KR20220034859A - 락트산 내성이 개선된 효모 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호: 2의 전사 인자를 코딩하는 핵산 서열, 구체적으로 Haa1을 불활성화 또는 결실시키는 유전자 변형을 적어도 포함하는 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포를 개시한다. 본 발명에 따른 유전자 조작된 효모 세포는 모체 세포에 비해 락트산 내성, 락트산 생성 또는 이들의 조합이 개선된다.
Description
락트산 내성이 개선된 효모 및 이의 용도에 관한 생명 공학, 특히 유전 공학
재생 가능한 자원으로부터 생성되는 유기산은 여러 산업 분야에서 매력적인 분자가 되고 있다. 에너지 산업에서, 바이오에탄올 및 바이오부탄올은 오랫동안 개발되어 왔고, 상업적으로 사용되었다. 락트산 및 숙신산이 또한 생물학적으로 생산되어, 다양한 응용 분야 예컨대 식품 산업의 식품 및 사료 첨가제, 퍼스널 케어 제조에서 마일드 (mild) 용매 적용 및 바이오-기반 수지 제조를 위한 바이오-폴리머 합성에서 원료로 사용된다. 전술한 모든 분자는 발효로 불리우는 잘 알려진 공정에 의해 생성된다. 발효 공정의 가장 큰 문제는 제조 비용이다.
제조 비용을 줄이기 위한 여러 시도가 있었다. 발효 공급원료의 비용을 줄이기 위해, 농업 폐기물 예컨대 제당 산업 (sugar industry)으로부터 나오는 버개스 (bagasse)가 제안되었다. 버개스 유래의 셀룰로스는 박테리아 이용을 위해 발효 가능한 당으로 물리적 및 화학적으로 분해될 수 있다. 그러나 전처리 과정으로부터 발생하는 다양한 불순물이 박테리아에 대한 억제 효과를 유발한다. 예를 들어, 헤미셀룰로스 분해로부터 방출되는 아세테이트는 대부분의 미생물에 대해 잘 알려진 억제제이다. 또한, 버개스 저장 중에 일부 박테리아의 오염으로 인해 생성된 원치 않는 락트산이 또한 발효 공정에 영향을 줄 수 있다.
한편, 발효 중 세포 손상을 방지하는 문제도 비용이 많이 든다. 예를 들어, 이는 약산 예컨대 락트산 및 숙신산 생성의 경우에 발생한다. 이들 산이 발효되는 동안, 생성된 락트산을 중화하고, 생성된 락테이트의 탈염 (desalination)으로 pH 저하로 인한 세포 활성 손상을 방지하는 것이 중요하다. 생명공학 공정에서 사용되는 강력한 박테리아들 중 효모는 견고성 (robustness) 및 낮은 pH 내성 때문에 주로 사용되어 왔다. 여전히, 2.8 미만의 pH 값에서는 조작된 효모 균주의 락트산 생산이 강하되었다. 그러므로, 효모에 더 높은 락트산 저항성을 부여하면 비-중화 조건하에 락트산 생산성을 개선할 것이다.
사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 효모에서 여러 연구가 수행되었고, 이에 의해 효모 세포는 HAA1 유전자에 의해 코딩된 전사 인자의 조절에 의해 산에 반응한다는 것이 명확하게 나타났다.
Sugiyama 등 (Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80, 3488-3495)은 전사 인자를 코딩하는 HAA1 유전자를 과발현하여 이의 단백질인 Haa1p의 뉴클레아제로의 재국소화를 모방하고, 이에 의해 이들은 결과적으로 사카로마이세스 세레비지에에서 락트산 저항성을 개선하기 위해 약산 적응 기전 (weak acid adaptation mechanisms)을 유도하는 방법으로 접근하였다. 이 연구는 또한 haa1 파괴체 (disruptant)가 모체 균주에 비해 심각한 락트산 민감성을 유발하였음을 발견하였다.
Tanaka 등 (Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78, 8161-8163)은 사카로마이세스 세레비지에에서 아세트산 내성을 향상시킬 수 있는 HAA1의 과발현에 대해 유사한 결과를 개시하였다.
US9085781B2 및 Swinnen 등 (Microbial Cell Factories, 2017, 16:7, 1-15)은 사카로마이세스 세레비지에에서 HAA1 발현을 미세 조정하기 위해 점 돌연변이를 유도하려고 시도하였고; 그러므로 이는 야생형 대립유전자에 비해 더 높은 아세트산 저항성을 유도하였다.
WO2016083397A1은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지에에서 내산성을 개선하기 위한 HAA1 및 이의 파라로그 CUP2의 조합을 개시하였다. 상기 접근 방식을 상업화된 제조 규모로 사용하는데는 이러한 복잡성이 주요 장애가 되었다.
또한, 이 연구 분야에서 효모 균주, 특히 사카로마이세스 세레비지에에서 락트산 내성을 개선하기 위한 일부 연구가 있었지만, HAA1 유전자의 사용은 포함되지 않았다.
US9994877B2는 SUL1, STR3, AAD10, MXR1, GRX8, MRK1, GRE1, HTX7, ERR1, 또는 이들의 조합의 활성을 증가시킨 유전자 조작된 효모 세포를 개시하였다. 수득된 효모 균주는 이의 모체 세포에 비해 내산성이 증가되었고, 락테이트를 생성하는데 유용하다.
US9758564B2는 락트산 저항성을 증가시키기 위해 Fps1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시킨 내산성 효모 세포를 개시하였다.
US10053714B2는 포스파티딜이노시톨 (PI) 및 세라마이드의 이노시톨 포스포릴세라마이드 (IPC) 및 디아실글리세롤 (DG)로의 전환을 촉매하는 효소 활성의 증가, 또는 지방 아실-CoA의 지방 아실 부위로 이중 결합의 도입을 촉매하는 효소 활성의 증가, 및/또는 DG 또는 이들의 조합으로부터 트리아실글리세롤 (TG)의 형성을 촉매하는 효소 활성의 감소, 및 선택적으로 1-20개의 탄소 원자를 갖는 유기산, 특히 락트산의 내성을 증가시킬 수 있는 외부 미토콘드리아 NADH 데하이드로게나제 NDE1 및/또는 NDE2의 활성을 감소시키는 유전자 변형을 포함하는 내산성 유전자 조작된 효모 세포를 개시하였다.
Suzuki 등 (Journal of Bioscience and Bioengineering, 2013, 115, 467-474)은 락트산 저항성을 유도하는 유전자 파괴들을 조합하여 사카로마이세스 세레비지에에서 내산성 효모의 제작을 보고하였다. 이 연구에서는 94개의 유전자 파괴체가 락트산에 대한 저항성을 나타내는 것을 발견하였고, 여러 유전자들의 파괴들을 조합하여 락트산 저항성을 더욱 향상시켜서, 중화 없이 높은 락트산 생산성을 유도하였다.
상기 언급된 이유로부터, 본 발명은 다른 비-전통적 효모, 구체적으로 클루이베로마이세스 종 (Kluyveromyces sp.)에서 락트산 내성을 향상시키는 간단한 접근법을 개시하였고, 여기서 HAA1의 결실은 락트산 내성, 락트산 생성 또는 이들의 조합의 개선을 충분히 야기하였다.
본 발명의 개선된 효모는 광범위한 양상에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만, 임의의 산 불순물을 함유하는 저-비용 공급원료를 사용하여 발효를 수행하는 발효 공정에 이를 사용하여, 높은 수준의 유리 락트산을 갖는 발효액을 생성할 수 있다. 상기 이점은 비용-효율적 제조이다.
발명의 요약
본 발명은 서열번호: 2의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 구체적으로 Haa1을 불활성화 또는 결실시키는 유전자 변형을 적어도 포함하는 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전자 조작된 효모 세포는 모체에 비해 락트산 내성, 락트산 생성 또는 이들의 조합이 개선된다.
도 1 MYR2297 및 MYR2787 균주 유래의 HAA1 유전자를 결실시키는데 사용되는 카세트를 함유하는 플라스미드인 pHAA1del2의 구조.
도 2 MYR2297 및 MYR2787 균주 유래의 HAA1 유전자를 결실시키는데 사용되는 절차의 개략도.
도 3 0.5% (pH 2.7), 1.0% (pH 2.5), 1.5% (pH 2.4), 2.0% (pH 2.3) 락트산 보충을 함유하거나, 또는 락트산 보충을 함유하지 않는 (pH 3.5) CM 마이너스 우라실 고체 배지 (CM minus uracil solid medium)에서, 30℃에서 2일 동안 인큐베이션된, MYR2297 모체 세포 (MYR2297 HAA1) 및 Δhaa1 파괴를 포함하는 MYR2297 (MYR2297 Δhaa1)의 성장 성능.
도 4 0.5% (pH 2.7), 1.0% (pH 2.5), 1.5% (pH 2.4), 2.0% (pH 2.3) 락트산 보충을 함유하거나, 또는 락트산 보충을 함유하지 않는 (pH 3.5) CM 마이너스 우라실 고체 배지에서, 30℃에서 2일 동안 인큐베이션된, MYR2787 모체 세포 (MYR2787 HAA1), Δhaa1 파괴를 포함하는 MYR2787 (MYR2787 Δhaa1) 및 HAA1 과발현을 포함하는 MYR2787 (MYR2787 2X HAA1)의 성장 성능.
도 5 2일 동안 BioLector 발효에서 MYR2787 모체 세포 (MYR2787 HAA1), Δhaa1 파괴를 포함하는 MYR2787 (MYR2787 Δhaa1) 및 HAA1 과발현을 포함하는 MYR2787 (MYR2787 2X HAA1)의 성장 성능.
도 6 2일 동안 BioLector 발효에서 MYR2787 모체 세포 (MYR2787 HAA1), Δhaa1 파괴를 포함하는 MYR2787 (MYR2787 Δhaa1) 및 HAA1 과발현을 포함하는 MYR2787 (MYR2787 2X HAA1)에 의해 생성된 D-락트산 역가.
도 2 MYR2297 및 MYR2787 균주 유래의 HAA1 유전자를 결실시키는데 사용되는 절차의 개략도.
도 3 0.5% (pH 2.7), 1.0% (pH 2.5), 1.5% (pH 2.4), 2.0% (pH 2.3) 락트산 보충을 함유하거나, 또는 락트산 보충을 함유하지 않는 (pH 3.5) CM 마이너스 우라실 고체 배지 (CM minus uracil solid medium)에서, 30℃에서 2일 동안 인큐베이션된, MYR2297 모체 세포 (MYR2297 HAA1) 및 Δhaa1 파괴를 포함하는 MYR2297 (MYR2297 Δhaa1)의 성장 성능.
도 4 0.5% (pH 2.7), 1.0% (pH 2.5), 1.5% (pH 2.4), 2.0% (pH 2.3) 락트산 보충을 함유하거나, 또는 락트산 보충을 함유하지 않는 (pH 3.5) CM 마이너스 우라실 고체 배지에서, 30℃에서 2일 동안 인큐베이션된, MYR2787 모체 세포 (MYR2787 HAA1), Δhaa1 파괴를 포함하는 MYR2787 (MYR2787 Δhaa1) 및 HAA1 과발현을 포함하는 MYR2787 (MYR2787 2X HAA1)의 성장 성능.
도 5 2일 동안 BioLector 발효에서 MYR2787 모체 세포 (MYR2787 HAA1), Δhaa1 파괴를 포함하는 MYR2787 (MYR2787 Δhaa1) 및 HAA1 과발현을 포함하는 MYR2787 (MYR2787 2X HAA1)의 성장 성능.
도 6 2일 동안 BioLector 발효에서 MYR2787 모체 세포 (MYR2787 HAA1), Δhaa1 파괴를 포함하는 MYR2787 (MYR2787 Δhaa1) 및 HAA1 과발현을 포함하는 MYR2787 (MYR2787 2X HAA1)에 의해 생성된 D-락트산 역가.
정의
본원에서 사용되는 기술 용어 또는 과학 용어는 달리 언급하지 않는 한, 당해 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 이해되는 정의를 갖는다. 본 발명의 이해를 돕기 위해, 명명법에 대한 설명이 하기에 제공된다.
본원에 언급된 장비, 장치, 방법 또는 화학물질은 본 발명에서 특별히 사용되는 장비, 장치, 방법 또는 화학물질이라고 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 당업자에 의해 일반적으로 작동되거나 또는 사용되는 장비, 장치, 방법 또는 화학물질을 의미한다.
청구범위 또는 명세서에서 용어 "포함하는 (comprising)"과 함께 사용되는 단수 또는 복수 명사는 "하나"를 지칭하며, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"를 포함한다.
본 출원에서 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 발명과는 상당히 다른 임의의 작용, 성능, 수정 또는 조정을 어떠한 실험 없이 얻어지는 구체예, 및 청구항에 구체적으로 명시되지 않았지만, 당해 분야의 통상의 기술을 가진 자가 본 구체예와 동일한 결과 및 유용성을 가진 목적을 수득하는 구체예를 포함한다. 그러므로, 본 구체예에 대한 대체 가능하거나 또는 유사한 목적은 당업자가 명백하게 알 수 있는 임의의 약간의 수정 또는 조정을 비롯하여, 첨부된 청구범위에 나타낸 발명의 정신, 범위 및 개념에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약 (about)"은 본원에 제시된 임의의 값이 잠재적으로 가변되거나 또는 벗어날 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 이러한 변동 또는 편차는 장치의 오류, 계산에 사용된 방법, 또는 장치 또는 방법을 구현하는 개별 작업자로 인해 발생할 수 있다. 여기에는 물리적 특성의 변화로 인한 변동 또는 편차를 포함한다.
명명법과 관련하여, 박테리아 유전자 또는 코딩 영역은 통상 이탤릭체 소문자로 기재되고, 예를 들어, 대장균 (E.coli) 유래의 "ldhA"로 기재되고, 해당 유전자에 의해 코딩된 효소 또는 단백질은 동일한 문자로 기재되지만, 그러나 이탤릭체 없이, 첫 문자는 대문자로, 예를 들어, "LdhA"로 기재된다. 효모 유전자 또는 코딩 영역은 이탤릭체 대문자로, 예를 들어, "HAA1"로 기재되고, 해당 유전자에 의해 코딩되는 효소 또는 단백질은 동일한 문자로 기재되지만, 이탤릭체 없이, 첫 문자는 대문자로, 예를 들어, "Haa1"로 기재된다. 특정 유전자에 돌연변이를 함유하거나, 또는 돌연변이체 표현형을 갖는 효모 균주의 경우, 유전자 또는 균주는 소문자 이탤릭체, 예를 들어 기능적 HAA1 유전자가 결여된 균주의 경우 haa1 또는 Δhaa1로 기재된다. 특정 유전자가 유래된 유기체를 명시하기 위해, 유전자 명칭은 속 및 종을 표시하는 2개의 문자가 선행될 수 있다. 예를 들어, KmURA3 유전자는 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus)로부터 유래되고, ScURA3 유전자는 사카로마이세스 세레비지에로부터 유래된다.
"효모 (yeast)"는 일부 조건 하에 단일 세포 상태로 성장할 수 있는 임의의 진균 유기체를 의미한다. 일부 효모 균주는 또한 일부 조건, 예를 들어, 기아 상태 (starvation) 하에 균사 상태 (hyphal state) 또는 유사 균사 (pseudohyphal) (즉, 짧은 균사) 상태로 성장할 수 있다.
"락트산 (Lactic acid)" 또는 "D-LAC" 또는 "D-락트산 (D-lactic acid)"은 락트산을 의미하고, 이의 염 예컨대 락테이트를 포함한다.
"유전자 조작 (Genetic engineering)" 또는 "유전자 조작된 (Genetically engineered)"은 하나 이상의 유전자 변형을 세포 또는 이에 의해 생성된 세포에 도입하는 활동을 의미한다.
"유전자 변형 (Genetic modification)"은 세포의 유전 물질의 특징 또는 구조에 있어서 인위적 변경을 의미한다. 유전자 변형은 모체 세포의 유전 물질의 화학적 변형 또는 모체 세포의 유전 물질과 관련하여 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 추가, 삽입 또는 결실을 위해 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 것을 포함한다.
"모체 세포 (Parent cell)" 또는 "모체 (Parent)" 또는 "모체의 (Parental)"는 기원 세포 또는 특정 유전자 변형이 없는 세포를 의미하며, 활성 또는 생산을 증가 또는 감소시키는, 유전자 조작된 세포를 생성하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다.
"야생형 (Wild type)"은 특정 유전자 변형이 없는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"형질전환체 (Transformant)"는 선형 또는 원형, 및 자가 복제 가능하거나 또는 가능하지 않은, 원하는 DNA 서열의 숙주 또는 모체 균주로의 도입 (installation)으로부터 유도된 세포 또는 균주를 의미한다.
"돌연변이 (Mutation)"는 네이티브 또는 모체 DNA 서열로부터의 임의의 변경, 예를 들어 역위, 복제, 하나 이상의 염기쌍의 삽입, 하나 이상의 염기쌍의 결실, 조기 정지 코돈을 형성하는 염기 변경을 유도하는 점 돌연변이, 또는 해당 위치에서 코딩되는 아미노산을 변경하는 미스센스 돌연변이를 의미한다.
"돌연변이체 (Mutant)"는 네이티브, 야생형, 모체 또는 전구체 균주와 비교하여, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 균주를 의미한다.
"카세트 (Cassette)"는 숙주 유기체에 도입되는 경우, 하나 이상의 원하는 단백질 또는 효소를 코딩하거나, 생성하거나, 또는 과생성하거나, 또는 대안으로서 그의 활성을 제거하거나 또는 감소시킬 수 있는 데옥시리보스 핵산 (DNA) 서열을 의미한다. 단백질 또는 효소를 생성하기 위한 카세트는 전형적으로 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 단백질 코딩 서열, 및 선택적으로 적어도 하나의 전사 종결인자를 포함한다. 카세트는 원형일 수 있는 플라스미드로 작제될 수 있거나, 또는 이는 중합효소 연쇄반응 (PCR), 프라이머 연장 PCR, 또는 DNA 단편들의 말단들 간의 인 비보 또는 인 비트로 상동 재조합에 의해 형성된 선형 DNA일 수 있으며, 상기 DNA 단편들 각각은 원하는 최종 카세트의 서브세트 (subset)이고, 여기서 각 서브세트 단편은 인 비보 또는 인 비트로 상동 재조합에 의해 인접한 단편들과 결합하도록 디자인된, 하나의 말단 또는 양 말단에서 중복 상동성 (overlapping homology)을 갖는다. 카세트는 통합시에 약 30 bp (base pairs) 이상의 직접 반복 서열 (통합된 선택 가능한 유전자의 양 말단에 존재하는 배향이 동일한 서열)로 둘러싸인 DNA 서열 또는 선택 가능한 마커 유전자를 포함하고, 상기 선택 가능한 마커를 포함하는 초기 카세트가 염색체 또는 플라스미드 내로 통합된 후에, 상기 선택 가능한 마커는 직접 반복 서열들 간의 상동 재조합에 의해 결실 ("루핑 아웃 (looping out)"으로도 알려짐)되도록 디자인될 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커 유전자는 항생제 G418 저항성 (kan 또는 kanR), 하이그로마이신 (hygromycin) 저항성 (hyg 또는 hygR), 제오신 (zeocin) 저항성 (zeo 또는 zeoR), 나투리신 (naturicin) 저항성 (nat 또는 natR), 및 생합성 유전자 예컨대 URA3, TRP1, TRP5, LEU2, 및 HIS3을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 선택 가능한 마커로 사용될 생합성 유전자의 경우, 숙주 균주는 상응하는 유전자에 돌연변이, 바람직하게는 비-복귀 널 돌연변이 (non-reverting null mutation)를 포함해야 한다. 예를 들어, URA3이 선택 가능한 마커 유전자로 사용되는 경우, 형질전환될 균주는 표현형이 ura3 이어야 한다.
"플라스미드 (Plasmid)"는 염색체보다 훨씬 더 작고, 미생물의 염색체 또는 염색체들과 분리되며, 염색체 또는 염색체들과 별개로 복제하는 선형 또는 원형 DNA 분자를 의미한다. 플라스미드는 세포 당 약 1개의 카피, 또는 세포 당 1개 초과의 카피로 존재할 수 있다. 미생물 세포내 플라스미드의 유지는 통상적으로 플라스미드의 존재를 위해 선택된 배지, 예를 들어 항생제 내성 유전자 또는 염색체 영양요구성 (auxotrophy)의 보충을 사용하는 배지에서의 성장을 필요로 한다.
"염색체 (Chromosome)" 또는 "염색체의 (Chromosomal)"는 플라스미드보다 실질적으로 더 크고, 통상적으로 임의의 항생제 또는 영양적 선택을 필요로 하지 않는, 선형 또는 원형 DNA 분자를 의미한다.
"파괴 (Disruption)"는 유전자 또는 코딩 영역에 의해 코딩된 효소 또는 단백질이 동일하거나 또는 유사한 성장 조건 하에 숙주 미생물의 야생형 버전에서 발견되는 수준보다 더 낮은 수준으로 숙주 미생물에서 생성되거나 또는 생성되지 않도록 하는 것을 의미한다.
"과발현 (Overexpression)"은 유전자 또는 코딩 영역에 의해 코딩된 효소 또는 단백질이 동일하거나 또는 유사한 성장 조건 하에 숙주 미생물의 야생형 버전에서 발견되는 수준보다 더 높은 수준으로 숙주 미생물에서 생성되도록 하는 것을 의미한다.
"깁슨 방법 (Gibson method)"은 2개 이상의 선형 DNA 단편들의 말단에 짧은 (약 15-40 bp) 중복 상동성을 갖는 이들 DNA 단편들을 함께 인 비트로 결합시키는 방법을 의미한다. 이 방법은 합성 선형 DNA 단편, PCR 단편, 또는 제한 효소에 의해 생성된 단편들로부터 플라스미드를 작제하기 위해 사용될 수 있다. 깁슨 방법을 수행하기 위해 키트, 예를 들어 NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England BioLabs, Ipswitch, Massachusetts, USA)를 구입하고, 제조자가 지시한 바와 같이 사용할 수 있다.
"역가 (Titer)"는 통상적으로 리터당 그람 (g/L) 또는 부피당 중량 % (%)로 표시되는, 발효액 (fermentation broth) 중 화합물의 농도를 의미한다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 다양한 유전자들이 하기 표 1에 열거되어 있다.
| 유전자 명칭 | 코딩된 단백질 또는 기능 | 출처 미생물 |
| EcldhA | D-락테이트 데하이드로게나제 | 대장균 (E. coli) |
|
URA3
ScURA3 KmURA3 |
오로티딘-5'-포스페이트 데카복실라제 | K. 마르시아누스 (K. marxianus) S. 세레비지에 (S. cerevisiae) |
|
PDC1
KmPDC1 |
피루베이트 데카복실라제 | K. 마르시아누스 |
| GPP1 | 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 | K. 마르시아누스 |
| NDE1 | NADH 데하이드로게나제-1 | K. 마르시아누스 |
|
HAA1
KmHAA1 Kmhaa1 |
산-반응성 전사 인자 | K. 마르시아누스 |
달리 명시하지 않는 한, 본 발명에서 재조합 DNA 및 유전 공학은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법 및 재료로 수행하였다. 플라스미드 및 선형 DNA 카세트는 제조자의 프로토콜에 따라 "깁슨 방법"을 사용하거나, 또는 전술된 바와 같은 인 비보 상동 재조합에 의해 조립하였다.
DNA 서열을 결실시키거나 또는 발현 카세트를 통합시키기 위해, 본 발명자들이 일반적으로 사용한 방법은 대장균에서 복제할 수 있는 플라스미드 상에 카세트를 조립하거나, 또는 카세트의 2개 이상의 서브섹션을 공동-형질전환시키는 것에 의해 표적 효모 균주에서 카세트를 인 비보 조립하고, 여기서 인접한 서브섹션들은 결합될 말단에서의 염기쌍과 염색체 표적 서열과 상동인 조립된 카세트의 말단에서의 염기쌍이 중복되도록 디자인된다. 클루이베로마이세스 종 염색체에의 통합을 위해 본원에 기재된 모든 카세트는 효모 URA3 유전자 (전형적으로 ScURA3 유전자 또는 네이티브 KmURA3 유전자)를 발현하도록 디자인되고, 수용 숙주 유기체 (recipient host organism)는 전형적으로 네이티브 KmURA3 유전자좌에서의 결실에 의해, 비-복귀 (non-reverting) ura3- 표현형을 갖는다. 후속 조작 단계들에서 URA3+ 선택을 재사용할 수 있도록 하기 위해, 각 카세트에서, URA3 유전자가 직접 반복 DNA 서열에 의해 둘러싸이고, 이는 URA3 유전자가 통합된 후에, 상기 직접 반복 DNA 서열들 간의 상동 재조합에 의해, 제2 단계에서는 5'-플루오로오로트산 (5'-FOA)을 함유하는 최소 배지에서 상기 URA3 유전자를 선택함으로써, 상기 카세트로부터 상기 URA3 유전자를 결실시키는 것이 가능하다.
그러므로, 통합을 위한 파괴 카세트의 일반적인 디자인은 하기 순서로 하기 특징을 갖는다: 1) 원하는 통합 표적 부위로부터 바로 상류에 있는 표적 염색체 서열에 상동인 염기쌍의 서열 "Up", 2) 원하는 결실 종점의 바로 하류에 있는 표적 염색체 서열과 상동인 염기쌍의 서열 "Down", 3) 선택 가능한 마커 유전자 예컨대 URA3 유전자 (및 선택적으로 역선택 가능한 마커 유전자), 4) 결실되기를 원하는 염색체 표적 서열의 적어도 일부와 상동인 염기쌍의 서열 "Middle". 형질전환 및 선택 시에, 조립된 카세트는 "Up" 서열 및 "Middle" 서열 간의 상동 이중 재조합 (homologous double recombination)에 의해 염색체 표적 부위로 통합된다. 정확한 통합을 포함하는 형질전환체는 정확한 예상 크기의 상류 및 하류 접합 단편 모두를 보여주는 진단용 PCR로 확인하였다. 두 번째 단계에서, 상기 선택 가능한 마커 유전자는 카세트 내부의 "Down" 서열 및 통합된 카세트의 하류에 국소적으로 존재하는 염색체의 "Down"에 상동인 서열 간의 역선택 및 상동 재조합에 의해 "루핑 아웃"된다.
한편, 통합을 위한 발현 카세트의 일반적인 디자인은 하기 순서로 하기 특징을 갖는다: 1) 원하는 통합 표적 부위로부터 바로 상류에 있는 표적 염색체 서열에 상동인 더 많은 염기쌍의 서열 "Up", 2) 통합되도록 디자인된 서열, 예를 들어 프로모터-ORF-종결인자 조합, 3) 원하는 결실 종점의 바로 하류에 있는 표적 염색체 서열과 상동인 염기쌍의 서열 "Down", 4) 선택 가능한 마커 유전자 예컨대 URA3 유전자 (및 선택적으로 역선택 가능한 마커 유전자), 5) 결실되기를 원하는 염색체 표적 서열의 적어도 일부와 상동인 염기쌍의 서열 "Middle". 상기 표적 염색체 서열이 동시 삽입 없이 결실되도록 의도된 경우, 상기 기재된 일반 디자인의 제2 단편 2)은 생략된다. 정확한 통합을 포함하는 형질전환체는 정확한 예상 크기의 상류 및 하류 접합 단편을 모두 보여주는 진단용 PCR로 확인하였다. 두 번째 단계에서, 상기 선택 가능한 마커 유전자는 카세트 내부의 "Down" 서열 및 통합된 카세트의 하류에 국소적으로 존재하는 염색체의 "Down"에 상동인 서열 간의 역선택 및 상동 재조합에 의해 "루핑 아웃"된다.
이하, 본 발명 구체예는 본 발명의 범위를 제한하려는 목적 없이 개시된다.
본 발명은 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포에 관한 것으로서, 상기 효모 세포는 서열번호: 2의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 불활성화 또는 결실시키는 유전자 변형을 적어도 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포는 산 반응성 전사 인자 Haa1인, 서열번호: 2의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포는 모체 세포와 비교하여 락트산 내성을 증가시키는 유전자 변형을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포는 모체 세포와 비교하여 락트산 생성을 증가시키는 유전자 변형을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포는 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 또는 클루이베로마이세스 서모톨레란스 (Kluyveromyces thermotolerans)로부터 선택될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포는 락트산 생성을 위한 모든 발효 공정에 사용될 수 있다.
락트산 내성 및 락트산 생성에 대한 KmHAA1 유전자의 영향을 평가하기 위해, HAA1 유전자의 파괴 및 과발현에 대한 유전자 변형을 연구하고, 그 결과를 모체 균주와 비교하였다. 결과는 도 3-6에 도시되어 있다.
하기 예는 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
락트산 내성에 대한 KmHAA1 유전자의 파괴 효과를 확인하기 위해, 2가지의 K. 마르시아누스 균주인, D-LAC 생성이 가능한 MYR2787 및 D-LAC 생성이 불가능한 MYR2297을 본 발명에 사용하였다.
K. 마르시아누스
균주 MYR2297 및 MYR2787의 DNA 형질전환 방법
하기 화학-기반 DNA 형질전환 방법은 Abdel-Banat 등 (Abdel-Banat, 2010)에 의해 공개된 프로토콜로부터, MYR2297 및 MYR2787 균주를 개선하기 위해 조정되었고, 이들 중 다수는 본원에 기재된 예에서 명명되고 사용되었다.
형질전환될 균주의 새로운 단일 콜로니를, 1 리터당 10 g의 효모 추출물, 20 g의 펩톤 및 3 g의 글루코스로 구성된 YPD 배지 5 mL에 접종하였다. 이 출발 배양물을 30 ℃의 진탕 인큐베이터에서 밤새 포화 상태로 성장시켰다.
그 후, 배양된 효모 5 mL를 2% 글루코스가 함유된 YPD 배지 45 mL에 접종하여, 30℃의 진탕 인큐베이터에서 225 rpm으로 약 4 내지 8시간 동안, 약 4 내지 5의 OD 600 nm에 도달할 때까지 인큐베이션하였다.
배양물의 성장 중에, 10 mg/ml의 단일가닥 연어 정자 (ssDNA)의 용액은, 서모사이클러 (thermocycler)에서 10분 동안 가열한 다음에, 얼음물 배스 (ice-water bath)에서 상기 튜브를 빠르게 냉각시켜서 제조하였다. 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브를 각 개별 형질전환을 위해 준비하고, 상기 각 튜브에 10 μl의 ssDNA 용액을 부가한 다음에, 균주로 형질전환시킬 실험 DNA를 5 내지 10 μl 부가하였다. 이상적으로, 상기 실험 DNA의 농도는 플라스미드당 DNA 약 500 내지 1,000 ng이어야 한다.
형질전환을 위해 세포를 화학적으로 준비하기 위해, 최종 농도의 PEG 3350 (40% 폴리에틸렌 글리콜), 2M 리튬 아세테이트 (LiAc) 및 1M 디티오트레이톨 (DTT)을 함유하는, 멸균 형질전환 혼합물 (TM)을 제조하였다. 실제로, 상기 TM은 형질전환 당일 3개의 스톡 용액들을 조합하여 제조하였다. 1 mL당 TM의 조성은 800 μl의 50% PEG3350, 100 μl의 2M LiAc 및 100 μl의 1M DTT이었다.
형질전환될 배양물이 약 4 내지 5의 OD 600 nm에 도달하면, 세포를 실온에서 7500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 따라내고, 세포 펠렛을 1 mL의 TM에 재현탁하고, 동일한 조건에서 다시 한 번 원심분리하였다. 상등액을 마이크로피펫으로 제거하고, 1 mL의 TM에 재현탁하였다. 후속 단계를 위해, 15 μl의 혼합 DNA 및 세포 현탁액의 분취액 85 μl를 각 형질전환 튜브에 부가하고, 약 1 내지 2분 동안 철저히 혼합하였다. 상기 튜브를 42℃ 수조 또는 가열 블록 (heating block)에 1시간 동안 배치하여 각 형질전환에 열 충격을 가하였다.
열 충격 후에, 마이크로퓨지 (microfuge)에서 최고 속도로 세포를 펠렛화하고, 1 mL의 CM 마이너스 우라실 배지로 헹구었다. 각 형질전환의 세포를 회전 침강시키고, 상등액을 피펫으로 제거하였다. 신선한 CM 마이너스 우라실 배지 1 mL에 각 펠렛을 재현탁하고, CM 마이너스 우라실 배지를 함유하는 플레이트 상에 세포 현탁액 100 μl를 스프레드하였다. 상기 플레이트를 30℃에서 콜로니가 나타날 때까지, 전형적으로 2 내지 4일 동안 인큐베이션하였다.
Δhaa1
파괴를 포함하는 균주 MYR2297 (MYR2297
Δhaa1
)의 제작
| 성분 | CM 마이너스 우라실 | SDM2 | YPD |
| 글루코스 | 가변량 (20-200 g) |
20 g | |
| 수크로스 | 가변량 (20-200 g) |
||
| Teknova CM-ura 믹스 | 1 L 팩 1개 | ||
| 제1 인산 칼륨 | |||
| 제1 인산 암모늄 | 13.8 g | ||
| 제2 인산 암모늄 | 3.96 g | ||
| 황산마그네슘. 7H2O | 0.493 g | ||
| 효모 추출물 | 10 g | ||
| 펩톤 | 20 g | ||
| 티아민 HCl | 200 mcg | ||
| 니아신 | 3 mg | ||
| 비오틴 | 10 mcg | ||
| 판토텐산 칼슘 | 400 mcg | ||
| 1000 X 미량 원소* | 1 ml | ||
| pH (수산화암모늄 또는 인산 사용) | 6.2 | ||
| MES (2-( N-모르폴리노) 에탄설폰산) | |||
| 베타인 | |||
| 염화 나트륨 | 0.234 g | ||
| 염화 칼륨 | 0.521 g |
*1000 X 미량 원소, 1 리터당: 1.6 g FeCl3 
6H2O, 0.1 g CuCl2 
2H2O, 0.2 g ZnCl2, 0.05 g H3BO3, 0.55 g MnCl2 
4H2O, 10 mL 85% 인산
출발 균주는 우라실 영양요구성 효모 균주 및 야생형 HAA1 유전자를 가진 K. 마르시아누스, 즉 MYR2297 HAA1이었다. 상기 HAA1 유전자는 플라스미드 pHAA1del2에 제작된 파괴 카세트를 통합하여 결실시켰다. 상기 파괴 카세트는 1) "HAA Up" 서열, 2) "HAA Down" 서열, 3) 선택 가능한 마커로서 ScURA3 서열 및 4) "HAA MID" 서열을 포함한다. pHAA1del2의 구조를 나타내는 도식도가 도 1에 도시되어 있고, 이의 서열은 서열번호: 1로 제시되었다. KmHAA1 결실 절차는 도 2에 도시되어 있다. 상기 파괴 카세트는 상동 재조합에 의해, 서열번호: 2의 아미노산을 코딩하는 표적 HAA1 유전자좌에 통합되도록 디자인되었다. CM 마이너스 우라실 배지에서 ScURA3 유전자로부터 선택함으로써 파괴체를 선택하였다. 그 다음에, 상기 URA3 유전자는 5'-FOA를 함유하는 배지에서 하류 플랭크의 직접 반복들 간의 상동 재조합에 의해 루핑 아웃되었다. 그 다음에 생성된 단일 콜로니를 필요에 따라 1회 이상 다시 스트리킹 (restreaked)하여, 배경 세포로부터 정확한 균주를 유리하고, 이형 접합 이배체 (heterozygous diploids)를 제거하였다. 정확한 삽입 및 정확한 루핑 아웃은 통합된 카세트의 바로 상류 또는 바로 하류에 있는 표적 유전자좌의 염색체 서열들 및 카세트의 말단들 사이의 경계를 묶는 적절한 프라이머를 사용하여 PCR로 확인하였다. PCR 진단은 단배체 (haploids)에 정확하게 통합된 카세트를 정확하게 통합된 동형 접합 이배체 (homozygous diploids)와 구별할 수 없었으므로, 이러한 구별은 제작의 어떤 단계에서도 수행되지 않았다. 루핑 아웃을 확인한 후에, 네이티브 KmURA3 유전자는 주형으로서 K. 마르시아누스 야생형 균주 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 수득된 선형 DNA 단편의 형질전환에 의해 재도입되어, CM 마이너스 우라실 플레이트에서 선택에 의해 우라실 원영양체 (prototroph)를 제공하였다. 현재 HAA1 유전자의 파괴를 포함하는 생성된 균주는 MYR2297 Δhaa1로 명명되었다.
Δhaa1
파괴를 포함하는 균주 MYR2787 (MYR2787
Δhaa1
)의 제작
출발 균주는 우라실 영양요구성 효모 균주 및 D-LAC를 생성할 수 있는 야생형 HAA1 유전자를 가진 K. 마르시아누스, 즉 MYR2787 HAA1이었다. MYR2787 HAA1의 제작은 하기에 기재하였다. EcldhA 유전자를 발현하도록 디자인된 3개의 상이한 카세트를 플라스미드 상에 제작하였다. 3가지 경우 모두에서, ldhA 유전자가 KmPDC1 프로모터로부터 발현되었다. 3개의 EcldhA 카세트를 디자인하고, 상동 재조합에 의해 KmPDC1, KmGPP1 및 KmNDE1 유전자좌인 표적 유전자좌에 삽입하였다. CM 마이너스 우라실 배지에서 ScURA3 유전자로부터 선택함으로써 파괴체를 선택하였다. 그 다음에 상기 URA3 유전자는 5'-FOA를 함유하는 배지에서 하류 플랭크의 직접 반복들 간의 상동 재조합에 의해 루핑 아웃되고, 후속 형질전환을 위해 상기 URA3 유전자를 재사용하였다. 각 형질전환 단계 및 각 루핑 아웃 단계에서, 단일 콜로니를 필요에 따라 1회 이상 다시 스트리킹하여, 배경 세포로부터 정확한 균주를 유리하고, 이형접합 이배체를 제거하였다. 정확한 삽입 및 정확한 루핑 아웃은 통합된 카세트의 바로 상류 또는 바로 하류에 있는 표적 유전자좌의 염색체 서열들 및 카세트의 말단들 사이의 경계를 묶는 적절한 프라이머를 사용하여 PCR로 확인하였다. PCR 진단은 단배체에 정확하게 통합된 카세트를 정확하게 통합된 동형 접합 이배체와 구별할 수 없었으므로, 이러한 구별은 제작의 어떤 단계에서도 수행되지 않았다. MYR2297 균주로부터 출발하여, 3개의 ldhA 카세트를 상기에 나열된 순서대로 한 번에 하나씩 도입하였다. 카세트의 각 초기 통합 후에, 상기 URA3 유전자는 5'-FOA 역선택에 의해 루핑 아웃되었다. 이와 같이 제3 카세트가 도입된 후에, 네이티브 KmURA3 유전자는 주형으로서 K. 마르시아누스 야생형 균주 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 수득된 선형 DNA 단편의 형질전환에 의해 재도입되어, CM 마이너스 우라실 플레이트에서 선택에 의해 우라실 원영양체를 제공하였다. 현재 통합된 ldhA 유전자의 3개의 카피를 함유하는 생성된 균주는 MYR2787 HAA1로 명명되었다.
HAA1의 파괴 카세트는 상기 MYR2297 Δhaa1의 제작에서 기재된 것과 동일한 절차로 상동 재조합에 의해 표적 유전자좌에서 통합되도록 디자인되었다. 현재 HAA1 유전자의 파괴를 포함하는 생성된 D-LAC 생산 균주는 MYR2787 Δhaa1로 명명되었다.
HAA1
과발현을 포함하는 효모 균주 (MYR2787 2X
HAA1
)의 제작
HAA1 과발현 카세트는 ldhA 발현 카세트로 교체하여 균주 MYR2287에 통합되도록 디자인되었다. 상기 플라스미드는 하기 순서로 하기 특징으로 갖는다: 1) 강력한 항시성 프로모터, 2) HAA1 코딩 영역, 3) 종결인자, 4) 선택 가능한 마커로서 ScURA3, 및 5) ldhA 유전자좌의 middle 서열에 대한 상동성. 상기 카세트가 3개의 ldhA 발현 유전자좌들 중 어느 하나에 통합될 수 있도록 디자인되었지만, GPP1 유전자좌에서 HAA1 과발현 카세트의 swop 통합이 추가 조사를 위해 선택되었다. 현재 ldhA 발현 카세트 대신에, GPP1 유전자좌에 HAA1 발현 카세트를 포함하는 생성된 D-LAC 생산 균주는 MYR2787 2X HAA1로 명명되었다.
락트산 보충 배지에서 효모 성장 비교
낮은 pH 조건에서 상기 기재된 바와 같이 수득된 모든 효모 균주들의 성장 성능을 결정하고 비교하기 위해, MYR2297 HAA1, MYR2297 Δhaa1, MYR2787 HAA1, MYR2787 Δhaa1 및 MYR2787 2X HAA1의 균주를, L-락트산을 함유하지 않거나, 또는 0.5%, 1.0%, 1.5% 및 2.0% w/v의 L-락트산을 함유하는 CM 마이너스 우라실 배지에서 배양하였다. 각 배지의 출발 pH는 각각 3.5, 2.7, 2.5, 2.4 및 2.3이었다. 모든 고체 배지는 2% 아가를 함유하였다. 효모 균주들 간의 성장 차이의 정량적 비교는 30℃에서 2일 동안 인큐베이션된, 동일한 아가 플레이트에서 서로 나란히 107개의 세포로부터 출발하여, 계열 10배 희석액을 스폿팅 (spotting)함으로써 수행되었다.
BioLector 2 리터에서 효모 성장 및 D-LAC 생성 비교
효모 성장 성능 및 이의 D-LAC 생성을 결정하고 비교하기 위해, MYR2787 HAA1, MYR2787 Δhaa1 및 MYR2787 2X HAA1의 D-LAC 생산 균주를 BioLector 미니발효기내 플라워 플레이트 (flower plates)에서 배양하였다. MYR2787 HAA1, MYR2787 Δhaa1 및 MYR2787 2X HAA1의 효모 균주들의 단일 콜로니를 튜브 내 CM 마이너스 우라실 5 mL에 개별로 접종하고, 200 rpm 속도로 12-18시간 동안 회전 인큐베이션을 사용하여 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 출발 OD 600 nm 0.1-0.2이고 pH 6.0-6.2인 BioLector 배양 플레이트에서 0.1 mL의 접종물을 0.9 mL의 SDM2 배지 (표 2 참조)에 접종하였다. 상기 플라워 플레이트를 진탕하고, 속도 1200 rpm 및 37℃에서 48시간 동안 각각 인큐베이션하였다. 습도는 실험 중 수분 증발을 방지하기 위해 50-80%로 조절하였다. 발효 중에, pH는 조절되지 않았다. 그러므로, 각 배양물의 pH는 D-LAC 생성으로 인해 발효를 따라 강하되고 있었다. 배양이 시작되면, 바이오매스 (biomass)를 매 30분마다 OD 600 nm로 자동 측정되었다. 48시간 후에, 실험을 중단하였다. 각 균주의 세포 덩어리 (Cell mass)를 원심분리에 의해 회전 침강시켰다. 상등액을 수집하고, 락트산 함량을 분석하였다.
도 3 및 4에 도시된 바와 같이, Δhaa1 파괴를 갖는 모든 효모 세포 (MYR2297 Δhaa1 및 MYR2787 Δhaa1)는 모체 균주에 비해 낮은 pH 조건에서 이의 성장이 개선되었다. 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, HAA1 유전자의 과발현을 갖는 효모 세포 (MYR2787 2X HAA1)는 모체 균주에 비해 낮은 pH 조건에서 민감한 반응성을 나타내었다. 이러한 결과로부터 Δhaa1 파괴를 갖는 효모 세포는 모체 균주에 비해 락트산 내성이 증가되었음을 나타낸다.
도 5에 도시된 바와 같이, 모체 균주 (MYR2787 HAA1) 및 HAA1 유전자의 과발현을 갖는 효모 세포 (MYR2787 2X HAA1)의 성장은 배양 12시간 후에 정지된 반면에, Δhaa1 파괴를 갖는 효모 세포 (MYR2787 Δhaa1)의 성장은 계속되었다. 이로부터 Δhaa1 파괴를 갖는 효모 세포 (MYR2787 Δhaa1)는 낮은 pH 조건에서 성장 성능이 개선되었음을 나타낸다. 상기 결과로부터 Δhaa1 파괴를 갖는 효모 세포는 모체 균주에 비해 락트산 내성이 증가되었음을 강력하게 확인하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, MYR2787 모체 세포 (MYR2787 HAA1), Δhaa1 파괴를 포함하는 MYR2787 (MYR2787 Δhaa1) 및 HAA1 과발현을 포함하는 MYR2787 (MYR2787 2X HAA1)에 의해 48시간 생성된 D-LAC 역가는 각각 3.8 g/L, 7.5 g/L 및 0.8 g/L이었다. 상기 결과로부터 Δhaa1 파괴를 갖는 효모 세포 (MYR2787 Δhaa1)는 모체 균주에 비해 pH 조절 없이 락트산 생성이 개선되었음을 명백하게 나타내었다. 한편, HAA1 유전자의 과발현을 갖는 효모 세포 (MYR2787 2X HAA1)는 모체 균주 및 Δhaa1 파괴를 갖는 효모 세포 (MYR2787 Δhaa1)보다 락트산을 적게 생성하였다.
상기 기재된 모든 예의 결과로부터, 본 발명에서 발견된 Δhaa1 파괴를 갖는 유전자 조작된 효모 세포는 본 발명의 요약에서 언급된 바와 같이 락트산 내성, 락트산 생성 또는 이들의 조합이 개선되었음을 나타내었다. 본 발명은 첫 번째 발견이다.
발명의 최선의 형태
본 발명의 최선의 형태는 상세한 설명에 개시되어 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> PTT Global Chemical Public Company Limited
<120> Yeast having improvement of lactic acid tolerance and use thereof
<130> BU62-PCT-PI2019
<140> PCT/TH2019/000030
<141> 2019-08-19
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6319
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pHAA1del2 Plasmid
<400> 1
gttgacagta agacgggtaa gcctgttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc 60
agtctgaatg acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag 120
gaactgctga acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc 180
tgagaagccc gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa 240
aaggcgcctg tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg 300
aatgtcacga aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca 360
gcgatttgcc cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt 420
gtagaggagc aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta 480
gtgagttata cacagggctg ggatctattc tttttatctt tttttattct ttctttattc 540
tataaattat aaccacttga atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta 600
cagagggtct agcagaattt acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac 660
ccacaactca aaggaaaagg actagtaatt atcattgact agcccatctc aattggtata 720
gtgattaaaa tcacctagac caattgagat gtatgtctga attagttgtt ttcaaagcaa 780
atgaactagc gattagtcgc tatgacttaa cggagcatga aaccaagcta attttatgct 840
gtgtggcact actcaacccc acgattgaaa accctacaag gaaagaacgg acggtatcgt 900
tcacttataa ccaatacgct cagatgatga acatcagtag ggaaaatgct tatggtgtat 960
tagctaaagc aaccagagag ctgatgacga gaactgtgga aatcaggaat cctttggtta 1020
aaggctttga gattttccag tggacaaact atgccaagtt ctcaagcgaa aaattagaat 1080
tagtttttag tgaagagata ttgccttatc ttttccagtt aaaaaaattc ataaaatata 1140
atctggaaca tgttaagtct tttgaaaaca aatactctat gaggatttat gagtggttat 1200
taaaagaact aacacaaaag aaaactcaca aggcaaatat agagattagc cttgatgaat 1260
ttaagttcat gttaatgctt gaaaataact accatgagtt taaaaggctt aaccaatggg 1320
ttttgaaacc aataagtaaa gatttaaaca cttacagcaa tatgaaattg gtggttgata 1380
agcgaggccg cccgactgat acgttgattt tccaagttga actagataga caaatggatc 1440
tcgtaaccga acttgagaac aaccagataa aaatgaatgg tgacaaaata ccaacaacca 1500
ttacatcaga ttcctaccta cgtaacggac taagaaaaac actacacgat gctttaactg 1560
caaaaattca gctcaccagt tttgaggcaa aatttttgag tgacatgcaa agtaagcatg 1620
atctcaatgg ttcgttctca tggctcacgc aaaaacaacg aaccacacta gagaacatac 1680
tggctaaata cggaaggatc tgaggttctt atggccatta gccatcatcg tatccgatat 1740
tcaagtatca tcacacttac caacacaatt attttttttt ttttttattt taaatattaa 1800
gaaaagagag aataaagaag aagtggtaaa agacaaacaa ggagcaagcg tttagtgggg 1860
atctaacaaa caacacaaca acaacatact ctgtgctttg aagtgtaaac tactatatca 1920
ttatcattaa tttttggata ttggattttg gttttttttt tctgtcgaga acctctcatt 1980
acttgggctt taatttaaag tcataaatta ttcgttttat ttcatttcat ttcattttat 2040
tttattttaa tattgggaaa tttactctct caatagtgtg tgcttttaaa aaccgggttc 2100
caaaataggt tttagcgcac agatacgggt tctggggaaa caccagcagc agcagtagcg 2160
aaagttttcc accgtctcca gccttcttcc tggtcatttt tttcgataca agccaactta 2220
ataacaaata tatatatgtg ttatctattt ctacctaatt aaatcggtac aatccgttat 2280
tgaatgtaat agttctaatt atatttgtta gcacgtcttt cattttttcc cccaaatgct 2340
ctatatatat tcttactctc gctactatat tttatataat aagagactaa tcgataatat 2400
caaattttaa attatacttg ttgttaccca tctatataca ctgaacccta tccgagagca 2460
cataggtgta tgacaatccg gtatcaaacc attcaatggg agatatactg gaaaacaaaa 2520
cttatatctt tgtagttgtg ctcattcttt agtagatggt cattggtttt tgccaatgca 2580
ctgtgatcca aatggttcca cgaggtagca tcaccataca acattacagg cgcttttatc 2640
atttgtttac catttttgca acgcttacag ttgtatgtct cgttcaattc atcatttttt 2700
ttttattctt ttttttgatt tcggtttctt tgaaattttt ttgattcggt aatctccgaa 2760
cagaaggaag aacgaaggaa ggagcacaga cttagattgg tatatatacg catatgtagt 2820
gttgaagaaa catgaaattg cccagtattc ttaacccaac tgcacagaac aaaaacctgc 2880
aggaaacgaa gataaatcat gtcgaaagct acatataagg aacgtgctgc tactcatcct 2940
agtcctgttg ctgccaagct atttaatatc atgcacgaaa agcaaacaaa cttgtgtgct 3000
tcattggatg ttcgtaccac caaggaatta ctggagttag ttgaagcatt aggtcccaaa 3060
atttgtttac taaaaacaca tgtggatatc ttgactgatt tttccatgga gggcacagtt 3120
aagccgctaa aggcattatc cgccaagtac aattttttac tcttcgaaga cagaaaattt 3180
gctgacattg gtaatacagt caaattgcag tactctgcgg gtgtatacag aatagcagaa 3240
tgggcagaca ttacgaatgc acacggtgtg gtgggcccag gtattgttag cggtttgaag 3300
caggcggcag aagaagtaac aaaggaacct agaggccttt tgatgttagc agaattgtca 3360
tgcaagggct ccctatctac tggagaatat actaagggta ctgttgacat tgcgaagagc 3420
gacaaagatt ttgttatcgg ctttattgct caaagagaca tgggtggaag agatgaaggt 3480
tacgattggt tgattatgac acccggtgtg ggtttagatg acaagggaga cgcattgggt 3540
caacagtata gaaccgtgga tgatgtggtc tctacaggat ctgacattat tattgttgga 3600
agaggactat ttgcaaaggg aagggatgct aaggtagagg gtgaacgtta cagaaaagca 3660
ggctgggaag catatttgag aagatgcggc cagcaaaact aaaaaactgt attataagta 3720
aatgcatgta tactaaactc acaaattaga gcttcaattt aattatatca gttattaccc 3780
gggaatctcg gtcgtaatga tttttataat gacgaaaaaa aaaaaattgg aaagaaaaag 3840
cttggacaca agtaaaaaca cagtcgggct tgaaccgcta agtataatga aacccatcac 3900
tccaaatact agaacaaagg ttggtgaagt ctatatccca ctaacagagt acgtcccaac 3960
aagtataacg tcttctcacg accaaacaga cagcatcaac ccacttctca tgggcgacag 4020
cctgtccata tatgacgatg gccagtctga tactcctaat gtaacatact tcgctgatac 4080
ttctaaaagt atgtcgtata cccagttgaa ggaacagcgg aagtctgtca acaatgaaca 4140
cgttccttca caaagagtgc ctctagccaa cactggtcgc tcctcttcct ttatctctaa 4200
tatatcatct catgactccg taatctcgaa taacgatttc ataagttcga tgaacagttc 4260
ggattctctt tcgtcgatgc tgcaaggtgg taacgctcac cattaccagg atatgctcca 4320
tcaccccagc aatggcagag gcatggacat aagcctgttc ggttcgtaag ctgtaatgca 4380
agtagcgtat gcgctcacgc aactggtcca gaaccttgac cgaacgcagc ggtggtaacg 4440
gcgcagtggc ggttttcatg gcttgttatg actgtttttt tggggtacag tctatgcctc 4500
gggcatccaa gcagcaagcg cgttacgccg tgggtcgatg tttgatgtta tggagcagca 4560
acgatgttac gcagcagggc agtcgcccta aaacaaagtt aaacatcatg agggaagcgg 4620
tgatcgccga agtatcgact caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg 4680
aaccgacgtt gctggccgta catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc ctgaagccac 4740
acagtgatat tgatttgctg gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca acgcggcgag 4800
ctttgatcaa cgaccttttg gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg 4860
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gcgaactgca atttggagaa tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag 4980
ccacgatcga cattgatctg gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct 5040
tggtaggtcc agcggcggag gaactctttg atccggttcc tgaacaggat ctatttgagg 5100
cgctaaatga aaccttaacg ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa 5160
atgtagtgct tacgttgtcc cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa atcgcgccga 5220
aggatgtcgc tgccgactgg gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag cccgtcatac 5280
ttgaagctag acaggcttat cttggacaag aagaagatcg cttggcctcg cgcgcagatc 5340
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gtctaacaat tcgttcaagc cgacgccgct tcgcggcgcg gcttaactca agcgttagat 5460
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ggatccccgg gtaccgagct cgaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 6060
aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg 6120
taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga 6180
atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg 6240
gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc 6300
aacacccgct gacgaattc 6319
<210> 2
<211> 599
<212> PRT
<213> Kluyveromyces marxianus
<400> 2
Met Val Leu Ile Asn Gly Val Lys Tyr Ala Cys Glu Arg Cys Ile Arg
1 5 10 15
Gly His Arg Val Thr Thr Cys Asn His Thr Asp Gln Pro Leu Thr Met
20 25 30
Ile Lys Pro Lys Gly Arg Pro Ser Thr Thr Cys Ala His Cys Lys Glu
35 40 45
Leu Arg Lys Ser Lys Asn Ala Asn Pro Ser Gly Gln Cys Thr Cys Gly
50 55 60
Arg Gln Asp Lys Lys Arg Leu Ala Gln Lys Val Lys Glu Glu Ala Ser
65 70 75 80
Cys Thr Cys Lys Thr Asp Pro Asp His Cys Ala Cys His Lys Lys Arg
85 90 95
Gly Ala Lys Arg Lys Thr Lys Gly Gln Asn Ser Gly Thr Ser Ile Gly
100 105 110
Leu Asp Leu Asp Gly Lys Val Ser Lys Ser Asn Gly Tyr Ser Phe Gln
115 120 125
Ser Leu Pro Ser Ile Asn Ser Ser Gln Ser Leu Asp Lys Asp Ile Ser
130 135 140
Asn Leu Leu Gly Ser Pro Ile Ser Met Asn Thr Ser Phe Ser Thr Gly
145 150 155 160
Trp Asp Thr Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Arg Ser Pro Pro Gly Ser
165 170 175
Gly Asn Thr Tyr Ser Asn Ile Ser Asn Gly Asn Thr Gly Thr Ile Ser
180 185 190
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn His His His His His Lys His
195 200 205
Gly Gln Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Gly Leu Glu Pro Leu Ser Ile
210 215 220
Met Lys Pro Ile Thr Pro Asn Thr Arg Thr Lys Val Gly Glu Val Tyr
225 230 235 240
Ile Pro Leu Thr Glu Tyr Val Pro Thr Ser Ile Thr Ser Ser His Asp
245 250 255
Gln Thr Asp Ser Ile Asn Pro Leu Leu Met Gly Asp Ser Leu Ser Ile
260 265 270
Tyr Asp Asp Gly Gln Ser Asp Thr Pro Asn Val Thr Tyr Phe Ala Asp
275 280 285
Thr Ser Lys Ser Met Ser Tyr Thr Gln Leu Lys Glu Gln Arg Lys Ser
290 295 300
Val Asn Asn Glu His Val Pro Ser Gln Arg Val Pro Leu Ala Asn Thr
305 310 315 320
Gly Arg Ser Ser Ser Phe Ile Ser Asn Ile Ser Ser His Asp Ser Val
325 330 335
Ile Ser Asn Asn Asp Phe Ile Ser Ser Met Asn Ser Ser Asp Ser Leu
340 345 350
Ser Ser Met Leu Gln Gly Gly Asn Ala His His Tyr Gln Asp Met Leu
355 360 365
His His Pro Ser Asn Gly Arg Gly Ser Gly Phe Asn Pro Val His Ile
370 375 380
Glu Gln Ser Pro Asn Val Tyr Gly Phe Asp Thr Asp Ser Val Arg Ser
385 390 395 400
Val Glu Val Leu Ser Ile Thr Pro Ser Phe Met Asp Ile Pro Glu Ser
405 410 415
Lys Gln Ala Ser Ala Glu Ser Asn Thr Ser Ser Ser Gly Tyr Ile Ser
420 425 430
Trp Lys Gly Val Asn Ser Arg Arg Glu Arg Ser Val Ser Ile His Lys
435 440 445
Asn His Arg Tyr Asp Ser Glu Asn Lys Arg Lys Arg His Pro Leu Thr
450 455 460
Ser Ala Asn Ser Ser Lys Gln Gln Ile Lys Ser Met Ile Leu Pro Ile
465 470 475 480
Glu Glu Asn Asn Asn His Asn Ser Ser Ser Ser Asn Glu Asn Thr Ala
485 490 495
Ala Thr Leu Pro Thr Thr Ser Asn Asn Phe Asn Ser Pro Ala Asp Ser
500 505 510
Thr Asn Thr Ala Leu Ser Ser Lys Ala Ala Phe Gly Asp Gln Ser Val
515 520 525
Phe Ser Thr Glu Arg Arg Gly Leu Glu Pro Ser Phe Val Asp Pro Gln
530 535 540
Phe Ser Pro Asp Phe Asn Pro Ser Leu Lys Gln Ser His Met Ile Asn
545 550 555 560
Gln Asn Ile Ile Asp Asn Asn Ser Leu Phe Ser Gly Thr Ser Glu Gly
565 570 575
Asn Asn Pro Ser Pro Asn Asp Ile Phe Pro Val Glu Phe Ala Asp Ile
580 585 590
Asp Asp Leu Met Thr His Leu
595
Claims (6)
- 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 (Kluyveromyces sp.) 효모 세포로서, 상기 효모 세포는 서열번호: 2의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 불활성화 또는 결실시키는 유전자 변형을 적어도 포함하는 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 서열번호: 2의 아미노산은 산-반응성 전사 인자 (acid-responsive transcription factor) Haal인 것인 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 유전자 변형은 모체 세포와 비교하여 락트산 내성 (lactic acid tolerance)을 증가시키는 것인 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포.
- 청구항 1 내지 3에 있어서, 상기 유전자 변형은 모체 세포와 비교하여 락트산 생성을 증가시키는 것인 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포.
- 청구항 1 내지 4에 있어서, 상기 클루이베로마이세스 종 효모 세포는 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 또는 클루이베로마이세스 서모톨레란스 (Kluyveromyces thermotolerans)로부터 선택되는 것인 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포.
- 청구항 1 내지 5에 따른 유전자 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 세포를 사용하여 락트산을 생성하기 위한 발효 방법.
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