CN107868795B - 利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用 - Google Patents

利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，代谢工程改造的大肠杆菌以乙酸为碳源发酵生产丙酮或异丙醇，其改造途径为构建乙酰CoA生产丙酮或异丙醇的代谢途径，并和/或过表达乙酸摄入途径相关基因的表达以增强乙酸的运输速率，并和/或阻断TCA循环或下调TCA循环以增加流向目标代谢产物的乙酰CoA代谢流，并和/或减少苹果酸和草酰乙酸的脱羧反应以缺失副产物生成途径，和/或缺失乙醇生产途径中关键基因以调节乙酰CoA节点代谢流。本发明通过对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得的菌株能够在以乙酸为碳源的培养基中生产丙酮及异丙醇。

Description

利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建 方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体地讲，涉及利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用。
背景技术
丙酮，又名二甲基酮，其用途十分广泛，主要可作为各种多聚物的溶剂、及稀释剂、电子产品去油的洗涤剂、各种维生素、激素及石油脱蜡的萃取剂等；另外，丙酮作为一种化工原料，也可以用来生产甲基丙烯酸甲酯、双酚A，进而用来合成聚碳酸脂塑料。丙酮的生产方法主要有丙烯直接氧化法、异丙醇法、异丙苯法、发酵法。目前，约有83％的丙酮通过不可再生的化石原料生产而来，由于化学合成的缺点，利用可再生资源通过生物合成法合成丙酮受到极大关注，据报道，通过丙酮-丁醇-乙醇发酵生产丙酮可以替代由70％化石原料来源的丙酮。
利用发酵法生产丙酮的菌株主要为丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum(Microbiol.Rev.1986，50,484–524)，丙酮丁醇梭菌为能够产生丙酮和丁醇等溶剂的厌氧芽孢杆菌。丙酮的生产主要是由乙酰CoA经过硫解酶、CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶几步酶催化反应而得到。此外，也有研究工作表明将丙酮丁醇梭菌的丙酮生产途径的关键基因thlA、adc、ctfAB转入E.coli ER2275、ATCC11303、MC1060中，利用葡萄糖为碳源可以发酵生产丙酮，E.coli ER2275(pACT)和ATCC11303(pACT)在摇瓶发酵中能够产生40mM丙酮，且在培养基中添加乙酸有利于丙酮的积累(Appl.Environ.Mircrobiol.1998,64,1079-1085)。Antje等利用Bacillus subtilis来源的硫酯酶teIIsrf或Haemophilus influenzae来源的ybgC代替thl基因，消除了转移CoA时对乙酸的依赖(Metab.Eng.2013,15,218-225)。
异丙醇，又名二甲基甲醇，作为有机原料和溶剂有着广泛用途。作为化工原料，可生产丙酮、过氧化氢、甲基异丁基酮、二异丁基酮、异丙胺、异丙醚、异丙基氯化物等。在精细化工方面，可用于生产硝酸异丙酯，黄原酸异丙酯、亚磷酸三异丙酯、异丙醇铝以及医药和农药等，也可用于生产二异丙酮、醋酸异丙酯和麝香草酚以及汽油添加剂。异丙醇的生产方法主要有丙烯的间接水合法和直接水合法。许多梭菌如：Clostridium beijerinckii和Clostridium isopropylicum IAM 19239都具备异丙醇的生产能力。有研究表明，在大肠杆菌中转入丙酮合成途径的基础上引入梭菌来源的乙醇脱氢酶能够利用葡萄糖生产异丙醇。Hanai等将大肠杆菌来源的atoDA代替梭菌来源ctfAB使得摇瓶发酵产生81.6mM异丙醇(Appl.Environ.Mircrobiol.2007,73,7814-7818)。Kentaro等通过气体剥离方式提高了发酵批培养时异丙醇产量，经240h可获得2378mM异丙醇(J.Biosci.Bioeng.2010，110,696-701)。
乙酸主要由甲醇的羰基化制备，即甲醇和一氧化碳制备，是一种大量而廉价的碳源，同时也是木质纤维素材料酸水解中形成的主要副产物之一；乙酸也能通过生物法由CO2、CO、CH4等一碳化合物转化而来；同时，乙酸是许多微生物厌氧代谢的终产物和有氧代谢的不完全氧化产物。大肠杆菌可以好氧代谢乙酸进行生长，Lourdes等人的研究表明，在以葡萄糖等为碳源的培养基中添加少量乙酸有利于丙酮的积累(Appl.Environ.Mircrobiol.1998,64,1079-1085)，但以乙酸为唯一碳源来生产丙酮及异丙醇则没有被报道。本发明通过对大肠杆菌途径改造，使其能够以乙酸为碳源进行丙酮及异丙醇的生产。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法。
本发明的第二个目的在于提供利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株。
本发明的第三个目的在于提供利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株在以乙酸为碳源发酵生产丙酮或异丙醇中的应用。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，代谢工程改造的大肠杆菌以乙酸为碳源发酵生产丙酮或异丙醇，其改造途径为构建乙酰CoA生产丙酮或异丙醇的代谢途径，并和/或过表达乙酸摄入途径相关基因的表达以增强乙酸的运输速率，并和/或阻断TCA循环或下调TCA循环以增加流向目标代谢产物的乙酰CoA代谢流，并和/或减少苹果酸和草酰乙酸的脱羧反应以缺失副产物生成途径，和/或缺失乙醇生产途径中关键基因以调节乙酰CoA节点代谢流。
作为一个优选方案，改造途径至少包括：
(1)构建乙酰CoA生产丙酮或异丙醇的代谢途径：该途径涉及3个酶，分别为硫解酶、CoA转移酶和乙酸乙酰脱羧酶，在丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobulylicum)中，编码该3个酶的基因分别为thl、ctftAB、adc，通过过表达上述3个酶的基因，构建丙酮的生产途径，此外，大肠杆菌中含有其中两个酶的编码基因，分别为atoB编码硫解酶、atoDA编码CoA转移酶，通过选择性替换丙酮丁醇梭菌的相应基因，构建不同生产强度的丙酮生产途径；
在丙酮生产菌株的基础上进一步过表达来源于不同宿主菌的乙醇脱氢酶编码基因(adh)，构建丙酮衍生物异丙醇的生产途径；
此外，对宿主菌的改造包括以下一种或几种：
(2)过表达acs；
(3)ackA-pta启动子替换；
(4)下调gltA表达；
(5)缺失maeB和/或scfA；
(6)缺失pckA；
(7)缺失icdA；
(8)缺失adhE。
作为一个优选方案，构建乙酰CoA生产丙酮的改造途径为：同时过表达来源于Clostridium acetobulylicum的thl、ctfAB、adc，或同时过表达来源于Clostridiumacetobulylicum的thl、adc及来源于E.coli的atoDA，或同时过表达来源于Clostridiumacetobulylicum的adc及来源于大肠杆菌的atoB和atoDA。
作为一个优选方案，构建乙酰CoA生产异丙醇的改造途径为：同时过表达来源于Clostridium acetobulylicum的thl、ctfAB、adc及Clostridium beijerinckii来源的adh；或同时过表达来源于Clostridium acetobulylicum的thl、adc及来源于E.coli的atoDA及Clostridium beijerinckii来源的adh；或同时过表达来源于Clostridiumacetobulylicum的adc及来源于大肠杆菌的atoB和atoDA及Clostridium beijerinckii来源的adh。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造还包括：过表达acs或替换pta-ackA启动子。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造还包括：替换pta-ackA启动子，下调gltA表达水平。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造还包括：替换pta-ackA启动子，下调gltA表达水平，缺失maeB或scfA。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造还包括：替换pta-ackA启动子，下调gltA表达水平，缺失maeB,缺失pckA。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造还包括：替换pta-ackA启动子，下调gltA表达水平，缺失maeB,缺失pckA，缺失icdA。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造还包括：替换pta-ackA启动子，下调gltA表达水平，缺失maeB,缺失pckA，缺失icdA，缺失adhE。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株在以乙酸为碳源发酵生产丙酮或异丙醇中的应用。以乙酸为主要碳源，在大肠杆菌常用的发酵培养基M9中发酵生产丙酮或异丙醇。利用构建的丙酮生产的菌株，进一步表达由丙酮生产异丙醇的基因(乙醇脱氢酶编码基因)，从而由丙酮生产异丙醇。
代谢工程改造的大肠杆菌使用乙酸为原料发酵生产丙酮，主要包括对由乙酰CoA合成丙酮途径中的不同来源的关键酶的编码基因进行克隆，构建一条完整的丙酮或其衍生物的生产途径，并结合宿主菌的改造，包括对乙酸运输途径的改造，以增强乙酸的利用；另外，通过阻断或下调TCA循环，以减少乙酰CoA流向中心代谢途径，从而增强流向目标产物的代谢流；减少碳源流向其他支路，如糖异生途径等，以进一步提高流向目标产物的碳流。本发明通过对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得好氧条件下能够以乙酸作为碳源生产丙酮的代谢工程大肠杆菌，并利用改造后的代谢工程菌株以乙酸为主要碳源或者以乙酸为唯一碳源生产丙酮及异丙醇。
本发明的方法是利用分子生物学技术构建外源表达的丙酮及异丙醇生产途径，并且该途径的基因来源于多个宿主菌，包括来源丙酮丁醇梭菌的thl、ctfAB、adc和来源于大肠杆菌的atoB、atoDA，为了能够生产异丙醇，克隆不同来源的乙醇脱氢酶adh；另外，采用CRISPR-dCas9技术下调gltA表达，并利用Red重组技术敲除maeB、pckA、icdA、adhE，构建单缺失菌或组合缺失菌。
本发明以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌，通过构建来自于丙酮丁醇梭菌的丙酮生产途径，并用来源于大肠杆菌的酶替换来源于丙酮丁醇梭菌的关键酶，构建一条更加高效的丙酮生产途径。同时，本发明以乙酸为碳源，是指以乙酸为主要碳源或者唯一碳源，通过对乙酸摄入途径ACK-PTA的改造，可以进一步提高乙酸的吸收速率。乙酰CoA作为丙酮生产的关键前体物质，同时也是中心代谢的关键节点，因此，通过下调gltA调节乙酰CoA代谢流可以增加乙酰CoA流向丙酮的代谢流可以提高丙酮的产量，也能够维持中心代谢，保证能量和生长必需的前体物质供应。通过敲除基因maeB和pckA可以减少TCA循环中间代谢物进入糖异生途径，敲除基因icdA可以减少TCA循环中间代谢产物以CO2形式流失，敲除基因adhE可以减少乙酰CoA进入乙醇合成途径。
本发明的优点在于：本发明通过构建外源表达丙酮途径，并对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得的菌株在以乙酸为碳源的培养基中，能够产生丙酮。
附图说明
图1为大肠杆菌利用乙酸生产丙酮、异丙醇代谢图。丙酮、异丙醇生成的关键酶：ackA，乙酸激酶；pta，磷酸转乙酰酶；acs，乙酰辅酶A合成酶；thlA，硫解酶；atoDA/ctfAB，辅酶A转移酶；adc，乙酰乙酸脱羧酶；adh，乙醇脱氢酶；ppc，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；pckA，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶；pykAF，丙酮酸激酶；ppsA，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶；gltA，柠檬酸合酶；acnAB，顺乌头酸酶；icdA，异柠檬酸脱氢酶；sucAB，α酮戊二酸脱氢酶；sucCD，琥珀酸硫激酶；aceA，异柠檬酸裂解酶；aceB，苹果酸合成酶；aceEF，丙酮酸脱氢酶；mdh，苹果酸脱氢酶；fumABC，延胡索酸酶；frdABCD，延胡索酸还原酶；sdhABCD，琥珀酸脱氢酶。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.丙酮生成途径的构建以获得丙酮生产的菌株
以pTrc99a质粒为载体，通过过表达来自于E.coli或C.acetobutylicum丙酮生产途径的关键酶，构建丙酮生产的异源表达途径。由乙酰CoA合成丙酮的酶分别为硫解酶、CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶，其中CoA转移酶由两个不同的基因分别编码其不同的亚基。而在E.coli中没有乙酰乙酸脱羧酶的编码基因。通过在pTrc99a中组合表达来源于E.coli和C.acetobutylicum以上四个基因，得到三个不同的重组质粒。分别为pTrc99a-thl-RBS-adc-Trc-ctfAB(以上基因均来自于C.acetobutylicum)、pTrc99a-thl-RBS-adc-Trc-atoDA(thl、adc来自于C.acetobutylicum，atoDA来自于E.coli)、pTrc99a-atoB-RBS-adc-Trc-atoDA(adc来自于C.acetobutylicum，atoB、atoDA来自于E.coli)。质粒构建方法如下：
由NCBI中查找大肠杆菌MG1655来源的atoB、atoD、atoA基因序列以及丙酮丁醇梭菌来源的adc、thl、ctfA、ctfB基因序列，按照来源、片段大小及基因功能将其分组，其中atoD与atoA相邻,将此基因一起表达，记为atoDA，ctfA与ctfB相邻，将此基因一起表达，记为ctfAB。将其分别与其它两个基因组合表达，得到下述三种组合：
组合1:atoB-adc和atoDA
组合2:thl-adc和ctfAB
组合3:thl-adc和atoDA
分别将上述3组的每一组基因串联表达，并在前两个基因中间加入经过计算优化的RBS,在最后基因atoDA或ctfAB前加上trc启动子及pTrc99a上的RBS位点。
构建质粒方法为T4DNA连接酶连接或无缝克隆连接。构建好的质粒通过钙转转入E.coli MG1655中，然后通过菌落PCR和测序验证。扩增不同片段的引物如下表1所示：
表1质粒构建引物列表
Figure BDA0001437430270000071
Figure BDA0001437430270000081
表1序列为SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.16，粗体为RBS Calculator计算出的核糖体结合位点。
实施例2.增强乙酸的运输途径
通过Red重组的方法替换乙酸生产乙酰CoA途径的基因(ack，pta)的启动子，在E.coli中ack，pta共用一个启动子，通过由trc启动子突变而来的组成型表达的较强的启动子替换基因组上ack与pta启动子，以增强其表达。将启动子替换成功的菌株命名为HY01,启动子替换具体操作如下：
首先通过设计引物扩增带有目标启动子的卡那片段，通过Dpn I消化以除去甲基化的模板质粒。宿主菌中钙转化导入质粒pKD46，以氨苄青霉素筛选重组子。导入pKD46的重组菌30℃培养至OD600约为0.3时，加入L-阿拉伯糖诱导1小时，然后使用10％的甘油制备电转感受态。将以上获得的卡那片段转入制备好的电转感受态中。电转化采用细菌模式1(1.8KV，5ms)进行，使用卡那霉素筛选发生同源重组的转化子。设计替换验证引物，采用菌落PCR方法验证启动子是否替换成功，对PCR验证的阳性克隆子进一步测序验证，以确保替换的启动子区域没有发生突变，所用引物如下表2。
对启动子替换成功的重组菌，37℃培养5-6小时后，转入42℃培养过夜，分离单菌落，然后验证抗性。只有卡那霉素抗性无氨苄青霉素抗性的为pKD46已消除的菌落。然后在该菌中转入质粒pCP20，30℃培养一段时间后，转入42℃培养过夜，分离单菌落，然后验证抗性。挑取只在无抗性平板上生长，而卡那霉素抗性平板和氨苄青霉素抗性平板上均不生长的菌落进行鉴定。使用以上的验证引物进行菌落PCR，抗性消除成功的转化子与野生菌PCR得到的目的片段大小相似，而与抗性未消除菌株PCR片段大小存在明显的差异，能够判定抗性基因是否消除重组成功。
实施例3.敲除基因以进一步提高丙酮的产量及得率
由于在以乙酸为碳源的培养基中，糖异生途径的基因表达上调，以致于过多的碳源流向糖异生途径。因此，采用Red重组的方法敲除基因maeB、pckA、icdA、adhE和sfcA。将在HY 01基础上敲除maeB的菌株命名为HY 02,在HY 02基础上敲除pckA的菌株命名为HY 03。基因敲除的具体操作如下：
对于基因maeB的敲除，由本实验室保藏的E.coli MG1655单缺失maeB菌株为模板，首先设计引物(引物序列如下表所示)，通过PCR克隆约1700bp的带有卡那抗性的DNA片段。通过电转将该片段转入宿主菌的电转感受态中，宿主菌的电转感受态的制备及敲除的验证和卡那抗性的消除同上述ack-pta启动子替换部分所述。
基因pckA、icdA、adhE、sfcA的敲除，与基因maeB的敲除方法相同，所用引物见表2。
表2启动子替换及基因敲除引物
Figure BDA0001437430270000091
表2序列为SEQ ID NO.17—SEQ ID NO.30。
实施例4.通过反义RNA技术或CRASPR-dCas9系统下调gltA表达
本专利采用两种方法下调gltA基因的表达，以增强乙酰CoA流向目标产物的代谢流。
采用反义RNA技术下调gltA基因的表达：从NCBI上查找来源于E.coliK12系列菌株的柠檬酸合梅的编码基因(gltA)，根据获得的序列及其5，端上游调控区域序列，设计不同的反义RNA引物,通过PCR扩增得到不同序列及长短的反义RNA。
采用CRISPR-dCas9技术下调gltA基因的表达:根据获得的gltA序列及其启动子区域的序列，利用Cas-Designer网站(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计不同的sgRNA。具体操作如下：
获得宿主菌的电转感受态，将predcas9质粒通过电转转入宿主菌中，涂布含终浓度为50mg/L的奇霉素平板。由于predcas9质粒为温敏性的质粒，因此，在32℃过夜培养。挑单克隆，抽质粒验证目的质粒是否成功转入。对成功转入目的质粒的单克隆进一步制备电转感受态。3mL LB在32℃过夜培养E.coli-predcas9，转接0.5-1mL试管菌液至50mL LB,32℃培养至OD600＝0.5，冰上放置10min，冰水洗两遍后，每1mL菌液浓缩至50μL感受态分装，用于电转pGRB-sgRNA。
pGRB-sgRNA构建：根据上述方法得到的sgRNA，设计带有20bp sgRNA突出序列的引物扩增pGRB质粒。在该上下游的引物的5，端均含有20bpsgRNA，且其序列反向互补，便于PCR得到的线性化载体转化后能够自连接形成环状质粒pGRB-sgRNA。将PCR扩增得到的片段通过钙转转入E.coli感受态中。从而在细胞内该片段能自连接形成环状质粒pGRB-sgRNA。涂布氨苄抗性平板，挑菌后测序验证该质粒中是否带有目标sgRNA。对于测序阳性质粒以上所述方法转入E.coli-predcas9感受态中。涂布含100mg/L氨苄抗生素和50mg/L奇霉素平板。
实施例5.丙酮生产菌株摇瓶发酵
以MG1655或其缺失菌为出发菌，通过钙转转入构建丙酮生产途径的质粒，分别得到MG1655(pTrc99a-thl-RBS-adc-Trc-ctfAB)、MG1655(pTrc99a-thl-RBS-adc-Trc-atoDA)、MG1655(pTrc99a-atoB-RBS-adc-Trc-atoDA)菌株。上述菌株构建完成后，保存于甘油中(25％v/v)。
摇瓶发酵操作：保存在甘油管中的种子接种于装有3mL LB的试管中培养过夜，然后转接到装有50mL LB培养基的锥形瓶中，接种量2％，培养条件均为37℃，220rpm。二级种子培养10h后，转入摇瓶发酵培养基(M9培养基)。M9培养基中添加5g/L乙酸钠和2g/L酵母提取物。接种量为2％，培养条件为37℃，220rpm，至OD600达到1.0左右，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM。诱导后培养条件为25℃，220rpm。
M9培养基组成为(每升)：Na2HPO4·12H2O 15.12g，KH2PO4 3g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.011g，NH4Cl 1g，1％维生素B1 0.2mL以及微量元素(TE)混合液0.2mL。微量元素(TE)混合液组成为(每升)：Na2MoO4·2H2O 2.0g，FeSO4·7H2O 80g，MnSO4·H2O10g，ZnSO4·7H2O 2.0g，CoCl2 4.0g，CuCl2·2H2O 1.0g，H3BO4 0.5g，AlCl3·6H2O 10g。
丙酮及乙酸的测定方法：摇瓶发酵培养期间，间隔12h取样，12000rpm离心10分钟分离菌体和上清。发酵液上清经0.22μm微孔膜过滤，采用日本岛津高效液相色谱仪监测发酵液上清中的丙酮及乙酸有机酸。色谱柱为BioRadAminex HPX-87离子色谱柱(300mm*7.8mm)，配有紫外检测器和示差折光检测器。流动相为2.5mM的H2SO4，流速0.5mL/min，柱温50℃。
生物量的测定采用分光光度计法测定600nm下的吸光值。
摇瓶发酵结果如下表：
表3基因工程菌丙酮产量及得率
Figure BDA0001437430270000111
ND：未检测到产物。
实施例6.以乙酸为唯一碳源，利用静息细胞转化生产丙酮
为了进一步提高丙酮的生产速率与产量，本专利通过静息细胞的方式来生物转化乙酸生产丙酮。通过缺少培养基中的某一关键营养物质或添加某种毒性物质可以使细胞停止生长，从而使底物能最大限度的转化为目标产物。本专利通过不含氮源的培养基使细胞不能生长。
静息细胞转化分为两个阶段，第一阶段为培养阶段，其操作同摇瓶发酵，即实现菌体的增殖。在摇瓶培养12h，此时，菌体积累丙酮的速率最快，收集浓缩菌体。4℃，8000rpm离心10min收集菌体。然后，用不含氮源的M9培养基洗涤菌体一次。接下来，进入第二阶段，即静息细胞转化阶段。将第一阶段收集的菌体用无氮M9培养基重悬，控制OD600约为25，并分装至250mL摇瓶中，装液量为25mL。摇瓶中添加MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.011g/L，初始乙酸钠浓度为10g/L。培养条件为220rpm，25℃，液相检测残留的乙酸浓度，当乙酸浓度低于2g/L时补加适量乙酸钠。
结果：静息细胞转化2h丙酮的产量达到999.6mg，得率为0.29mol/mol。
为了减少丙酮挥发，静息细胞转化反应在100mL带尾气冷凝的小反应器中进行，并且使用小型的自吸式搅拌桨，结果静息细胞转化10h，丙酮的产量达到6.8g，得率为0.35mol/mol。
实施例7.以乙酸为碳源生产异丙醇
丙酮加氢反应可以获得异丙醇，在生物体内，丙酮可以在乙醇脱氢酶的催化下产生异丙醇。本专利在由乙酸生产丙酮的基础上，进一步表达来源于不同宿主菌的乙醇脱氢酶(ADH)编码基因，从而能够生产异丙醇。
从NCBI中查找不同宿主菌株的乙醇脱氢酶编码基因，包括来源于Clostridiumbeijerinckii、Thermoanaerobacter brockii，及在NCBI中查找与该菌株ADH酶相似度较高的序列。通过密码子优化使其能在E.coli中正常表达，将合成的序列连接到丙酮生产的质粒pTrc99a-thl-RBS-adc-Trc-atoDA上，构建pTrc99a-thl-RBS-adc-Trc-atoDA-RBS-adh质粒。其中基因atoDA与adh通过RBS Calculator计算得出合适的RBS序列。
由于催化丙酮产生异丙醇的乙醇脱氢酶为NADPH依赖型，过表达NAD激酶及转氢酶酶以增加胞内NADPH含量，包括来源于大肠杆菌的PntAB、UdhA、NadK。由于质粒pBAD33启动子由阿拉伯糖诱导，因此，替换其启动子为Trc启动子，以IPTG诱导。获得如下质粒：pBAD33-Trc-pntAB,pBAD33-Trc-udhA,pBAD33-Trc-nadK。其构建方法采用无缝克隆连接，引物如下表4。
表4引物列表
Figure BDA0001437430270000131
表3序列为SEQ ID NO.31—SEQ ID NO.42。
异丙醇检测使用气相色谱，乙酸检测使用高效液相色谱。气相色谱条件为：初始温度为40℃，保持5min，然后以15℃/min速率上升至120℃，接下来以50℃/min速率上升到230℃，保持4min，进样口和检测器温度为225℃。氦气为载气。
摇瓶发酵操作同丙酮生产摇瓶发酵。
以来源于Clostridium beijerinckii菌株，经密码子优化的adh为例阐述结果，如表5。
表5基因工程菌异丙醇产量
Figure BDA0001437430270000141
ND：未检测到产物。
采用静息细胞方式，以HY03(pTrc99a-thl-RBS-adc-Trc-atoDA,pBAD33-Trc-pntAB)菌株转化生产异丙醇，操作实施例6，使用防止异丙醇挥发的微型反应器，静息细胞转化10h，异丙醇产量达到4.7g/L，得率为0.27mol/mol。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用
<130> /
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> trc
<400> 1
tgcactgcag gcgcaacgca attaatgtga gttag 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> trc
<400> 2
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<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 3
gaaacagacc atgaaaacaa aattgatgac attacaagac gccacc 46
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<212> DNA
<213> E.coli
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ccaagctttc ataaatcacc ccgttgcgta ttcagatc 38
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<212> DNA
<213> E.coli
<400> 5
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<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 6
tactatactt atccttgttt ttatatggtc gtttaattca accgttcaat caccatcgc 59
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> C. acetobutylicum
<400> 7
aaacaaggat aagtatagta aggaggtttt cgatgttaaa ggatgaagta attaaaca 58
<210> 8
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<212> DNA
<213> C. acetobutylicum
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<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> trc
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> trc
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<213> C. acetobutylicum
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gaaacagacc atgaactcta aaataattag atttgaaaat 40
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<212> DNA
<213> C. acetobutylicum
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<212> DNA
<213> C. acetobutylicum
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<213> C. acetobutylicum
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acctccttat ttctcgtgta gttgctgcta gcacttttct agcaatattg ctg 53
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<213> C. acetobutylicum
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tacacgagaa ataaggaggt aaggtatgtt aaaggatgaa gtaattaaac aaa 53
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<212> DNA
<213> C. acetobutylicum
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caggtcgact ctagaggatc cttacttaag ataatcatat ataacttcag c 51
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<212> DNA
<213> trc
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ttcagaacca gtactaactt a 21
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<212> DNA
<213> E.coli
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caggcatggt attgctggat 20
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<213> E.coli
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ttcgctgtgg tgcataaact 20
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gaatttctcc agatacgtaa 20
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gcagggcacg acaaaagaag g 21
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<213> E.coli
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cgcatatgca acgtggtggc agacgagcaa accagtagcg ctcgaaggag aggtgagtgt 60
aggctggagc tgcttc 76
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<212> DNA
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aacaaaaaac aacgggagcg ttacgctccc gttaataaat ttaacaaact acggcaatgg 60
gaattagcca tggtcc 76
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cctggaagtg acgcattaga 20
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<212> DNA
<213> E.coli
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gcagatcatt gagaagtggc 20
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cctcaatgac gattaaacac 20
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ccttcatagt tcctcctttt 20
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<212> DNA
<213> E.coli
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gcgaattcga gctcggtacc gcgcaacgca attaatgtga gttag 45
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gtaggaatgt ggcatgtttc ctgtgtgaaa ttgtt 35
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ttcacacagg aaacatgcca cattcctacg attac 35
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Claims (11)

1.一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，代谢工程改造的大肠杆菌以乙酸为碳源发酵生产丙酮或异丙醇，其改造途径为构建乙酰CoA生产丙酮或异丙醇的代谢途径，并和/或过表达乙酸摄入途径相关基因的表达以增强乙酸的运输速率，并和/或阻断TCA循环或下调TCA循环以增加流向目标代谢产物的乙酰CoA代谢流，并和/或减少苹果酸和草酰乙酸的脱羧反应以缺失副产物生成途径，和/或缺失乙醇生产途径中关键基因以调节乙酰CoA节点代谢流；
其中，(1)构建乙酰CoA生产丙酮或异丙醇的代谢途径：该途径涉及3个酶，分别为硫解酶、CoA转移酶和乙酸乙酰脱羧酶，在丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobulylicum)中，编码该3个酶的基因分别为thl、ctftAB、adc，通过过表达上述3个酶的基因，构建丙酮的生产途径，此外，大肠杆菌中含有其中两个酶的编码基因，分别为atoB编码硫解酶、atoDA编码CoA转移酶，通过选择性替换丙酮丁醇梭菌的相应基因，构建不同生产强度的丙酮生产途径；
在丙酮生产菌株的基础上进一步过表达来源于不同宿主菌的乙醇脱氢酶编码基因(adh)，构建丙酮衍生物异丙醇的生产途径；
对宿主菌的改造还包括以下一种或几种：
(2)过表达acs；
(3)ackA-pta启动子替换；
(4)下调gltA表达；
(5)缺失maeB和/或scfA；
(6)缺失pckA；
(7)缺失icdA；
(8)缺失adhE。
2.根据权利要求1所述的一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，构建乙酰CoA生产丙酮的改造途径为：同时过表达来源于Clostridium acetobulylicum的thl、ctfAB、adc，或同时过表达来源于Clostridium acetobulylicum的thl、adc及来源于E.coli的atoDA，或同时过表达来源于Clostridium acetobulylicum的adc及来源于大肠杆菌的atoB和atoDA。
3.根据权利要求1所述的一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，构建乙酰CoA生产异丙醇的改造途径为：同时过表达来源于Clostridium acetobulylicum的thl、ctfAB、adc及Clostridium beijerinckii来源的adh，或同时过表达来源于Clostridium acetobulylicum的thl、adc及来源于E.coli的atoDA及Clostridium beijerinckii来源的adh，或同时过表达来源于Clostridium acetobulylicum的adc及来源于大肠杆菌的atoB和atoDA及Clostridium beijerinckii来源的adh。
4.根据权利要求1所述的一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造还包括：过表达acs或替换pta-ackA启动子。
5.根据权利要求1所述的一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造还包括：替换pta-ackA启动子，下调gltA表达水平。
6.根据权利要求1所述的一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造还包括：替换pta-ackA启动子，下调gltA表达水平，缺失maeB或scfA。
7.根据权利要求1所述的一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造还包括：替换pta-ackA启动子，下调gltA表达水平，缺失maeB,缺失pckA。
8.根据权利要求1所述的一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造还包括：替换pta-ackA启动子，下调gltA表达水平，缺失maeB,缺失pckA，缺失icdA。
9.根据权利要求1所述的一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造还包括：替换pta-ackA启动子，下调gltA表达水平，缺失maeB,缺失pckA，缺失icdA，缺失adhE。
10.利用权利要求1—9任一所述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株。
11.利用权利要求1—9任一所述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株在以乙酸为碳源发酵生产丙酮或异丙醇中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795833B (zh) * 2018-05-25 2021-08-13 淮阴工学院 乙酸CoA转移酶缺陷型大肠杆菌工程菌及其应用
CN110656075B (zh) * 2018-06-28 2022-11-11 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种合成乙酰辅酶a衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法与应用
CN109055417B (zh) * 2018-08-28 2020-07-07 浙江新和成股份有限公司 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用
CN110343672B (zh) * 2018-12-27 2021-07-06 华东理工大学 一种抗尿苷酸反馈抑制的氨甲酰磷酸合成酶突变体及其应用
CN114752516B (zh) * 2022-04-25 2023-11-10 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产甲基酮的重组酿酒酵母及其构建方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104560852A (zh) * 2014-09-22 2015-04-29 江南大学 一种l-苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌
CN105543214A (zh) * 2014-10-30 2016-05-04 华东理工大学 利用乙酸生产丁二酸的代谢工程大肠杆菌菌株构建方法和应用
WO2017031329A1 (en) * 2015-08-19 2017-02-23 Technology Holding, Llc Hybrid chem-bio method to produce diene molecules

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104560852A (zh) * 2014-09-22 2015-04-29 江南大学 一种l-苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌
CN105543214A (zh) * 2014-10-30 2016-05-04 华东理工大学 利用乙酸生产丁二酸的代谢工程大肠杆菌菌株构建方法和应用
WO2017031329A1 (en) * 2015-08-19 2017-02-23 Technology Holding, Llc Hybrid chem-bio method to produce diene molecules

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Engineered Synthetic Pathway for Isopropanol Production in Escherichia coli;T. Hanai et al.,;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;20071231;第73卷(第24期);第7814-7818页 *
Expression of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Genes in Escherichia coli for Acetone Production and Acetate Detoxification;LOURDES L.BERMEJO et al.,;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;19980331;第64卷(第3期);第1079-1085页 *
共表达甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶对大肠杆菌生长及甘油代谢的影响;魏淼等;《生物加工过程》;20110930;第9卷(第5期);第59-64页 *

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