CN104762242A - 甲羟戊酸的生产菌以及生产甲羟戊酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本文涉及一种甲羟戊酸的生产菌以及生产甲羟戊酸的方法。具体来说涉及一种用于以甲醇为原料生产甲羟戊酸的细菌,其中所述细菌属于甲基杆菌属(Methylobacterium),并且所述细菌经过修饰以表达HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)。本文还涉及利用该表达HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)的甲基杆菌属(Methylobacterium)的细菌来生产甲羟戊酸的方法。
Description
技术领域
本文涉及甲羟戊酸的生产菌以及利用甲羟戊酸生产菌生产甲羟戊酸的方法。
背景技术
甲羟戊酸(Mevalonaic Acid),全称3,5-二羟基-3-甲基戊酸,分子式为C6H12O4,常温下呈油状,易溶于水和极性有机溶剂,在溶液中易内酯化形成甲羟戊酸内酯(参见图1)。甲羟戊酸的3位碳具有手性,生物体只能利用甲羟戊酸的3R异构体。
甲羟戊酸在生物体内普遍存在,它是细胞生物化学中的关键中间体,是许多生物活性脂的前体,如胆固醇、甾类激素、胆酸、泛醌和长醇等。它还是合成萜类的重要前体物质,萜类参与形成酯类、防御毒剂、生长激素等,在生物体内起着极其重要的调节作用。其中很多单萜化合物都是重要的药物或香料。有研究表明,在植物培养过程中,在营养液中添加适量的甲羟戊酸,可以极大地提高一些天然产物的产量。
甲羟戊酸主要以甲羟戊酸内酯的形式供应出售。甲羟戊酸内酯被广泛应用于化妆品、食品等领域。它能够帮助恢复受损角质层,具有非常好的抗衰老、抗皱功能,其特有的亲水结构能形成网状交联,锁住水分,保持肤感滑爽,保湿效果明显,因此是各种高级化妆品、润肤剂、精华液中重要的添加成分。
甲羟戊酸作为中间产物,还能继续合成很多重要的产品:合成异戊二烯,用于制作异戊橡胶;合成青蒿素,用于治疗疟疾,以改善人类健康水平;合成胡萝卜素和番茄红素,用于制作抗癌、抗心血管疾病的高级保健品;近期有研究表明,甲羟戊酸还可合成没药烷,作为很有前景的生物柴油替代品(http://www.sciencedaily.com/releases/2011/09/110927134254.htm?utm_source=feedburner&utm_medium=email&utm_campaign=Feed%3A+sciencedaily%2Fplants_animals+%28ScienceDaily%3A+Plants+%26+Animals+News%29)。
由于甲羟戊酸具有很高的价值,因此国内外一直有机构在研究成本更经济的甲羟戊酸生产方法。传统的生产方法主要是化学合成法。化学合成法以4-氯-2-丁酮为原料,需要经过酯化、Reformatsky反应、水解和环化等步骤,最终得到甲羟戊酸内酯产品。但是化学法存在如下问题:化学法中使用的原料难以获得,化学合成难度大、过程复杂、能耗高、得率低,并且最终得到的产物为消旋体(等比例R构型和S构型的混合物),因此要得到纯净的R构型产品还需要经过复杂的分离过程。
有机构研究开发出酶法合成(Mizuguchi Eisaku,e.a.,Enzyme-catalyzedsynthesis of(S)-chromanethanol and(R)-mevalonolactone.Synlett,1996.8:p.743~744),还有生物催化和化学催化相结合的方法(Orru Romano VA,e.a.,An efficient large-scale synthesis of R-mevalonolactone using simplebiological and chemical catalysis.Synthesis,1998.9:p.1259~1263.),但是因为流程复杂,产品收率低等原因未被大规模运用。
近年来,日本Adeka株式会社新开发出的生物法合成甲羟戊酸内酯的技术(糖基生物合成法),生产得到均一的R构型产品,现已经投产销售,投产之后显示出了良好的经济效益。2009年Adeka株式会社生产的R型甲羟戊酸内酯产品开始投向市场的时候,每公斤的价格为14.3万元,而当时市场上出售的外消旋混合物的价格还维持在每公斤28.7万元,由此可见利用微生物生产天然型甲羟戊酸内酯巨大的优势。
日本Adeka株式会社研发出来的生物法是以生物质为原料,由经过改造的酵母菌发酵生产,得到R型甲羟戊酸内酯。相比于传统的化学法,生物法具有反应条件温和、原料利用率高、产品构型均一(R构型)等优点。通过高密度培养,糖基生物法的产量可达50g/L(http://tec.k8008.com/html/2011/05/98731.html)。
虽然以生物质为原料的生物合成法相比于传统的化学法有很大的优势,但如果进行大规模生产,原料的获得会存在问题。在当前全球粮食紧缺的大环境下,将生物质用于工业生产,会不可避免地与人争粮,很可能因为政策因素的限制,无法保证原料的持续供应;同时,如果甲羟戊酸需求增加带动生物质价格的上涨,对于长期生产开发利用甲羟戊酸也是不利的。
因此,在本领域中非常期望可以开发出不以生物质为原料的生产甲羟戊酸的方法。
针对以上问题,本发明人开发了以甲醇作为原料生产甲羟戊酸的甲醇基生物合成法。
首先,我国甲醇产业产能过剩,甲醇便宜易得。近年来,我国甲醇产能保持快速增长,目前应达到4654万吨(http://www.askci.com/news/201202/28/161652_53.shtml),2012年有550万吨以上的新建的甲醇项目投产运行,总产能将达到5200多万吨,但是甲醇的年消耗量仅为2200万吨左右(http://www.coalstudy.com/cn/Article/zxpd/dlzx/hghf/201204/17162.html)。由于严重的供大于求,以及进口甲醇的低价冲击,导致甲醇的价格持续下降,目前价格为2800元/吨,装置开工率仅为56%。因此,甲醇产业亟待寻求下游产品的开发。其次,甲醇基生物合成法可以有效避免糖基生物合成法在原料来源上存在的诸多问题。生物质原料的供应和价格会因为季节、气候的变化呈现较大的波动,而甲醇作为有机化工的基础原料,能够实现一年四季连续稳定供应。同时,生物质原料在工业领域的应用会受到国家政策的限制,而运用甲醇为原料进行工业生产则会得到扶持和保护,甲羟戊酸这一高附加值的产品可以很好地延伸煤制甲醇这一产业链。再次,甲醇基生物合成法在生产工艺上也有诸多优势。由于原料甲醇具有生物毒性,在发酵生产的前期,可降低除菌操作的成本,在运行过程中,也能大大地降低了培养基染菌的风险,保证产品质量,减少倒罐、停产的发生(郝常明,赵建锋,黄雪菊.生物发酵染菌问题的探讨.医药工程设计.02(2007):11-15.),这对于工业发酵生产来说具有极大的经济价值。在后期的分离环节中,由于培养细菌所使用的培养基是加入甲醇的无机盐溶液,相比于成分复杂的糖基培养基,分离成本可以大大降低。
甲基生物合成法生产甲羟戊酸很好地将生物化工过程依托于传统有机化工产业之上,对于该生物方法的应用和发展具有重要意义。
发明内容
鉴于上述问题,本发明的发明人在属于甲基杆菌属(Methylobacterium)的细菌中外源引入甲羟戊酸上游途径并进行重构,构建了由甲醇生产甲羟戊酸的细菌,并开发了利用该细菌生产甲羟戊酸的方法。从而实现利用价格低廉、供应充足的原料甲醇,通过微生物代谢,直接合成纯净的R型甲羟戊酸产品。
本发明提供了一种以甲醇为原料生产甲羟戊酸的细菌及方法。具体地本文提供了:
1.一种用于以甲醇为原料生产甲羟戊酸的细菌,其中所述细菌属于甲基杆菌属(Methylobacterium),并且所述细菌经过修饰表达HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)。
2.根据项1所述的细菌,其中所述细菌经进一步修饰该细菌的乙酰乙酰CoA硫解酶(phaA酶)的活性得到增强。
3.根据项1或2所述的细菌,其中所述细菌中的phaC基因被敲除。
4.根据项1~3中任一项所述的细菌,其中所述细菌具有丝氨酸循环途径。
5.根据项1~4中任一项所述的细菌,其中所述细菌选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)或罗得西亚甲基杆菌(Methylobacteriumrhodesianum)。
6.根据项1~5中任一项所述的细菌,其中所述HMG-CoA合成酶的氨基酸序列是选自下述(a)~(c)中的任一种:
(a)具有SEQ ID NO:1所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的序列;
(b)具有SEQ ID NO:2所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的序列;
(c)具有SEQ ID NO:3所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:3所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的序列。
7.根据项1~6中任一项所述的细菌,其中所述HMG-CoA还原酶的氨基酸序列是选自下述(d)~(f)中的任一种:
(d)具有SEQ ID NO:4所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:4所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的序列;
(e)具有SEQ ID NO:5所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:5所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的序列;
(f)具有SEQ ID NO:6所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的序列。
8.根据项2~7中任一项所述的细菌,其中所述乙酰乙酰CoA硫解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示的序列;
或者为由在SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的序列;
或者由与SEQ ID NO:7所示的序列具有75%一致性的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的序列。
9.根据项3~7中任一项所述的细菌,其中,所述phaC基因的DNA序列为SEQ ID No:8所示的序列;
或者为由在SEQ ID NO:8所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且敲出该序列阻断了PHB途径。
10.根据项1~9中任一项所述的细菌,其中编码所述HMG-CoA合成酶的DNA序列选自下述(a)~(f)中的任一种:
(a)SEQ ID No:9所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:9所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质,
(b)SEQ ID No:17所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:17所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质,
(c)SEQ ID No:10所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:10所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质,
(d)SEQ ID No:18所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:18所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质,
(e)SEQ ID No:11所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:11所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质,
(f)SEQ ID No:19所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:19所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质。
11.根据项1~10中任一项所述的细菌,其中编码所述HMG-CoA还原酶的DNA序列选自下述(a)~(f)中的任一种:
(a)SEQ ID No:12所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:12所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质,
(b)SEQ ID No:20所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:20所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质,
(c)SEQ ID No:13所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:13所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质,
(d)SEQ ID No:21所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:21所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质,
(e)SEQ ID No:14所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:14所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质,
(f)SEQ ID No:22所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:22所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质。
12.根据项2~11中任一项所述的细菌,其中编码所述乙酰乙酰CoA硫解酶的DNA序列是选自下述(a)~(b)中的任一种:
(a)SEQ ID NO:15所述的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:15所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的蛋白质;
或者能够与SEQ ID NO:15所述的DNA序列或其互补序列的DNA在严格条件下杂交的DNA序列,且该DNA编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的蛋白质;
(b)SEQ ID NO:16所述的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:16所述的碱基序列中发生1个或数个碱基的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的蛋白质;
或者能够与具有SEQ ID NO:16所述的DNA序列或其互补序列的DNA在严格条件下杂交的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的蛋白质。
13.一种编码乙酰乙酰CoA硫解酶的DNA序列,其序列为SEQ IDNO:16。
14.一种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列,其序列为SEQ ID NO:17。
15.一种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列,其序列为SEQ ID NO:18。
16.一种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:19。
17.一种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:20。
18.一种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:21。
19.一种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:22。
20.生产甲羟戊酸的方法,其包括:
以甲醇为碳源培养项1~12中任一项所述的细菌,生产甲羟戊酸。
本发明的其他目的,在本说明书对本发明的描述中体现。另外本发明涉及的其它的特点和优点将在下面的详细说明中进行描述。
附图说明
图1.甲羟戊酸及甲羟戊酸内酯相互转化示意图。
图2.甲羟戊酸途径示意图。
图3.扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)AM1中甲醇的代谢途径。
图4.扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)AM1的碳代谢流量图。
图5.扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)AM1的PHB合成途径。
图6.HMGS基因优化前(左)后(右)密码子使用频率分布图。
图7.HMGR基因优化前(左)后(右)密码子使用频率分布图。
图8.质粒pCM110的示意图。
图9.质粒pCM110m构建的示意图。
图10.phaC基因敲除方法示意图。
图11.pCM433质粒图。
图12.pCM433kc质粒构建步骤图。
图13.一次同源重组示意图。
具体实施方式
以下,对本文的详细内容和实施方式进行具体说明。
如无特殊说明,本文中所用术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同,但如有冲突,则以本文中的定义为准。本文中,所涉及的数值一般指重量或重量百分比,除非特殊说明。
<甲基杆菌属细菌>
甲基杆菌属拉丁学名(Methylobacterium Green&Bousfield,1983),甲基杆菌属的细菌为杆状,大小在0.8~1.0μm×1.0~8.0μm。甲基杆菌属细菌通常为单个,罕见成簇,也罕有分枝或多形态。甲基杆菌属细菌为革兰氏阴性细菌,有的菌株为革兰氏染色可变,代表菌株具有革兰氏阴性细胞多层细胞壁结构和柠檬酸盐合成特性。多数甲基杆菌属细菌生长缓慢,有的不能在营养琼脂上生长。甲基杆菌属的细菌分为兼性甲基营养菌和罕有兼性甲烷营养菌。有的菌株可利用甲烷作为惟一碳源。甲基杆菌属细菌通常从土壤、尘土、淡水、湖泥、叶表、瘤、稻谷和医院环境中分离得到。最适生长温度通常为25~30℃。
在本文中使用的甲基杆菌属的细菌是能够代谢甲醇并生产乙酰辅酶A的细菌。甲基杆菌属的细菌可以利用甲醇作为碳源生长,不局限于理论,通常认为甲基杆菌属的细菌在转化甲醇时存在两种途径:丝氨酸循环和一磷核酮糖循环(RuMP-cycle),目前认为存在丝氨酸循环途径的菌株可以代谢甲醇并产生乙酰辅酶A(Jens Schrader,Martin Schilling,irk Holtmann,Dieter Sell,Murillo Villela Filho,Achim Marx,Julia A,Vorholt,Methanol-based industrialbiotechnology:current status and future perspectives of methylotrophic bacteria,Trends in Biotechnology,27,107-115(2008))。
在一个实施方式中,本文使用的甲基杆菌属的细菌是具有丝氨酸循环途径的甲基杆菌属细菌。
在一个实施方式中,本文使用的甲基杆菌属的细菌是扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)。
扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)是一种革兰氏阴性菌,它能够以C1化合物如甲醇、甲烷等为唯一碳源进行生长代谢,它在自然界C1循环当中起到关键作用(Guo,X.;Lidstrom,M.E.,Metabolite profiling analysis ofMethylobacterium extorquens AM1 by comprehensive two-dimensional gaschromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry.Biotechnologyand Bioengineering 2008,99(4),929-940)。
在一个实施方式中,本文使用的甲基杆菌属的细菌是扭脱甲基杆菌AM1(Methylobacterium extorquens AM1)。
扭脱甲基杆菌AM1(下文有时也简写为M.extorquens AM1)是被研究得最多的扭脱甲基杆菌,其基因序列已经被测序完毕(Vuilleumier S,Chistoserdova L,Lee MC,Bringel F,Lajus A,Zhou Y,Gourion B,Barbe V,Chang J,Cruveiller S,Dossat C,Gillett W,Gruffaz C,Haugen E,Hourcade E,Levy,Mangenot S,Muller E,Nadalig T,Pagni M,Penny C,Peyraud R,RobinsonDG,Roche D,Rouy Z,Saenampechek C,Salvignol G,Vallenet D,Wu ZN,MarxCJ,Vorholt JA,Olson MV,Kaul R,Weissenbach J,Medigue C,Lidstrom ME,Methylobacterium Genome Sequences:A Reference Blueprint to InvestigateMicrobial Metabolism of C1 Compounds from Natural and Industrial Sources,Plos One,4(2009)),中心碳代谢途径也已经全部被查明(Guo,X.;Lidstrom,M.E.,Metabolite profiling analysis of Methylobacterium extorquens AM1 bycomprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flightmass spectrometry.Biotechnology and Bioengineering 2008,99(4),929-940.))。
M.extorquens AM1的甲醇的代谢途径如图3所示,甲醇被扭脱甲基杆菌摄取吸收后,经过C1同化作用形成L-丝氨酸,然后进入到丝氨酸循环途径中,代谢合成乙酰CoA。进一步分析M.extorquens AM1中的代谢流量,在其中心碳代谢中,有22%的碳会用于合成乙酰CoA(Peyraud R,Kiefer P,Christen P,Massou S,Portais JC,Vorholt JA.Demonstration of theethylmalonyl-CoA pathway by using C-13 metabolomics.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America;106(12):4846-51(2009)),如图4所示。
在一个实施方式中,本文使用的甲基杆菌属的细菌是罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)。罗得西亚甲基杆菌通常在15~30℃条件下生长,但在10℃下不生长。大部分罗得西亚甲基杆菌在37℃下也可以生长,生长过程不需要生长因子。罗得西亚甲基杆菌的甲基红和博赫斯-普测试(Voges-Proskauer test)呈阴性。一些菌种可以降解硝酸盐为亚硝酸盐。该菌对庆大霉素、卡那霉素、四环素类、链霉素、新霉素敏感,但对萘啶酸、竹桃霉素、螺旋霉素、硫酸粘菌素、青霉素G、多粘菌素B、杆菌肽具有耐受性。该细菌可以利用甲醇作为碳源(P.N.GREEN,I.J.BOUSFIELD,AND D.HOOD.Three New Methylobacterium Species:M.rhodesianum sp.nov.M.zatmanii sp.nov.,and M.fujisawaense sp.nov.INTERNATIONAL JOURNALOF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY,Jan.1988,p.124-127)。
在一个实施方式中,本文使用的甲基杆菌属的细菌是Methylobacteriumrhodesianum sp.nov。
本文使用的扭脱甲基杆菌AM1从德国微生物和菌种保藏中心(DSMZ)(http://www.dsmz.de/)购买,货号为DSM No.:1338。罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum sp.nov)从德国微生物和菌种保藏中心(DSMZ)(http://www.dsmz.de/)购买,货号为DSM No.:5687。
<生产甲羟戊酸的细菌>
生产甲羟戊酸的代谢途径
在本文的生物法生产甲羟戊酸依赖于甲羟戊酸途径。甲羟戊酸途径是生物体内广泛存在的代谢途径,其代谢产物是生物体内类固醇、萜类等生物分子的重要前体物质。该途径以乙酰辅酶A为原料,最终合成异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP),其中关键的中间代谢产物就是甲羟戊酸,代谢途径如图2所示。
由于这个代谢途径较长,因此通常以甲羟戊酸为分界产物,由乙酰CoA代谢合成甲羟戊酸的代谢流路被称为上游途径,由甲羟戊酸合成IPP和DMAPP的代谢流路被称为下游途径。
在本文涉及的细菌组入了甲羟戊酸的上游途径,从而首次获得能够直接以甲醇为原料生产甲羟戊酸的细菌。上述上游途径涉及到三个主要的酶:乙酰乙酰CoA硫解酶(phaA)、HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)。
乙酰乙酰CoA硫解酶(phaA)是将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的酶(参见图2),是上述上游途径三个主要的酶中的第一个酶。在某些属于甲基杆菌属的细菌中能够通过自身基因的表达,合成phaA酶。有些甲基杆菌属的细菌合成phaA酶的量较少,可以对这样的细菌进一步进行修饰以使该细菌的phaA酶的活性增强。
在本文的一个实施方式中,通过外源引入表达乙酰乙酰CoA硫解酶的基因,增加从乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A转化的代谢流量。对于phaA酶的来源没有限定,只要是在引入到甲基杆菌属细菌后可以将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A的酶即可,可以列举来自Ralstonia eutropha的phaA酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。在本文的一个实施方式中表达Ralstonia eutropha的phaA酶的DNA序列如SEQ ID NO:15所示。
在NCBI中对Ralstonia eutropha的phaA酶进行BLAST分析,从结果可以看出,各物种中phaA基因的相似度很高,均大于75%,具有同源性。在本文的一个实施方式中,phaA酶由与SEQ ID NO:7所示的序列具有75%一致性的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的序列。例如来自Cupriavidus necator、Cupriavidus taiwanensis的phaA酶,来自Ralstonia pickettii的phaA酶,来自Burkholderia cenocepacia、Burkholderia kururiensis的phaA酶,来自Pseudomonas putida、Thiomonasintermedia、Limnobacter sp.、Herbaspirillum lusitanum、Methylibiumpetroleiphilum、Polaromonas naphthalenivorans、Herbaspirillum frisingense、Massilia niastensis、Oxalobacteraceae bacterium、Leptothrix cholodnii、Janthinobacterium sp.Marseille、Rubrivivax benzoatilyticus的phaA酶。
对甲基杆菌属细菌而言,可以优化上述列举的phaA酶的密码子使其更适合在甲基杆菌属细菌中表达,例如在本文的一个实施方案中,经密码子优化后的表达Ralstonia eutropha的phaA酶的DNA序列如SEQ ID NO:16所示。
在本文中使用的密码子优化方法例如可以从Kazusa Codon UsageDatabase数据库查得扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1的密码子使用频率表(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=408&aa=1&style=GCG)。然后利用GeneDesigner软件进行密码子优化。将扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1的密码子使用频率表输入GeneDesigner软件,设临界密码子使用频率为0.12(Lindberg P,Park S,Melis A,Engineering a platform forphotosynthetic isoprene production in cyanobacteria,using Synechocystis as themodel organism,Metabolic Engineering,12,70-79(2010))。将基因中使用频率低于0.12的密码子换成高于0.12的密码子。尽量保证基因中同义密码子的数量比和M.extorquens AM1中相应密码子使用频率比相同。优化后,检查是否有构建质粒时需要用到的酶切位点,若有则依据以上原则进行更换。此外也可以委托公司按照扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1的密码子使用频率对Ralstonia eutropha的phaA酶的DNA序列进行优化,在本文的实施例中委托了DNA2.0生物技术公司对Ralstonia eutropha的phaA酶的DNA进行了优化。针对其他属于甲基杆菌属的菌株也可以参考扭脱甲基杆菌的密码子使用频率来进行上述优化。
HMG-CoA合成酶(HMGS)是将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)的酶(参见图2),是上述上游途径三个主要的酶中的第二个酶。为获得表达HMGS活性的酶基因,可以在BRENDA蛋白质数据库中查找所有关于HMGS酶的信息,并从BRENDA蛋白质数据中选取HMGS酶。
在本文的一个实施方式中,使用来自德国小蠊(Blattella Germanica)的HMG-CoA合成酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、其DNA序列如SEQID NO:9所示。在另一个实施方式中,针对德国小蠊的HMG-CoA合成酶,为了使其更好在甲基杆菌属细菌中表达,对其DNA密码子进行了优化,优化可以参考上述方法,经密码子优化后的表达来自德国小蠊的HMG-CoA合成酶的DNA序列如SEQ ID NO:17所示。
在本文的一个实施方式中,使用来自酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)的HMG-CoA合成酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、其DNA序列如SEQ ID NO:10所示。在另一个实施方式中,针对酿酒酵母的HMG-CoA合成酶,为了使其更好在甲基杆菌属细菌中表达,对其DNA密码子进行了优化,优化可以参考上述方法,经密码子优化后的表达来自酿酒酵母的HMG-CoA合成酶的DNA序列如SEQ ID NO:18所示。
在本文的一个实施方式中,使用来自粪链球菌(Enterococcus Faecalis)的HMG-CoA合成酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,其DNA序列如SEQID NO:11所示。在另一个实施方式中,针对粪链球菌的HMG-CoA合成酶,为了使其更好在甲基杆菌属细菌中表达,对其DNA密码子进行了优化,优化可以参考上述方法,经密码子优化后的表达来自粪链球菌的HMG-CoA合成酶的DNA序列如SEQ ID NO:19所示。
HMG-CoA还原酶(HMGR)是将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)转化为甲羟戊酸的酶(参见图2),是上述上游途径三个主要的酶中的第三个酶。为获得表达HMGR活性的酶基因,可以在BRENDA蛋白质数据库中查找所有关于HMGR酶的信息,并从BRENDA蛋白质数据中选取HMGR酶。
在本文的一个实施方式中,使用来自克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的HMG-CoA还原酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、其DNA序列如SEQID NO:12所示。在另一个实施方式中,针对克氏锥虫的HMG-CoA还原酶,为了使其更好在甲基杆菌属细菌中表达,对其DNA密码子进行了优化,优化可以参考上述方法,经密码子优化后的表达来自克氏锥虫的HMG-CoA还原酶的DNA序列如SEQ ID NO:20所示。
在本文的一个实施方式中,使用来自酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)的HMG-CoA还原酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、其DNA序列如SEQ ID NO:13所示。在另一个实施方式中,针对酿酒酵母的HMG-CoA还原酶,为了使其更好在甲基杆菌属细菌中表达,对其DNA密码子进行了优化,优化可以参考上述方法,经密码子优化后的表达来自酿酒酵母的HMG-CoA还原酶的DNA序列如SEQ ID NO:21所示。
在本文的一个实施方式中,使用来自粪链球菌(Enterococcus faecalis)的HMG-CoA还原酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示、其DNA序列如SEQID NO:14所示。在另一个实施方式中,针对粪链球菌的HMG-CoA还原酶,为了使其更好在甲基杆菌属细菌中表达,对其DNA密码子进行了优化,优化可以参考上述方法,经密码子优化后的表达来自粪链球菌的HMG-CoA还原酶的DNA序列如SEQ ID NO:22所示。
在本文的一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自德国小蠊的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自克氏锥虫的HMG-CoA还原酶。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA还原酶。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自粪链球菌的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自粪链球菌的HMG-CoA还原酶。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自德国小蠊的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA还原酶。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自德国小蠊的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自粪链球菌的HMG-CoA还原酶。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自克氏锥虫的HMG-CoA还原酶。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自粪链球菌的HMG-CoA还原酶。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自粪链球菌的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自克氏锥虫的HMG-CoA还原酶。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自粪链球菌的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA还原酶。
在本文的一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自德国小蠊的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自克氏锥虫的HMG-CoA还原酶,并且通过外源引入表达乙酰乙酰CoA硫解酶的基因(Ralstonia eutropha的phaA酶)。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA还原酶,并且通过外源引入表达乙酰乙酰CoA硫解酶的基因(Ralstoniaeutropha的phaA酶)。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自粪链球菌的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自粪链球菌的HMG-CoA还原酶,并且通过外源引入表达乙酰乙酰CoA硫解酶的基因(Ralstonia eutropha的phaA酶)。
在甲基杆菌属细菌的代谢途径中,代谢途径中的乙酰辅酶A中的一部分会用于合成PHB。以扭脱甲基杆菌AM1为例,当其以甲醇为碳源时,PHB的积累可以达到细胞干重的34~42%(Korotkova N,Lidstrom ME.Connectionbetween poly-beta-hydroxybutyrate biosynthesis and growth on C-1 and C-2compounds in the methylotroph Methylobacterium extorquens AM1.Journal ofBacteriology;183(3):1038-46(2001)),因此估计很可能PHB会占用一部分碳源。如果将用于合成PHB的乙酰辅酶A引入合成甲羟戊酸的途径,预计会提高合成甲羟戊酸代谢途径的代谢通量,增加甲羟戊酸的产量。另外,PHB是一种储能物质,通常认为不累积PHB对细胞的生长没有影响。因此,可以通过阻断PHB合成途径以增加导入的生产甲羟戊酸途径的代谢通量。
以扭脱甲基杆菌中的M.extorquens AM1为例,其PHB合成途径如图5所示。目前的研究结果显示对该途径中的phaA,phaB,phaC三个基因进行插入突变后,发现如果敲出其中的phaC,细菌不积累PHB,虽然细菌开始时生长较为缓慢,但是随后生长速度恢复正常。在本文的一个实施方式中,敲除了phaC基因(其DNA序列如SEQ ID No:8所示)。本领域技术人员可以采用任何已知的方法来敲出甲基杆菌属细菌的基因。在一个具体实施方式中,选用环状质粒载体介导的同源双交换敲除策略,利用pCM433质粒敲除phaC基因。具体的敲出方案可以参见实施例6。
在本文的一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自德国小蠊的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自克氏锥虫的HMG-CoA还原酶,并且通过外源引入表达乙酰乙酰CoA硫解酶的基因(Ralstonia eutropha的phaA酶),并敲除了phaC基因。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自酿酒酵母的HMG-CoA还原酶,并且通过外源引入表达乙酰乙酰CoA硫解酶的基因(Ralstonia eutropha的phaA酶),并敲除了phaC基因。在本文的另一个实施方式中,HMG-CoA合成酶使用来自粪链球菌的HMG-CoA合成酶,HMG-CoA还原酶使用来自粪链球菌的HMG-CoA还原酶,并且通过外源引入表达乙酰乙酰CoA硫解酶的基因(Ralstonia eutropha的phaA酶),并敲除了phaC基因。
如上所述,本文所述的甲羟戊酸生产细菌,解决了本领域技术中长期存在的希望避免利用生物质的问题,成功地将甲羟戊酸代谢途径导入到能够代谢甲醇的甲基杆菌属细菌中,从而可以直接利用甲醇作为原料来高效地生产甲羟戊酸,并且得到的甲羟戊酸是纯净的R型甲羟戊酸产品,实现利用价格低廉、供应充足的原料甲醇,通过微生物代谢,直接合成纯净的R型甲羟戊酸产品。
<DNA>
本文还涉及一种编码乙酰乙酰CoA硫解酶的DNA序列,其序列为SEQID NO:16。本文还涉及一种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列,其序列为SEQ ID NO:17。本文还涉及一种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列,其序列为SEQ ID NO:18。本文还涉及一种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:19。本文还涉及一种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:20。本文还涉及一种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:21。本文还涉及一种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:22。
用于本说明书的术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。
编码序列的边界通常由开读框决定,所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始,并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。
本文中所述的DNA序列可以和其它调控序列结合在一起,产生重组载体,该载体可以包括一个或多个(数个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码肽段的DNA序列。备选的,可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述氨基酸序列的DNA序列来表达本文的DNA序列。在制备重组载体的过程中,将编码序列导入载体中,从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
启动子、转录信号、翻译终止信号以及其它调控序列是任何本领域普通技术人员能够可以根据常规选择而确定的。
在本文中为了表达HMGS、HMGR、乙酰乙酰CoA硫解酶,可以使用重组载体来进行表达。
重组载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其能够方便地进行重组DNA步骤,并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体,例如,质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的构建。或者,载体可以是一种当被引入宿主细胞中时,整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒,其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA,或可以使用转座子。在本文中可以使用例如pCM110质粒作为初始质粒,来构建表达本文HMGS、HMGR和/或乙酰乙酰CoA硫解酶的质粒。
核糖体结合位点(RBS)是mRNA上的特异性序列,核糖体可以识别并结合这一序列来启动翻译过程。在本文中由于存在表达多个蛋白质的需求,在表达多个蛋白质时在每个蛋白质的DNA序列之前添加了RBS序列。在本文中使用了商用的质粒中自带的RBS,例如pCM110质粒的RBS。
下文中使用了质粒pCM110的RBS,在下文中用RBS(pCM110)来表示,其序列为GATCCTAAGGGCGAATTC(5’-3’)。在本文中,由于需要同时表达两个或以上蛋白质时,可以使需要表达的每个蛋白质的DNA序列之前具有各自的RBS序列,例如为了表达HMGS和HMGR,因此可以在HMGS和HMGR之间添加一个上述RBS(pCM110),以分别表达HMGS和HMGR。
<甲羟戊酸的生产方法>
本文还涉及以甲醇为碳源培养上述的属于甲基杆菌属(Methylobacterium)的细菌,并收集所产生的甲羟戊酸的方法。
有文献[D.Bourque,B.Ouellette,G.Andre,and D.Groleau.Production ofpoly-β-hydroxybutyrate from methanol:characterization of a new isolate ofMethylobacterium extorquen.Appl Microbiol Biotechnol(1992)37:7-12]对甲醇的浓度进行了优化,研究结果发现在恒化培养条件下,培养基中甲醇浓度在1.7g/L左右的时候生长速度最快,甲醇浓度在5~8g/L的时候,甲基杆菌属细菌可以保持相对较好的生长,因此本文中运用批式培养的方法培养菌株的时候,为保证充足的底物供应和较好的生长水平,采用通用的1%(v/v)的甲醇浓度,即7.918g/L。
除此之外,可以在常规的甲基杆菌属的培养条件下进行培养,例如在20~40℃,可以在25~35℃,可以在25~30℃,例如在30℃左右的温度下培养40~120小时,并收集由此得到的甲羟戊酸。
利用本文所述的方法生产甲羟戊酸,可以直接利用原料甲醇、简单、高效地直接得到R型甲羟戊酸,与传统的化学方法相比具有节约能源、合成过程简单、能耗低、高效地优点。并且与目前利用生物质生物合成甲羟戊酸的方法相比,成功地避免了使用生物质,而是能够使用更为充足的甲醇作为原料,进一步减低了生产成本。
实施例
下面结合具体实施例对本文作进一步说明,但本文并不限于以下实施例。
下述实施例中,如无特殊说明,均为常规方法。PCR相关试剂来自北京全式金公司;限制性内切酶均购自NEB(New England BioLabs)公司;T4DNA连接酶购自宝生生物工程有限公司(Takara);质粒提取试剂盒购自Omega公司;细菌基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen公司;PCR产物纯化,酶切产物纯化试剂盒购自上海华舜公司。
实施例中使用的培养基如下:
LB培养基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L。配制固体平板时在以上基础上再加15g/L的琼脂粉,必要时可在其中加入相应浓度的抗生素溶液。
NB培养基:营养肉汤18g/L
CHOI培养基:溶液1100mL/L,溶液21mL/L,溶液31mL/L,溶液41mL/L,溶液51mL/L,溶液610mL/L,甲醇10mL/L或琥珀酸钠4.60g/L。其中溶液6需单独高压蒸汽灭菌,甲醇需单独过滤除菌。配制固体平板时在以上基础上再加15g/L琼脂粉,必要时可以加入相应浓度的抗生素溶液。
溶液1:(NH4)2SO4 10g,MgSO4·7H2O 4.5g,CaCl2·2H2O 33mg,加800mL超纯水溶解后,稀释至1L;
溶液2:Na2MoO4 40mg/L;
溶液3:ZnSO4·7H2O 130mg,H3BO3 30mg,MnSO4·H2O 100mg,CoCl2·6H2O 40mg,加800mL超纯水溶解后,稀释至1L;
溶液4:FeSO4·7H2O 1.3g/L;
溶液5:CuSO4·5H2O 40mg,加80mL超纯水溶解后,稀释至100mL;
溶液6:Na2HPO4·12H2O 402g,KH2PO4 130.5g,加800mL超纯水溶解后,调解pH至6.8,再稀释至1L。
实施例中对得到的各种甲基杆菌属菌种摇瓶发酵的方法如下:
从平板上挑取菌株,分别接种至装有5mL含有1%(v/v)甲醇以及相应浓度抗生素的CHOI培养基的50mL三角瓶中,在30℃、170rpm下培养3天,制得种子液。
测量种子液光密度,保证接种量与接种1mL OD600=0.8种子液总的OD600相同,即接种量=0.8×1mL/OD600。
将种子液接种到装有100mL含有1%(v/v)甲醇、10μg/mL四环素的CHOI培养基的500mL锥形瓶,30℃摇床中连续培养120小时,菌株生长到达平台期,取样分析,并在10000rpm下离心10min,保存上清用于后续测量甲羟戊酸含量和甲醇含量。
下面对本文的实施例中使用的测定方法和实验方法进行说明。
甲羟戊酸含量的测定
利用气相色谱测定甲羟戊酸的含量。甲羟戊酸在pH=2,45℃的条件下会内酯化形成甲羟戊酸内酯,用乙酸乙酯将甲羟戊酸内酯从水相中萃取出来,以藜芦醛为内标物,用Agilent DB-Wax毛细柱在气相色谱中分析,确定萃取相中甲羟戊酸内酯的浓度。用甲羟戊酸内酯标准品配制甲羟戊酸标准水溶液,然后经过萃取、分析,可以绘制甲羟戊酸内酯在水相浓度相对应萃取相浓度的标准曲线。通过标准曲线计算得到水相样品当中的甲羟戊酸内酯的浓度。
气相色谱分析参数如下:
柱箱温度:200℃
进样口温度:230℃
FID检测器温度:260℃
载气类型:He
载气线速度:50cm/s
进样量:1μL
分流比50
H2:空气:He=40:400:30
假定甲羟戊酸内酯的校正因子是1,可计算得到萃取相中甲羟戊酸内酯的浓度:
上式中:AM表示甲羟戊酸内酯的峰面积:AV表示藜芦醛的峰面积:CM表示萃取相中甲羟戊酸内酯的浓度。
测量样品中甲羟戊酸含量
取25mL待测样品放置到200mL锥形瓶中,用转子边搅拌边滴加3M盐酸,调节pH至pH=2.0。将溶液倒入50mL离心管中,45℃水浴1小时。加入无水硫酸钠至饱和析出。取1mL溶液于5mL EP管,加入2mL乙酸乙酯,涡旋震荡使之充分萃取。将溶液静置,待其分层后,取1mL上层萃取相于气相小瓶,加入0.5mL0.3mg/mL藜芦醛标准溶液,涡旋震荡混匀,用上述色谱柱进行色谱分析。
甲羟戊酸的产率计算方法:
产率(P)定义为单位质量干细胞的甲羟戊酸产量,计算方法如下所示:
其中CMEV为通过气相色谱的方法测量得到的甲羟戊酸产量,V为菌液体积,MDCW为相应体积菌液对应的细胞干重。
甲醇浓度的测定
利用气相色谱法测量甲醇浓度。气相色谱采用岛津GC-2010,毛细管柱采用Agilent DB-Wax。分析参数如下:
柱箱温度:90℃
进样口温度:250℃
FID检测器温度:250℃
载气类型:He
载气线速度:50cm/s
进样量:1μL,分流比50
H2:空气:He=40:400:30
扭脱甲基杆菌电转感受态细胞的制备
(1)用10μL移液枪头或接种环从平板上挑取菌体,接种至5mL含0.46%(w/v)琥珀酸钠的上述CHOI液体培养基中,170rpm,30℃,充分培养,制得种子液。
(2)取400μL种子液,接种至20mL含0.46%(w/v)琥珀酸钠的CHOI液体培养基中,170rpm,30℃,培养。
(3)当OD600达到0.6-0.8时,立即将菌液冰水浴15~30min,定期震荡菌液,使之充分冷却。同时冷却已灭菌的超纯水,10%(v/v)甘油,以及50mL离心管,使其在后续操作中保持4℃。
(4)将菌液分装在两个50mL离心管中,1800×g,4℃,离心15min。
(5)倒掉上清,并用40mL冰水重悬菌体,1800×g,4℃,离心15min。
(6)重复步骤(5)。
(7)倒掉上清,用40mL10%(v/v)甘油重悬菌体,1800×g,4℃,离心
(8)用0.5mL10%(v/v)甘油重悬菌体,将菌液以100μL分装至已灭菌且预冷好的1.5mL EP管中,放入-80℃保存。
电击转化
将2μL质粒(质粒浓度一般为50ng/μL左右)加入100μL扭脱甲基杆菌电转感受态细胞中,取45μL加入已灭菌且预冷好的0.1cm电转杯中(加入过程中应避免气泡产生)。用电转仪在2000V条件下进行电击,当电转仪显示时间为5左右则电击操作成功,此时迅速用1mL液体NB培养基洗出菌体,在30℃摇床复苏培养1h。离心浓缩菌体,倒掉800μL上清后重悬菌体,将其涂在含0.46%(w/v)琥珀酸钠的固体CHOI培养平板上,在30℃恒温培养箱中培养。
实施例1 获取HMGS的表达基因以及HMGS基因的密码子优化
为获得表达HMGS活性的酶基因,本发明人等在BRENDA蛋白质数据库中查找所有关于HMGS酶的信息,并从BRENDA蛋白质数据中选取报道的活性最高的三种酶,然后针对这三种酶查找各自的源文献,对酶活结果进行详细确认。
表1.BRENDA数据库中具有较高酶活三种HMGS酶
注:一酶活单位指特定条件(25℃,其他条件为最适条件),1分钟内转化1μmol底物NADPH所需酶量。
[1]J.;Buesa,C.;Hegardt,F.G.;Marrero,P.F.,Catalytic properties of recombinant3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Synthase-1 from Blattella Germanica.Insect Biochemistry andMolecular Biology 1997,27(6),499-505.
[2]Sutherlin,A.;Hedl,M.;Sanchez-Neri,B.;Burgner II,J.W.;Stauffacher,C.V.;Rodwell,V.W.,Enterococcus faecalis 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Synthase,an Enzyme of IsopentenylDiphosphate Biosynthesis.Journal of Bacteriology 2002,184(15),4065-4070
[3]MIDDLETON,B.,The Kinetic Mechanism of 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A Synthasefrom Baker′s Yeast,Biochemical Journal.1971,126,35-47
(1)来源于酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)HMGS基因及密码子优化
Martin VJJ等人将酿酒酵母中的甲羟戊酸途径外源导入到大肠杆菌当中,并使得该途径成功表达(Martin VJJ,Pitera DJ,Withers ST,Newman JD,Keasling JD.Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli forproduction of terpenoids.Nat Biotechnol;21(7):796-802(2003))。本实施例中,从NCBI数据库中查到酿酒酵母的HMGS基因信息,其DNA序列如SEQ IDNO:10所示,酿酒酵母的HMGS酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
对来源于酿酒酵母的HMGS基因进行密码子优化
从Kazusa Codon Usage Database数据库查得扭脱甲基杆菌M.extorquensAM1的密码子使用频率表(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=408&aa=1&style=GCG)。然后利用GeneDesigner软件进行密码子优化。将扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1的密码子使用频率表输入GeneDesigner软件,设临界密码子使用频率为0.12(Lindberg P,Park S,Melis A,Engineering a platform forphotosynthetic isoprene production in cyanobacteria,using Synechocystis as themodel organism,Metabolic Engineering,12,70-79(2010))。将基因中使用频率低于0.12的密码子换成高于0.12的密码子。尽量保证基因中同义密码子的数量比和M.extorquens AM1中相应密码子使用频率比相同。优化后,检查是否有构建质粒时需要用到的酶切位点,若有则依据以上原则进行更换。
按照上述方法对HMGS基因进行优化,将优化前后的密码子使用频率分布画出如图6所示。由图6可知,优化后基因中密码子的使用频率均高于临界值0.12,有利于异源基因表达效率的提高。经上述方法优化的酿酒酵母的HMGS的DNA序列如SEQ ID NO:18所示。
(2)来源于粪链球菌(Enterococcus Faecalis)和德国小蠊(BlattellaGermanica)的HMGS基因及密码子优化
从表1可以看出,通过生物信息学的手段能够找到的酶活最高的HMGS酶分别来源于德国小蠊、粪链球菌和酿酒酵母。除了酿酒酵母之外,另外分别从GenBank中查找出来自德国小蠊、粪链球菌的HMGS酶的基因序列、氨基酸序列。其中来自德国小蠊的HMGS酶的DNA序列如SEQ ID NO:9所示,德国小蠊的HMGS酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。来自粪链球菌的HMGS酶的DNA序列如SEQ ID NO:11所示,粪链球菌的HMGS酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
然后分别根据扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1的密码子使用频率对德国小蠊的HMGS酶和粪链球菌的HMGS酶的DNA序列进行密码子优化。密码子优化委托DNA2.0生物技术公司进行优化,优化原理与上述酿酒酵母的优化原理相同,优化后的德国小蠊的HMGS酶的DNA序列如SEQ IDNO:17所示,优化后的粪链球菌的HMGS酶的DNA序列如SEQ ID NO:19所示。
实施例2 获取HMGR的表达基因以及HMGR基因的密码子优化
为获得表达HMGR活性的酶基因,本发明人等在BRENDA蛋白质数据库中,查找所有关于HMGR酶的信息,并从BRENDA蛋白质数据中选取报道的活性最高的三种酶,然后针对这三种酶查找各自的源文献,对酶活结果进行详细确认。
表2.BRENDA数据库中具有较高酶活三种HMGR酶
注:一酶活单位指特定条件(25℃,其他条件为最适条件),1分钟内转化1μmol底物NADPH所需酶量。
[4]LI,S.;FRIESEN,J.A.;FEI,H.;DING,X.;BORST,D.W.,The lobster mandibular organ producessoluble and embrane-bound forms of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase.Biochemical Journal.2004,381,831-840.
[5]Hurtado-Guerrrero;Javier Pena-Diaz;Andrea Montalvetti;Luis M.Ruiz-Perez;Gonzalez-Pacanowska,D.,Kinetic properties and inhibition of Trypanosoma cruzi3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase,FEBS Letters,2002,510,141-144.
[6]Dong-Yul Kim;Daniel A.Bochar;Cynthia V.Stauffacher;Rodwell,V.W.,Expression andCharacterization of the HMG-CoA Reductase of the Thermophilic Archaeon Sulfolobus solfataricus.ProteinExpression and Purification 1999,17,435-442.
(1)来源于酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)的HMGR基因及密码子优化
本实施例中,从NCBI数据库中查到酿酒酵母的HMGR基因信息,来自酿酒酵母的HMGR酶的DNA序列如SEQ ID NO:13所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。然后根据扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1的密码子使用频率对来自酿酒酵母的HMGR酶的DNA序列进行密码子优化。
对来源于酿酒酵母的HMGR基因进行密码子优化
从Kazusa Codon Usage Database数据库查得扭脱甲基杆菌M.extorquensAM1的密码子使用频率表(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=408&aa=1&style=GCG)。然后利用GeneDesigner软件进行密码子优化。将扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1的密码子使用频率表输入GeneDesigner软件,设临界密码子使用频率为0.12(Lindberg P,Park S,Melis A,Engineering a platform forphotosynthetic isoprene production in cyanobacteria,using Synechocystis as themodel organism,Metabolic Engineering,12,70-79(2010))。将基因中使用频率低于0.12的密码子换成高于0.12的密码子。尽量保证基因中同义密码子的数量比和M.extorquens AM1中相应密码子使用频率比相同。优化后,检查是否有构建质粒时需要用到的酶切位点,若有则依据以上原则进行更换。按照上述方法对HMGS基因进行优化,将优化前后的密码子使用频率分布画出如图7所示。由图7可知,优化后基因中密码子的使用频率均高于临界值0.12,有利于异源基因表达效率的提高。经密码子优化后的酿酒酵母的HMGR酶的DNA序列如SEQ ID NO:21所示。
(2)来源于粪链球菌(Enterococcus Faecalis)的HMGR基因及密码子优化
Yeong-Su Kim等人将粪链球菌的HMGS和HMGR酶基因同时外源引入到大肠杆菌当中,并表达成功(Yeong-Su Kim&Jae-Hee Lee&Nam-Hee Kim&Soo-Jin Yeom&Seon-Won Kim&Deok-Kun Oh.Increase of lycopeneproduction by supplementing auxiliary carbon sources in metabolicallyengineered Escherichia coli.Appl Microbiol Biotechnol(2011)90:489–497)。在本实施例中,从GenBank中查找粪链球菌的HMGR酶的基因序列、氨基酸序列,来自粪链球菌的HMGR酶的DNA序列如SEQ ID NO:14所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。然后根据扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1的密码子使用频率对来自粪链球菌的HMGR酶的DNA序列进行密码子优化。密码子优化委托DNA2.0生物技术公司进行,其优化原理与上述酿酒酵母HMGR酶密码子优化的原理相同,经密码子优化后的酿酒酵母的HMGR酶的DNA序列如SEQ ID NO:22所示。
(3)来源于克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的HMGR基因及密码子优化
根据上表2可以看出,来源于螯龙虾的HMGR酶具有最高的酶活性,但通过详细确认,无法得到详细的测量条件,其酶活性也尚存疑问。因此,选择克氏锥虫的HMGR来进行本实验。发明人等从GenBank中查找克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的HMGR酶的基因序列、氨基酸序列,来自克氏锥虫的HMGR酶的DNA序列如SEQ ID NO:12所示,其氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。然后根据扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1的密码子使用频率对来自克氏锥虫的HMGR酶的DNA序列进行密码子优化。密码子优化委托DNA2.0生物技术公司进行,其优化原理与上述酿酒酵母HMGR酶密码子优化的原理相同,经密码子优化后的克氏锥虫的HMGR酶的DNA序列如SEQID NO:20所示。
实施例3 获取phaA酶的基因以及phaA酶基因的密码子优化
扭脱甲基杆菌能够通过自身基因的表达,合成phaA酶,但是合成量不大,一旦外源引入甲羟戊酸途径,增加了乙酰CoA向乙酰乙酰CoA的代谢流量,那么原有的phaA酶表达量可能无法充分满足代谢需求而成为限速酶,因此进一步考虑外源引入phaA基因,保证足够的phaA酶被合成。在本文中选择来源于Ralstonia eutropha的phaA酶。从GenBank中查找该种酶的基因序列、氨基酸序列,来自Ralstonia eutropha的phaA酶的DNA序列如SEQID NO:15所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。然后根据扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1的密码子使用频率对来源于Ralstonia eutropha的phaA酶的DNA序列进行密码子优化。密码子优化委托DNA2.0生物技术公司进行,经密码子优化后的来源于Ralstonia eutropha的phaA酶的DNA序列如SEQ ID NO:16所示。
实施例4 表达HMGS+HMGR的扭脱甲基杆菌AM1的构建
(1)利用来源于酿酒酵母的HMGS和HMGR基因
将经过密码子优化的来源于酿酒酵母的HMGS基因(SEQ ID No:18)、HMGR基因(SEQ ID No:21)以及质粒pCM110自带RBS(pCM110)序列(GATCCTAAGGGCGAATTC(5’-3’))。按照HMGS+RBS+HMGR的顺序在DNA2.0生物技术公司合成DNA片段。并将该合成的HMGS+RBS+HMGR片段导入到pCM110质粒中,按照下述方法构建质粒pCM110m(参见图9),其中使用的原始pCM110质粒如图8所示。
1)利用PCR扩增合成的包含HMGS+HMGR双基因的片段(上述合成的HMGS+RBS+HMGR),并在片段两端加入酶切位点(SacI和KpnI)。引物及酶切位点如表3所示:
表3 扩增HMGS+RBS+HMGR的上游引物和下游引物及各自的酶切位点
2)使用分步双酶切对PCR产物进行酶切操作,得到具有SacI和KpnI酶切位点粘性末端的目标片段,大小为3003bp。
3)载体质粒选用pCM110(参见图8),该质粒信息如下所示:
pCM110质粒具有如下特点:启动子为PmxaF,是其染色体中甲醇脱氢酶操纵子的启动子,可被甲醇诱导且表达效果强;具有多克隆位点(MCS);具有四环素抗性;GenBank序列号为AF327718。该质粒是扭脱甲基杆菌中常用的表达载体。
4)用SacI和KpnI限制性内切酶对质粒进行处理,回收大小为5834bp的片段。
5)将纯化过的具有SacI和KpnI酶切位点的HMGS+RBS+HMGR的双基因片段,与经过处理的质粒骨架进行连接,得到质粒pCM110m。
6)将连接产物通过化学转化的方法转化至E.coli DH5α感受态细胞,将载有pCM110m的大肠杆菌扩大培养,提取质粒。
7)将构建的pCM110m质粒用电击转化法导入扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1中,将构建得到菌株命名为AM1-m。
将菌种接入到装有100mL四环素浓度为10μg/mL的CHOI液体培养基的500mL三角瓶中,30℃避光条件下摇床培养70h,最终菌种AM1-m成功实现表达并产生甲羟戊酸,利用上文中描述的甲羟戊酸的测定方法测得的甲羟戊酸的产率(P)为18.4mg/g干细胞。
(2)利用来源于粪链球菌的HMGS和HMGR酶基因
1)将经过密码子优化的来源于粪链球菌的HMGS基因(SEQ ID No:19)、HMGR基因(SEQ ID No:22)以及质粒pCM110自带RBS(pCM110)序列(GATCCTAAGGGCGAATTC(5’-3’))。按照HMGS+RBS+HMGR的顺序在DNA2.0生物技术公司合成DNA片段。
2)利用PCR扩增合成的包含HMGS+HMGR双基因的片段(上述合成的HMGS+RBS+HMGR),并在片段两端加入酶切位点(SacI和KpnI)。引物及酶切位点如表4所示:
表4 扩增来源于粪链球菌的HMGS+RBS+HMGR的上游引物和下游引物
3)使用分步双酶切对PCR产物进行酶切操作,得到具有SacI和KpnI酶切位点粘性末端的目标片段,大小为3588bp。
4)使用与实施例4(1)相同的方法,构建得到质粒pCM110e。
5)将构建的pCM110e质粒用电击转化法导入扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1中,将构建得到菌株命名为AM1-e。
将菌种接入到装有100mL四环素浓度为10μg/mL的CHOI液体培养基的500mL三角瓶中,30℃避光条件下摇床培养120h,最终菌种AM1-e成功实现表达并产生甲羟戊酸,利用上文中描述的甲羟戊酸的测定方法测得的甲羟戊酸的产率为50.3mg/g干细胞。
(3)利用来源于德国小蠊的HMGS基因和来源于克氏锥虫的HMGR基因
1)将来源于德国小蠊的HMGS基因(SEQ ID No:17)和来源于克氏锥虫的HMGR基因(SEQ ID No:20),以及质粒pCM110自带RBS(pCM110)序列(GATCCTAAGGGCGAATTC(5’-3’)),按照HMGS+RBS+HMGR的顺序在DNA2.0生物技术公司合成DNA片段。
2)利用PCR扩增合成的包含HMGS+HMGR双基因的片段(上述合成的HMGS+RBS+HMGR),并在片段两端加入酶切位点(SacI和KpnI)。引物及酶切位点如表5所示:
表5 扩增来源于德国小蠊的HMGS基因和来源于克氏锥虫的HMGR基因的HMGS+RBS+HMGR的上游引物和下游引物
3)使用分步双酶切对PCR产物进行酶切操作,得到具有SacI和KpnI酶切位点粘性末端的目标片段,大小为2694bp。
4)使用与实施例4(1)相同的方法,构建得到质粒pCM110h。
5)将构建的pCM110h质粒用电击转化法导入扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1中,将构建得到菌株命名为AM1-h。将菌种接入到装有100mL四环素浓度为10μg/mL的CHOI液体培养基的500mL三角瓶中,30℃避光条件下摇床培养120h,最终菌种AM1-h成功实现表达并产生甲羟戊酸,利用上文中描述的甲羟戊酸的测定方法测得的甲羟戊酸的产率为88.4mg/g干细胞。
实施例5 表达phaA酶+HMGS+HMGR的扭脱甲基杆菌AM1的构建
1)将phaA(SEQ ID No:16)、HMGS(SEQ ID No:17)、HMGR(SEQ IDNo:20),以及质粒pCM110自带RBS(pCM110)序列(GATCCTAAGGGCGAATTC(5’-3’)),按照phaA+RBS+HMGS+RBS+HMGR的顺序在DNA2.0生物技术公司合成DNA片段。
表6 扩增DNA片段的上游引物和下游引物
2)使用分步双酶切对PCR产物进行酶切操作,得到具有SacI和KpnI酶切位点粘性末端的目标片段,大小为3894bp。
3)使用与实施例4(1)相同的方法,构建得到质粒pCM110t。
4)将构建的pCM110t质粒用电击转化法导入扭脱甲基杆菌M.extorquensAM1中,将构建得到菌株命名为AM1-t。
将菌种接入到装有100mL四环素浓度为10μg/mL的CHOI液体培养基的500mL三角瓶中,30℃避光条件下摇床培养120h,最终菌种AM1-t成功实现表达并产生甲羟戊酸,利用上文中描述的甲羟戊酸的测定方法测得的甲羟戊酸的产率为96.7mg/g干细胞。
实施例6 敲除了phaC基因的扭脱甲基杆菌AM1的构建
本实施例中选用环状质粒载体介导的同源双交换敲除策略,利用pCM433质粒敲除phaC基因。
用环状质粒载体介导的同源双交换敲除策略敲除扭脱甲基杆菌AM1基因组上的phaC基因,需将phaC基因的同源片段载入pCM433质粒中构建得到pCM433kc,再将其转入M.extorquens AM1,通过两次同源交换,使基因组中phaC基因缺失,且不留下任何标记。具体敲除方法如图10所示。
其中使用的pCM433质粒(参见图11)具有如下特点:在扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1中是自杀型质粒;在大肠杆菌中高拷贝数存在;具有丰富的多克隆位点(MCS);具有四环素抗性,氨苄霉素抗性和氯霉素抗性,可用于一次同源重组筛选;具有蔗糖致死基因SacB,用于二次同源重组筛选;GenBank序列号为EU118176。
构建pCM433kc质粒的具体步骤如下所述。
以扭脱甲基杆菌AM1基因组为模板,第一轮Overlap PCR扩增得到phaC基因上下各600bp左右的片段,并在两端加入酶切位点或重叠区间。所使用的引物及酶切位点如表7所示:
表7.引物及酶切位点
第二轮以uphaCf和dphaCr为引物,Overlap PCR将扩增得到phaC基因上下游片段连接,得到kphaC片段,kphaC片段上下游分别含有SacI和NdeI酶切位点。
使用SacI和NdeI限制性内切酶对kphaC片段及pCM433进行双酶切操作,得到目标片段和载体片段。将目标片段和载体片段进行连接得到连接产物pCM433kc(如图12所示)。将6μL连接产物化转至E.coli DH5α感受态细胞,涂布于含有12.5μg/mL四环素的LB平板,在37℃下培养16h,得到载有pCM433kc质粒的大肠杆菌细胞。
一次同源重组的操作
将质粒pCM433kc电转导入扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1后,质粒上的kphaC片段将有可能与基因组上的phaC基因进行同源重组,质粒pCM433kc将会全部插入M.extorquens AM1的基因组DNA中,如图13所示。
由于质粒pCM433在扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1是自杀型的,因此只有一次同源重组成功的菌株才可具有pCM433所携带的抗性,用合适的抗生素便可筛选到一次同源重组成功的菌株,据Marx CJ等人的报道(MarxCJ.Development of a broad-host-range sacB-based vector for unmarked allelicexchange.BMC Res Notes;1:1(2008).),四环素是最有效的,因此选择四环素筛选同源一次重组型。
具体操作为:取2μL pCM433kc质粒电转导入扭脱甲基杆菌M.extorquens AM1。电转后在含四环素10μg/mL的0.46%(w/v)琥珀酸钠CHOI平板上培养72h。将平板上出现的菌落则进行固转固培养:用牙签粗端沾取单菌落,z字形划在相同条件的平板上。充分培养,以便进一步使用。
二次同源重组的操作
一次同源重组成功的菌株,由于基因组DNA上带有同源片段,将会自行发生二次同源重组。若发生二次同源重组则phaC和kphac片段之间的序列会从基因组上去除,而phaC和kphaC片段则会留下其中一个。因此会有两种结果,一种是仅留下phaC基因片段则菌株回复野生型,另一种是仅留下kphaC片段,则phaC基因被敲除。若二次同源重组成功,则可通过菌落PCR的方法筛出敲除phaC基因的菌株。
由于二次同源重组成功的菌株将不再带有质粒pCM433的片段,即不带有SacB基因,而未成功的菌株则会因为这个基因的存在,不能在有蔗糖的环境中生长。因此,可用带有蔗糖的平板筛选出二次同源重组成功的菌株,再通过菌落PCR筛出敲除phaC基因的菌株。
具体操作为:挑取一次重组型菌落,用200μL0.46%(w/v)琥珀酸钠CHOI培养基重悬后,涂布在含有5%(w/v)蔗糖的0.46%(w/v)琥珀酸钠CHOI平板上培养72h。将平板上出现菌落进行固转固培养后进行菌落PCR筛选,找出菌落PCR扩增不出phaC基因的菌株,再进一步验证。
将初步筛选出的菌株以kphaC,phaC,SacB为目标片段进行PCR,各目标片段对应引物如下表8所示。
表8.PCR验证所用引物列表
kphaC型,AM1一次重组型及野生型应得到的片段大小如下表9所示。
表9.二次同源重组PCR验证依据
验证结果符合kphaC型的菌株即为成功敲除基因组上phaC基因的M.extorquens AM1-kc菌株。
截断PHB途径后对目标产物甲羟戊酸产量的提升作用
取5ml的菌株M.extorquens AM1-p(含有质粒pCM110),M.extorquensAM1-m(含有质粒pCM110m),M.extorquens AM1-kcm(敲除phaC基因且含有质粒pCM110m)的种子液,分别接种到装有100ml含四环素10μg/mL的1%(v/v)甲醇CHOI液体培养基的500ml锥形瓶中,30℃摇床中连续培养70h,每6~10小时取5ml,1000rpm下离心10min,留下上清液待分析测定。
发酵70h后,收取50ml菌液测量干重,测得的干重如下表10所示:
表10.70h各菌株50ml细胞的干重表
可看出敲除phaC基因的菌株生长状况较慢。
用气相色谱分析细菌生长70h的菌液,测得菌液中甲羟戊酸浓度CMEV如下表11所示:
表11.70h各菌株菌液中甲羟戊酸的浓度
由以上数据可知,敲除phaC基因有利于甲羟戊酸的合成。甲羟戊酸的浓度与未敲出phaC基因的时相比提高为原来的1.54倍,单位质量干细胞的甲羟戊酸产量与未敲出phaC基因时相比提高为原来的2.35倍。
实施例7 采用了罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum sp.nov.)构建甲羟戊酸生产菌
罗得西亚甲基杆菌的培养基、培养方法、相关基因操作和相关菌种的构建方法同甲基扭脱杆菌相同。采用实施例5中构建的pCM110t质粒,将pCM110t质粒用电击转化法导入到罗得西亚甲基杆菌中,并筛选得到带有pCM110t质粒的罗得西亚甲基杆菌RDSIA-t,具体的构建方法和发酵方法与实施例5所述的方法相同。最终发酵120h,利用本文中描述的甲羟戊酸的测定方法测得的菌株RDSIA-t的甲羟戊酸产率为89.6mg/g干细胞。
本文所述的甲羟戊酸生产细菌导入了甲羟戊酸代谢途径,并首次获得了能够直接代谢甲醇生产甲羟戊酸的甲基杆菌属细菌,从而直接利用甲醇作为原料来高效地生产甲羟戊酸,并且得到的甲羟戊酸是纯净的R型甲羟戊酸产品,实现利用价格低廉、供应充足的原料甲醇,通过微生物代谢,直接合成纯净的R型甲羟戊酸产品,并同时解决了本领域中长期需要利用生物质原料来生物合成甲羟戊酸的问题。
以上全面描述了本发明的优选实施例,但是可对它们进行各种替代和修改。因此,不应参照以上描述来决定本发明的范围,而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征,(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制,除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明确地列举出此类限制。将本文中出现的参考文献并入作为参考。
在本文中列举的数值范围应当认为是包括该数值范围的端点,以及数值范围中任意两点之间的数值范围,例如范围为1~100的情况下,还包括任何1~100中两点之间的范围,例如5~20,10~80等。
在本发明中,采用的词语“不定冠词(a)或(an)”既包括单数又包括复数。相反,任何提到复数的物品在适当的情况下应包括单数。
从前面将观察到可以完成许多修改和变化而不脱离本发明的新颖概念的真实精神和范围。应理解预期或应该推断关于所示的特定实施方式或实施例没有限制。本发明旨在由所附的权利要求覆盖落入权利要求范围内的所有这些修改。
Claims (20)
1.一种用于以甲醇为原料生产甲羟戊酸的细菌,其中所述细菌属于甲基杆菌属(Methylobacterium),并且所述细菌经过修饰表达HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)。
2.根据权利要求1所述的细菌,其中所述细菌经进一步修饰该细菌的乙酰乙酰CoA硫解酶(phaA酶)的活性得到增强。
3.根据权利要求1或2所述的细菌,其中所述细菌中的phaC基因被敲除。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的细菌,其中所述细菌具有丝氨酸循环途径。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的细菌,其中所述细菌选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)或罗得西亚甲基杆菌(Methylobacteriumrhodesianum)。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的细菌,其中所述HMG-CoA合成酶的氨基酸序列是选自下述(a)~(c)中的任一种:
(a)具有SEQ ID NO:1所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的序列;
(b)具有SEQ ID NO:2所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的序列;
(c)具有SEQ ID NO:3所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:3所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的序列。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的细菌,其中所述HMG-CoA还原酶的氨基酸序列是选自下述(d)~(f)中的任一种:
(d)具有SEQ ID NO:4所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:4所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的序列;
(e)具有SEQ ID NO:5所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:5所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的序列;
(f)具有SEQ ID NO:6所示的序列,
或者由在SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的序列。
8.根据权利要求2~7中任一项所述的细菌,其中所述乙酰乙酰CoA硫解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示的序列;
或者为由在SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的序列;
或者由与SEQ ID NO:7所示的序列具有75%一致性的氨基酸序列组成,并且具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的序列。
9.根据权利要求3~7中任一项所述的细菌,其中,所述phaC基因的DNA序列为SEQ ID No:8所示的序列;
或者为由在SEQ ID NO:8所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成,并且敲出该序列阻断了PHB途径。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的细菌,其中编码所述HMG-CoA合成酶的DNA序列选自下述(a)~(f)中的任一种:
(a)SEQ ID No:9所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:9所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质,
(b)SEQ ID No:17所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:17所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质,
(c)SEQ ID No:10所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:10所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质,
(d)SEQ ID No:18所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:18所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质,
(e)SEQ ID No:11所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:11所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质,
(f)SEQ ID No:19所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:19所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性的蛋白质。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的细菌,其中编码所述HMG-CoA还原酶的DNA序列选自下述(a)~(f)中的任一种:
(a)SEQ ID No:12所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:12所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质,
(b)SEQ ID No:20所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:20所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质,
(c)SEQ ID No:13所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:13所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质,
(d)SEQ ID No:21所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:21所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质,
(e)SEQ ID No:14所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:14所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质,
(f)SEQ ID No:22所示的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:22所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲羟戊酸的活性的蛋白质。
12.根据权利要求2~11中任一项所述的细菌,其中编码所述乙酰乙酰CoA硫解酶的DNA序列是选自下述(a)~(b)中的任一种:
(a)SEQ ID NO:15所述的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:15所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的蛋白质;
或者能够与SEQ ID NO:15所述的DNA序列或其互补序列的DNA在严格条件下杂交的DNA序列,且该DNA编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的蛋白质;
(b)SEQ ID NO:16所述的DNA序列,
或者在SEQ ID NO:16所述的碱基序列中发生1个或数个碱基的缺失、取代和/或添加而得到的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的蛋白质;
或者能够与具有SEQ ID NO:16所述的DNA序列或其互补序列的DNA在严格条件下杂交的DNA序列,且该DNA序列编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的蛋白质。
13.一种编码乙酰乙酰CoA硫解酶的DNA序列,其序列为SEQ IDNO:16。
14.一种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列,其序列为SEQ ID NO:17。
15.一种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列,其序列为SEQ ID NO:18。
16.一种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:19。
17.一种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:20。
18.一种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:21。
19.一种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列,其序列为SEQ ID No:22。
20.生产甲羟戊酸的方法,其包括:
以甲醇为碳源培养权利要求1~12中任一项所述的细菌,生产甲羟戊酸。
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