UA127433C2 - Спосіб одержання молочної кислоти та система з двох або більше біореакторів для виробництва молочної кислоти - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способу одержання молочної кислоти з рекомбінантної дріжджової клітинної культури з використанням глюкози як джерела вуглецю, який включає a) культивування щонайменше диплоїдних дріжджів на стадії ферментації посіву штаму рекомбінантної дріжджової клітинної культури для отримання біомаси, де дріжджі культивують в культуральному середовищі при рН від 5 до 7 з подальшим b) культивуванням вказаних дріжджів на стадії виробничої ферментації з використанням біомаси із стадії ферментації посіву для отримання молочної кислоти, при цьому дріжджі інокулюють при щільності клітин OD600 не менше 5, і культивують в культуральному середовищі при pH менше 5 до досягнення кінцевого рН менше 3,5 і при цьому вказані дріжджі є штамом CBS7962 з S. cerevisiae і експресують лактатдегідрогеназу (LDH) з Lactobacillus plantarum, при цьому вказаний штам дріжджів нокаутує по експресії генів PDC1, PDC5 і PDC6, і при цьому стадія ферментації посіву і стадія виробничої ферментації проходять в окремих ферментерах. Винахід стосується також системи з двох або більше біореакторів для виробництва молочної кислоти. 2

Description

Галузь винаходу

Цей винахід забезпечує спосіб одержання молочної кислоти в рекомбінантній дріжджовій клітинній культурі з використанням глюкози як джерела вуглецю, який включає перший етап посіву ферментації для одержання біомаси на якому дріжджі вирощують у поживному середовищі, з рН від 5 до 7, потім другий етап, ферментаційного виробництва молочної кислоти з використанням біомаси від посіву ферментації, на якому дріжджі культивують на поживному середовищі при низьких значеннях рН з використанням штаму дріжджів, який розроблений, щоб активувати лактат дегідрогенази (ОН) або активувати лактат дегідрогенази (ОН) і зменшити або нокаутувати активність піруват декарбоксилази (РОС).

Передумови винаходу

Молочна кислота за оцінками Міністерства енергетики США входить до верхніх 30 кандидатів хімічних будівельних блоків від цукрів, які демонструють значне зростання ринку.

Глобальний ринок молочної кислоти в 2013 році оцінювався у 714 200 т і, як очікується, зросте до 1,960,100 т до 2020 року, з темпом росту між 2014 і 2020 роками 15,5 95 сукупного річного темпу зростання (САСК).

Молочна кислота давно використовується у харчовій промисловості як консервант і як підкислювач. Ціна молочної кислоти зараз становить близько 51.30 - 51.60 за кг. ЇЇ також використовують як розчинник, особливо у формі складних ефірів, і як сировину у фармацевтичній, косметичній і хімічній промисловостях, а також для виробництва складних ефірів молочної кислоти. Молочна кислота все більше використовується як вихідний матеріал у виробництві полімолочної кислоти (РІА), пластику, який розкладається мікроорганізмами, виготовленого з відновлюваних ресурсів.

Основними факторами зростання ринку молочної кислоти є використання в розробці полімерів, які розкладаються мікроорганізмами і розчинниками лактатів. Як очікується, виробництво засобів особистої гігієни також, буде швидко зростаючим сегментом, оскільки молочна кислота використовується в засобах для освітлення шкіри, засобах проти вугрів, проти зморшок і проти старіння.

Виробництво полі-молочної кислоти (РГА) оцінюється у 11,4 95 (близько 185 тис. тон) світового ринку біопластиків у 2013 році. Прогнозується щорічне зростання ринку РІГ А на 18,8 95

Зо САСБЕ, яке досягне обсягу ринку 438 тис. тонн у 2018 році. За останні роки якість РІГ А і діапазон її технічного застосування швидко розвивається. Сьогодні РЕА використовується в трьох основних галузях: 1. Волокно: для тканин, килимів, оббивки меблів, нетканих та інших промислових застосувань 2. Плівки і упаковки: пакування свіжих продуктів та інші застосування як-от вироби для продуктів харчування 3. Інженерні застосування: в електроніці, товарах широкого вжитку і в автомобільній промисловості.

Пластик, який розкладається мікроорганізмами з відновлюваних джерел (біопластик) має широкий спектр переваг у порівнянні з нафтохімічними пластиками. Подолання цінового бар'єру

РГА у порівнянні з нафтохімічними пластиками зробить ці переваги досяжними для широкого діапазону застосувань.

Переваги біопластиків протягом їхнього життєвого циклу: - Одержання з відновлюваної сировини - Відсутність виснаження цінних ресурсів сирої нафти - Низький "вуглецевий слід", який, як вважається, буде щонайменше на 30 95 нижчим, ніж для звичайних нафтохімічних пластиків - Розкладаються мікроорганізмами - Дозволяють уникнути проблем, пов'язаних зі звалищами і засміченням.

Виробництво вихідного матеріалу для РІ А, тобто, молочної кислоти, за ціною у половину сучасної вартості істотно вплине на собівартість продукції РІ А. Це дає можливість підвищити ринкову позицію РІ А у порівнянні з більш дорогими продуктами з нафтохімічного пластику.

Молочна кислота традиційно виробляється з використанням молочнокислих бактерій.

Зокрема, у харчовій промисловості переважно, використовують робочі мікроорганізми, які виробляють кислоту природним чином. Прикладами традиційних продуктів, що містять молочну кислоту, є квашена капуста і йогурт. Виділена молочна кислота, одержувана з глюкози молочнокислими ферментаційними бактеріями, також використовується у сучасній харчовій промисловості. Основне застосування молочної кислоти у хімічній промисловості це виробництво пластикового полілактату (РІ А). бо Однак попит на молочну кислоту як сировину для виробництва пластика значно вищій, ніж для виробництва харчових продуктів. Молочна кислота має бути особливо чистою, зокрема енантіомерно чистою (тобто вона має бути чистою О-або І -молочною кислотою) і вона має бути досить недорога оскільки РІ А в наш час вона конкурує з дешевими звичайними нафтохімічними пластиками. Вирішальним фактором ціни молочної кислоти є її очищення після ферментації.

Очищення є складним і коштовним, зокрема тому, що молочнокислі бактерії не можуть переносити низькі значення рН в процесі ферментації, зокрема тому, що вони залежні від джерел органічного азоту. Крім того, молочнокислі бактерії зазвичай накопичують обидва енантіомери (дзеркальні ізомери) кислоти (запцег еї а!., 2008, Тгтепаз Віотесппої. 26, 100-108 апа зЗацег М. єї аї., 2010, ВіоїесппоІЇ. Сеп. Епадіпеегіпу, 27, 229-256). Зокрема, значення рН є проблемою оскільки на очищення вільної молочної кислоти можуть впливати лише розчини з низьким рН. Це означає, що під час ферментації рН має бути утриманий високим, шляхом додавання основи. Для очищення молочної кислоти ферментаційний бульйон необхідно підкислити, а одержану сіль (гіпс) утилізувати або переробити, що є технічно складною процедурою.

Рішенням цих проблем є виробництво молочної кислоти рекомбінантними дріжджами. Вони більш кислотостійкі, ніж молочнокислі бактерії, можуть рости і розмножуватися на мінеральних середовищах і накопичувати лише бажаний дзеркальний ізомер молочної кислоти. Компанія

Маїигеумогкз ГІ С (Сагодії) є одним з небагатьох комерційних виробників РІ А. Молочна кислота, яка служить основою для виготовлення РІ А, виробляється дріжджовим способом (близько 140 000 т на рік). Технологічний процес компанії Магигеумогк5 базується на рекомбінантних Стабрігее- негативних дріжджах (див. МіШег еї аї. 2011, Іпаивійа! ргодисійоп ої Іасіїс асіа, ЕІвемівг, 179-188).

Процес ферментації дає 100-130 г/л молочної кислоти за 40-45 годин, при кінцевому значенні рн.-З. Ця молочна кислота, однак, не доступна на відкритому ринку, і безпосередньо на місці переробляється на РІ А.

Ферментація глюкози на етанол хлібопекарськими дріжджами є одним з найефективніших існуючих біопроцесів. Вважається, що їх продуктивність обмежується лише швидкістю поглинання глюкози з середовища у клітину. Піровиноградна кислота (піруват) є ключовим метаболітом глюкози, що використовується у виробництві етанолу. Якщо метаболічний шлях етанолу усувається шляхом видалення активності піруват декарбоксилази (РОС) і одночасно

Зо вставлення лактату дегідрогенази (ОН), яка перетворює піровиноградну кислоту на молочну кислоту, штам дріжджів, виробляє молочну кислоту замість етанолу. Такі штами вже розроблені в різних попередніх проектах (Вгапапагаї еї аІ. 2006, Місгобіа! Сеї! Расіогіє5, 5:4, 1-12).

ММО2004/099425 стосується до такого методу виробництва молочної кислоти без виробництва значної кількості етанолу використовуючи гаплоїдні Старігее позитивні дріжджі вирощені в аеробному середовищі з глюкозою за недостатньої активності пірувату декарбоксилази і містять екзогенний ген лактату дегідрогенази.

МО2009/144013 описує метод виробництва молочної кислоти з використанням дріжджів з гіперекспресивним геном транспортера гексози який зумовлю збільшення продуктивності органічної кислоти.

Однак, хоча були зроблені декілька спроб для того, щоб покращити дріжджі для виробництва молочної кислоти, вони все ще не відповідають вимогам забезпечення покращеного процесу відтворення значної кількості чистої ізомерної молочної кислоти без необхідності у дорогих процесах очищення.

Короткий опис винаходу

Зазначена вимога вирішується у варіантах здійснення винаходу.

Цей винахід забезпечує одержання генетично модифікованих штамів дріжджів для одержання оптично чистих ізомерів молочної кислоти, І (ї)-молочної кислоти або ОД(-) - молочної кислоти в залежності від використовуваних генетично модифікованих штамів дріжджів. При узгодженні конкретних метаболічних потреб цих штамів дріжджів і винахідницькі підходи до інженерії біопроцесів, цей процес дозволяє істотно знизити витрати на виробництво молочної кислоти. Чистота ферментаційного бульйону у винахідницькому процесі є великою перевагою у порівнянні з традиційними процесами з використанням молочнокислих бактерій, оскільки вони вимагають органічних джерел азоту і високого значення рн, обидва з яких збільшують вартість очищення. У порівнянні із усталеними процесами, заснованими на дріжджових системах, винахідницький процес має особливу перевагу більшу продуктивність, дозволяє підвищити продуктивність за рахунок значного скорочення часу ферментації і, отже, більш низької вартості продукту. Цей процес характеризується особливо високою продуктивністю при низьких значеннях рН на мінеральних середовищах.

Основною проблемою ферментації при низькому значенні рН є обмежена життєздатність 60 штамів, особливо при високих концентраціях молочної кислоти. Це значно обмежує загальну продуктивність. Інноваційний аспект цього процесу полягає у зведенні до мінімуму часу, протягом якого клітини піддаються впливу стресових умов під час ефективного виробництва молочної кислоти. Це досягається за рахунок двоетапного процесу, який відокремлює фазу росту клітин від фази виробництва молочної кислоти як у часі, так і за вибором, у просторі.

Перший етап процесу ферментації передбачає швидке збільшення біомаси дріжджів, а на другому етапі глюкоза перетворюється на молочну кислоту. Це щоб уникнути гальмівного впливу молочної кислоти на зростанні під час проліферації дріжджів, і при досягненні високої щільності клітин, вона досягає максимального виходу молочної кислоти 3 високою продуктивністю.

Подальше очищення молочної кислоти можна проводити стандартними методами. Процес ферментації забезпечує бульйон, який можна очистити звичайними методами. Крім того, процес ферментації при низькому значенні рН робить процес очищення більш дешевим, оскільки більше немає необхідності підкислювати ферментаційний бульйон перед очищенням, що, в свою чергу, робить непотрібним видалення великої кількості солей.

Цей винахід забезпечує спосіб одержання молочної кислоти в рекомбінантній дріжджовій клітинній культурі з використанням глюкози як джерела вуглецю, який включає такі послідовні етапи: посіву ферментації для одержання біомаси, в якому дріжджі вирощують у поживному середовищі з рН від 5 до 7, і подальшого етапу ферментаційного виробництва молочної кислоти з використанням біомаси від посіву ферментації, на якому дріжджі вирощують на поживному середовищі з рНе5, і в якому зазначені дріжджі модифікують так, щоб активувати лактат дегідрогенази (І ОН) або активності І ОН і активувати лактат дегідрогенази (І ОН) і зменшити або нокаутувати активність піруват декарбоксилази (РОС).

В рамках здійснення винаходу також запропоновано спосіб одержання молочної кислоти в рекомбінантній дріжджовій клітинній культурі, яка містить глюкозу як джерело вуглецю, який включає етапи: а) культивування дріжджових клітин з рН від 5 до 7 при посіві ферментації для одержання біомаси р) збирання одержаного продукту і за необхідності, промивання клітин етапу а), с) інокулювання виробничої ферментації з зазначеними клітинами з 00900 не менше 3,0

Зо а) інкубацію зазначених клітин за умов виробництва молочної кислоти з рНе5, а конкретно до кінцевого значення рН менше 2,5 і е) очищення молочної кислоти від клітинної культури або супернатанту клітинної культури, в якому, зазначені дріжджі є диплоїдними або, за необхідності, поліплоїдними, або анеуплоїдними дріжджами, які мають активність рекомбінантного лактату дегідрогенази (ІОН) і за необхідності знижують активність пірувату декарбоксилази (РОС).

В рамках здійснення винаходу також запропоновано спосіб одержання молочної кислоти в рекомбінантній дріжджовій клітинній культурі, яка містить глюкозу як джерело вуглецю, який включає етапи: а) культивування дріжджових клітин при постійному рН від 5 до 7 до досягнення 00 не менше 10 в умовах посіву ферментації, р) культивування зазначених клітин до досягнення кінцевого значення рН менше 2,5 у виробництві молочної кислоти, і с) очищення молочної кислоти від клітинної культури або супернатанту клітинної культури, при якому зазначені дріжджі є диплоїдними дріжджами або за необхідності поліплоїдними або анеуплоїдними дріжджами, які мають активність лактату дегідрогенази (ІОН) ї за необхідності знижують активність піруват декарбоксилази (РОС).

Таким чином, зазначені рекомбінантні дріжджі, використовувані в цьому процесі за винаходом є метаболічно розробленими для ефективного виробництва молочної кислоти.

Згідно варіанта здійснення винаходу, штам дріжджів здатний виробляти близько 80 г/л молочної кислоти А) із 100 г/л глюкози, зокрема близько 100 г/л ГА на 120 г/л глюкози, точніше близько 120 г/л на 150 г/л глюкози або навіть у ще більшій кількості. Зокрема, кінцевий рн такого виробничого середовища «3.

Згідно варіанта здійснення винаходу, молочна кислота очищується після етапу ферментації загальноприйнятими промисловими процесами і конкретно має чистоту не менше 90 95, конкретно не менше 95 95, більш конкретно не менше 99 95, ще більш конкретно вона є вільною від будь-яких домішок.

У конкретному варіанті ферментаційного виробництва етапі з рН « 4.5, зокрема, «4, а саме «3.5, більш конкретно етап ферментаційного виробництва має кінцеве значення рнН.З, більш конкретно етап ферментаційного виробництва має кінцеве значення рН «2.9, «2.8, «2.7, 2.6, « 60 2.5,:2.4, 2.3, 2.2, «2.15 або менше.

У деяких варіантах етап посіву ферментації здійснюється за умов періодичного підживлювання.

В деяких варіантах етап виробничої ферментації здійснюється як періодичний процес.

Згідно винаходу, посів ферментації і виробнича ферментація можуть проводитися в одній ємності.

Відповідно до конкретного варіанта здійснення винаходу етап посіву ферментації і етап виробничої ферментації проводяться в окремих біореакторах.

Згідно певного варіанта здійснення винаходу, початкова концентрація цукру на етапі виробничої ферментації становить не менше 10 95 (за вагою), конкретно 12 95 (за вагою) і більше, точніше 15 9; і більше, і переважно 20 95 і більше.

Згідно одного варіанта здійснення винаходу, початкова концентрація глюкози на етапі виробничої ферментації становить не менше 10 95 (за вагою), конкретно 12 95 (за вагою), більш конкретно 15 95 і більше, і переважно 20 95 і більше.

В іншому варіанті процес базується на сахарозі. Початкова концентрація сахарози на етапі виробничої ферментації становить не менше 10 95 (за вагою), зокрема 12 95 (за вагою) або, більш конкретно 15 95 або більше, і більш переважно 20 95 або більше.

Згідно з варіантом здійснення, молочна кислота виробляється у вільній формі, зокрема, вона виробляється в оптично чистій ізомерній формі, конкретно О(-) або І (Ж) - молочна кислота.

Спосіб винаходу може бути здійснений рекомбінантними дріжджами, які містять гетерологічний ген лактату дегідрогенази (ОН) як стабільно інтегрований в геном або на плазміді або, на векторний або експресивний кластер, придатний для функціональної і стабільної експресії генів. Такі дріжджі здатні виробляти молочну кислоту за рН менше 3,5, зокрема за рН менше 3, більш конкретно за рН менше 2,8, а точніше за рН менше 2,5, ще більш конкретно рН менше 2,2.

Введення екзогенного гена ОН може бути виконане за допомогою методів, відомих кваліфікованому фахівцю, наприклад, шляхом перетворення, особливо електропорацією, бомбардуванням мікрочастинками, методом ГІ іАс/55/0МА/РЕС або використанням методу системи СКІЗБРЕК-Саз9, тощо.

Згідно з подальшим варіантом, зазначені рекомбінантні дріжджі зменшили або нокаутували

Зо експресію одного або декількох генів з кодами РОС1, РОС5 і/або РОСб.

Відповідно до конкретного втілення, рекомбінантні дріжджі зменшили або нокаутували експресію одного або більше генів, з кодами РОС1, РОС5 і/або РОСб, шляхом заміни і/або видалення одного або більше промоторів генів РОС1, РОС5 і/або РОСб.

В альтернативному варіанті здійснення рекомбінантні дріжджі генів з кодами РОС1, РОСЬ або РОСб умовно експресивні, зокрема через контроль гетерологічних промоторів, зокрема завдяки можливості пригнічення промоторів глюкози, а точніше завдяки контролю промоторів генів НХТ2 або НХТАУ.

В альтернативному варіанті в рекомбінантних дріжджах видаляється, принаймні, один з генів з кодами РОС1, РОС5 і/або РОСб.

У подальшому конкретному варіанті здійснення винаходу дріжджі зменшували або припиняли експресію одного або декількох генів, які кодують білки, які взаємодіють з сенсорами глюкози, які контролюють або регулюють експресію генів, зокрема експресію білків 541 або

МІНІ.

Зокрема, ген МТНІ частково або повністю видаляють.

У подальшому варіанті, дріжджі змінені так, що гіперекспресивним був, принаймні, один ген транспортера гексози, а конкретно дріжджі змінені так, щоб гіперекспресивним був, принаймні, один ген транспортера гексози, вибраний з групи НХТІ1, НХТ2, НХТЗ, НХТА4, НХТ5, НХТб, НХТ7, нНХхтвВ, НХТе, НХТ10, НХТ11, НХТ12, НХТ13, НХТ14, НХТ15, НХТ16, НХТ17, САІ2, ЗМЕЗ і КОТ2.

Додатково передбаченими варіантами здійснення цього винаходу є рекомбінантні дріжджі, які мають активність лактату дегідрогенази (ОН) і за необхідності, також зменшеною або нокаутованою активністю пірувату декарбоксилази (РОС), як це описано далі.

Згідно з іншим варіантом, рекомбінантні дріжджі можуть також зменшувати або нокаутувати активність піруват декарбоксилази.

Цей винахід додатково забезпечує одержання рекомбінантного штаму дріжджів, який містить ї) видалені функціональні гени РОС1, РОС5 і РОСб, і) видалений функціональний ген МТНІ, ії) гіперекспресивний ген НХТІ, і ім) принаймні, один гетерологічний ген І ОН. 60 Штам рекомбінантних дріжджів, який використовується згідно винаходу, може належати до роду, який вибирається з Засспаготусе5, Сапаїда, Зспілозасспаготусе5, Тогціазрога,

Кісумеготусев, 7удозасспаготусев, Зидіуатавєе!йа, Котадагїаеї!а і ОеккКега.

В деяких варіантах штам дріжджів вибирається з Кіпумеготусе5 ІПептоїоїегапв,

Кінулеготусев Іасіїє, Тогшазрога аеїбгиескКії, 7удозасспаготусез Ваїйїй, 5сНігозасснаготусев ротбе, зидіуатаєпйа Ідпопаріапзо, Котадаїаєїйа равзіогіз, Котадаїаеїйа рпапйії і Сапаїда діабгага.

Найбільш переважно він належить до Засспаготусев, зокрема до Засспаготусез сегемізіає зЗасспаготусев рауапив, засспаготусез рошагаїй або Засспаготусезх рагадохив5.

Рекомбінантні дріжджі можуть бути гаплоїдними або диплоїдними, переважно диплоїдними.

В якості альтернативи дріжджові клітини також можуть бути анеуплоїдними або поліплоїдними клітинами.

Згідно до переважного варіанта, рекомбінантні дріжджові клітини є стійкими до стресу.

Переважно, щоб дріжджові клітини були диплоїдними дріжджовими клітинами, оскільки диплоїдні дріжджі часто більш стійкі до стресу і більш живучі. Дріжджі також переважно видалити із стресових умов, як-от високий рівень цукру у середовищах, як-от фруктовий сік або сік цукрового очерету або видалений шляхом адаптивної лабораторної еволюції (АГЕ) з використанням селективного тиску для еволюційної інженерії, як наприклад описано у СакКаг 2.Р. та ін. (ЕЕМ5 Уеавбі Кев5. 12, 2012, 171-182). Еволюційна інженерія включає більш систематичний підхід повторюваних серій культивацій, виконуваних за наявності селективного тиску або, альтернативно, тривалих культивацій у хемостаті, виконуваних у селективних умовах. Ці культивації можуть бути виконані з дикого типу або, щоб збільшити генетичне різноманіття, з хімічно або фізично мутованих штамів. Спонтанний або індукований мутагенез вихідної моноколоніальної популяції призводить до формування привабливих варіантів у вихідній моноколоніальній популяції внаслідок селекційного тиску, який чиниться протягом культивацій. Ці привабливі варіанти можуть вижити і краще рости, ніж вихідні клітини за умов селекції. Таким чином, в хемостатних або серійних періодичних культурах відношення числа привабливих клітин до загальної кількості клітин у культурі буде періодично збільшуватися, і в культурі будуть домінувати привабливі клітини (СакКаг, 2012, Зацег 0 (2001), Адм Віоснет Епд

Віотесппо! 73: 130-166.).

У конкретному варіанті дріжджові клітини можуть бути попередньо культивовані або

Зо культивуватися, принаймні у 50, 60, 70, 80 90, 100 або більше поколінь за умов стресу перш ніж клітини будуть передані для посіву ферментації і виробничої ферментації. Зазначеними стресовими умовами можуть бути, але не обмежуються ними, висока концентрація цукру, зокрема, концентрація сахарози або глюкози, обмеження цукру, азотне виснаження, сульфіт, низький рівень рН, гіперосмотичний вплив зумовлений високою концентрацією розчиненої речовини, гіпоосмолярність, окислювальний стрес зумовлений аеробіозом і анаеробіозом, гідростатичний тиск, збільшення концентрації оцтового альдегіду і етанолу, внутрішнє окислювання, голодування, термічний стрес, тобто культивування поза оптимальної температури близько 25-30 "С.

Конкретні умови стресу для клітин дріжджів створюють за збільшеної концентрації глюкози.

Конкретно концентрація глюкози може становити близько 110 г/л, 120 г/л, 130 г/л, 150 г/л, 160 г/л і більше.

Згідно варіанта здійснення винаходу, зазначені рекомбінантні стійкі до стресу диплоїдні дріжджові клітини генетично модифіковані, як описано нижче. Конкретні зазначені клітини толерантні до глюкози і мають більш високий темп росту ніж батьківський штам, якщо обидва вирощувалися в такому самому середовищі.

Штам Засспаготусе5 сегемізіае доступний з різних джерел, включаючи, але не обмежуючись ними, колекції Американських типів культур (Роквіл, штат Меріленд),

СепігааІритеаи моог Зспіттвісийиге5 (СВ5) ЕРипдаї! Віодімегезйу Сепіге, І езЗайте, Сеп 5ігапа АВ,

Еегт Боїішіоп5, Могій Атегісап Віоргодисів, Магігех і І айетапа. Штам 5. Сегемівіає входить до складу дріжджів, але не обмежений ними ВУ4741, СЕМ.РК 113-70, ЕтШапо! ВедФ дріжджі, Віо-

ЕептФ ХК дріжджі, Сегі 5ігапа Ргезіїде Ваїсп Тигро спиртові дріжджі, Зегії 5ігапа Рої різіШеге дріжджі, Сегі 5Зігапа різіШеге Тигро уеазі, РегМах"мМ Зелені дріжджі, РегмМах"м Золоті дріжджі,

ТпептозасефФ дріжджі, СКЕ180, ВО-1, РЕ-2, САТ-1, СВ51585, СВ52910, Св57833, СВ57834, 7835, СВ57836, СВ57837, СВ57838, 7839, СВ57840, СВ57959, СВ57960 та СВ57961, СВ57962,

Св59562, СВ59563, СВ59564, 2859565, СЕМ.РК113-70, СІ ІВ215, СІ ІВ324, СІ ІВ382, ЕС1118,

ЕСО-8, РІ.100, РіІєївсптапп5 пекарські дріжджі, Бо5іег5В, Розієг5О, ЕУ, (3600, (351135, 114, І -01,

ІВ-2, ЧАУ291, УМ/У6147, КАУВ8, ІГАМ211, І іпадиівї 5672, М1-2, М13, М14, М2-8, М22, М32, М34,

М3707, М3836, М3837, М3838, М3839, М5, М5268, М52сМу, М8, МММ112, МИСІ 28177, М85,

МАМ34-40, МО-02, МАВ У-12632, ММ1308, Р283, РЗОЇ, РЕ-2, РМУ5, Е00О8, В103, Ней аг 60 пекарські дріжджі, ЕМ11-1А, 5228, 5288с, 50257, бБідта1278р, ЗК, Т7, 173, 005, ОЕМа А 905,

Міп13, МІ 3, М/303, М/ЕЗ72, У10, У12, 2209, 389, 9, УВ210, МОМ1004, МОМІ1005, МОМІТОО06,

МОМІ1978, МОМІТ083, МОМІ1094, мМОМІ1095, М)МІ1096, МОМІТ097, МОМІ1098, МОМІ1099,

МОМІ1100, МОМІ1101, МОМІ1102, МОМІ1103, МОМІ1104-МУ)МІ1122, МОМІ1124, М)МІ1125, МОМІ1129,

МОМІ1133, МОМІ1135, МОМІ1138, МмОМІ1139, М)МІ1140, МОМІ1141, МОМІ1142, МУОМІ1143,

МОМІ1144, МОМІ1145, МОМІ1146, М)МІ1178, МОМІ1190, МОМІ1199, мМуМмІ1202, МОМІ1208,

МОМІ1242, УОМІ1244, У)ОМІ1248, МОМІ1250, МОМІ1252, МОМІ1259, МОМІ1273, МОМІ1Т289,

МОМІ1292, УОМІ1304, МОМІ1307, МУОМІ1311, МОМІ1326, МОМІ1336, МОМІ1338, МОМІ1341,

МОМІ1342, МУОМІ1355, МОМІ1356, МОМІ1381, МмОМІ1383, МОМІ1385, МОМІ1386, МОМІ1387,

МОМІ1388, МОМІ1389, МОМІ1399, мМуОМ!І1400, МмОМІ1401, МОМІ1402, МОМІ1415, МОМІ1417,

МОМІ1418, МОМІТ1419, М)МІ1433, МОМІ1434, МОУМІ1439, МОМІ1443, МОМІ1447, МОМІ145, МОМІ1450,

МОМІ1460, МОМІ1463, МОМІ1477, МОМІ1478, МОМІ1479, МОМІ1526, МОМІ1527, МОМІ1549,

МОМІ1573, МОМІ1574, МОМІ1592, МОМІ1615, МУОУМ!189, МОМІ193, МОМІ195, МУОУМІ223, МОМ!І244,

МОМІ248, МОМІ269, МОМІ270, МОМІ271, МОМІ280, МОМІЗОВ8, МОМІЗ2О, МОМІЗ26б, МОМІЗЗ2, МОМІЗЗ9,

МОМІ421, МОУМІ428, МОМІ432, МОМІ434, МОМІ435, МОМІ436, МОМІ437, МОМІ439, МОМІ440, МОМІ450,

МОМІ451, МОУМІ453, МОМІ454, МОМІ455, МОМІ456, МОМІ464, МОМІ466, МОМІ467, МУМІ470, МОМІБ21,

МОМІБ525, МОМІБбЯ1, МОМІБ554, МОМІ555, МОМІБббО, МОМІбБ61, МОМІб27, МОМІбЗ34, МОМІ65З3, МОМІ669,

МОМІ6Є7О, МОМІб671, МОМІ6ЄТ72, МОМІб674, МОМІ6Є76, МОМІ677, МОУМІбЄ78, МОМІб81, МОМІбВ82, УОМІ6В8З,

МОМІбЄВ89, МОМІбОЗ, МОМІ789, МОМІВ10, МОМІВ811, МОМІВ1З3, МОМІ815, МОМІ816, МУОМІ936, МОМІЗ45,

МОМІ946, МОМІЗ9З47, МОМІ948, МОМІЗ9У49, МОМІ950, МУОМІЗ51, МОУМІ952, МОМІ953, МУМІ954, МОМІЗ955,

МОМІ956, МОУМІЗ957, МОМІ958, МОМІЗ959, МОМ!І960, МОМІ961, МОМІ962, МОМІ963, МУМІ964, МОМІЗ965,

МОМІ966, МОМІ967, МОМІ969, МОМІЗ9У72, МОМІ975, МОМІ9У78, МУОМІ981, МОМІЗ984, МОМІ987, МОМІЗ9ОО,

МУОМІЗ993, МОМІ996, МО5НІ, УРНАЗ9ОМ, МРБО1009, УРБ163, 27 ТМУ1.

У конкретному варіанті Засспаготусев5 сегемізіае є штамом СВ57962, СВ57959, СВ57960 або СВ57961.

У конкретному варіанті штам дріжджів може бути ауксотрофним для урацилу, лейцину, триптофану і/або гістидину. Зокрема, штам є ауксотрофним для ура, триптофану і його інактивації генів з такими кодами.

У варіантах здійснення винаходу також передбачена послідовна двоступенева система ферментації для одержання молочної кислоти з цукром, наприклад глюкози або сахарози в

Зо якості джерела вуглецю з використанням рекомбінантного штаму дріжджів, що складається з а) етапу посіву ферментації для одержання біомаси, на якій дріжджі культивують у поживному середовищі з рН від 5 до 7, а потім

Б) етапу виробничої ферментації, на якому виробляють молочну кислоту, і дріжджі вирощують на культурі клітин середовища з рН менше 3,5, а конкретно до кінцевого значення рН близько 3, точніше доки кінцеве значення рН близько 2,8, близько 2,7, близько 2,6, близько 2,5, близько 2,4, близько 2,3, близько 2,2, точніше доки кінцеве значення рН близько 2,1, при якому дріжджі відповідальні за гетерологічну активність лактату дегідрогенази (ІОН) і зменшили або нокаутували діяльність РОС.

Альтернативно, забезпечується двоетапна система забезпечення ферментації для вироблення молочної кислоти з цукрів, як-от глюкози або сахарози як джерела вуглецю з використанням штамів рекомбінантних дріжджів, яка складається з а) етапу посіву ферментації у першому біореакторі для одержання біомаси, в якій дріжджі культивують в поживному середовищі з рН від 5 до 7, а потім р) етапу виробничої ферментації у другому біореакторі інокульованого з посіву ферментації для виробництва молочної кислоти, на якому дріжджі культивують на клітинній культурі у середовищі з рН менше 3,5, а конкретно доки рН буде близько 3, більш конкретно доки рн близько 2,8, близько 2,7, близько 2,6, близько 2,5, близько 2,4, близько 2,3, близько 2,2, точніше доки рН близько 21, при якому дріжджі модифіковані для того щоб мати активність лактату дегідрогенази (ІОН) іабо зменшення активності пірувату декарбоксилази (РОС).

Крім того у додатковому варіанті здійснення об'єднання двох систем біореакторів для виробництва молочної кислоти з глюкозою в якості джерела вуглецю з використанням рекомбінантного штаму дріжджів, який складається з а) біореактор посіву для виготовлення біомаси, в якому дріжджі культивуються в культурному середови щі з рН 5 до 7, за яким використовують

Б) виробничий біореактор в який інокулюють посів ферментації і виробляють молочну кислоту, в якому дріжджі вирощують у культурі клітин в середовищі з рН менше 3,5, а конкретно на кінцеве значення рН близько З або менше, більш конкретно до рН близько 2,8, близько 2,7, близько 2,6, близько 2,5, близько 2,4, близько 2,3, близько 2,2, точніше до рН близько 2.1, бо при цьому дріжджі мають активність лактату дегідрогенази (ОН) і зменшують або б припиняють активність пірувату декарбоксилази (РОС).

Фігури

Фіг. 1: Відмінності в технологічному процесі з використанням молочнокислих бактерій у порівнянні з генетично модифікованими дріжджами у двоетапному процесі ферментації (процес винаходу).

Фіг. 2: Двоетапний процес ферментації розділений на вирощування біомаси і утворення молочної кислоти.

Детальний опис винаходу

Цей винахід забезпечує новий спосіб одержання молочної кислоти з використанням рекомбінантних дріжджів.

Молочна кислота(2-гідроксипропіонова кислота) являє собою органічну сполуку з формулою

СНСН(ОН) СОН. З гідроксильною групою суміжною з карбоксильною групою, молочна кислота класифікується як кислота альфа гідроксильна кислота (АНА). У своїй формі спряженої основи званої лактатом, яке відіграє роль у декількох біохімічних процесах.

У розчині, вона може іонізувати протон карбоксильної групи, утворюючи лактат іон

СНСН(ОН)СО»-. Порівняно з оцтовою кислотою, її рКа є на одну одиницю менше, що означає молочна кислота втрачає протон у десять разів легше, ніж оцтова кислота. Ця більш висока кислотність є наслідком внутрішньо молекулярного водневого зв'язку між а-гідроксильною і карбоксилатною групами.

Молочна кислота хіральна, і складається з двох оптичних ізомерів. Молочна кислота найпростіша гідроксильна кислота, яка є оптично активною. І(ж)-молочна кислота може одержане безпосередньо без Ю(-)-молочної кислоти шляхом ферментації (наприклад, відомим хімічним синтезом виробляють рацемічні суміші обох ізомерів). Також О(-)-молочна кислота може бути вироблена шляхом ферментації без | (ї)-молочної кислоти. Відомо, що І (ж)-молочна кислота або (5)-молочна кислота та її дзеркальні відображення, Д(-)-молочна кислота або (В)- молочна кислота. Суміш цих двох кислот у рівних кількостях називається ОіІ-молочною кислотою.

Молочна кислота гігроскопічна. ОІ -молочна кислота змішується з водою і з етанолом вище своєї точки плавлення яка становить близько 17 або 18 "С. Ю-молочна кислота та І-молочна

Зо кислота мають більш високу точку плавлення.

Термін "культурне середовище" стосується до твердого або рідинного середовища, яке містить достатньо поживних речовин, включаючи цукор, але не обмежуючись ними, глюкозу або сахарозу як джерело вуглецю, на якому можуть рости рекомбінантні дріжджі. У хемостаті, середовищем з періодичним живленням або періодичними культурами є рідина.

Терміни "етап посіву ферментації" і "етап розвитку інокуляції", які використовуються в цьому документі, стосуються до забезпечення умов культивації, за яких рекомбінантні дріжджі вирощуються з високою щільністю і, які можуть бути використані для інокуляції етапу виробничої ферментації. Таким чином, посівна ферментація здійснюється за умов, опгимальних для росту рекомбінантних дріжджів (фаза росту біомаси).

Посів ферментації проводиться за рН від 5,0 до 7,0, зокрема, рН становить близько 5,0.

Необов'язково, перший етап обмежений концентрацією глюкози або сахарози (наприклад, менше 10 г/л, переважно менш 5 г/л, більш переважно менше 2 г/л). Глюкоза або сахароза використовуються тут в якості основного джерела вуглецю для посіву ферментації, зокрема, вміст глюкози у середовищі посіву ферментації при інокуляції становить від 10 до 25 г/л, зокрема від 15 до 25 г/л, більш конкретно близько 20 г/л.

Низька концентрація глюкози в цьому контексті означає менше 10 г/л глюкози для вирощування, зокрема менше 5 г/л, зокрема менше 2 г/л.

Як альтернатива можуть застосовуватися інші джерела вуглецю, наприклад, але не обмежуючись ними, цукри, які одержані з лігноцелюлози, гідролізати лігноцелюлози, ксилоза, арабіноза, маноза, галактоза або фруктоза або будь-які їх суміші.

Далі забезпечується джерело азоту.

Посів ферментації можна спеціально виконати як процес або періодичний поживний процес, переважним є періодичний поживний процес.

За умов періодичного живлення, періодична культура працює до повного або майже повного споживання глюкози і етанолу перш ніж свіже середовище подається в культуру. Переважно поживне середовище містить високі концентрації глюкози або сахарози, а конкретно між 20 г/л і близько 500 г/л дріжджі культивують на швидкості потоку достатньої, щоб підтримувати певні темпи росту на критичному рівні, який визначається штамом і може бути визначений за допомогою попередньої культивації в хемостаті. Якщо швидкість росту перевищує критичне бо значення, дихальна здатність дріжджів буде перевищена і ферментація субстрату буде відбуватися навіть за присутності кисню. Підтримання специфічної швидкості росту на критичному значенні забезпечує високий вихід біомаси спожитий субстрат без утворення побічних продуктів, як-то етанол, лактат, гліцерин і ацетат.

Висока концентрація цукру в цьому контексті означає 10 г/л цукру, зокрема 20 г/л цукру або більше для культивації.

Висока концентрація глюкози в цьому контексті означає 10 г/л глюкози, зокрема 20 г/л глюкози або більше для культивації.

Висока концентрація сахарози в цьому контексті означає 10 г/л сахарози, зокрема 20 г/л сахарози або більше для культивації.

Переважно, щоб етап посіву ферментації був аеробним.

В деяких варіантах контрольований параметр збільшення біомаси може бути обраний з групи, яка складається з респіраторного фактора (КО), питомої швидкості поглинання кисню, питомої швидкості еволюції вуглекислого газу, рН, рівня біомаси, питомої швидкості росту, парціального тиску кисню (рог), швидкості тепловиділення, питомої швидкості виробництва побічних продуктів і їх комбінацій.

Швидкість тепловиділення може бути оцінена за швидкістю тепловідведення за даними охолоджувача, як-от витрата охолоджувального потоку і/або температура на вході і виході з охолоджувача.

В деяких варіантах, в яких контрольованим параметром є концентрація побічних продуктів, побічний продукт обраний із групи, яка складається з ізо-бутерату, ізомасляної кислоти, дигідроксиіїзовалерату, кетоіїзовалерату, ізобутиратдегідрату, лактату, ацетолактату, ацетату, форміату, гліцерину та їх комбінації.

Питома витрата еволюція двоокису вуглецю (СЕК, ммоль/г/год.) та питома швидкість споживання кисню (ОК, ммоль/г/год.-) можуть бути розрахована шляхом вимірювання швидкості потоку, вхідних і вихідних газових композицій повітря (СО, 02 тощо), використовуючи, наприклад, мас-спектрометрію і/або вимірювання густини клітин. Питома швидкість виділення вуглекислого газу - це відношення виробленого вуглекислого газу (швидкість повітряного потоку, помножена на різницю між вихідною і вхідною концентрацією вуглекислого газу) до густини клітин за одиницю часу. Питома швидкість поглинання кисню - це

Зо відношення спожитого кисню (швидкість повітряного потоку, помножена на різницю між концентрацією кисню на вході і виході) до густини клітин. В деяких варіантах ОШК вимірюється безпосередньо, наприклад, шляхом аналізу вихідних газів. В деяких варіантах СЕК вимірюється безпосередньо, наприклад, шляхом аналізу вихлопних газів.

В деяких варіантах точка відліку ОШЕ. у процесі росту біомаси фази становить від близько 2 до близько 10, від близько 2 до близько 9, від близько 2 до близько 8, від близько 2 до близько 7, від близько 2 до близько 6, від близько 2 до близько 5, від близько 2 до близько 4, або від близько 2 до близько 3, від близько З до близько 10, від близько З до близько 9, від близько З до 8, від близько З до близько 7, від близько З до 6, або від близько З до близько 5 ммоль на грам клітин на годину (ммоль/(г клітин х год.)).

У деяких варіантах точка відліку СЕК під час фази росту біомаси становить від близько 1 до близько 10, від близько 1 до близько 9, від близько 1 до близько 8, від близько 1 до близько 7, від близько 1 до близько 6, від близько 1 до близько 5,5, від близько 1 до близько 4, від близько 1 до близько 3, від близько 2,5 до близько 10, від близько 2,5 до близько 9, від близько 2,5 до близько 8, від близько 2,5 до близько від близько 2,5 до 5, від близько 2,5 до близько 4, від близько 2,5 до близько 3, від близько 2 до близько 10, від близько 2 до близько 9, від близько 2 до близько 8, від близько 2 до близько 7, від близько 2 до близько 6, від близько 2 до 5, від близько 2 до близько 4, або від близько 2 до близько З ммоль/(г клітин х год.).

Респіраторний фактор (КО) - це відношення СЕК до ОШК. Для розрахунку КО за заданої постійної швидкості потоку повітря необхідна лише мас спектрометрія складу газу на вході і виході. КО використовують як контрольований параметр який об'єднує швидкість споживання кисню з потоком вуглецю через систему біореактора. КО внутрішньо не залежить від масштабу.

КО можна виміряти, наприклад, за допомогою аналізу вихідних газів.

Конкретні швидкості росту можуть бути оцінені за щільністю клітин або ОЮОвоо даними або побічно за даними ОШК з емпіричної моделі.

В деяких варіантах, точка відліку КО під час фази росту біомаси становить від близько 0,5 до близько 5, від близько 1 до близько 5, від близько 2 до близько 5, від близько З до близько 5, від близько 2 до близько 4, від близько 2, до близько 3, від близько 3, до близько 4, від близько 0,5 до близько 5, від близько 0,7 до близько 5, від близько 0,9 до близько 5, від близько 1,2 до близько 5, від близько 1,4 до близько 5, від близько 1,6 до близько 5, від близько 1,8 до близько 60 5, від близько 2,2 до близько 5, від близько 2,4 до близько 5, від близько 2,6 до близько 5, від близько 2,8 до близько 5, від близько 3,2 до близько 5, від близько 3,4 до близько 5, від близько 3,6 до близько 5, від близько 3,8 до близько 5, від близько 4,2 до близько 5, від близько 4,4 близько 5, від близько 4,6 до близько 5, від близько 4,8 до близько 5, від близько 0,5 до близько 4, від близько 0,7 до близько 4, від близько 0,9 до близько 4, від близько 1,2 до близько 4, від близько 1,4 до близько 4, від близько 1,6 до близько 4, від близько 1,8 до близько 4, від близько 2,2 до близько 4, від близько 2,4 до близько 4, від близько 2.6 до близько 4, від близько 2,8 до близько 4, від близько 3,2 до близько 4, від близько 3,4 до близько 4, від близько 3,6 до близько 4, від близько 3,8 до близько 4, від близько 0,5 до близько 1,5, від близько 0,6 до близько 1,5, від близько 0,65 до близько 1,5, від близько 0,67 до близько 1,5, від близько 0,7 до 1,5, від близько 0,75 до близько 1,5, від близько 0,8 до близько 1,5, від близько 0,9 до близько 1,5, від близько 0,5 до близько 1,2, від близько 0,6 до близько 1,2, від близько 0,65 до близько 1,2, від близько 0,67 до близько 1,2, від близько 0,7 до близько 1,2, від близько 0,75 до близько 1,2, від близько 0,8 до близько 1,2, від близько 0,9 до близько 1,2, від близько 0,5 до 1.05, від близько 0,6 до близько 1,05, від близько 0,7 до близько 1,05, від близько 0,75 до близько 1,05, від близько 0,8 до близько 1,05, від близько 0,9 до близько 1,05, від близько 0,95 до близько 1,5, від близько 0,95 до близько 1,4, від близько 0,95 до близько 1,3, від близько 0,95 до близько 1,2, від близько 0,95 до близько 1,1 або від близько 0,95 до близько 1,05.

В деяких варіантах, параметр для керування збільшенням біомаси вибирається з групи, яка складається із швидкості живлення, складу живлення, витрати повітря, складу повітря, швидкості перемішування, тиску і їх комбінацій.

Згідно до винаходу, термін "Слизько" включає відхилення числового значення максимум на 10 95, а конкретно максимум на 5 95, точніше максимум на 1 95. Наприклад, термін "близько 10 мкг", означає діапазон від 9 до 10 мкг, зокрема від 9,5 до 10,5 мкг, зокрема від 9,9 до 1,1 мкг.

Термін "етап виробничої ферментації", який використано тут, стосується забезпечення умов культивації за яких молочна кислота вироблена рекомбінантними дріжджами з кінцевим рН-З або менше, зокрема, може бути досягнуте кінцеве значення рН «2,9, «2,8, :2,7,:2,6, «2,5, 24,к2,3, «2,2, «2,15 або менше.

Виробнича ферментація у виробничому біореакторі ініціюється інокуляцією дріжджових клітин які одержані від посіву ферментації. Переважно, для інокуляції використовують дріжджові клітини з високою щільністю клітин, яка становить 25 г/л, переважно 210 г/л, »20 г/л, »30 г/л, 240 г/л, » 50 г/л. Кількість інокуляту може відігравати значну роль у визначенні показників ферментації.

Щільність дріжджових клітин для інокуляції або початку виробничої ферментації має бути як мінімум ОЮвоо-3, а бажано ОЮвоо близько 5, переважно ОЮвоо близько 6, переважно ОЮвоо близько 7, переважно ОЮвоо близько 8, переважно ОЮОвоо близько 9, переважно більше ОЮвоо до 10.

Виробниче середовище має високу концентрацію цукру, конкретно сахарози глюкози, фруктози, мальтози, галактози, гідролізованого крохмалю, концентрацію лактози для того, щоб забезпечити високі титри молочної кислоти. Переважно середовище додатково містить поживні речовини для того, щоб підтримати клітинний метаболізм за високої концентрації цукру, зокрема глюкози.

Термін "періодична культура" стосується самодостатньої культури мікроорганізмів, яка розвивається у фіксованому об'ємі поживного середовища, який постійно змінюється під дією росту організмів, поки він не стане не придатним для подальшого росту. У періодичній культурі всі поживні речовини, необхідні для мікробіологічного росту присутні у середовищі до початку культивації, за винятком молекулярного кисню при аеробній культивації.

Періодична культура росте до повного або майже повного вживання глюкози.

Середовище ферментації використовується для посівної ферментації і у виробництві молочної кислоти, ферментація може бути основним середовищем, яке складається в основному з глюкози або, як альтернатива, цукрози, принаймні, одного джерела азоту та води.

Джерелом азоту, яке використовується для засобу ферментації може бути, але не обмежене ними, сечовина, фосфат амонію, аміачна селітра, сульфат амонію.

Крім того, можуть бути додані інші солі, як-от фосфат монокалію, сульфат магнію, сульфат міді, хлорид заліза, марганець, сульфат, молібдат натрію, сульфат цинку, біотин, інозитол і тіамін.

Зокрема, основа середовища може бути доповнена мінімальними розчинними солями, обраними з (МНА)2505, КНгРО», Ма5О-7НеО, вітамінним розчином і залишковими елементами.

Корисні вітамінні розчини можуть містити, наприклад, О-біотин, Са-О-пантотенат, нікотинову кислоту, міо-інозитол, гідрохлорид тіаміну, піридоксаль гідрохлорид і Р-амінобензойну кислоту. бо Корисними мікроелементи можуть бути Маг2ЕЮОТА, 7п504:7НгО, МпсСі»:2Н2О, СосСі»- бно,

бивО:5НгО, МагМоО4:2Н2О, Сасі»:2Н2О, Бе5О0.:7Н2О, НзВоз, КІ.

Інші умови ферментації, як-от температура, щільність клітини, вибір субстрату(ів), вибір поживних речовин і подібні взагалі обираються для того, щоб забезпечити економічність процесів. Переважна температура, зокрема під час фази виробництва становить від 25-45" С, конкретно близько 30 "С.

У середовище може бути доданий буферний розчин або основа, щоб підтримати або відрегулювати рн.

У середовище може бути доданий буферний розчин або рН може бути відрегульований шляхом додавання агентів під час етапу посіву ферментації так, що рН буде відрегульований або утриманий в межах від близько 3,5 до близько 9,0, конкретно від близько 4,5 до близько 7,0, більш конкретно від близько 5,0 до близько 7,0.

Будь-який відповідний буферний розчин відомий кваліфікованому фахівцю і може бути використаний, зокрема буферний фосфатний розчин.

Придатні агенти для регулювання переважного значення рН це основні матеріали, які містять, наприклад, гідроксид кальцію, карбонат кальцію, гідроксид натрію, гідроксид калію, карбонат калію, карбонат натрію, карбонат амонію, аміак, гідроксид амонію, або гідроксид магнію тощо. Також придатні буферні агенти, які використовуються у звичайних процесах ферментації.

Переважно, дозволити значенню рН на етапі виробничої ферментації зменшувався від початкового рН зазвичай 5,5 або більше, до рКа або менше його значення у кислоти ферментованого продукту, наприклад в діапазоні від 1,5 до 3,5, зокрема, в діапазоні від 1,5 до 3,0 або в діапазоні від 1,5 до 2,5.

Альтернативно, рН на етапі виробничої ферментації підтримувався на або нижче рівня рКа молочної кислоти під час процесу. Тому, рН ферментаційного середовища регулюється до рівня рКа або нижче молочної кислоти до або на початку процесу виробничої ферментації, і утримується на цьому рівні під час виробничої ферментації. В цьому конкретному варіанті переважно утримувати рнН в діапазоні від 1,5 до 3,5, переважно в діапазоні від 2,0 до 3,0.

У конкретному варіанті виконання це кінцеве значення рН середовища виробничої ферментації менше 5, зокрема, «4,5, зокрема, «4, зокрема «3,5, зокрема «3, зокрема «2,5, зокрема «2,15.

Виробнича ферментація може бути зокрема виконана як поживний періодичний процес або періодичний процес, періодичний процес є переважним.

Відповідно до конкретного втілення, рН є меншим 5, зокрема, «4,5, зокрема, «4, зокрема«3,5, зокрема «3, зокрема «2,5, зокрема «2,15 і зберігається протягом всього етапу виробничої ферментації.

Згідно з наступним конкретним варіантом, рН менше або дорівнює 3 і зберігається протягом всього етапу виробничої ферментації. В альтернативному варіанті, рН має підтримуватися на рівні рН «2,9, «2,8, 52,7, :2,6, 52,5, х:2,4, 2,3, 2,2, «2,15 або менше.

Ферментація, процес ферментації або реакція ферментації і подібні терміни які використані тут, спрямовані на те щоб поєднати фазу росту і фазу біосинтезу молочної кислоти.

Як описано далі, у деяких варіантах біореактор може містити перший реактор для вирощування посіву і другий реактор для ферментації.

Терміни "біореактор' або "ферментер" згідно з винаходом відносяться до будь-якого пристрою або системи, яка підтримує біологічно активне середовище і містить ферментаційний пристрій, який складається з одного або декількох посудин і/або колон або трубопроводів.

Біореактори зазвичай, циліндричні, різних об'ємів від літрів до кубічних метрів і часто виготовлені з нержавіючої сталі, в своєму складі вони мають реактор з безперервно перемішуваним баком (С5ТК), реактор з барботажною колоною (ВС) або реактор із зрошуваним шаром (ТВК), або іншу посудину або інший прилад придатний для роботи в контакті газ-рідина. На підставі режиму діяльності, біореактор може бути класифікований як періодичний, з періодичним живленням або безперервний (наприклад, модель з безперервно перемішуваним баком). Прикладом безперервного біореактора є хемостат.

Як вже згадувалося вище, посівна і виробнича ферментації можуть здійснюватися в окремих біореакторах. Тому біореактор може містити, перший реактор для вирощування посіву, в якому культивуються рекомбінантні дріжджі, і другий, реактор виробничої ферментації до якого подається інокулят дріжджів з реактора для вирощування і в якому виробляється більшість молочної кислоти.

Первинний або перший, або реактор для посіву ферментації, використовуваний в цьому документі, може також містити один або декілька реакторів, з'єднаних послідовно паралельно із 60 вторинним біореактором виробничої ферментації.

Щільність інокуляту для інокуляції у виробничому ферментаційному біореакторі переважно становить ОЮОвоо 2 3.

Вторинний виробничий ферментаційний біореактор, який використовується в цьому документі, може містити будь-яку кількість додаткових біореакторів, які можуть бути з'єднані послідовно або паралельно з первинними біореакторами. Будь-який з цих додаткових біореакторів може бути підключений до подальшого сепаратора.

Витяг молочної кислоти з середовища ферментації з низьким рН може проводитися методами, відомими досвідченому фахівцю. Очищення може здійснюватися відомими методами, наприклад, центрифугуванням, фільтрацією, як-от мікрофільтрація, ультрафільтрація, нанофільтрація, рідинна екстракція, кристалізація, хроматографія тощо.

В деяких варіантах виробництва ферментація призводить до виробництва молочної кислоти більше 500 ммоль, переважно більше 60 г/л, більше 80 г/л, більше 100 г/л, більше 120 г/л.

Корисний для способу винаходу штам рекомбінантних дріжджів має активність лактату дегідрогенази завдяки одному або кільком гетерологічним генам ГОН і додатково зниженою або нокаутованою активністю піруват декарбоксилази.

У цьому винаході "гетерологічний" або "інорідний" стосовно до будь-якого генетичного матеріалу, означає, що генетичний матеріал не є рідним для клітини-господаря.

Термін "ген" стосується хромосомної ДНК, плазмідної ДНК, синтетичної ДНК, комплементарної ДНК або іншої ДНК, яка визначає пептид, поліпептид, білок або молекулу

РНК, а також області фланкування кодувальної послідовності, яка бере участь у регуляції експресії.

Термін "мутація" означає будь-яку зміну або перебудову у послідовності нуклеїнової кислоти. Існує декілька типів, включаючи точковий, рамковий зсув і вирізання. Мутація може бути виконана спрямованим або випадковим чином.

Термін "плазміда" стосується циркулярної, екстрахромосомної, необов'язково самовідтворюваної частини ДНК.

Термін "геном" охоплює як хромосомуци), так і плазміди в клітинах рекомбінантних дріжджів.

Термін "лактат дегідрогеназа" стосується білка (наприклад, ферменту), який каталізує перетворення пірувату на лактат.

Зо Термін "І--лактат дегідрогеназа" стосується ферменту, який каталізує перетворення пірувату на І -лактату, зокрема, він класифікується як ЕС 1.1.1.27.

Термін "О-лактат-дегідрогеназа" стосується ферменту, який каталізує перетворення пірувату на О-лактату, зокрема, він класифікується як ЕС 1.1.1.28.

Термін "ген ГОН" стосується гену відповідального за експресію продуктивності білка який має активність лактату дегідрогенази. Ген ГОН як використано в цій патентній заявці може означати будь-який ген який, при експресії, виробляє протеїн і має активність лактату дегідрогенази. Гени лактату дегідрогенази можуть бути стереоспецифічними. Тобто ген лактату дегідрогенази може каталізувати реакцію з утворенням лише І-лактату або лише ЮО-лактату.

Інший лактат дегідрогенази каталізує реакцію виробництва як І -, так і О-лактату. Ген І -лактат дегідрогенази каталізує перетворення пірувату на І! -лактат.

Відповідні гени ГОН включають, але не обмежені такими, які одержані від бактеріальних, грибкових, дріжджових джерел або від ссавців. Прикладами І ОН генів, є гени одержані від Ї.

Пеїмеїсив, І. сазеї, В. тедаїегішит, В. вівагоїпенторніи5, В. соадшапв, ГІ. айоїїмогапв, Ї. гецшіе!і,

Оеєпососсив овпії, Воз їайгив, Р. асіайасіїсі, І асіорбасіїив5 ріапіагит, Г. іопп5опії, С. риїдагісив, Ї. аеїбгоиескії, С. ріапіагит та ГГ. репіозиз. Переважно, кодувальний ензим ГОН є незалежним бісфосфату фруктози, як І-І ОН від Г.. ріапіагит.

Прикладами конкретних Г-ГОН генів є гени одержувані від І асіорасшШив5 ріапіагит, І.

Пеїмеїїси5, І. сазеї, В. тедаїегішт, В. 5іеагоїйегт, В. їаийги5, Р. асіайасіісіта людських або яловичих джерел.

Прикладами конкретних Ю-ГОН генів є гени одержувані /. Пеїмеїїси5, Г. (|оппзопії, Ї. риїдагісив, Г.. аеїІргиескії, Г. ріапіагит апа Г. репіози5. Придатними є функціональні гени, які є ідентичними або, принаймні, на 80 9», 85 95, 90 95 чи 95 95 гомологічними до будь-яких з цих І-

ІОН або 0-ІГ ОН генів. Нативні гени, одержані з будь-якого з цих джерел, можуть бути піддані мутагенезу, за необхідності, для забезпечення кодувальної послідовності починаючи з еукаріотичного вихідного кодону (АТО).

Відсоток ідентичних ДНК, РНК або іншого генетичного матеріалу і послідовностей амінокислот білка може бути обчислений за допомогою програмного забезпечення ВІ А5ЗТ або зтагВГА5Т з типовими параметрами.

Рекомбінантні дріжджові клітини можуть містити один ген ГОН або декілька генів ІОН, 60 наприклад, від 1 до 10 генів ІОН, конкретно від 1 до 5 генів ГОН. Коли трансформовані дріжджі містять кілька генів ІОН, окремі гени можуть бути копіями одного і того ж гена або містити копії двох або більше різних генів І ОН. Множинні копії екзогенного гена І ОН можуть бути інтегровані в одному локусі, тому вони суміжні один з одним або у декількох локусах у геномі дріжджів.

Екзогенний ген ГОН знаходиться під транскрипційним контролем одного або декількох промоторів і одного або декількох термінаторів, обидва з яких є функціональними в модифікованій дріжджовій клітині.

Використовуваний у відповідності з винаходом термін "промотор" стосується нетранскрибованої послідовності, розташованої проти хода транскрипції (тобто 5") до вихідного кодону трансляції структурного гена (зазвичай в межах від 1 до 1000 рр, переважно 1-500 Бр, переважно 1-100 Бр), яка контролює початок транскрипції структурного гена.

Термін "послідовність термінації" стосується нетранскрибованої послідовності розташованої за напрямком транскрипції (тобто, 3") до кінцевого кодону трансляції структурного гена (взагалі у межах близько від 1 до 1000 рр, більш типово 1-500 рр базових пар і особливо 1-100 базових пар) і контролює кінець транскрипції структурного гена.

Промотор або термінатор "оперативно зчеплений" зі структурним геном, якщо його положення в геномі відносно положення структурного гена таке, що промотор або термінатор, в залежності від випадку, виконує свою функцію контролю транскрипції.

Промоторні і термінаторні послідовності можуть бути нативними або екзогенними для рекомбінантних дріжджових клітин за винаходом.

Особливо придатні ОН гени, які включають такі, що кодують ензим з амінокислотною послідовністю, яка ідентична, щонайменше, на 60 95, переважно, щонайменше на 80 95, 85 95 або 95 95 у порівняні з ОпіРгоїєКкВ-Р5О6512 (І ОНІ ГАСРІ), ЗЕО ІО Мо. 1:

М55МРМНОКУМІ Ма раАМавзВМАБРАМАСОСІАЕЕРМІМОУУКОовАТКарА ОЇ ЕВАОАЕТАРККІ

УБОЕМБОСКОАВІ УМІТАВАРОКРОЕЗНВІ ОЇ ММКМІ МІ 55ІМКРУМОЗаРОраїІвРІї МААМРУМОІ ТМАТ

МКЕЗагРКОВУІаЗИаИтТ51 Ю558І ВМАГ ЕКОЕММОРАЗМВАМІМСЕНОИОЗЕРААХУЗТАТІСТАРУВОМ

АКЕОСУ5ОЕОІ АКГЕВЕУМАМКАМОПМІ КЕАТЕМСИтаТА!І МАІЗКА АСЕМАМІ РУСАУМОСЮМИЇ М

РІМІЖТРАМІСОС ТОЇ КОПЕЗРІ БАЮЕЇ ККМО ОЗААТІ ККМІ МОСІ АБ ЕМК.

Використання промоторів і термінаторів нативних дріжджових клітин разом із відповідними фланговими областями, розташованим проти і за ходом транскрипції, уможливлює

Зо цілеспрямовану інтеграцію гена ГОН у конкретні локуси геному дріжджів, а також для одночасної інтеграції гена І ОН і делеції або деструкції іншого нативного гена, як-от, наприклад, гена РОС.

Якщо у дріжджову клітину вводяться декілька екзогенних генів ГОН, можливо, що різні гени

ГОН знаходяться під контролем промоторів і/або термінаторів різних типів.

Екзогенний ген ГОН може бути випадково інтегрований в геном дріжджів або вставлений в одну або декілька цільових позицій. Приклади цільових місць включають локус одного або декількох генів, які бажано видалити або зруйнувати, як-от гени РОС або МТНІ.

Терміни "делеція" і "порушення" стосуються видалення всієї кодувальної області гена або модифікації відповідної області промотора і/або термінатора, наприклад шляхом делеції, вставки або мутації, так що ген або не експресує білок або активну версію білка, або виробляє ензим зі значно зниженою активністю. Делеція або порушення можуть бути виконані методами генної інженерії, примусової еволюції або мутагенезу з подальшою відповідною селекцією або скринінгом для ідентифікації бажаних мутантів.

Крім того рекомбінантні дріжджі відповідні винаходу мають додаткові генетично- модифіковані гени РОСІТ, РОС5 і/або РОСб, наприклад, їх делеція або порушення, тим самим знижуючи здатність дріжджів виробляти етанол.

Гени РОС1 ї РОС5 активні під час ферментації глюкози, причому експресія гена РОС1 приблизно у в шість разів сильніша, ніж у гена РОС5. Експресія гена РОСб слабка і, мабуть, індукується в середовищі етанолу.

Зокрема, рекомбінантні дріжджі є піруват декарбоксилазо негативними або не активними або мають послаблений дріжджовий штам або не мають відчутної активності піруват декарбоксилази, і не ростуть або проявляють порушення росту в аеробних умовах на глюкозі як одного джерела вуглецю у синтетичному поживному середовищі і не можуть виробляти помітну кількість етанолу (наприклад, менше, ніж близько 1 мг/кг) при вирощуванні в аеробних умовах у мінімальному середовищі.

Зокрема, один, два або всі гени РОСІ, РОС5 і РОСб функціонально нокаутовані або видалені. Зокрема, у рекомбінантного штаму дріжджів не вистачає обох алелів РОС1, РОС5 і

РОСб.

Альтернативно, один, два або всі гени РОС1І, РОС5 і РОСб умовно експресивні завдяки бо контролю конститутивних умовних/індукційних промоторів, тобто промоторів які знижують або підвищують експресію гена за визначених умов або при додаванні обраних поповнень. У конкретному варіанті здійснення умовні промотори є глюкозо-репресивними. В іншому конкретному варіанті здійснення умовні промотори залежать від рН, переважно активні якщо рн »5, але неактивні якщо рН «4. У конкретному варіанті умовні промотори НХТ генів, зокрема генів НХТ2, НХТА, НХТІ або НХТ7.

Прикладами придатних конститутивних промоторів є промотори гліколітичних ензимів.

Прикладами таких гліколітичних промоторів є промотор ТРІЇ (промотор триозофосфату ізомерази 1, ТОНЗ (САРН, глицеральдегид-3-фосфат дегідрогенази), промотор РОКІ (3- фосфоглицерату кінази) і промотор РОЇ фосфоглюкозиізомерази).

Засспаготусев сегемізіае має 20 генів, які кодують білки, аналогічні глюкозі (гексозі) транспортери (НХТІ у НХТ17, САІ2, 5МЕЗ та ВСИТ2). Ці білки Нхі належать до головного посередника суперродини (МЕ5) транспортерів. Білюим МЕ5 транспортують свої субстрати шляхом пасивної, енергонезалежної полегшеної дифузії при зменшенні градієнта концентрації глюкози. Генами транспортерами гексози є НХТІ1, НХТ2, НХТЗ, НХТа., НХТ5, НХТв, НХТ7, НХТВ8,

НХТте, НХТ10, НХТ11, НХТ12, НХТ13, НХТ14, НХТ15, НХТ16, НХТ17, САІ 2, ЗМЕЗ і КОТ, проте будь-які інші ще невідомі гени, які кодують транспортну систему гексози є також корисними для дріжджів охоплених цим документом.

Згідно із одним з варіантів, один або декілька з перерахованих вище генів транспортера гексози гіперекспресують з використанням гетерологічних конститутивних або індукційних промоторів.

Згідно з подальшим варіантом, дріжджі містять функціональну делецію гена МТНІ або

ЗТО1. Згідно з іншим варіантом, дріжджі містять гіперекспресію гена МТНІ. Білок 51 модулює експресію регульованих глюкозою генів і здогадно взаємодіє із сенсорами глюкози 5піЗ і Ка.

Передбачається, що гомологія 5141, МІйї має взаємодіяти з ЗпіЗ, а не з Коді2. Генетичні взаємодії між 501, МТНІ, 5МЕЗ і ВОТ2 припускають, що сигналізація глюкози опосередковується, принаймні частково, через взаємодію продуктів цих генів. У середовищах бідних на глюкозу або з низькими рівнями глюкози, гени транспортера гексози змінюються для пригнічення за допомоги механізму який потребує білків 511 і МЕН.

Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу, ген МТНІ містить, щонайменше,

Зо часткову делецію, що призводить до недостатньої функціональності продукту експресії гена.

Особливо корисним для способу описаного в цьому документі є рекомбінантний штам диплоїдних дріжджів, переважно Засспаготусев5 сегемізіає, який має функціональну делецію генів РОС1, РОС5 ії РОСб, функціональну делецію гена МТНІ, гіперекспресію гена НХТІ і, щонайменше, одного гетерологічного гена І ОН.

Використовуваний тут, термін "гаплоїд" стосується гаплоїдних клітин дріжджів, які мають одну копію кожної хромосоми, тобто один набір непарних хромосом.

Використовуваний тут, термін "диплоїд" стосується диплоїдних дріжджових клітин, які мають дві гомологічні копії кожної хромосоми. У диплоїдному стані кількість гаплоїдів подвоюється, тому ця умова також відома як умова 2п. "Гомологічні хромосоми" або "гомологічні копії кожної хромосоми" означають, що хромосоми мають однакові гени в одних і тих самих локусах, в яких вони забезпечують точки вздовж кожної хромосоми, які дозволяють парі хромосом правильно вирівнюватися одна з одною. Однак хромосоми (і гени) не обов'язково ідентичні. Один і той самий ген може бути закодований двома різними алелями. Алель є різновидом даного гена.

Поліплоїдія стосується клітин, що містить більше двох парних гомологічних наборів хромосом, тобто стосується числової зміни всього набору хромосом.

Поліплоїдія - це стан, в якому клітини мають декілька наборів хромосом за межами базового набору, зазвичай З або більше.

Анеуплоїдія - це наявність аномальної кількості хромосом в клітині, наприклад, стан, в якому одна або декілька хромосом нормального набору відсутні або присутні в більш ніж звичайній кількості копій. На відміну від еуплоїдії, анеуплоїдні каріотипи не кратні гаплоїдному числу. Анеуплоїдія описує стан, в якому значні частини однієї або декількох хромосом відсутні або присутні в більшій кількості копій, ніж зазвичай.

Диплоїдні дріжджові клітини, як описано тут, здатні виробляти вільну молочну кислоту у кількості 80 г/100 г глюкози або більше за дуже низького рн, тобто навіть нижче 2,5.

Цей винахід включає в себе наступні пункти: 1. Спосіб одержання молочної кислоти в рекомбінантній дріжджовій клітинній культурі з використанням цукру, зокрема глюкози або сахарози в якості джерела вуглецю, який включає: а) етап посіву ферментації для одержання біомаси, на якому дріжджі культивують у 60 поживному середовищі з рН від 5 до 7, а потім р) етап виробничої ферментації з біомасою від етапу ферментації для одержання молочної кислоти, на якому дріжджі культивують у культурному середовищі з рН «5, причому зазначені дріжджі мають активність лактату дегідрогенази (ОН) і/або знижену активність піруват декарбоксилази (РОС). 2. Спосіб за п. 2, в якому дріжджова клітина є диплоїдною, поліплоїдною і анеуплоїдною, зокрема, зазначену дріжджову клітину одержують шляхом селекції в умовах стресу і генетичної модифікації. 3. Спосіб за п. 1 або 2, в якому посівну ферментацію проводять при високій концентрації глюкози. 4. Спосіб за пунктами 1-3, в якому виробничу ферментацію проводять при низькій концентрації глюкози. 5. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-4, в якому молочну кислоту очищують звичайними виробничими процесами. 6. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-5, в якому молочну кислоту очищують від забруднень після етапу ферментації до чистоти не менше 90 95. 7. Спосіб за кожного з пунктів 1-6, в якому етап виробничої ферментації проводять з рН « 4,5, конкретно «4, конкретно «3,5. 8. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-7, в якому етап виробничої ферментації має кінцеве значення рН-З або менше, зокрема, кінцеве значення рН «2,9, «2,8, 2,7, 2,6, 52,5, 2,4, «2,3, «2,2, 2,1 або менше. 9. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-8, в якому етап посіву ферментації проводять в умовах періодичного живлення. 10. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-9, в якому етап виробничої ферментації проводять в умовах періодичного процесу. 11. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-10, в якому етап посіву ферментації і етап виробничої ферментації проводять в окремих біореакторах. 12. Спосіб за кожного з пунктів 1-11, в якому молочна кислота виробляється у вільній формі, конкретно її виробляють в оптично чистій ізомерній формі, конкретно це або О(-) або І (ж)- молочна кислота.

Зо 13. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-12, в якому дріжджі мають зменшену або пригнічену експресію одного або декількох генів РОС1, РОС5 і/або РОСб. 14. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-13, в якому один або декілька промоторів генів РОСТІ,

РОС і/або РОС замінені або видалені. 15. Спосіб за п. 14, в якому гени РОС1, РОС5 і/або РОСб є умовно експресивні, зокрема, завдяки контролю промоторів гетерологічних промоторів, а конкретно, промоторів, які репресують глюкозу, більш конкретно, завдяки контролю промоторів генів НХТ2 або НХТАУ. 16. Спосіб за будь-яким з пунктів 13-15, в якому видаляють хоча б один з генів РОС1, РОСЬ або РОСб. 17. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-16, в якому дріжджі мають знижену або нокаутовану експресію і які контролюють або регулюють експресію генів, зокрема експресію білків ЗІ41 або

МІНІ. 18. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-17, в якому ген МТНІ частково або повністю видаляється. 19. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-18, в якому дріжджі модифіковані для одержання гіперекспресії, щонайменше, одного гена транспортера гексози. 20. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-19, якому дріжджі модифіковані для одержання гіперекспресії, щонайменше, одного гена транспортера гексози, вибраних з такої групи генів

НХТтІ, НХТтТ2, НХТЗ, НХТ4, НХтТ5, НХТвб, НХТ7, НХтТ8, НХТ9, НХТІ10, НХТІ11, НХТ12, НХТ13,

НХТ14, НХТ15, НХТ16, НХТ17, САЇ 2, ЗМЕЗ і КОТ2. 21. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-20, в якому початкова концентрація глюкози на етапі виробництва становить не менше 10 95 (за вагою), а конкретно 20 95 (за вагою) і більше, а точніше 25 95 і більше. 22. Рекомбінантні дріжджі, які містять один або кілька гетерологічних генів лактату дегідрогенази (І ОН) і мають знижену піруват декарбоксилазу (РОС). 23. Рекомбінантні дріжджі за п. 22, у яких зменшена або нокаутована експресія одного або декількох генів з кодами РОС1, РОС5 і/або РОСб. 24. Рекомбінантні дріжджі за п. 23, у яких один або кілька промоторів генів РОС1, РОС5 і/або

РОС заміщені або видалені. 25. Рекомбінантні дріжджі за п. 23 або 24, в яких гени з кодами РОС1, РОС5 і/або РОСб є 60 умовно експресивними, зокрема завдяки контролю гетерологічних промоторів, зокрема,

промоторів, які репресують глюкозу, точніше завдяки контролю промоторів генів НХТ2 або

НХхТтаА. 26. Рекомбінантні дріжджі за п. 23-25, в яких видалений, щонайменше, один з генів з кодами

РОСТІ, РОС5 і/або РОСб. 27. Рекомбінантні дріжджі за будь-яким з пунктів 23-26, які мають знижену або нокаутовану експресію одного або декількох генів, які кодують білки, які взаємодіють з сенсорами глюкози, які контролюють або регулюють експресію генів, зокрема експресію білків 5141 або МЕНІ. 28. Рекомбінантні дріжджі за будь-яким з пунктів 23-27, в яких ген МТНІ частково або повністю видалений. 29. Рекомбінантні дріжджі за будь-яким з пунктів 23-28, які модифіковані для одержання гіперекспресії принаймні одного гена транспортера гексози. 30. Рекомбінантні дріжджі за будь-яким з пунктів 23-29, які модифіковані для одержання гіперекспресії принаймні одного гена транспортера гексози, вибраних з групи генів НХТІ1, НХТ2, нНХхтЗ, НХТтА4, НХТт5, НХТтв, НХТт7, НХТв8, НХТе, НХТ10, НХТ11, НХТ12, НХТ13, НХТ14, НХТ15,

НХТІ16, НХТ17, САІ2, ЗМЕЗ і КОТ2. 31. Штам рекомбінантних дріжджів, зокрема диплоїдних, поліплоїдних і анеуплоїдних клітини дріжджів, який включає: ї) функціональну делецію генів РОС1, РОС5 і РОСб, ії) рункціональну делецію гена МТНІ, ії) гіперекспресія гена НХТІ, і ім) гетерологічну експресія гена І ОН. 32. Штам рекомбінантних дріжджів за будь-яким з пунктів 23-31, який належить до виду зЗасспаготусез сегемівіає. 33. Двоетапна система ферментації для одержання молочної кислоти з глюкозою в якості джерела вуглецю з використанням рекомбінантного штаму дріжджів, яка включає а) етап посіву ферментації для одержання біомаси, на якому дріжджові клітини культивуються в поживному середовищі з рН від 5 до 7, а потім

Б) етап виробничої ферментації для одержання молочної кислоти, на якому дріжджові клітини культивуються в середовищі клітинних культур причому досягають кінцевого значення рН 3,5 або менше, зокрема рН «3,4, «3,3, «3,2, 3,1, 3,0, 2,9, 2,68, «2,7, «2,6, «2,5, «2,4, «2,3, «9,2, х2,1 або менше.

Причому дріжджі кодують гетерологічний лактат дегідрогенази( ОН) і мають зменшену активність пірувату декарбоксилази (РОС). 34. Двоетапна система ферментації для одержання молочної кислоти з глюкозою в якості джерела вуглецю з використанням рекомбінантного штаму дріжджів, яка включає: а) етап посіву ферментації у першому біореакторі для одержання біомаси, на якому дріжджові клітини культивуються в поживному середовищі клітин з рН від 5 до 7, а потім р) етап виробничої ферментації у другому біореакторі інокульовану від посіву ферментації для того щоб зробити молочну кислоту, на якому дріжджові клітини культивують у середовищі клітинних культур з рН менше 3,5, а конкретно рН «2,9, «2,8, 2,7, 2,6, 52,5, 2,4, «2,3, «22, -2,15,5 або менше, при якому дріжджі модифіковані для того щоб мати активність лактату дегідрогенази (ІОН) і/або зменшення активності пірувату декарбоксилази (РОС). 35. Поєднання двох або більше систем біореакторів для виробництва молочної кислоти з глюкозою в якості джерела вуглецю з використанням штаму рекомбінантних дріжджів, які складаються з а) біореактора для посіву для створення біомаси, в якому клітини дріжджів культивуються у середовищі клітинних культур з від рН 5 до 7 і наступного

Б) виробничий біореактор інокульовану від посіву ферментації для того щоб виробити молочну кислоту, у якому дріжджові клітини культивують у середовищі клітинних культур з рн менше 3,5, а конкретно рН «3,4, «3,3, «3,2, 3,1, 53,0, 2,9, 2,68, 2,7, «2,6, 52,5, «2,4, «23, «9,2, «2,15 або менше, в якому дріжджі кодуються гетерологічним геном (ОН) лактату дегідрогенази і мають зменшену піруват декарбоксилазу (РОС).

Приклади

Приклади, описані в цьому документі, є ілюстрацією цього винаходу і не призначені для його обмеження. Відповідно до цього винаходу описані різні варіанти здійснення цього винаходу. В технології, які описані і проілюстровані тут можуть бути внесені численні зміни і модифікації, які не виходять за рамки сутності та обсягу винаходу. Відповідно, слід розуміти, що приклади бо носять виключно ілюстративний характер і не обмежують обсяг винаходу.

Якщо не вказано інше, дріжджові клітини, використовувані в прикладах, є диплоїдними дріжджовими клітинами.

Приклад 1: Характеристика штаму 5. сегемізіае (СВ57962) для проведення ферментації при різних концентраціях глюкози, молочної кислоти і рН.

Штам 5. сегемізіае СВ57962 культивували в біореакторах і у перемішувальних колбах в два етапи. Етап розвитку інокуляту проводять у середовищі, яке містить 1,8 г/л МУМВ, 5 г/л (МН4І)25054 і 20 г/л глюкози. Клітини з флаконів з гліцерином, які зберігалися при температурі - 80 "С були використані для того, щоб інокулювати 50 мл передінокуолятного середовища з оптичною густини на довжині хвилі 600 нм (00600) рівною 0,05. Після 24 годин вирощування клітини збирали і використовували як інокулят на етапі культивації у перемішувальних колбах і в біореакторах (Еррепдоїї БАБСІР рАБЗБрох 4, Німеччина) робочим об'ємом 50 мл і 700 мл відповідно. Склад середовища і параметри ферментації на етапі культивування наведені в

Таблиці 1 і Таблиці 2. Всі культивації проводилися при 30 "С; перемішувальні колби інкубували в орбітальному шейкері із заданою йому швидкістю 180 об/хв; рН у перемішувальних колбах підтримувався на рівні 3,0 шляхом додавання буферного розчину гідрофталату калію до концентрації 100 мм; рН в культиваціях на біореакторі підтримувався автоматичним додаванням 2 моль Маон. Культивації в біореакторі були запрограмовані на підтримування концентрації розчиненого кисню 2095 і вище шляхом керування швидкостями аерації і перемішування. Зразки культивацій вилучали з перемішувальної колби і біореактора через регулярні проміжки часу для вимірювання збільшення оптичної густини на 600 нм і для аналізу супернатанту на вміст метаболітів включаючи глюкозу, етанол, гліцерин і молочну кислоту за допомогою набору колонок Атіпех НРХ-87Н у НРІ С (Зпітайд2и наукових приладів) при бО Сі 5 ммоль Н25О4 в якості елюенту зі швидкістю потоку 0,6 мл/хв. Результати чітко показують, що темпи ферментації і вихід виробництва етанолу при високих концентраціях глюкози у присутності молочної кислоти у середовищі можуть бути значно покращені за рахунок збільшення концентрацій УМВБ і сульфату амонію і за рахунок збільшення вихідного об'єму посівного матеріалу (Таблиця 1 і Таблиця 2).

Таблиця 1

Біореактор культивацій 5. сегемізіае СВ57962

Макс. чна» г Початковий Вихі Продуктивн Молочна "МВ, г/л ( т» ь пили, рн інокулят, ИхІд / ість киспотау. г/л г/л Орбоо ну етанолу, г/г етанолу, середовищі , Г/л г/пл/год. 1.8 5 20 5 01 0,40 0,55 - 1.8 5 20 З 01 0,40 0,45 - 1.8 5 125 5 01 0,36 0,92 - 1.8 5 250 5 01 0,32 0,47 - 1.8 5-57 125 5 01 0,37 1,48 - 3,6 10 125 5 01 0,41 2,60 - 3,6 10 250 5 01 0,40 3,78 - 3,6 10 250 З 01 0,40 2,83 - 3,6 10 250 З 01 0,37 0,40 15 3,6 10 250 5 0,1 0,40 3,03 15

Таблиця 2

Культивації 5. сегемізідае СВ57962 у перемішувальній колбі

Початковий . Продуктивність Молочна

ХУМВ-- Глюкоза, й Вихід етанолу, кислота у (МНаг)25О», г/л г/л рН інокулят, г/г етанопу при середовищі ' 00600 нм ЗОч, г/л/год. г/п ' 3.6-10 125 З 0,5 0,38 0,53 15 3.6-10 125 З 1,0 0,38 0,97 15 3.6-10 125 З 2,0 0,38 1,35 15

Приклад 2: Конструкція генів штаму 5. сегемізіаеє без піруват декарбоксилази (РОС1, РОС5 і

РОС) за методом делеції з розщепленим маркером.

Нокаут обох алелів РОС1І, РОС5 і РОСб полегшувався використанням методу делеції з розщепленим маркером з канаміцином і гігроміцином в якості можливих маркерів. Послідовності праймерів для делеції і верифікації праймерів наведені в Таблиці 3. Для делеції однієї з алелей були розроблені дві структури. Кожна структура містить фланг цільового гена, за яким слідує сайт ГохР і приблизно половина одного з вибраних маркерів. Флангова область і сайти І охР були включені у праймер, який використовувався для ампліфікації частин обираних маркерів канаміцину і гігроміцину з РРМ2ак?г1 і рРМ2а рр, відповідно. Дві РСК-конструкції, які містять флангові області цільового гена, сайт ІохР і частини одного з виділених маркерів, трансформувалися у штам СВ57962. Трансформація була здійснена відповідно до протоколу

ПАс/РЕСІ/55-ОМА (пер//поте.сс.итапйноба.са /-дієї7/теїйоа.піті). Трансформанти висівали на селективному УР етанол-гліцериновому середовищі (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону, 10 г/л етанолу і 10 г/л гліцерину) та інкубували протягом 3-4 днів при 30 "С. Потім поодинокі колонії піддавали колонії РОК з використанням верифікаційних праймерів цільового гена. Колонію РСК проводили наступним чином: колонію дріжджів обережно чіпали кінчиком піпетки і переносили у пробірку РСЕ, яка містить 1,2 моль сорбіту, 100 ммоль фосфату натрію і 1500 О/мл ферменту литікази, інкубували при 37 "С протягом 15 хв; РСК проводили з використанням верифікаційних праймерів цільового гена і суспензії розчинених клітин в якості матриці. Як було підтверджено дріжджова колонія втратила один алель гена рас, використовувалася для трансформації в нокаут іншого алеля цільового гена з використанням двох конструкцій РОК, які містять флангові області цільового гена, сайт І охР і частини іншого обраного маркера. Ті трансформанти, які з'являються на УР етанол-гліцериновому середовищі, яке містить 5418 і чашку гігроміцину були перевірені за допомогою колонії РСК для видалення обох алелів гена-мішені. Одержаний штам з одним з трьох віддалених генів рас був перетворений з допомогою СКЕ плазміди, щоб видалити обидва обираних маркера. Штами, які експресують СКЕ плазмід, пізніше вирощуваливчашці з неселективним УР етанол-гліцерином для одержання колоній без СЕРЕ плазміди. Потім штам дріжджів з одним з віддалених генів рас використовувався для нокауту інших генів рас, використовуючи ту саму процедуру, описану

Зо вище.

Таблиця З

Послідовності РОС праймерів для делеції та верифікації праймерів

РОСІ делеції праймера, проти | СААААТасСАТААССТАТаСАТТТААДААСАТТАТОТАТОИСТСТТО хода транскрипції ТОАСТТТСОО (5ЕО ІЮО Мо 2)

РОСТІ делеції праймера за ТАДСТОаАСАСТасСАаТААТААТАТИААССААТТТАТТТТТСИТТ ходом транскрипції АСАТААДАДАТасС (5ЕО І Мо. 3)

РОС5 делеції праймера, проти | САТТАТТ"ТТААТ ТТ ТТТСТАТТАСТатТСаСТААСАССТатАТа хода транскрипції атта (ЗЕО ІЮ Мо. 4)

РОС» делеції праймера за С,ССАТАТТААТАИТАТАСААСААДАААСАААСсАААААААСАААТ ходом транскрипції САДАТС (5ЕО ІО Мо. 5)

РОС делеції праймера, проти | СТАТатТАСТТааСААТАСАТИАаСАТТТСААТаААдаСАДАСаТс хода транскрипції СстТаАатТсСА,ТТАТОИ (5ЕО ІО Мо. 6)

РОС делеції праймера за сазссаса,атсостатттстасттаасСТСАТСТСТТОоа ходом транскрипції СсТоСОаАСОапАСОаАААс (5ЕО ІО Мо. 7)

РОСІ1 верифікаційний ргітег йми | ААСССІСТСТТТСАСТОТОСТТОас (ЗЕО ІЮ Мо. 8)

РОСІ1 верифікаційний внутрішній ргітег. бм/ ттАа,аСсаасСатСАасСААТАСаТаИас (ЗЕО ІО Мо. 9)

РОСТІ верифікаційний внутрішній ргітег. Му ССАСТАТТАСТадСассастАА (5ЕО ІО Мо. 10)

РОС5 верифікаційний ргітег їм | ТСЕСТААСАССТатАТОаИСтТТас (5ЕО ІЮО Мо. 11)

РОС5 верифікаційний внутрішній ргітег. бм/ СТТаАСАТСАТатТСТАСААИС (ЗЕО ІО Мо. 12)

РОС5 верифікаційний внутрішній ргітег. Му ТСТАВАСАТаАТатТСААДИЦаИС (5ЕО ІЮО Мо. 13)

РОС5 верифікаційний внутрішній ргітег. бм/ АСТААИТаАСАДАСААСТАСОИС (ЗЕО І Мо. 14)

Таблиця З

Послідовності РОС праймерів для делеції та верифікації праймерів

РОСб верифікаційний ргітег Ями | ТАСАаИСТОССсатААТТТСТТТСтТас (5ЕО ІО Мо. 15)

РОС верифікаційний внутрішній ргітег. бм/ ваАТСАААТСАаССОСАСТОСААСИ (5ЕО ІО Мо. 16)

РОС верифікаційний внутрішній ргітег. Му са,атта,алдатбаастТаАТТТОаАТСОС (5ЕО ІО Мо. 17)

РОС верифікаційний внутрішній ргітег м ТАААДИСТатААЛастАаАССАСС (5ЕО О Мо. 18)

Приклад 3: Конструкція штаму 5. сегемізіае з генами неактивної піруват декарбоксилази (РОС1, РОС5 і РОСб): Нокаутування генів рас з використанням системи СКІЗРЕ-савз9.

Система СКІЗРЕК-Са5з9, РНК керована активністю ендонуклеази індукує розриви дволанцюгової ДНК (азБ) на цільовому сайті і відновлює 456 з дволанцюговою (а5) ДНК в гомології олігонуклеотидів, яка містить стоп кодони і використовується для інактивації рас генів.

Трансформації були здійснені відповідно до протоколу ЦПАсС/РЕС/55-ОМА (пер:/поте.сс.итапйнобра.са /--дієї;7/теїтой.піті). Ензим ендонуклеази, са59, побудований в центромерному плазміді під промотором ТЕРЕ1 і термінатором СУС1 використовуючи збірку золотих воріт (Епдієг еї аКІ. 2008). Напрямні РНК (9КМА) для генів РОСІ, РОСЬ і РОСб ідентифікуються за допомогою метода СпорСпор (перз:/спорспор.го.Та5.пагмага.еди/). сАМА розміром 20 Бр побудована для того, щоб містити послідовність рибозими типу головки молотка (НН) і послідовність рибозими дельта вірусу гепатиту (НОМ) на 5' 3" кінцях, відповідно (Таблиця 4). Конструкція рибозим-дАМА-рибозим (КОК), яка одержана з використанням РСК з праймерами перекриття (Таблиця 4). РСЕ для побудови КОК виконується з використанням чотирьох загальних праймерів перекриття, включаючи їдгпа аїЇ гем, 2О9КМА аї гем,

ЗУ9КМА аї! гем ї 49КМА аї! й, а також двох прямих праймерів, специфічних для ЗКМА5в генів рас (Таблиця 4). Використовуючи збірку золотих воріт, конструкція КОК складається у плазміді 2уи з промотором ТРІ! і термінатором СУС1. Олігонуклеотиди 850МА, яка використовуються для сприяння у відновленні а5Б6, являє собою РСК побудованою для того, щоб містити стоп-кодон, який розташований на обох кінцях області гомології близько 90 Бр. Нокаутування одного гена рас5 за один раз здійснюється в два етапи. На першому етапі одержують штам дріжджів, який експресує саз9, шляхом перетворення центромерної плазміди, яка містить са59 на штам

СвВв57962. Штам, який експресує са59 трансформується з РОС1 КОК плазміди і відповідних її олігонуклеотидів 45ОМА. Трансформанти висівають на селективному середовищі УРО (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону і 20 г/л глюкози) і інкубують протягом 3-4 днів при 30 "С.

Поодинокі колонії верифікують на нокаутування РОСТІ з використанням РСК. З цією метою наявність гена РОС верифікують шляхом ампліфікації відповідними праймерами. Штам нокаутування РОСІ, який містить центромерну плазміду са59, використовується для

Зо нокаутування двох інших генів РОС, використовуючи ту саму процедуру, що описана вище. Для останнього РОС нокаутування трансформанти висівають на селективному УР етанол- гліцериновому середовищі (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону, 10 г/л етанолу і 10 г/л гліцерину) для забезпечення росту цих нокаутувальних штамів.

Таблиця 4

Послідовність ЗОЗКМА, послідовність праймерів і послідовність побудови ЗЕМА для інактивації

РОС» з використанням СКІЗРЕ-Са59 9АМА, РОС САТАССАССОСТААССАТСАа (5ЕО ІО Мо. 19) 9АМА, РОСЬ тТаААДИТСАААдСааИТтАТИаАсСАТ (ЗЕО І Мо. 20) 9АМА, РОСб СТААССАТСаСОСасСАТАСИ (5ЕО ІО Мо. 21)

Праймер для дгпа сопвігисі, САТаСОаТАТОСТаАТОАСТоСсатТаАдапАСпАААСаАсаТААастТ 1 РОСТ А М СатсаАТА (5ЕО ІО Мо. 22)

Праймер для діта сопвігисі, АААСсСОС)АСТААИаСтТоИтоаАТАСаАдасСаТААССАТСАСЯШадаас 2 РОСТ А М Тадаааіадсааа (ЗЕО ІО Мо. 23)

Праймер для дгпа сопвігисі, САТаАСТТСАСТОаАТОАСаСТОоСОасталда,асАСсАААСаАаТтАдаст

Таблиця 4

Послідовність ЗОЗКМА, послідовність праймерів і послідовність побудови ЗЕМА для інактивації

РОС» з використанням СКІЗРЕ-Са59

Праймер для дгпа сопвігисі, АААСсСОС.АССТААССТо, ТСТаААаТСАААдааТАТОАСАТатшадасчсі 2 РОС5 А М адааатадсааа (ЗЕО ІО Мо. 25)

Праймер для побудови ЗОЕМА, | САТаСОаТттТАССТаАтТадатосСаТОАаСпАСОАААСаАатТААастТ 1 РОСб А М СатТсСатАА (5ЕО ІО Мо. 26)

Праймер для дгпа сопвігисі, АААСОСАСТААаИаСстТоИа,ИтоатААССАТССИОСССИСАТАССЯ Шавад 2 РОСб А М сіадаааіаадсаад (ЗЕО І Мо. 27)

Праймер перекриття, СсішададсіадаааіаддсааонааааіаадосіадіссоНаісаасноаааааці

АДАМА аї! й (5ЕО ІО Мо. 28)

Праймер перекриття, СасСсСсАТаСССЯЯАДасСАТатта,асосаассвсаСсасСАааСовАцади 19АМА аї гем сстаавАССАТаССИвасс (5ЕО ІО Мо. 29)

Праймер перекриття, даастаспАССАТаССасссСаааадсассдасісддіассасиннісаана

ЗаВМА аї| гем аїаасу (ЗЕО ІО Мо. 30)

Праймер перекриття, ААСаСАСаТоСААдАаСтТаТатосСАТТсаССАТаССаААасАТаИтта 29АМА аї! гем соСсдасса (5ЕО І Мо. 31)

САТаАСОаТАТССТОАтТОаДИитоСатаАапйАСпАААСаАаТААастТ структура ЗЕМА: Рибозим НН | ССТоСАТАССАаСатТААССАТСАСІЇШададсіадаааіадсааднааа прогуте-растдАМА-НОМ із аїааддсіадіссоНаїсаасндааааадідасассдадісаатдсша асСасасСА сайтами з'єднання типу золоті | ІЗИТОоСсСАаасстостсастассассвсаставаСААСАТастт ворота саасАТавССаААТтасаАСАаастттасАсСтастт (5ЕО І Мо. 32) структура ОЗЕМА: Рибозим НН САТОАСТТСАСТаАТОАДИСТССИатаАОпАСОАААСОАСТАдОСтТ ; ; . са,атстТаААдатТСАААдааТтАТаАсСАТаШшададсіадаааіадсааоднаааа прогуте-расздаАМА-НОМ із ССССОССАТ сайтами з'єднання типу золоті іїІааддсіадіссудПаісаасідааааадщдоасассдадчісдаістн ворота сатоссаласстостсастоасооссаставасСААСАТОСТТО васАтТавСсаААТаСпАСАастТтТасАСТОСТТ (5ЕО ІО Мо. 33)

САТОСаИТтТАССТОАТтТаАДаТоСатадаспАСаАААСОАСаТААаТстТт структура ЗЕМА: Рибозим НН | ССТСаТААССАТОСЯСИВИаСАТАСОСДІШададсіадаааіадсааднааа прогуте-расбдавМА-НОМ із аїааддсіадіссоНаїсаасндааааадідасассдадісаатдсша асСасасСА сайтами з'єднання типу золоті | ІЗИТОоСсСАаасстостсастассассвсаставаСААСАТасСтТтТ ворота свдасАТаССаААТасаАСАастТттасА

СТОаСТТт (5ЕО ІО Мо. 34)

ААСТТатТоСтТтТаттасАСААСпАТСТАСОААИТТаААсаТАТОДО а5зОМА олігонуклеотид зі стоп- І АТаСО!СТтапТтААСасСсСААСПААТтТаААСсасСтасттТАСасаст кодонами для інактивації СанчзадтааттТАСастосАТСААаааТтТАТаТоТттТатАТСАТСАС

РОСІ1 САССТІоСОаСТатоааТаААТТатТСТаст тТадАСОаатТАТТОСС сатто (5ЕО ІО Мо.35) тТатстассСААСАТТТСТОАДААССАСТаССАТОаАТСАСТОаАТАТТ азОМА олігонуклеотид з Стоп- | 8СТААСастосАастаАААТТаАСАЧАТатАТСАСААасАсСста кодонами для інактивації садзАСАСТАСССААаАССАаТтСстТАСТТасаТтттассСАасСтТААСТ

РОСЬ таатТаАСТТОаААСаТСССАаССААаТТАТТОаСАААСТОСААТТ

САС (5ЕО ІО Мо.36)

СсАВИСОАСТТСААСТТатТоССТАТТОСАСААСАТТТАСадОааТтТА азОМА олігонуклеотид з Стоп- | АТаОСАТТаАСАТасСа7аСтастТААТаСАААтТалдасСтаААСсасс кодонами для інактивації ССтТаннвадтассасСсСаАтаатТАСасСАСасСАТСААДСИЯаИатТТАТСТ

РОСб стТастаатТААСТАСТІТТаССатАасаТаААТТАТССОССТТОдДА тат (5ЕО ІО Мо.37

Приклад 4: Конструкція ауксотрофів штаму дріжджів 5. сегемізіае (СВ57962) урацилу, триптофану і гістидину: інактивація генів ОКАЗ, ТКРІ і НІЗЗ з використанням системи СКІЗРЕ- саз59.

Система СКІЗРК-Са59, РНК керована активністю ендонуклеази індукує розриви дволанцюгової ДНК (а5Б5) на цільовому сайті і відновлює а5о з дволанцюговою (45) ДНК в гомології олігонуклеотидів, яка містить стоп кодони і використовується для інактивації генів

ОКАЗ, ТКРІ ї НІБЗЗ. Трансформації проводилися згідно до протоколу ГіАс/РЕС/55-ОМА (пнр//поте.сс.итапйноба.са/-дієїг/тетоа. літі). Ензим ендонуклеази, са5з9, був побудований в центромерному плазміді під промотором ТЕРЕ1 і термінатором СУС1 використовуючи збірку золотих воріт (Епдіег еї аІ. 2008). Напрямні РНК (9КМА) генів ОМКАЗ, ТКРІ і НІ5ЗЗ були ідентифіковані з допомогою метода СпорСпор (перз:/спорспор.го.Та5.пагмага.еди/). деЕМА розміром 20 Бр побудована для того, щоб містити послідовність рибозими типу головки молотка (НН) і послідовність рибозими дельта вірусу гепатиту (НОМ) на 5' 3" кінцях, відповідно (Таблиця 5). Конструкція рибозим-ЯяМА-рибозим (КОК) була одержана з використанням РСК з праймерами перекриття. РСК для побудови КОК виконується з допомогою чотирьох праймерів перекриття, в тому числі Т9ДКМА аїЇ гем, 29КМА аїЇ гем, З9ОКМА аї! гем і 49дкМА аї! пи ї двох прямих праймерів характерних для ЯОКМА5 з ШОКАЗ, ТКРІ і НІЗЗ генами (Таблиця 5).

Використовуючи збірку золотих воріт, була складена конструкція КОМ з промотором ТРІ! і термінатором СУСІ1 в плазміді 2). Олігонуклеотиди 850МА, яка використовується для сприяння у відновленні а50, була РОК побудована так, щоб містити два стоп-кодони, які були оточені гомологічною областю близько 40-50 рр на обох кінцях (Таблиця 5). Нокаутування генів ОКАЗ,

ТАРІ ї НІ5ЗЗ за один раз було здійснене в два етапи. На першому етапі одержують штам дріжджів, який експресує са59, шляхом перетворення центромерної плазміди, яка містить саз59 на штам СВ57962. Штам, який експресує са59 був трансформований з плазміди ЮШКАЗ КОБ і її відповідних олігонуклеотидів Я4500МА. Трансформанти були висіяні на селективному ХРО середовищі (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону і 20 г/л глюкози) і інкубували протягом 3-4 днів при температурі 30 "С. Поодинокі колонії далі були висіяні для реплікації на УМВ- урацил-РОА середовищі (1,8 г/л МВ, 5г/л (МН4)25054, 20 г/л глюкози, 1 г/л 5'ЄОА і 500рд/мл урацилу) і неповному УМВ середовищі (1,8 г/л УМВ, 5г/л (МН 4)25054 і 20 г/л глюкози). Штам нокаутування ОКАЗ саз59, який експресує плазміду, піддавався поетапному нокаутування генів

ТЕРІ ї НІЗЗ за тією самою, описаною вище методикою.

Таблиця 5 «"Послідовності ЗКМА, праймерів, олігонуклеотидів О5ОМА і КОК для пмгазЗ, ігр1, і піз3 інактивації з використанням СКІЗРЕК-Саз9

ЯОАМА, ОНАЗ ТААСТОСАСТААТТОСТТас (ЗЕО ІО Мо.38) 9АМА, ТАРІ асатсСАТТаатТаАААДИТТтТа (5ЕО ІО Мо.39) 9АМА, НІЗЗ АТТОСОАТСТСТТТТАААСОО (зеяд ІЮ Мо 40)

Праймер для структури ОЕМА, САТОСАСТТАСТаАТОЛлСТОоСатаАдапАСапАААСаАаИТт 1 ОНАЗ А й ААССТСаИтстТААС (5ЕО ІО Мо. 41)

Праймер для структури ОЕМА, АААСсОСАаТААХаСтТСаТтсТААСТОСАСТААТТОСТТасашй 2 РОСТ А М Тададсіадаааіадсааа (5ЕО ІО Мо. 42) преднер для структури ОККА, САТСТОСАСССТОАТСАСТОССТОАССАСОАААССАСТ - -60- Адастоатсаато (5ЕО ПО Мо. 43)

Праймер для структури ОЕМА, АААСсСОСАСЖТААХССТОСТосСИ7аТсСАТТааТтТаАААаТТТсаЯн 2 ТАРІ А М Нададсіадаааіаосааа (ЗЕО ІО Мо. 44)

Праймер для структури ОЕМА, САТаСаСААТСТаАТОалСТОСИаВТаАдапАСапАААСсАаТ 1 НІ5З А М ААССТСаИатсСАТТОИ (5ЕО ІО Мо. 45)

Праймер для структури ОЕМА, АААСсСОС)АСТААХИаСТоаТтоАТТаСсасАТСТСТТТАААССИасаТн 2 НІЗЗ А М Нададсіадаааіаосааа (ЗЕО І Мо. 46) - сиішададсіадаааіадсаааінааааіааддсіадіссоНаїісаасноааа

Праймер перекриття, 49КМА аї! й ааді (ЗЕО І Мо. 47) . СсасСсАТаСсСсадАадасАТаттассслассвасасСАасСа

Праймер перекриття, Т9КМА. аїї. тех | ДОСАСОСТООСАССАТОССОССС (5ЕО 10 Мо. 48) . АдсаставаАССАТаАССвасСсСаааадсассдасісадідссаснтй

Праймер перекриття, З9ОКМА аї! гем ісаадноаїаасо (ЗЕО 10 Мо. 49) . ААаСАСТОСАААаастатосССАттсасСсАтасСсаАдасА

Праймер перекриття, 29КМА аї! гем ТОТТОСССАСССС (9ЕО І Мо. 50 . САТОСАСТТАСТаАТОЛлСТОоСатаАдапАСапАААСаАаИТт структура ОКМА: Рибозим НН. ААССТООТСТААСТОСАСТААТТОСТТООдИНададсіадаа прогуте-растдАМА-НОМ із сайтами з'єднання типу золоті ворота аїадсааднааааіааддсіадіссоНаісаасідааааадіддсассдавді садіасінСЬЬССЬСЯсСАтТастоссАаа,7сстостсастаасся

00002 ее ово да7астттааАСТастт (ЗЕО ІО Мо.51

САТОаОТасСАСсСсСсТаАТОАаТтОоСсСатадасАСсСАААСаАаТт структура ОКМА: Рибозим НН ААХдастсатоааТсСАТттастТаАААсатТ ТТ сашададсіада прогуте- ГАРТІЯЧЗАМА-НОМ із сайтами | ааїадсааонааааіааддсіадіссонНаїісаасідааааадіддсассдад з'єднання типу золоті ворота ісдаюсітвсасСа7ааАТаатосСАсОоСТСТССЬКСТвИаСа ссаастасасСААСсАтТасттоаасСАТтааСадАтацосАс дастттаадсСтТастт (5ЕО О Мо.52)

САТаСаСААТСТаАТОалСТОСИаВТаАдапАСапАААСсАаТ

ААасСтТоаТтосАТТасСсаАТСТСОТТТАААсСОасаішададсіадаа структура ОКМА: Рибозим НН агадсаадііааааіааддсіадіссонаїсаасідааааадіддсассдаді прогуте-НІЗЗОВАМА-НОМ із сайтами | сляатасітасаССса7асСАтаатосСАаостстастасса з'єднання типу золоті ворота сссаестасваСААСАТаСсттоааСАтТааСаААтТасвИаАс дастттаадстастт (5ЕО О Мо.53)

СстТаттТАТТААТТТСАСАССТ ТАТ ТОТасСсТтоСАТТаСТаА а5ОМА олігонуклеотид з Стоп- ААстТааваттаСассттасСсАасАасСАСАаАааасСсасСАСАА кодонами для інактивації ТКР1 татастотТАСАТ (5ЕО ІО Мо.54) а5ОМА олігонуклеотид з Стоп- ААССОатАТТАСАААТаАААССААСаАТТСАСпАТтТасаАТо кодонами для інактивації НІЗЗ тоСтТталстідаасттааТоСсСоСтАаасСсадтТАаАасСАСТОоИАТС

ТТОССАСААДА (5ЕО ІО Мо.55)

ТСАТаСАССАААДАСаСАААСАААСТТИ ТаТасТттСАТТОаС а5зОМА олігонуклеотид з Стоп- АТаТттСсатАССТААСТААСТААТТАСТТаААаСАТТАСО кодонами для інактивації ОБАЗ ТОоССААААТТТаТТТАСТАААДАДАСАСАТИаТаааА (5ЕО І

Мо. 56

ЕМаГЕВ, С., КАМОЛІА, В. 4 МАВШГ ОММЕТ, 5. 2008. А Опе Рої, Опе еїгер, Ргесівіоп Сіопіпд

Меїноа м/ійй Нідй Тигоцднриї Сарабіїйу. Ріоз Опе, 3.

Приклад 5: Конструкція штамів 5. сегемізіае (СВ57962 апа дАдрас), яка експресує гетерологічну активність І ОН від І асіорасійи5 ріапіагит.

Штам 5. сегемізіає, в якому відсутні обидві алелі РОС1, РОС5 і РОСб, був трансформований з 2и плазмідою, яка містить ген Г ОН. В якості контрольного брали штам дикого типу 5. сегемізіає

Св57962, який був також трансформований, з 2 плазмідою, яка містить ген ГОН. Область 2 містить два перевернутих повтори 599рр, розділених великою і малою унікальною областю; 2 дозволяє реплікацію типу кільця, що котиться, створюючи декілька копій плазміди у кожному клітинному циклі. Зазначена плазміда була побудована за процедурою збірки золотих воріт (Епаїєг еї аі. 2008). Ген ТОН раніше був ампліфікований РСК з використанням геному

І асюбрасійив5 ріапіагит АТОС8014(Вгапацагаї еї аі!., 2006) як матриці і праймерів, які містять відповідні сайти зв'язування для вектора остов1. Конструкція РСЕ. у ГОН і остов1 лінкера був сайт Вр5і вирізаний, щоб одержати плазміду остова!, яка містить кодувальну послідовність

ГОН. Аналогічно, остов1 плазміди, який містить промотор ТРІ! і термінатор СУСТ1, відповідно, були побудовані з використанням РСК-конструкцій відповідних елементів, апліфікованих з використанням геному 5. сегемізіає в якості матриці. Остов1 плазміди гена І ОН, промотор ТРІ! їі термінатор СУСТ1, разом з лінкером остов2 були вирізані Врії, щоб одержати остов2 плазміди з

ІОН касетою експресії. У одержаної плазміди разом з лінкером остов3, який містить 2н і ОРІ 5. сегемізіає, вирізали Вр5І для одержання плазміди експресії дріжджів, яка потім використовувалася для трансформації вищезгаданих штамів дріжджів. Трансформації проводилися згідно до протоколу ПАс/РЕС/55-ОМА (пер/поте.сс.итапйноба. са/-діеєт/теїтод. піт). Трансформанти штаму ДАдрас були висіяні на селективному УР етанол-гліцерин середовищі (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону, 10 г/л етанолу і 10 г/л гліцерину). Тоді як трансформанти штаму СВ57962 були висіяні на селективному УРО середовищі (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону і 20 г/л глюкози).

Поодинокі колонії одержували з обох трансформантів через 3-4 дні інкубації при зо 30 "СбрвВвАМОШАРВОЇ, Р., БАОЕН, М., СЕ СІОА, Г., 2АМРЕЇТА, Са. МАСІ, М. МАТТАМОМІСН, 0. 5 РОВНО, 0. 2006. І асіае ргодисійп уївЇід їот епадіпеегеєд уєавів із дерепаєпі їтот їйе пові

БасКагоипоа, їНе Іасіаїє аДенпуагодепазе 5о0!йгсеє апа пе Іасіаїе ехроп. Містобвіа! Сеї! Расюгієв, 5.

ЕМаГЕВ, С., КАМОЛІА, В. 4 МАВШГ ОММЕТ, 5. 2008. А Опе Рої, Опе епер, Ргесівіоп Сіопіпд

Меїноа м/ійй Нідй Тигоцднриї Сарабіїйу. Ріоз Опе, 3.

Приклад 6: Конструкція штаму 5. сегемізіае СВ57962 з генами піруват декарбоксилази під контролем системи умовної експресії проводиться з використанням системи СКІЗРЕК-Савз9.

Гени пірувату декарбоксилази РОСІ, РОС5 і РОСб конститутивно експресовані у хлібопекарських дріжджах. Цей приклад забезпечує розкриття улоеможливлення конститутивної експресії генів рас і улюоеможливлення умовної експресіїя генів рас5 під контролем промоторів гена НХТ2 або гена НХТ4. Гени, НХТ2 ії НХТ4 мають експресію при низьких рівнях глюкози (0,1 Фо) ії репресовані при високому рівні глюкози (02сап апа допп5іоп, 1995). Використовуючи систему СКІЗРЕК-Саз59, промотори генів рас замінюються промотором гена НХТ2 або НХТА.

Система СКІЗРЕ-Са59, РНК керована активністю ендонуклеази індукує розриви дволанцюгової

ДНК (056) на цільовому сайті і відновлює аз з дволанцюговою (05) ДНК в гомології олігонуклеотидів, яка містить послідовність промотора гена НХТ2 або НХТА і використовується для уможливлення умовної експресії системи рас генів. Трансформації були здійснені відповідно до протоколу ЦАс/РЕС/55-ОМА (пир/поте.сс.итапінобвра.са /-дієї2г/теїтод.піті).

Ензим ендонуклеази, са59, побудований в центромерній плазміді під промотором ТЕНІ1 і термінатором СУС1 використовуючи збірку золотих воріт (Епаіег єї а!., 2008). Для ідентифікації цільових промоторів РОСТІ, РОСЬ і РОСб в оКМА5 використовували метод спорспор (пере://споревор.гс.Та5.пагмага.еди/). ЧЕМА розміром 20 Бр побудована для того, щоб містити послідовність рибозима типу головки молотка (НН) і послідовність рибозими дельта вірусу гепатиту (НОМ) на 5' 3' кінцях, відповідно. РСК для побудови гіболгуте-ЯАМА-прогуте (НИ) виконується з використанням чотирьох праймерів перекриття (Таблиця 6), включаючи 19КМА аїЇ гем, 2О9КМА аїЇ гем, ЗОКМА ай гем і 4Дд9дКМА ай йу ії двох прямих праймерів, характерних для ЗОКМА5 промоторів рас генів. Використовуючи збірку золотих воріт, конструкції

КОР були зібрані в плазміді 2и з промотором ТРІ! і термінатором СУС1. Олігонуклеотиди а5зОМА призначені для того, щоб утримувати послідовність генів НХТ2 або НХТА промотора і на обох кінцях послідовності промотора утримувати послідовність 40Ббр гомологічних областей, прилеглих до рідного промотора рас генів. Заміна конститутивних промоторів генів рас, по одному промотору за раз, здійснюється в два етапи. На першому етапі одержують штам дріжджів, який експресує са59, шляхом перетворення центромерної плазміди, яка містить саз59 на штам дріжджів. Дріжджі, які мають експресію сабз9 трансформують з КОК, яка містить

Зо цільовий промотор РОСТІ з ДКМА і олігонуклеотид а50МА, який містить послідовності промотора

НХТ?2 або НХТ4і. Трансформанти штаму СВ5792 висівають на селективному середовищі УРОЕ (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону, 1 г/л глюкози і 10 г/л етанолу) і інкубують протягом 3-4 днів при З30"С. Потім поодинокі колонії піддають РСК колонії з використанням верифікаційних праймерів для цільової області. Колонії РСК здійснюють наступним чином: обережно торкаються дріжджової колонії кінцем піпетки і переносять у РСК пробірку, яка містить 1,2 моль сорбіту, 100мм гідрофосфату натрію і 1500О/мл розчину ензиму і інкубували при 37 "С протягом 15хв; РСК здійснюється за допомогою верифікації праймерів для цільового регіону і лізису клітинної суспензії в якості шаблону. Дріжджова колонія, перевірена на наявність промотора НХТ2 або НХТ4А замість промотора РОСТІ, потім висівається на неселективному середовищі, щоб позбутися плазміди, яка містить ЗФЗЕМА промотора РОС1. Цей штам дріжджів, все ще містить плазміду експресії са59 і потім використовується для заміни промоторів РОС5 і

РОС, по одному за раз, за тією самою процедурою, описаною вище.

Таблиця 6

Праймер перекриття, сішададсіададаіадсааунааааіааддсіадіссонаісаасидааааачі (ЗЕО ІЮ

АД9АМА аї! пу МоО.57)

Праймер перекриття, СсасСсАТаССЯЯАДасАТаттассосАаассааСсассааСсавлаавАваста

ТаАМА аї гем апАССАТОаССИвасс (5ЕО ІО Мо. 58)

Праймер перекриття, даастаспАССАТаССасссСаааадсассдасісддіассасннісаадноагаас

З9АМА аї! гем 9 (ЗЕО ІО Мо. 59)

Праймер перекриття, ААдСаСАСаТоСАААаСтТаТатоССАТТсаССАТасСаААасСсАТаИТатасссА 29ВМА аї| гем саоба (5ЕО ІО Мо. 60

ЕМаГ ЕВ, С., КАМОЛІА, В. 4 МАВШГ ОММЕТ, 5. 2008. А Опе Рої, Опе епер, Ргесівіоп Сіопіпа

Меїноа м/ійй Нідй Тигоцднриї Сарабіїйу. Ріоз Опе, 3. 07САМ, 5. а "«ОНМ5ЗТОМ, М. 1995. Тнгєе айегепі гедшаюгту теснапізтв5 епабіє увазі Нехозе ігапзропіег (НХТ) депез іо ре іпадисед Бу айегепі Іємеї!5 ої аІйсозе. Мої Сеї! Віої, 15, 1564-72.

Приклад 7: Конструкція штаму 5. сегемізіае (СВ57962 і ДАдрас) для делеції внутрішньої області 225рр в гені МТНІ з використанням системи СКІЗРЕК-Савз9.

Система СКІЗРЕК-Са5з9, РНК керована активністю ендонуклеази індукує розриви дволанцюгової ДНК (а5Б5) на цільовому сайті і відновлює 4565 з дволанцюговою (05) ДНК в гомології олігонуклеотидів використовується для видалення області 225Бр (від 169 до 393 ВР) (Таблиця 8) у МТНІ гена. Дві напрямні РНК (9КМА) використовуються для індукування двох азр і олігонуклеотиду 450МА, 500Ббр флангових областей внутрішньої послідовності видалення, використовується для відновлення 45р. Трансформації були здійснені відповідно до протоколу

ПАс/РЕСІ/55-ОМА (пер/попте.сс.итапйноба.са /-діеї7/теїод.піті). Ензим ендонуклеази, са59, побудований в центромерному плазміді під промотором ТЕБ1 і термінатором СУС1 використовуючи збірку золотих воріт (Епдієг еї а. 2008). Два гена ОЕМА (МТНІ А МмТтНнІ1 В) (Таблиця 8), які лежать в області МТНІ, які мають бути видалені, ідентифікуються за допомогою метода спорспор (перз://спорспор.гс.Та5.пагуага.еди/). Аналогічним чином визначають два ген 9ЕМА5 (МТНІ С іМмтнНІ1 Б) за межами цієї області. ЗЕМА розміром 20 Бр побудована для того, щоб містити послідовність рибозима типу головки молотка (НН) і послідовність рибозими дельта вірусу гепатиту (НОМ) на 5 3 кінцях, відповідно (Таблиця 8). Конструкція рибозим-аАМА- рибозим (КОК) одержана з використанням РСЕК з праймерами перекриття (табл.8). РОК для побудови КОК виконується з використанням чотирьох загальних праймерів перекриття, включаючи Тдгпа аїЇ гем, 29КЕМА аїЇ гем, З9ОКМА аї!Ї гем ії 49КЕМА аїЇ й, а також двох прямих праймерів ЗЕМА5 генів МТНІ А ії МТНІ1 В (Таблиця 8). Використовуючи збірку типу золотих воріт і конструкції КОМ зібрані у плазміді 2и з промотором ТРІ! і термінатором СУС1. а5ОМА олігонуклеотид, використовуваний для сприяння делеції 225Ббр шляхом гомологічної рекомбінації, являє собою РСК побудований для утримання гомологічних областей 500Бр (Таблиця 8), які лежать по обидві сторони від внутрішньої області делеції. а5ОМА олігонуклеотид ампліфікується при з'єднанні РСК з використанням геномної ДНК штаму

СвВ57962 з набором праймерів перекриття (Таблиця 8). Часткова внутрішня делеція в рамці гена МТНІ здійснюється в два етапи. На першому етапі одержують штам дріжджів, який експресує сабз9, шляхом перетворення центромерної плазміди, яка містить са59 на штам дріжджів. Штам з експресією са59 трансформують за допомогою КО генів МТНІ АЇїіМмТтНнІ1 в (або МТНІ С і МтТНІ ОО відповідно) плазміди і відповідного олігонуклеотиду азхОМА.

Зо Трансформанти штамів СВ5792 і ДДАрас висівають на селективному середовищі УРО (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону і 20 г/л глюкози) і інкубують протягом 3-4 днів при 30 "С.

Потім поодинокі колонії піддають РСК з використанням верифікаційних праймерів цільового гена (Таблиця 8). Колонію РСК проводили наступним чином: колонію дріжджів обережно чіпали кінчиком піпетки і переносили у РОК пробірку, яка містить 1,2 моль сорбіту, 100 ммоль фосфату натрію і 1500 О/мл ферменту литікази, інкубували при 37 "С протягом 15 хв; РСЕ проводили з використанням верифікаційних праймерів цільового гена і суспензії лизірованних клітин в якості шаблону.

Таблиця 7

Послідовності ЗКМА, праймерів, олігонуклеотидів а5ОМА їі КОК для внутрішньої делеції в рамці зчитування гена МТНІ з використанням СКІБРЕ-Саз9

АСТАасСстТоТСААТССАСИ,АСТТСТТОоПАПААСАсСАСААСТТ татаАдАТтТастостоСасАатТАСАСТаАТАаАаСтТАСпАСАТ 225рр (169 до 393Бр) внутрішньої. | ЗАйАТТААААДАААСАТТАТТИИССТОСТСАССТАаСАСАДа делеції послідовності МТНІ1 СТСАСАТСАТТСААДОСАСТАТаСАТТСАаСадаСАсСаАсА

ТсАдаСсатааСТАААдатавИаАа т тТАСТТТСасСАТААТО

ССТСатТсСсТТАТСААТСАДаТАТА (5ЕО ІО Мо. 61)

ОАМА, МІНІ а СТОТСТТСТоОААСААЛИТСа (5ЕО ІО Мо. 62) 9АМА, МТНІ Б АСАТСАДОаСИЯТаастадАда (5ЕО ІО Мо. 63)

Праймер структури ОКМА, САТОАСАСАсаСсТаАтала,атоСатаАасАСсАААСИ,аАаИтАА 1 МТНІ А М естТСатсстет (5ЕО ІО Мо. 64)

Праймер структури ЗОЕМА, АААСсСОС)АСТААЛСЯСТоаТтоСтТСоТоТСТопААпААстТСсаша 2 МІНІ А їм дадсіадаааіадсаад (5ЕО ІО Мо. 65)

Праймер структури ОКМА, САТаТаАТСТоТаАТаАДСаСТОоСОсСТаАаааАСаАААСаАаТтАА 1 МТНІ В М асСтТоатТсСАСАТ (ЗЕО ІО Мо. 66)

Праймер структури ЗОЕМА, АААДАСсСОСІДТАХИСТОИа ТСАВАТСААССЯТааСТаАААсСоїШша 2 МТНІ В й чадсіадаааіадсааад (5ЕО ІО Мо. 67

Таблиця 7

Послідовності ЗКМА, праймерів, олігонуклеотидів а5ОМА їі КОК для внутрішньої делеції в рамці зчитування гена МТНІ з використанням СКІБРЕ-Саз9 - сішададсіадаааіадсаааінааааіааддсіадіссоНаісаасноааааад

Праймер перекриття, 49КМА аї! йу НЕО ІО Мо. 68)

Мам СсасСсАТаСсСсадАаасАТаттассосаассвсасасСАаа,Сада 5-0 слаастапаАССАТассСосасс (5ЕО ІО Мо. 69)

В МА ат дсаставаАССАТасСасссаааадсассдасісддіассаснйса 9 5-50 адноааїааса (ЗЕО ІО Мо. 70)

МА АДОСАСТССААДАОСТОаТСССАТТСОССАТОССОААССАТО 5-0 ттасссдасса (5ЕО ІЮО Мо. 71)

САТОАСАСАсаСсТаАтала,атоСатаАасАСсАААСИ,аАаИтАА структура ЗЕМА: НН гірогуте- астоа;тостотстсТоаААпААсТСсСсашадаасіадаааіадс тій! а-д98МА-НОМ рибозим з ааднНааааіааддсіадіссоНаїсаасндааааадіддсассдадісддостяй вузлами кріплення типу золотих сесбсасАатаатсСАа,асстстастаасоабсвастоа воріт сСААСАТАСТТОСаСАТСИССаААтТасаАСАааСстта7асАСтТ

ССТТ (5ЕО ІО Мо. 72)

САТаТаАТСТоТаАТаАДСаСТОоСОсСТаАаааАСаАААСаАаТтАА структура ЗЕМА: НН гірогуте- астоатСАпАТСААДа,аСсастТаасСтТаАААсСоШшададсіадаааад тій! Б-ФАМА-НОМ рибозим з сааоднааааіааддсіадіссуНаїсаасндааааадіддсассдадісдаїдсії вузлами кріплення типу золотих набссасСАатаатососАаа,асстостастассавсаваста воріт саСбААСАТОаСТІСсСаСАТаДаСаААтТапаАСАасттааА

СТОастт (ЗЕО ІО Мо. 73) ваААТАТСТаССАТТСТАССССТТАТТСААдСТассттт тт

ТТ ТТ ТТ ТСАТСССАСАТТ ТТАТТаСТасстоААТСТОСАТТ

ААСАДААДААДААТТТАТАТААССАААТИАСАТТ ТТТОСТТТСТ

ТСТСАААСТТТаТААТОСОаССТтТатААСТасСтт ст ТТ ТтТАТ

Перша половина 8450МА ТААДАДАДАСАаСАТИаСпАСТ ТТ ТТААТААСТТААСаСАААСАТА олігонуклеотиду: 500рр перед САДАДАСАТТТаТттСАТТТСАСТОСААСТАТТТТТТААДАаИТтА внутрішньою областю делеції ТАТТОАААСаТТоТСААТАИСИ,ААДАССАСААДИаСАсССААТАСА

МтНІ1 ААСАСААТТТТАТТССААСОаСАТАСАСТАСАСАСАСТОСААДА ваААТаТ тат ТтсАССАССАССАИСААСТТСОСАААААССА

АСТТТТАСААСОАСаТТССАТТАСААТССИ,АСТААСАИТААТС

АТасаттасСсАдастоссСтТАСАаасССАТТОСОсСсААААСАС сАТаАХСТОИаСАаТаАТААТасСТТСТ т ТсСАААдаТтТТассАС

ТАТСААТ (5ЕО ІО Мо. 74) ст тсТасСсссссСстТоТАСТатТасСАСАСаСААСТААСТААТО

АСТСТТСаттстТоСОаААТТТОСТААССАСААДСИТТААТСАСаИа

АдсдатадасстацпАТаААаСАТТАСССААААСИаттТАТОа

АСАТаТтТАТТСаССАСАТАТТСТАТТАИСАСАСССАТОСААдС

АТТСоТотТатААдСа,асвасатТоССААсСТТТАССААсСАсАсаАатТ

Друга половина олігонуклеотиду тТАТТаСАТТасСОсАТТТАААСОСАТАТААСАТСИТТАТТаАТА а5ОМА: 500Бр за внутрішньою атоаАпААаТТААла,ааСССсаААТавааТААТСААСТАСССС областю делеції МТНІ ААСТААТААССЯЯ ТС ТОАТААТАТОССССАСТТТАсСаИттТА

СААТТАТТАССАСТАТАТТСТАаСаАтТаАсаАССАТААТССЯС

ААСсОСТТАаТССАТТСССАТСТаТтТАСАТасСАсСаИстТААСТТАС

АТТАТОААТТСААДАСТААССАаСОасСАААТАТАСАИатТАаСс

АССОаСтТАпААААДАпАСАТИАДаСАТАТААСТОСТАСАААТОИ

ААСССатсАТ (5ЕО І Мо. 75)

Праймер ампліфікації ргітег. бу ,аААТАТСТасССАТТСТАСС (5ЕО ІО Мо. 76)

Праймер ампліфікації перекриття. | сдАпСасассасСАсСААААСАТТаАТАСТИассАААС (5ЕО ІЮ Мо.

Огітег гем 77

Таблиця 7

Послідовності ЗКМА, праймерів, олігонуклеотидів а5ОМА їі КОК для внутрішньої делеції в рамці зчитування гена МТНІ з використанням СКІБРЕ-Саз9

Праймер ампліфікації перекриття (ТТ ТаССАСТАТСААТИТ ТТ ТСТасссссто (5ЕО ІЮ Мо. ріїтег тем 78)

Праймер ампліфікації ргітег гем |АТаАСаасСтТТСАТТТСТАСС (5ЕО ІО Мо. 79)

Праймер верифікації ргітег йМ/ ТАСОСАСТОСАТТТСТОСАСТ (ЗЕО ІО Мо. 80)

Праймер верифікації ргітег гем АТГИатТасстТСТАСТОаСсСТтТАТА (5ЕО ІО Мо. 81

Приклад 8: Конструкція штамів 5. сегемізіае (СВ57962 апа дДАдрас) для гіперекспресії ендогенного гена МТНІ1.

Штам дріжджів 5. сегемізіае у якого відсутні обидва алелі РОСІ, РОС5 і РОСб був перетворений з 2) плазмідою, яка містить ген МТНІ. В якості контрольного брали штам дикого типу 5. сегемізіае СВ57962, який був також трансформований, з 2) плазмідою, яка містить ген

МТНІ. Область 2н містить два перевернутих повтори 599Бр, розділених великою і малою унікальною областю; 2и дозволяє реплікацію типу кільця, що котиться, створюючи декілька копій плазміди у кожному циклі осередку. Зазначена плазміда була побудована за процедурою

Збірки золотих воріт (Епдіег еї ам. 2008). Ген МТНІ раніше був ампліфікований РСЕ з використанням геному штаму СВ57962 в якості шаблону і ампліфікаційні праймери (Таблиця 9), що містять відповідні вузли кріплення для вектора остов1. Структура РСК у МТНІ ії остов!1 лінкера був сайт Вр5і вирізаний, щоб одержати плазміду остова, яка містять кодувальну послідовність МТНІ. Аналогічно, остов1 плазмід, які містять промотор ТРІ! і термінатор СУС, відповідно, були побудовані з використанням РСК-конструкцій відповідних елементів, апліфікованих з використанням геному СВ57962 в якості шаблону. Остові плазміди МТНІ1, промотор ТРІ! і термінатор СУСТ1, разом з лінкером остов2 були ВріїЇ вирізані, щоб одержати плазмід остова2 з касетою експресії гена МТНІ. У одержаної плазміди разом з лінкером остов3, який містить 2н і ОРІ 5. сегемізіаеє, вирізали ВБО5І для одержання плазміди експресії дріжджів, яка потім використовувалася для трансформації вищезгаданих штамів дріжджів. Трансформації проводилися згідно до протоколу ПАс/РЕС/55-ОМА (пНр/поте.сс.итапйноба.са/-дієї7/тетоа. піт). Трансформанти штамів СВ57962 і ДАДрас були висіяні на селективному УРО середовищі (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону і 20 г/л глюкози). Поодинокі колонії одержували з обох трансформантів через 3-4 дні інкубації при

МЗЗО"С.

Таблиця 8

Праймери ампліфікації МТНІ1 те АСААСАСОСТАОСОАТОАААССАТААТССС (5ЕО І Мо. 82)

МТНІ атрійісайоп сатТАСААТТАТТАССАСТАТАТТСТАИ,аСасатсттст (5ЕО ІЮО Мо.

Огітег гем 83

ЕМаГЕВ, С., КАМОЛІА, В. 4 МАВШГ ОММЕТ, 5. 2008. А Опе Рої, Опе бер, Ргесівзіоп Сіопіпд

Меїноа м/ійй Нідй Тигоцднриї Сарабіїйу. Ріоз Опе, 3.

Зо Приклад 9: Виробництво молочної кислоти з використанням штамів 5. сегемізіае (С857962-

ГОН і АдДАрабс-І ОН).

Штам 5. сегемізіае СВ579623 експресією гетерологічного генагоОон з ГГ. ріапіагит, культивували в перемішувальних колбах в два етапи. Інокулянт етапу розвитку, в якому УРО з 20 г/л глюкози було використане в якості середовища, яке передує інокулянту і на етапі виробництва, в якому використовують УРО з 250 г/л глюкози, як середовище для ферментації.

Періодичну культуру виготовляли при 30 "С в 100 мл у перемішувальних колбах. Клітини з пробірок гліцерину, які зберігали при -80 "С використовували для того, щоб інокулювати 20 мл в середовищі, яке передує інокуляції, з оптичною густиною бООпт (ОЮвоо) 0,05. Після 24 годин вирощування, клітини збирали і використовували для того, щоб інокулювати 50 мл середовища ферментації з оптичною густиною ОЮвоо 0,1.

Штам дддрасз експресією гетерологічного гена ІОН був культивований у перемішувальних колбах в двох різних рідких середовищах. У середовищі, перед інокуляцією, яке містить 1,8 г/л азотисту основу дріжджів (УМВ) без амінокислот і без (МН4)25054, 1 г/л сечовини, 20 г/л етанолу і 0,5 г/л глюкози і середовища ферментації, яке містить 4,5 г/л СасСо3, 1,8 г/л УМВ без амінокислот і без (МН4)25054, 1 г/л сечовини, 1 г/летанолу і 40 г/л глюкози, рН 5. Періодичну культуру виготовляли при 30 С в 100 мл у перемішувальних колбах. Клітини з пробірок гліцерину, які зберігали при -80 "С використовували для того, щоб інокулювати 50 мл в середовищі, яке передує інокуляції, з оптичною густиною бООпт (ОЮвоо) 0,1. Після 36 годин вирощування, клітини збирали і використовували для того, щоб інокулювати 50 мл середовища ферментації з оптичною густиною 00600 4,5.

Культури інкубували на 302С на 180 об./хв. і зразки були зібрані на частих інтервалах для того щоб контролювати зростання за вимірюванням ОЮОвоо. Супернатант був проаналізований з використанням колонки Атіпех НРХ-87Н встановленої в НРІ С (наукові апаратури Зпітайд?2и) при 60"С ії 5 ммоль На5О»; як еуліант з зі швидкістю потоку 0,6 мл/хв., на концентрацію метаболітів включаючи, глюкозу, етанол і молочну кислоту.

Після 40 годин інкубації, штам, СВ57962 з експресією І ОН, було витрачено 250 г/л глюкози і вироблено 9,4 г/л молочної кислоти з виходом 0,04 г молочної кислоти на грам спожитої глюкози. Надзвичайно, що значне збільшення виходу молочної кислоти спостерігається коли штам дДлдрас, який характеризує ГОН був використаний для виробництва молочної кислоти.

Хоча штам ДАддрас з експресією ОН, не повністю споживав 40 г/л глюкози після 96 годин інкубації, штам виробляв 21,3 г/л молочної кислоти з виходом 0,71 г молочної кислоти на грам спожитої глюкози.

Приклад 10: Двоступеневий процес виробництва молочної кислоти в контрольованих умовах.

Процес виробництва молочної кислоти проходить в два етапи: перший етап-культивування дріжджових клітин до високої щільності клітин у періодичному поживному процесі і другий етап це періодичний процес виробництва молочної кислоти з високим початковим інокулятом. Як було показано раніше (Приклад 1) в експериментах з перемішувальними колбами при низькому рН 3,0, швидкість ферментації і вихід етанолу були значно покращені з високим початковим

Зо інокулятом в середовищі, яке має молочну кислоту і високу концентрацію глюкози. Це дозволило припустити, що об'єм посівного матеріалу відіграє значну роль у визначенні ефективності ферментації.

Перший етап починається з періодичного культивування в середовищі, яке містить 1,8 г/л "УМВ, 5 г/л (МН4)250954 і 20 г/л глюкози. Концентрація розчиненого кисню підтримувалася на рівні 2095 шляхом контролю швидкості перемішування і швидкості аерації. Температура і рн підтримані на оптимальних значеннях на 30 "С і 5.0, відповідно. Періодична культура подається до повного споживання глюкози і етанолу перед подачею свіжого середовища в реактор.

Поживне середовище має високі концентрації глюкози, 5,4 г/л МВ ї 10 г/л (МНа)250О». При вичерпанні етанолу в періодичній культурі поживне середовище подається в реактор з витратою, необхідною для підтримки конкретної швидкості росту при критичному значенні, яке визначається конкретним штамом і може бути визначено шляхом попередніх культивацій у хемостаті. Підтримання темпу росту питомої при критичному значенні забезпечує високий вихід біомаси на субстрат, споживаний без утворення побічних продуктів, як-от етанол і ацетат.

Клітини зібрані після культивації з періодичним живленням і іносульовані до високої щільності клітин в виробничому реакторі. Виробниче середовище має високу концентрацію глюкози для того, щоб забезпечити високі титри молочної кислоти. Середовище поповнюється необхідними поживними речовинами для того, щоб підтримати клітинний метаболізм за високої концентрації глюкози. Значення рН є критичним фактором, щоб визначати продуктивність ферментації і тому, утримання рН на рівні 5,0 шляхом додавання солі основи або додавання

Сасо3 в середовище з самого початку може бути оптимальним варіантом заснованим на загальному аналізі економічності процесу.

Приклад 11: Альтернативний двоетапний процес виробництва молочної кислоти.

Процес виробництва молочної кислоти проходить в два етапи: перший етап-культивування дріжджових клітин до високої щільності клітин у періодичному поживному процесі і другий етап це періодичний процес виробництва молочної кислоти з високим початковим інокулятом.

Перший етап виробництва молочної кислоти:

Середовище для першої стадії культивації готують згідно з наступними таблицями, глюкози додають до одержання концентрації 25 г/л:

Мінімальні солі у середовищі (МНаА)2504 5,0 г/л

КНегРО»Х 3,0 г/л

Ма5О:7Нго 0,5 г/л 1000х вітамінний розчин 1 мл/л 100х залишок елемента 10 мл/л

Інгредієнти розчиняють в НгО, додають розчин вітаміну і мікроелементи, рН доводять до 5,0 соляною кислотою. Середовище стерильно фільтрують. 1000Х вітамінний розчин для мінімальної глюкози

О - біотин 0,05 г/л

Са - О-пантотенат 1.00 г/л

Нікотинова кислоти 1.00 г/л

Муо - іпозіо| 25,00 г/л

Тіаміну гідрохлорид 1,00 г/л

Піридоксалу гідрохлорид 1,00 г/л р - амінобензойна кислота 0,20 г/л

Біотин розчиняють в 0,1 моль Маон і розводять в НегО, потім рН доводять до 6,5 з 1 моль соляної кислоти. Всі інші компоненти додають і розчин стерильно фільтрують. 100х залишкові елементи для середовища з мінімальною глюкозою

Маг»ЕОТА 1,50 г/л 7п5ОТНго 0,45 г/л

МасСіІ2:2нН20 0,10 г/л

СосСіІ» бно 0,03 г/л бивО:5Нго 0,03 г/л

Маг2МоО4:2Н20 0,04 г/л

СасСі»2нНг2О 0,45 г/л

ЕезО:7НгОо 0,30 г/л

НзВОз 0,10 г/л

КІ 0,01 г/л

ЕОТА (етилен діамін тетраоцтова кислота) і сульфату цинку розчиняють в НО їі рн коригується додаванням гідроксиду натрію до 6,0. Були додані всі інші компоненти і рн доводився соляною кислотою до 4,0. Розчин стерильно фільтрований.

Періодична культура індосулюється до баку реактора з мішалкою до оптичної густини 1 з нічної попередньої культури на середовищі ЖРО з промитими дріжджовими клітинами.

Концентрація розчиненого кисню підтримувалася на рівні 20 96 шляхом контролю швидкості перемішування і швидкості аерації. Температура і рН підтримується на рівні З0С і 5.0, відповідно. Періодична культура працює до повного споживання глюкози. Коли глюкоза закінчилася, починається підживлення. Поживне середовище містить 500 г/л глюкози і двократну композицію середовища, як описано вище. Швидкість подачі експоненціальна і відповідає 8095 максимальної швидкості росту дріжджового штаму. Температура і рн підтримується на рівні 30 "С і 5.0, відповідно. Живлення продовжують до концентрації біомаси 100 г/л.

Другий етап процесу розпочинається зі збирання клітин і іносуляції до виробничого реактора до концентрації за вагою сухого елемента 50 г/л. Виробниче середовище містить 150 г/л глюкози. Концентрація розчиненого кисню підтримувалася на рівні 20 96 шляхом контролю швидкості перемішування і швидкості аерації. Температура підтримується на 30 "с. рн залишається безконтрольним і зменшується нижче 3 при виробництві молочної кислоти.

Періодична культура працює до повного споживання глюкози.

Альтернативно на другому етапі процесу є додавання середовища у перший реактор для одержання концентрації глюкози 150 г/л і концентрації біомаси 50 г/л. Концентрація розчиненого кисню підтримується на рівні 20 956 шляхом регулювання швидкості мішалки і швидкості аерації.

Зо Температура підтримується на 30 "С. рН залишається безконтрольним і зменшується нижче З при виробництві молочної кислоти. Періодична культура працює до повного споживання глюкози.

Приклад 12: Адаптивна лабораторна еволюція (АГ Е) Штаму ААдрас 5. сегемізіае (СВ57962) з експресією гетерологічного гена І ОН.

Штам дддрас 5. сегемізіає з експресією гетерологічного гена ГОН з Г. ріапіагит. (Приклад 5) надавався до адаптивної лабораторії еволюції (АГЕ). АГ Е була проведена в 100 мл у перемішувальних колбах, які містять 10 мл середовища, шляхом регулярного пасивування нічної культури у свіже рідке ферментаційне середовище до тих пір, поки культура не досягне 100 поколінь.

В залежності від концентрації джерела вуглецю використовувалися перед інокулумне середовище і дві різні середовища ферментації: Використовували перед інокулумне середовище, яке містить 3,4 г/л дріжджової основи азоту (УМВ) без амінокислот і без (МН4)250, 4.54 г/л сечовини і 10 г/л етанолу. Використовували ферментаційне середовище, яке містить 3,4 г/л дріжджової основи азоту (УМВ) без амінокислот і без такого (МН4)2505, 4.54 г/л, сечовини, 5 г/л етанолу і 100 г/л глюкози або 150 г/л глюкози, відповідно. Були проведені чотири незалежних еволюційних експерименти для кожного ферментаційного середовища (100 ї 150 г/л глюкози) (всього вісім).

Клітини, які не еволюціонували з флаконів гліцерину, які зберігаються при -80 С були використані для інокуляції 25 мл перед інокулярного середовища з оптичною густиною 600 Нм (00609) 0,25. Після 24 годин росту, клітини були зібрані, промиті і використані для АГЕ для того щоб іносулювати 10 мл ферментаційного середовища з ОЮвоо 0.5. Експеримент з АГЕ проводився до досягнення культурами 100 поколінь, що відповідає приблизно 40 трансферам.

Культури інкубували при 28 "С при 180 об/хв. Зростання контролювалося щодня за вимірами

ООбвоо. Супернатанти періодично аналізувалися на метаболіти з використанням колонки Атіпех

НРХ-87Н встановленої в НРІ С (наукові апаратури ЗПпітаайи) на 60 С, і 5 ммоль НебО4 як мобільну фазу з витратою потоку 0,6 мл/хв., детектор КІО, включаючи глюкозу, етанол, оцтову кислоту, гліцерин та молочну кислоту.

Після 100 поколінь еволюції штами демонстрували більш високі темпи росту і продуктивність у порівнянні з штамами, які не еволюціонували (Таблиця 1).

Питома швидкість росту і концентрація молочної кислоти у перші 24 год., нееволюціоновані штами 0,054 год." і 2,82 г/л, відповідно. Після 40 трансферів, які відповідають 100 поколінням, питома швидкість росту і концентрація молочної кислоти у перші 24 год. (з початковою концентрацією глюкози 100 г/л) становили 0,08 год." і 5,8 г/л відповідно. Уточнені цільові темпи росту культури після 40 трансферів у ферментних середовищах з 150 г/л глюкози були також виявлені: н- 0.108 сгод.7" і молочної кислоти виробництва була підвищена з 2,5 г/л до 4,2 г/л.

Крім того, концентрації етанолу в ході еволюції експерименту і після 24 год. інкубації, знизилася 3 2,9 г/л, для штаму нееволюціонованому до 2,3 г/л для штаму еволюціонованому близько через 100 поколінь. 4 Кількість 00000001 длаюетфї втанолфію | часбодо| оолньсдю еволюціонували в 100 г/л поечннитєн ою 58123 | | 5 глюкози " " "

Приклад 13: Характеристика ДДДрас 5. сегемізіае (СВ57962) в біореакторі з частково контрольованим значенням рн.

Штам дАддрас 5. сегемізіаегСВ57962 з експресією гетерологічного гена ІОН з Г. ріапіагит культивували у біореакторі в два етапи: перший етап накопичення біомаси, при цьому 10 г/л етанолу, 3,4 г/л азотисту основу дріжджів (УМВ) без амінокислот і без цього (МН4)»250х і з 4.54 г/л сечовини використовується в якості середовища і етап виробництва, в якому 100 г/л глюкози, 5 г/л етанолу, 3,4 г/л азотисту основу дріжджів (УМВБ) без амінокислот і без цього (МНУІ)»5О і 4.54 г/л сечовина використовується в якості середовища ферментації. Перший етап був виконаний у перемішувальних колбах І етап продукції був виконаний в біореакторі (системі раіАБОІР). Культуру у перемішувальних колбах вирощували при 28 С в 2000 мл в колбах

Зрленмейера, які містять 225 мл середовища. Клітини з експериментів АГЕ були взяті після 50 поколінь і використані для іносуляції на першому етапі при оптичній щільності 660 Нм (ОЮОвоо) 2,5. Через 30 год. росту клітини збирали, промивали водою і використовували для інокуляції 330 мл ферментаційного середовища з ОЮОбвоо 5 в 1,5 л біореакторі. Концентрація розчиненого кисню підтримувалася на рівні 3095 шляхом регулювання швидкості мішалки і швидкості аерації.

Температура підтримувалася при оптимальному значенні 28 "С. Значення рН підтримувалося протягом 18 год. на рівні 5, а потім більше не контролювалося.

Проби відбирали через регулярні проміжки часу, щоб стежити за зростанням за ОЮОвоо і супернатант аналізували на метаболіти з допомогою Атіпех НРХ-87Н колонки в НРІС (Зпітад?и наукові прилади) при 60 "С, і 5 мм Н250О5» в якості рухомої фази зі швидкістю потоку 0,6 мл/хв., КІЮО детектор для виявлення, в тому числі глюкози, етанолу, гліцерину, оцтової і молочної кислоти. У перші 64 годин після припинення контролю рН значення рН зменшилося з 5 до 3, а потім дуже незначно знизилося до кінцевого значення 2,89. Виробництво молочної кислоти становило 30,7 г/л, що відповідає виходу 0,66 г молочної кислоти на г споживаної глюкози. Етанол вживався в перші 40 год. після початку циклу. 64 | 468 | 307 | - Б | 50 | 066 | 299 | 253

Приклад 14: Вимірювання ДАдрас 5. сегемізіає (857962) в біореакторі без контролю рн.

Штам дАддрас 5. сегемізіаеСВ57962 з експресією гетерологічного гена ГОН з Г. ріапіагит культивували у біореакторі в два етапи: перший етап накопичення біомаси, при цьому 10 г/л етанолу, 3,4 г/л азотисту основу дріжджів (УМВ) без амінокислот і без цього (МН4)»250х і з 4.54 г/л сечовини використовується в якості середовища і етап виробництва, в якому 100 г/л глюкози, 5 г/л етанолу, 3,4 г/л азотисту основу дріжджів (УМВБ) без амінокислот і без цього (МНУІ)»5О і 4.54 г/л сечовина використовується в якості середовища ферментації. Перший етап був виконаний у перемішувальних колбах І етап продукції був виконаний в біореакторі (системі раіАБОІР). Культуру у перемішувальних колбах вирощували при 28 С в 2000 мл в колбах

Зрленмейера, які містять 225 мл середовища. Клітини з експериментів АГЕ були взяті після 75 поколінь і використані для індосуляціїна першому етапі при оптичній густині 600 нм (ОЮОвоо) 2,5.

Через 30 год. росту клітини збирали, промивали водою і використовували для інокуляції 330 мл ферментаційного середовища з ОЮОвоо 5 в 1,5 л біореакторі. Концентрація розчиненого кисню підтримувалася на рівні 3095 шляхом регулювання швидкості мішалки і швидкості аерації.

Температура підтримувалася на оптимальному рівні 28 "С. Значення рН не контролювалося з самого початку ферментації.

Проби відбирали через регулярні проміжки часу, щоб стежити за зростанням за ОЮвоо і супернатант аналізували на метаболіти з допомогою Атіпех НРХ-87Н колонки в НРІС (Зпітад?и наукові прилади) при 60 "С, і 5 мм Н2г50О5» в якості рухомої фази зі швидкістю потоку 0,6 мл/хв., КІЮО детектор для виявлення, в тому числі глюкози, етанолу, гліцерину, оцтової і молочної кислоти.

Протягом перших 15 годин культивації рН швидко знизилася з 5 до 2,45, а потім незначно знизився до відмітних 2,15 після 64 годин. За цей період було спожито 27,6 г/л глюкози і вироблено 24,5 г/л молочної кислоти (що надалі відповідає виходу 0,89 г молочної кислоти на г

Зо спожитої глюкози). Етанол повністю споживався протягом 47 год. 15 | 787 | 674 | 271 | юж 75 | 086 | 245 | 86 64 | 276 | 245 | - | 75 | 089 | 26 | 12

Приклад 15: Порівняння штамів ДлАріас 5. сегемізіае (СВ57962) з експресією гетерологічного гена І ОН. які еволюціонували і не еволюціонували у перемішувальних колбах.

Штам ДдАдрас 5. сегемізіае з експресією гетерологічного гена СОН з Г. ріапіагит, культивувався у перемішувальних колбах в двох різних рідких середовищах. У перед інокуляційному середовищі, що містить 3,4 г/л азотисту основу дріжджів (УМВ) без амінокислот і без цього (МН4)250, 4.54 г/л, сечовини, 10 г/л етанолу та ферментації середовища, що містить 3,4 г/л УМВ без амінокислот і без цього (МН4)2505, 4.54 г/л, сечовини, 5 г/л етанолу, 100 г/л глюкози і 4,5 г/л СаСОз були використані. Періодичну культуру готували при 28 "С в 500 мл у перемішувальних колбах, які містять 50 мл середовища з початковим значенням рн 6. Клітини, які не еволюціонували з флаконів гліцерину, які зберігаються при -80 "С, використовували для інокуляції 25 мл перед інокулярного середовища з оптичної густиною 600 Нм (ООвоо) 1. Клітини з експерименту АГ Е, одержані після 33 переносів і близько через 75 поколінь, використовувалися для інокуляції 25 мл преінокулярного середовища з оптичною густиною 600 Нм (ООвоо) 2. Після 40 годин росту, клітини були зібрані і промиті і були використані для того, щоб інокулювати 50 мл ферментаційного середовища на ОЮОвоо 3.

Культури інкубували при 28 "С при 180 об/хв, і зразки відбирали з інтервалом (кожні 24 год.) для моніторингу росту шляхом вимірювання ОЮвоо. Супернатант був проаналізований на метаболіти включаючи, глюкози, етанолу, оцтової кислоти, гліцерину і молочної кислоти, з використанням колонки Атіпех НРХ-87Н встановлену в НРІ С (наукові прилади Зпітаа?7и) на 60 "С, і 5 ммоль Н250О» як мобільну фазу з витратою потоку 0.6 мл/хв. і виявлення КІЮО.

Після 48 год. інкубації, штам який не еволюціонував ДАдрас з експресією ІОН спожив 14,6 г/л глюкози, в той час як штам, який еволюціонував АлЛАрас спожив 32.8 г/л, що підтверджує високу швидкість засвоєння глюкози еволюціонованого штаму. Після 90 годин інкубації штам, який не еволюціонував споживав 23,3 г/л. Штам, який еволюціонував споживав 59,5 г/л глюкози за 90 год. Етанол як і раніше був присутній в культурі штаму, який не еволюціонував через 90 годин (1,22 г/л), в той час як він повністю споживався штамом, який еволюціонував(на НРІ С не виявлений). Штам, який не еволюціонував напрацював 29,6 г/л молочної кислоти і досяг значення рН 3, в той час як штам, який еволюціонував наприкінці накопичив 51 г/л молочної кислоти з рН 2,86. Вихід становить 86 95 на основі г/г глюкози. (год.) | глюкоза (г/л) (г/л) (г/л) поколінь (АСЕ)| ((г/г) он йований міні! 1-1» Ге йований

Приклад 16: Вимірювання еволюціонованого штаму дДлдрас 5. сегемізіае (СВ57962) з експресією гетерологічного гена ТОН у перемішувальних колбах з різною концентрацією глюкози.

Штам ДдАддрас 5. сегемізіае з експресією гетерологічного гена ГОН з ГГ. ріапіагит культивували у перемішувальних колбах. Було використане передінокульоване середовище і три різних ферментаційні середовища з різною концентрацією глюкози. У передіносуляційному середовищі, яке містить 3,4 г/л азотисту основу дріжджів (УМВБ) без амінокислот і без цього (МНІ26505, 4.54 г/л, сечовини, 10 г/л етанолу, і ферментації носія, що містить 3,4 г/л УМВ без амінокислот і без цього (МН4)2505, 4.54 г/л, сечовини, 5 г/л етанолу, були використані 4,5 г/л

Сасо» і 60 г/л глюкози або 70 г/л глюкози або 80 г/л глюкози. Періодичну культуру готували при температурі 28"С в 500 мл у перемішувальних колбах, які містять 50 мл середовища, і з початковим значенням рн 6. Клітини адаптивної лабораторної еволюції (АГЕ), одержані після 33 переносів (близько 75 поколінь), використовувалися для інокуляції 25 мл перед інокулярного середовища при оптичної щільності 600 Нм (ООвбвоо) 2. Після 40 год. росту, клітини були зібрані і промиті і були використані для того, щоб прищепити 50 мл ферментаційного середовища на

ООбвоо 3.

Культури інкубували при 28 "С при 180 об/хв, і зразки відбирали з інтервалом (кожні 24 год.) для моніторингу росту шляхом вимірювання ОЮвоо. Супернатант був проаналізований на

Зо метаболіти включаючи, глюкозу, етанол, оцтову кислоту, гліцерин і молочну кислоту, З використанням колонки Атіпех НРХ-87Н встановленої у НРІ'І С (наукові прилади Зпітай?и) при 60 "С і 5 ммоль Н2г50О» як мобільної фази з витратою потоку 0,6 мл/хв. і КІО детектором.

Концентрація глюкози у всіх ферментаційних середовищах знижувалася в процесі інкубації.

Після 96 годин інкубації еволюціонований штам Алдрас з експресією І ОН і зростаючий на 80 г/л глюкози, перетворив 55,3 г/л глюкози на 49,4 г/л молочної кислоти. Це перетворення відповідає виходу 0,89 г молочної кислоти на г споживаної глюкози. За рахунок вичерпання глюкози через 72 години інкубації в ферментаційних середовищах з 60 г/л глюкози виробництво молочної кислоти досягло максимуму і залишалося незмінним після цього. З іншого боку, концентрація етанолу у всіх трьох середовищах ферментації і через 48 годин інкубації не виявлялася.

Характеристика росту (значення ОЮвоо) і профіль рН при культивуванні були однаковими для всіх культур, культивованих в різних середовищах ферментації.

Ч Концентрація | Споживана | Лактат | Етанол Кількість Вихід (г/ Значен- оо ас (год.)) глюкози (г/л) Іглюкоза (г/л) (г/л) (г/л) Ав ихід (г/7) ня рн бо 48 | 60 | 324 | ги | 09 | 75 | 087 | Зи7 96 | ющв60 | 531 | 47 | - | ющюю75 | 079 | 298 |125 48 | 7 | 298 | 2608 | 09 | 75 | 09 | зи7 96 | ющ7 | 574 | 492 | - | 75 | 086 | 285 | ПБ 48 | 80 | 280 | 272 | 08 | 75 | 097 | злив | 102 96 | 80 | 553 | 494 | - | 75 | 089 | 284 | 10,8

Зо

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 САЙКОНІУМ ЛЕКТІК ЕСІД ГМБХ «1205 СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ МОЛОЧНОЇ КИСЛОТИ «1305 5х001Р «1605 83 «1705 Патентна версія 3.5 «2105 1 «2115» 320 «2125 РКЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» ІОН ген «4005 1

Мет б5ег бег Мет Рго Ап НІі5 сіп Гуз Мма!ї ма! Гей ма! сІу А5р су 1 5 10 15

АІїа ма! сіу 5ег 5ег тТуг АЇа Ре АЇа меї АїЇа сіп сіп сіу ІЇе АЇа 20 25 30 сій сій РБе ма! Ії1е ма! Азр ма! ма! губ А5Зр Аг тТиг о гу5 су дор

АЇа гей А5зр Гей сіи А5Зр АЇа сіп АїЇа Ре ТНг АїЇа Рго Гуз Гуз ІїЇє 60 35 туг б5ег сіу сіи Ттуг 5ег Ар Суз Гуз А5Зр АЇа Азр Гей маї ма! Пе 65 70 75 80

Тег АТа с1у Аїа Рго сп Гуз Рго сіу сіи 5ег Агд Гей Азр Геи маї 40 85 90 95

АЗзп Гуз АЗп о Гей АЗп ІЇе Ге б5ег б5ег ІІе мМмаЇ Гу5 Рго ма! маї дор 100 105 110 45 5зег сіу Ре Азр сІіу ІЇе РПе Геи ма! Аїа АїЇа А5п Рго ма! А5р ІїЇе 115 120 125

Гей Ттийг отукг АїТа тийг Тер Гуз Ре бег су РМПе Рго Гу5 А5р Ага маї 130 135 140 50

ІІе с1у б5ег сіу Тийг 5ег Гей дор б5ег 5ег Аг Ге Агд ма! Аїа Геи 145 150 155 160 о1у Гуз сіп Рпе Ап ма! дер Рго Агуд 5ег ма! дор Аїа туг Іїе мес 55 165 170 175 сіу сіи нНі5 сіу А5р 5ег сій Ре АЇа Аїа туг 5ег Тйг Аїа тйг Пе 180 185 190 60 с1у ТтНг Агд Рго ма! Ага А5зр ма!Ї АТа Гуз сіи сіп сіу ма! 5ег дер 195 200 205 си А5р гей АїЇа Гуз Ге сіи Азр соІу ма! Агд Ап Гуз АЇа туг др 210 215 220 65 ч11е те Азп Гей Гуз сіу Аїа Ттйг РіПе туг СІу ІЇе сІу тНг Аїа ге 225 230 235 240 70 Мет Агу ІЇе 5ег Гу5 Аїа ІІе Ге Агд Азр сі Азп Аїа маї Геи Рго

245 250 255 ма! сіу Аїа туг мет А5р сіу сіп туг сСІу Гей А5Зп А5р ІЇе Туг ІЇє 260 265 270 с1у Ттйг Рго АЇа ма! ІЇе сІу сіу тйг сіу ге Гуз сіп те Пе си 275 280 285 5ег Рго Геу 5ег АЇа А5р сіи Гей Гуз Гуз Меї сіп Азр 5ег АїЇа АїЇа 290 295 300

Тиг Гей Гуз Гуз маЇ Ге Азп А5Зр сЇу Ге АїЇа сіи Гей сЇи А5бПпП Гуз 305 310 315 320 «2105» 2 «2115 54 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 2 саааасдсає аасстатдса сстаааадає хтасдтатдсе стестдась са 54 «210» З «2115 56 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність

Зо «220» «223» Праймер «4005» З таадсдасад єдсадсааста асасдаасса акстаьсс сдісасастаа ааасдс 56 «210» 4 «2115 49 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 4 саєстаєссста асстеес тастастуєс дссаасасст дсатдаєта 49 «2105». 5 «2115 49 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «А005 5 дсасаєсаас адсасасаас ааааасааад дааааааада аасдааатс 49 «2105» 6 бо «2115 57 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Праймер «А00» 6 стасурастсї ддсаасадасє дадсаєссса асдааддааа сдсстдадеіс адетата 57 70 «2105 7

«2115 58 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 7 ддадсддсадєс ссстдЕЕ стдсеетддс хсаєстст ддстіссдасд дасдааад 58

«210» 8 «2115 22 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність

«220» «223» Праймер «А00» 8 ааддсесттє састстсстт дес 22 «210» 9 «2115 22 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «А00» 9 тсадсддсдї садсаатаді да 22 «2105» 10 «2115 22 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер

«400» 10 ссастаєстдс єдасдссдст аа 22 «2105 11 «2115 22 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 11 тсдстаасас стдтатоад дес 22 «2105 12 «2115 21 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Праймер «4005 12 стсдасаєса хдістадаад с 21 65 «2105» 13 «2115 21 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70

«223» Праймер «4005» 13 тЕСсСтадасає датдісаада с 21 «210» 14 «2115 22 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 14 астаадсдас ааадаастас дс 22 «2105» 15 «2115 23 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 15 тасадссддає аасттстетс да 23 «2105» 16

Зо «2115 23 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00 «223» Праймер «400» 16 ддаєсааасс адссдастсса асд 23 «2105 17 «2115 23 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 17 сдесдадссуд дстдаєсесда сс 23 «210» 18 «2115 22 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 18 бо тааадсстдса адстадасса сс 22 «210» 19 «2115 20 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК 70 «400» 19 дасасдадсд хаассаєсад 20 «2105» 20 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК «4005» 20 тдаадессааа ддасасдадає 20 «2105» 21 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК «400» 21 дсаассаєсд дсддсатада 20 «2105» 22 «2115 51 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність

Зо «220» «223» Праймер «4005» 22 сатасдвтаєс стдаєдадіс сдасдаддасд ааасдадсаа дсісдісдає а 51 «2105» 23 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 23 ааасдадсаа дстсдусдас асдадсдсаа ссассаддєс: ссададстад ааатадсаад 60 «2105» 24 «2115 51 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 24 сасдастсса стдаєдадіс сдасдаддасд ааасдадсаа дсісдістда а 51 «2105» 25 «2115 60 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер 65 «4005» 25 ааасдадсаа дстсдЕстда адссааадді асдадастаєс сстададстад ааатадсаад 60 «210» 26 70 «2115 51

«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 26 сатадддаєсас стдаєдадіс сдасдаддасд ааасдадсаа дсісдісота а 51 «2105 27 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 27 ааасдадсаа дстісдЕсдста ассаєсддсуд дсасадддеє сстададстад ааатадсаад 60 «210» 28 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 28 деЕсссададс тадааастадс аадсстаааатст ааддстадіс сдістассаас ттідаааааді 60 «2105» 29 «2115 60 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 29 сдссаєсдссд аадсаєдутд сссадссддс дссадсдадд аддстдддас сатдссддсс 60 «2105» 30 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 30 аддссдддас сасдссддсес аааадсассуд астсддтдсс асттттссаа дісдатааса 60 «210» 31 «2115 51 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Праймер «400» 31 аадсадесса аадстдіссс атссдссастд ссдаадсатд сдсссадсс а 51 65 «2105 32 «2115 230 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»

Зб

«223» аРНК конструкція «4005 32 сатасдвтаєс стдаєсдадіс сдасдаддасд ааасдадсаа дсісдісдає асдадсдатаа 60 ссассаддес ссададссад ааасадсаад їстаааастаад дстадсссує тассаасттд 120 ааааадсддс ассдадссдд каст тдодс сддсатддіс ссадсстсст сдстддсдсс 180 додстдддсаа сатдастсду сасддсдаас дадасадсее єддастадсе 230 «2105» 33 «2115 230 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК конструкція «4005» 33 сасдастсса стдаєдадіс сасдаддасд ааасдадсаа дсісдістда адесаааддс 60 асдадаєсдес ссададссад ааасадсаад ссаааатаад дстадсссус тассаасттд 120 ааааадсддс ассдадесда дасте кдоас сддсатдадєс ссадсстсст сдстддсдсс 180 дастдддсаа сасдсессдод сасддсдаає дддасадсес кддастадсе 230 «2105» 34 «211» 230 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК конструкція «4005» 34 сасдддаєсас стдаєдадіс сдасдаддасд ааасдадсаа дсісдісдста ассатсддсд 60 дсатадддес єсададссад ааасадсаад їтаааастаад дстадсссує тассаасттд 120 ааааадсддс ассдадссдд каст тдодс сддсатддіс ссадсстсст сдстддсдсс 180 дастдддсаа сасдсессдод сасддсдаає дддасадсес кддастадсе 230

«2105» 35 «2115 180 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність

«220» «223» азднк оліго «4005» 35 аасттдЕсст хдесоддасаа дасстасдаа десдааддса єдадаєдддс ходдсаасдсс 60 аасдааєсда асдстдстта сдстдстдає сдааєсддста сдстсдаєса адддстасуєс 120 тсдктаєсаєс ассасстісдуд дідесдаєда асстдестудсе ссдаасддкта стдссуддеєс 180 бо «2105» 36 «2115 180 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» азднк оліго «4005» 36 70 хєстдссаа саєсстстдаа ассастдсса сдаєссастда хтастдстаас дсіссадстд 60 ааассдасад ахсдстаєсада аасасстасі адасастасс саадассаде стасттдудє 120 т сдссадста асттддесда стсдаасудус ссадссааді тастддааас тссаастдас 180 «2105» 37 «2115 180 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» азднк оліго «4005 37 саддсдасттї саасттдесс стасстддаса адаєстсасда ддсадасдда ссдадасддда 60 стдасаасдс ааасдадстд аасдасдсест астдаатдсс дссдатддса сдсасдсаєс 120 аададеесає стасустдаєЄ аастастсссї ддсдсадаєд аастасссдудс сттдаастуді 180 «2105» 38 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК «4005 38

Зо таастссаді аасттссттад 20 «2105» 39 «2115 20 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» аРНК «4005» 39 ддаєссаєсдуд хдааадента 20 «2105» 40 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК «4005» 40 ассдсдаєст стесаааддад 20 «210» 41 «2115 51 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Праймер «400» 41 састададеста стдаєдадіс сдсдаддасд ааасдадсаа дстсдістаа с 51 65 «2105» 42 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»

«223» Праймер «4005» 42 ааасдадстаа дстсудЕстаа стссадстаає хссттддаєЕ стададстад ааатадсаад 60

«2105» 43 «2115 51 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність

«220» «223» Праймер «4005» 43 сатдсддасс стдаєдадіс сдідаддасд ааасдадсаа дстісдІсадЕ с 51 «2105» 44 «2115 60 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 44 ааасдадсаа дстсдЕсдаєЄ ссастддіда аадсттдаєс ссададстад ааатадсаад 60 «2105» 45 «2115 51 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер

«4005» 45 сатдасдсаає стдаєдадіс сдасдаддасд ааасдадсаа дстсдісаїї ад 51 «210» 46 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 46 ааасдадсаа дстсудесаєт дсдаєстстї тааадддаєє ссададстад ааатадсаад 60 «2105» 47 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 47 дЕсссададс хтадааасадс аадссаааас ааддстадіс сдітассаас тідаааааді 60 бо «2105» 48 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Праймер «4005» 48 70 сдссатдссуд аадсасдєстд сссадссддс дссадсдадда аддастдддас сасдссддсес 60

«2105» 49 «2115 60 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 49 аддссдддас сасдссддсес аааадсассуд астсддтдсс асттттссаа дісдатаасд 60 «2105 50 «2115 51 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 50 аадсадесса аадстдіссс атссдссасд ссдаадсатд сдсссадсс а 51 «210» 51 «211» 230 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220»

Зо «223» аРНК конструкція «400» 51 сатадададета стдаєдадіс сасдаддасд ааасдадсаа дстсдістаа стссадтсаає 60 хссттдудЕЄ сададсстад ааасадсаад ссаааасаад дстадсссує тассаасттд 120 ааааадсддс ассдадссдд каст тдодс сддсатддіс ссадсстсст сдстддсдсс 180 дастдддсаа сасдсессдод сасддсдаає дддасадсес кддастадсе 230 «2105 1352 «2115 230 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК конструкція «4005 52 сатдсддасс стдаєдадіс сдідаддасд ааасдадсаа дсісдісдудх ссаттдоаєда 60 аадстсддес ссададсстад ааасадсаад їстаааастаад дстадсссує тассаасттд 120 ааааадсддс ассдадссдд каст тдодс сддсатддіс ссадсстсст сдстддсдсс 180 дастдддсаа сасдсессдод сасддсдаає дддасадсес кддастадсе 230 «2105 53 «2115 230 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК конструкція 65 «400» 53 сатдсдсаасє стдаєдадіс сасдаддасд ааасдадсаа дсесдесаєе дсдаєсстстє 60 тааадддаєє ссададсстад ааасадсаад ссаааасаад дстадсіссдс тассаасттд 120 70 ааааадсддс ассдадссдд каст тдодс сддсатддіс ссадсстсст сдстддсдсс 180 дастдддсаа сасдсессдод сасддсдаає дддасадсес кддастадсе 230 «2105» 54 «2115 90 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» азднк оліго «4005» 54 стдссаєсаа сессасадає адссстддіс састддсдаа адсастадесд сдудссттдсад 60 адсасададд ссдсадаасд касестадає 90 «2105 1055 «2115 90 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» азднк оліго «4005. ч555 аадсуктаєста сааасдааас саадаєссад астдудсдаєст стсаастадд стддісссст 60 адсдасадад састсдаєся ксссадаааа 90

Зо «2105» 56 «2115 111 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» азднк оліго «4005. Кь56 хсатдсасда ааадсаааса аасттдтдсд стссаєсдда хдіссдсасс таастаадта 60 аксадесдаа дсасстаддес ссааааєттд естастаааа асасастдасдд а 111 «2105 57 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005 57 дЕсссададс хтадааасадс аадссаааас ааддстадіс сдітассаас ттдаааааді 60 «2105. 58 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Праймер «4005 м58 сдссаєсдссд аадсаєдутд сссадссддс дссадсдадд аддстдддас сатдссддсс 60 65 «2105» 59 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 м

«223» Праймер «4005 59 аддстдддас сасдссддсес аааадсассуд астсддтдсс асттттссаа дісдатаасд 60 «2105» 60 «2115 51 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 60 аадсадесса аадстдіссс атссдссастд ссдаадсатд ссдсссадсс а 51 «210» 61 «2115 225 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» МтТНнІ «400» 61 адсадсестс аасссасдас Іст тїсдада адададааст студідаасудс тсстссддад 60 тасастдата дадстадада сдадаєсааа аааадаєстає суддсстсстс асстадсада 120

Зо аддісасаєс асссаадсад тасдсаєсса дсдадсадда дассаадсує доудстдаааді 180 дддадессас ссддасаа кдсстсдЕст тассаассаа дсата 225 «2105» 62 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК «4005» 62 сеЕСстстстсС даадаадссад 20 «2105» 63 «2115 20 «2125» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» аРНК «4005 63 адаєсаадсд хддстдааад 20 «2105» 64 «2115 51 «212» ДНК 60 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер 65 «4005» 64 сасдададад стдаєдадіс сдсдаддасд ааасдадсаа дстсдтсстс Є 51 «2105» 65 «2115 60 70 «212» ДНК

«2135 Штучна послідовність «223» Праймер «4005» 65 ааасдадстаа дстсдЕсстс хстЕстІсдаа даадссдує стададстад ааатадсаад 60 «210» 66 «2115 51 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «400» 66 сатаєдаєстї стдаєдадіс сдсдаддасд ааасдадсаа дстісдісада є 51 «2105» 67 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер «4005» 67 ааасдадсаа дсісдісада їсаадсдсдд стдаааддєс стададстад ааатадсаад 60

Зо «210» 68 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер перекриття «400» 68 деЕсссададс тадааастадс аадсстааааї ааддстаденс сдттассаас тідааааваадт 60 «2105» 69 «2115 60 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Праймер перекриття «400» 69 сдссаєсдссд аадсаєдустд сссадссддс дссадсдадд аддстдддас сахєдссддсс 60 «2105 70 «2115 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер перекриття бо «4005 70 аддссдддас сасдссддсес аааадсассуд астсддтдсс асттттссаа дісдатаасд 60 «2105 71 65 «2115 51 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 70 «223» Праймер перекриття

«4005 71 аадсадеєсса аадстдессс атссдссата ссдаадсата єтдсссадсс д 51 «2105 72 «2115 230 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» аРНК конструкція «4005 72 саєдададад стдаєдадіс саєдаддасд ааасдадстаа дстсаксстс хсттстсдаа 60 даадусдає тададстад ааасадсаад таааасаад дстадеіссду хассаастта 120 ааааадсддс ассдадесдд касет соддс сдасаєдаєс ссадсстсст састддсадсс 180 дастадддсаа саєсдстєсдд саєдасдаає дддасадсее ткддастдсеє 230 «2105 73 «2115 230 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» аРНК конструкція «4005 73 саєсдедаєся стдаєдадіс саєдаддасд ааасдадсаа дстісадассада ссааасдтда 60 стдаааддаєє тададстад ааасадсаад їхтаааасаад дстадессує тассаасттд 120 ааааадсддс ассдадесдд касет соддс сдасаєдаєс ссадсстсст састддсадсс 180 дастадддсаа саєсдстєсда саєдасдаає дддасадсе ткддастдсеє 230 «2105 74 «2115» 504 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» азднк оліго «4005 74 дааатаєстуд ссаєтстасс ссттаєттсаа дсгасствеє ее сатсссасає 60 т етаєсастад сстсаатстс саєтаадааа аааааєтттає асаассааає дасаєтттес 120 сс стс ааастттата асдсасстує аастадсетст тет таста ааааасадса 180 тдодадееє саасаастта аддааасата сааааадаєтс хактсатттс астссаадта 240

ЕЕ тааад тастаєстдааа діЕхстсаата дсдааассас аадсадсаат асааададаа 300 т Е-стаєссда асдсатадад хтасасасаст саааддаатад ха сас сассассадс 360 60 аасттсдааа аассаадї тасаасдасд хссаттадаа ссдастааса діаатсатдд 420 дЕстасаадс хссстасадд ссаєтссодда ааасасдаєд адсдасадід ахтаатдудсттс 480 теЕсесаааді сттдссастає саатє 504 65 «2105 75 «2115 498 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70

«223» азднк оліго «4005 75 дЕЕСтДссС ссстсСтТасту сдсасасдса астаастаає дастстксає єстссдааатті 60 тсстаассас аадсстааєса сдададсдад сстадаєдаа дсасттассса ааасдуттета 120 тдасаєатаєт хєсдссадата естаєтадс адасссаєсс аасаєтстст діаасдддса 180 тсссааан-ї ассаададад ад-таєссудда єссдадаєсеста аасдатастаа даєсдтаєт 240 дасадссдад аадестааддс ссдааєддадд тааєсааста ссудаадсаа таасоадсада 300 єдасаасатд ссссадееста аддеісасааєті астассаста татістадсуд ахдадассає 360 аассдсаасд тадессаєє садаєстата сасддадасе аасттадаєт ахдааєстссаа 420 астаассадс дссааатата садсадсдас сдстадаааа адасаєдадс атахтаастдд 480 тадааасдаа дссассах 498 «2105 76 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер м

Зо «4005 76 ддаасаєстд ссатестасс 20 «2105 77 «2115 31 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер перекриття гем «4005 77 дадддаддсад аааасаєтда садсддсааа с 31 «2105 78 «2115 31 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер перекриття гем «4005 78 дЕстсдссаст ассааїтдеєс сстдссссст с 31 «2105 79 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Праймер гем «4005 79 65 асдасддасес саєстетестасс 20 «2105» 80 «2115 20 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність

«223» Праймер м «400» 80 тасдадссса тесстссадие 20 «2105» 81 «2115 20 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер гем

«400» 81 ассдєдсстс тастдстата 20 «2105» 82 «2115 30 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер ампліфікації Му «4005» 82 адаадасадсї адсдаєдааа ссаєаатсдс 30 «2105 83 «2115 38 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Праймер ампліфікації гем «400» 83 дастасааєт асстассаста тасестадсд саєсстсст 38

Claims (18)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб одержання молочної кислоти з рекомбінантної дріжджової клітинної культури з використанням глюкози як джерела вуглецю, який включає: а) культивування щонайменше диплоїдних дріжджів на стадії ферментації посіву штаму рекомбінантної дріжджової клітинної культури для отримання біомаси, де дріжджі культивують в культуральному середовищі при рН від 5 до 7, р) культивування вказаних дріжджів на стадії виробничої ферментації з використанням біомаси із стадії ферментації посіву для отримання молочної кислоти, при цьому дріжджі інокулюють при щільності клітин 00600 не менше 5 і культивують в культуральному середовищі при рн менше 5 до досягнення кінцевого рН менше 3,5, і при цьому вказані дріжджі є штамом СВ57962 з 5. сегеумізіає і експресують лактатдегідрогеназу (ОН) з Гасіюбастих ріапіапгит, при цьому вказаний штам дріжджів нокаутує по експресії генів РОСІ, РОС5 ї РОС, і при цьому стадія ферментації посіву і стадія виробничої ферментації проходять в окремих ферментерах.

2. Спосіб за п. 1, в якому дріжджі є диплоїдними дріжджами. 60

3. Спосіб за п. 1 або 2, в якому дріжджі є поліплоїдними або анеуплоїдними дріжджами.

4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, в якому етап ферментаційного виробництва проводять з рн менше 4,5, конкретно менше 4, а саме менше 3,5, переважно етап ферментаційного виробництва має кінцевий рН З або менше, а конкретно етап ферментаційного виробництва має кінцевий рН З або менше, конкретно етап ферментаційного виробництва має кінцевий рн менше 2,9, менше 2,8, менше 2,7, менше 2,6, менше 2,5, менше 2,4, менше 2,3, менше 2,2, менше 2,15 або менше.

5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, в якому етап ферментації посіву штаму рекомбінантної дріжджової клітинної культури проводять в умовах періодичного живлення і/або етап посіву штаму рекомбінантної дріжджової клітинної культури для проведення ферментації проводять в періодичних умовах, зокрема етап посіву ферментації і етап виробничої ферментації проводять в окремих біореакторах.

6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, в якому молочна кислота виробляється у вільній формі, конкретно її одержують в оптично чистій ізомерній формі, конкретно або О(-), або І (ї)-молочна кислота.

7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, в якому дріжджі мають зменшену або нокаутовану експресію одного або декількох генів РОС1, РОС5 і/або РОСб.

8. Спосіб за п. 7, в якому один або кілька промоторів генів РОС1, РОС5 і/або РОСб заміщені або нокаутовані.

9. Спосіб за п. 8, в якому гени РОС1, РОС5 і/або РОСб є умовно експресивні, зокрема, завдяки контролю промоторів гетерологічних промоторів, а переважно промоторів, які репресують глюкозу, більш конкретно, завдяки контролю промоторів генів НХТ2 або НХТА.

10. Спосіб за будь-яким з пп. 7-9, в якому видаляють хоча б один з генів РОС1, РОС5 і/або РОСб.

11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-10, в якому у дріжджів зменшена або нокаутована експресія одного або декількох генів, які кодують білки, які взаємодіють з датчиками глюкози, які контролюють або регулюють експресію генів, зокрема експресію білків 541 або МЕНІ.

12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, при якому ген МТНІ частково або повністю видалений.

13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-12, в якому дріжджі модифікують до гіперекспресії хоча б одного гена транспортера гексози.

14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, в якому дріжджі модифіковані для одержання гіперекспресії щонайменше одного гена транспортера гексози, який вбирають з групи генів НХТІ1, НХТ2, НХТЗ, нНХхтА4, НХТт5, НХТтв, НХТ7, НХТт8, НХТО, НХТ10, НХТ11, НХТ12, НХТ13, НХТ14, НХТ15, НХТІ16, НХТІ17, САІ2, З5МЕЗ і КОТ2. Зо

15. Спосіб одержання молочної кислоти з глюкозою як джерелом вуглецю з використанням рекомбінантного штаму дріжджів, який включає: а) етап посіву штаму рекомбінантної дріжджової клітинної культури для проведення ферментації для отримання біомаси, на якому дріжджові клітини культивують в поживному середовищі клітин з рН від 5 до 7, а потім Б) етап виробничої ферментації, на якому виробляють молочну кислоту, в якому дріжджові клітини культивують в середовищі клітинних культур, причому досягають кінцевого значення рн менше 3,5, де дріжджі кодують гетерологічну лактатдегідрогеназу (ОН) і мають зменшену активність піруватдекарбоксилази (РОС), і де дріжджі є 5. сегемізіде штамом СВ57962.

16. Спосіб за п. 15, де на стадії Б) дріжджові клітини культивують в середовищі для культивування клітин до кінцевого рН переважно менше 3,4, менше 3,3, менше 3,2, менше 3,1, менше 3,0, менше 2,9, менше 2,8, менше 2,7, менше 2,6, менше 2,5, менше 2,4, менше 2,3, менше 2,2, менше 2,15 або менше.

17. Спосіб одержання молочної кислоти з глюкозою як джерелом вуглецю з використанням рекомбінантного штаму дріжджів, який включає: а) етап посіву штаму рекомбінантної дріжджової клітинної культури для проведення ферментації в першому ферментері для отримання біомаси, на якому дріжджові клітини культивують в поживному середовищі клітин з рН від 5 до 7, а потім р) етап виробничої ферментації в другому біореакторі інокульованої від посіву ферментації для виробництва молочної кислоти, при цьому дріжджові клітини культивують в середовищі культивування клітин доти, доки кінцевий рН не буде менше 3,5, при якому дріжджі модифіковані для того, щоб мати активність лактатдегідрогенази (ІОН) і/або зменшення активності піруватдекарбоксилази (РОС), і де дріжджі є 5. сегемізідае штамом Св57962.

18. Система з двох або більше біореакторів для виробництва молочної кислоти з глюкозою як джерелом вуглецю з використанням штаму рекомбінантних дріжджів, де це поєднання складається з: а) біореактора для посіву штаму рекомбінантної дріжджової клітинної культури для проведення ферментації для отримання біомаси, в якому клітини дріжджів культивують у середовищі бо клітинних культур з рН 5 до 7, і наступного р) виробничого біореактора, інокульованого з посіву ферментації для одержання молочної кислоти, в якому дріжджові клітини культивують у поживному середовищі клітин до остаточного рН менше 3,5, при якому дріжджі кодують гетерологічний ген лактатдегідрогенази (І ОН), і одержують зменшену активність піруватдекарбоксилази (РОС), і де дріжджі є 5. сегеу/ізіає штамом СВ57962. Севндаренни процес виробити Двовтанна ферментація дріжажів, з бактавиме мевачнеї кислоти виробництво МОЛОЧНОЇ КУКСИ " при низькому ри Цукор Цукор Ферментація | | тав РМ клея І ферментації З Коо-, ВИСПОТИ і т ! : Підкислення | | 2 атай . дкслення 0 ферментації З ке т де ще ей Очищенню | | Очищення Молочне ; . МОопочнОї : КСО Ко : КСО ТИ : воші бЛлЬ що Полімерізація . Полімерізація пк пк

ФІГ. 1

Двоетапний процес різь рн«З Цукор ; Молечна кислота ль Перемикач их їх | умов й і й - Ши ше приросту ) (000 утворення Го--е ш-ш.ь ей молочної кислоти Тео провесу, з підживленням я Біомаса Тии процесу; небезпарераньія (вафайси) дон» | ; (ваїсв) нИизЗака кону. ГглЛюкази ххх висока конц. глюкози йзака конц, глКУ ШИ ж на початку запуск онтим. живпення Глюкоза х о кРму кРКв ту утворення біомаси ши З запуск утворення утворення о молочної кислоти ! Молочна рай : шк ; я КИСЛОТа де З

Фіг. 2