌株中，在SD-URA^-+G418平板上长3-4天，构建得到菌株YLin17-P-02菌株，为了进行下一轮的基因编辑，需要保留p416-Cas9-G418质粒而将gRNA质粒去除。利用质粒在没有筛选压力的培养基中传代会自然丢失这一原理，将重组菌株接种于5mL YPD+G418试管中，30℃下培养12-14h后，取1mL菌液用无菌水清洗两次后稀释10000倍，取100μL涂于YPD+G418平板上。若平板上的单菌落在SD-URA^-试管不长，在SD+URA和YPD+G418试管中生长，则说明gRNA质粒已去除。进一步在上述去了质粒的重组菌株中导入P426-CCdB-gDPP1-gLPP1和upDPP1-ERG8-ePTS1-MVD1-ePTS1-dnDPP1和upLPP1-IDI1-ePTS1-tHMG1-ePTS1-dnLPP1基因整合片段，按照上述菌株的构建流程，得到重组菌株YLin17-P-04，进一步丢掉P426-CCdB-gDPP1-gLPP1质粒后，导入P426-SPSgH-gROX1质粒和upROX1-ERG20 ^F96W/N127W-ePTS1-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-ePTS1-dnROX1基因整合片段，构建得到YLin-PC-01菌株。在YPD摇瓶培养基中进行两相发酵后，检测到芳樟醇积累了212.0mg/L，与菌株YLin17相比，芳樟醇产量提高了3.5倍。但同时发现，YLin-PC-01的生物量比YLin-17下降了31.7％(结果如图3所示)。

由于双倍体菌株有更强的鲁棒性，因此本发明进一步构建了双倍体菌株用于发酵生产芳樟醇。首先将实施例4构建的pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD和PUMRI-13-IDI1-tHMG1(Biochemical Engineering Journal，2020,161:107655)SfiI线性化后，先后整合到酿酒酵母菌株YXWP-114(BY4742,Δgal80::HIS3；MetabolicEngineering 30(2015)69–78)基因组上，得到菌株YLin114-C2。将YLin17-PC-01与菌株YLin114-C2杂交，涂SD平板(不加任何氨基酸)，培养3-4天后，得到双倍体菌株YLin-DiPC-03。通过在YPD培养基摇瓶培养，检测到芳樟醇产量为216.4mg/L，而生物量又恢复了YLin-17的水平(结果如图3所示)。

实施例6重组菌株补料发酵生产芳樟醇

本发明中构建的高产芳樟醇重组酿酒酵母菌株YLin-DiPC-03采用5L生化反应器进行补料发酵生产芳樟醇。涉及的培养基配方如下：

微量元素溶液：15g/L EDTA，10.2g/L ZnSO₄·7H₂O，0.50g/L MnCl₂·4H₂O，0.5g/LCuSO₄，0.86g/L CoCl₂·6H₂O，0.56g/L Na₂MoO₄·2H₂O，3.84g/L CaCl₂·2H₂O，5.12g/LFeSO₄·7H₂O。溶液配制好后121℃，20min灭菌，4℃储存。

维生素溶液：0.05g/L生物素，1g/L泛酸钙，1g/L烟酸，25g/L肌醇，1g/L盐酸硫胺素(VB1)，1g/L吡哆醇(VB6)，0.2g/L对氨基苯甲酸。溶液过滤除菌，4℃储存。

种子培养基：10g/L酵母浸出粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，115℃灭菌21min。

发酵罐基础培养基：10g/L酵母浸出粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，3g/L MgSO₄，115℃，21min灭菌；

发酵补料浓缩液I：500g葡萄糖，9g KH₂PO₄,3.5g K₂SO₄,0.28g Na₂SO₄,2.5gMgSO₄，10ml/L微量元素溶液，12ml/L 维生素溶液；

发酵补料浓缩液II：250g/L酵母粉

具体流程：

(1)将高产芳樟醇重组菌株YLin-DiPC-03在SD-URA^-平板上划线，于30℃培养箱放置3天；

(2)将平板上长出来的菌落接种至5mL YPD试管中，置于30℃、220rpm的摇床中培养16h。然后将培养物接种至装有125mL种子培养基的500mL摇瓶中，置于30℃、220rpm的摇床中培养18h；

(3)将步骤2中250mL种子液接入含2.25L发酵培养基的5L生化反应器中，控制pH为5.5，控制温度为30℃，搅拌桨转速300-600rpm，空气流速1-2vvm.控制最低溶氧在20％，当发酵培养基中葡萄糖消耗完之后，开始补发酵补料浓缩液I，流速在5-15mL/h。每隔12h，加入50mL发酵补料浓缩液II，直到菌株生长进入平稳期。此外，在发酵8h时，加入250mL肉豆蔻酸异丙酯作为有机相。

发酵结束后，菌株OD₆₀₀达到了145，芳樟醇产量达到了2.6g/L，是目前微生物报道的发酵生产芳樟醇最高水平，具有工业化生产潜力。

上述实施例为本发明的较佳实施方案，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的原理所作的改变、修饰、替代、简化、组合均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体，其特征在于，所述突变体在野生型芳樟醇合成酶的第447位氨基酸发生突变。

2.根据权利要求1所述的芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体，其特征在于，所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体包括以下几种之一：

（1）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447E，其氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示；

（2）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447A，其氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示；

（3）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447M，其氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示；

（4）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447Q，其氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示；

（5）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M ^F447G，其氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示；

（6）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变体为t67OMcLIS_M  ^F447S，其氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示。

3.编码权利要求1或2所述的突变体的突变型基因或核酸。

4.根据权利要求3所述的突变型基因或核酸，其特征在于，所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

（1）序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列；

（2）序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列；

（3）序列表中SEQ ID NO:3的核苷酸序列；

（4）序列表中SEQ ID NO:4的核苷酸序列；

（5）序列表中SEQ ID NO:5的核苷酸序列；

（6）序列表中SEQ ID NO:6的核苷酸序列。

5.表达盒、重组载体、重组菌株，其含有权利要求3或4所述的突变型基因或核酸。

6.权利要求5所述的重组载体或重组菌株在高效合成芳樟醇中的应用。

7.权利要求5所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）权利要求3或4所述的芳樟醇合成酶t67OMcLIS_M突变基因的获得；

（2）构建含有上述t67OMcLIS_M突变基因的pUMRI-16-t67OMcLIS_M-ERG20^F96W/N127W重组质粒；

（3）将重组质粒整合到酿酒酵母菌株中即得。

8.权利要求5所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD质粒的获得；

（2）将步骤（1）中获得的质粒导入酿酒酵母YXWP113-C01菌株中得到YLin-17；

（3）将pUMRI-13-IDI1-tHMG1和pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD质粒导入酿酒酵母YXWP-114菌株中得到YLin114-C2；

（4）将C端含有ePTS1序列的甲羟戊酸途径基因、ERG20^F96W/N127W-ePTS1和SKIK-t67OMcLISM^F447E-ePTS1导入到YLin-17中，得到YLin-PC-01；

（5）将YLin-PC-01与YLin114-C2杂交得到原养型双倍体菌株YLin-DiPC-03。

9.根据权利要求8所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD质粒的构建方法为：以pUMRI-16-SKIK-t67OMcLIS_M-RIAD-ERG20^F96W/N127W-RIDD质粒为模板，采用QuickChangeTM方法扩增得到含有SKIK-t67OMcLIS_M ^F447E-RIAD和ERG20^F96W/N127W-RIDD基因的重组质粒。

10.权利要求6或权利要求7-8的方法构建的重组菌在提高芳樟醇产量中的应用。

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