KR20020033757A - 리보플라빈 생산을 위한 단세포 또는 다세포 생물체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리보플라빈을 생물공학적으로 생산하기 위한 단세포 또는 다세포 생물체, 특히 미생물에 관한 것으로서, 이들의 NAD(P)H 관련 효소 활성은 야생형 아쉬비아 고씹피이 (Ashbya gossypii) 종 ATCC10895의 활성보다 높다.

Description

리보플라빈 생산을 위한 단세포 또는 다세포 생물체 {Monocellular or Multicelluar Organisms for the Production of Riboflavin}
본 발명은 리보플라빈을 생산하기 위한 단세포 또는 다세포 생물체에 관한 것이다.
리보플라빈으로도 부르는 비타민 B2는 인간 및 동물에게 필수적이다. 비타민 B2결핍은 구강 및 인두 점막의 염증, 입가 열공, 피부 주름에서의 소양증 및 염증, 및 다른 피부 손상, 결막염, 시력 감퇴 및 망막 혼탁 현상을 일으킨다. 유아 및 어린이에게는 성장 정지 및 체중 감소를 일으킬 수 있다. 따라서, 비타민 B2는 특히 비타민 결핍과 관련한 비타민 제제 및 사료 첨가제로서 경제적 중요성을 갖는다. 그외에도, 예를 들어 마요네즈, 아이스크림, 블라망즈 등에서 식품 염료로서도 사용된다.
리보플라빈은 화학적으로 또는 미생물에 의해 생산된다. 화학적 생산 방법에 있어서, 리보플라빈은 대개 다단계 공정으로 순수한 최종 산물로서 얻어지지만, D-리보오스와 같은 비교적 고가의 출발 물질을 이용하는 것이 필수적이다.
미생물을 사용한 리보플라빈의 제조는 상기 물질의 화학적 생산에 대한 대안으로서 제공된다. 미생물에 의한 리보플라빈의 생산은 고순도의 물질이 요구되지않는 경우에 사용하기 특히 적합하다. 즉, 예를 들면 리보플라빈이 동물 사료의 첨가제로 사용되는 경우이다. 이러한 경우에, 리보플라빈의 미생물 생산은 일단계 공정으로 리보플라빈을 얻을 수 있다는 이점을 갖는다. 또한, 미생물 합성을 위한 출발 물질로서 식물성유와 같은 재생가능한 원료를 사용할 수 있다.
아쉬비야 고씹피이 (Ashbya gossypii) 또는 에레모테슘 아쉬비이 (Eremothecium ashbyi)와 같은 진균을 발효시켜 리보플라빈을 생산하는 것이 개시되어 있으나 [The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., page l183, 1983, A. Bacher, F. Lingens, Augen.Chem. 1969, p. 393); 칸디다 (Candida) 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces)와 같은 효모, 클로스티리듐 (Clostridium), 바실러스 (Bacillus) 및 코리네박테리움 (Corynebacterium)과 같은 세균도 또한 플라빈 생산에 적합하다.
또한, 효모 칸디다 파마타 (Candida famata)를 이용하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,231,007호에 기재되어 있다.
리보플라빈 과다 생산 세균 균주는 예를 들어 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis)로부터 리보플라빈 생합성 유전자를 형질전환시켜 얻어진 균주를 이용하는 EP 405370에 기재되어 있다. 그러나, 이 원핵생물 유전자는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 아쉬비야 고씹피이 (Ashbya gossypii)와 같은 진핵생물을 이용한 재조합 리보플라빈 생산 방법에는 적합하지 않다. 이러한 이유에서, WO 93/03183은 리보플라빈 생합성에 특이적인 유전자를 진핵생물, 소위 사카로마이세스 세레비지에로부터 분리하고 이를 이용하여 진핵 생산 생물체에서 리보플라빈을 생산하기 위한 재조합 방법을 제공하였다. 그러나, 상기 재조합 생산 방법은 성공적이지 않거나, 리보플라빈 생합성에 특이적으로 관여하는 효소에 기질이 불충분하게 제공되는 경우에만 제한적으로 리보플라빈을 생산하는데 성공하였다.
1967년에, 한손 (Hanson) [Hanson AM, 1967, in Microbial Techno1ogy, Peppler, HJ, pp.222-250 New York]은 아미노산 글리신을 첨가하면 아쉬비아 고씹피이가 리보플라빈 생산을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 그러나, 상기 방법은 글리신이 매우 고가 원료라는 단점을 갖는다. 이러한 이유에서, 돌연변이체를 제조함으로써 리보플라빈 생산을 최적화하기 위한 노력이 이루어졌다.
DE 19545468.5 A1은 리보플라빈 생산 미생물에서 이소시트레이트 리아제 활성 또는 이소시트레이트 리아제 유전자의 발현을 증가시켜 미생물에 의해 리보플라빈을 생산하는 또다른 방법을 개시하고 있다. 그외에도, DE 19840709 A1은 생물공학적인 방법에 의해 리보플라빈을 생산하기 위한 단세포 또는 다세포 생물체, 특히 미생물을 개시하고 있다. 상기 생물체는 글리신을 외부에서 전혀 공급하지 않으면서 야생형 아쉬비야 고씹피이 종 ATCC10892 이상으로 리보플라빈을 합성할 수 있도록 변형된 글리신 대사를 나타낸다는 점에서 특징을 갖는다.
그러나, 상기 방법에 비해 리보플라빈 생산을 더 최적화할 것이 요구된다.
따라서, 본 발명의 목적은 리보플라빈을 생물공학적으로 생산하기 위해 단세포 또는 다세포생물체, 바람직하게는 미생물을 이용하여, 상기 생물체가 리보플라빈 형성을 훨씬 더 최적화할 수 있도록 하는 것이다. 특히, 당업계의 현재 생산방법보다 경제적으로 생산할 수 있는 생물체를 이용하는 것이 필수적이다. 무엇보다도, 생물체가 현재 생물체에 의해 달성되는 것보다 더 많은 양의 리보플라빈을 형성할 수 있어야 한다.
본 발명자들은 상기 목적이 야생형의 아쉬비아 고씹피이 종 ATCC10895보다 더 높은 NAD(P)H 형성과 관련된 효소 활성을 나타내는 단세포 또는 다세포 생물체에 의해 달성된다는 것을 발견하였다.
세포내 NAD(P)H의 공급은 NAD(P)H 형성 효소의 활성을 증가시키거나 NAD(P)H 소모 효소의 활성을 감소시키거나, 또는 특이성을 변화시킴으로써 증가시킬 수 있다. 이것은 생물체의 균주를 개선시키는 공지된 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 즉, 간단한 경우에, 상응하는 균주는 미생물학 분야에서 통상적인 스크리닝 방법에 의한 선별법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 후속 선별법으로 돌연변이법을 이용할 수 있다. 이와 관련하여, 돌연변이법은 화학적 돌연변이 유발법을 이용하거나 물리적 돌연변이 유발법을 이용하여 수행할 수 있다. 또다른 방법은 선별 및 후속적인 재조합을 이용한 돌연변이법이다. 결국, 본 발명에 따른 생물체는 유전자 조작에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에 따르면, 생물체가 대사를 유지하기 위해 필요로 하는 것보다 많은 양의 NAD(P)H를 세포내에서 생산하도록 생물체를 변형시킨다. 본 발명에 따르면, NAD(P)H의 세포내 생산은 바람직하게는 이소시트레이트 데히드로게나제의 효소 활성이 증가된 생물체를 제조함으로써 증가시킬 수 있다. 이것은 예를 들어 촉매 중심을 변형시키거나 효소 억제제 효과를 제거시켜 기질 회전율을 증가시킴으로써 달성할 수 있다. 또한, 이소시트레이트 데히드로게나제의 효소 활성은 예를 들어 유전자 증폭에 의하여 효소 합성을 증가시키거나, 효소 생합성을 억제하는 인자를 제거함으로써 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 이소시트레이트 데히드로게나제의 활성은 바람직하게는 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자를 돌연변이시킴으로써 증가시킬 수 있다. 이러한 돌연변이는 예를 들어 UV 조사 또는 돌연변이 유도 화학물질을 이용하는 고전적인 방법을 이용한 무작위 방법에 의해, 또는 결실, 삽입 및(또는) 뉴클레오티드 치환과 같은 재조합 DNA 방법을 이용하여 특이적으로 제조할 수 있다.
이소시트레이트 데히드로게나제 유전자는 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자 카피를 혼입시키고(시키거나) 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자 발현에 양성 영향을 주는 조절 인자를 증대시킴으로써 발현시킬 수 있다. 따라서, 조절 요소는 바람직하게는 특히 전사 신호를 증가시킴으로써 전사 수준에서 증대시킬 수 있다. 그러나, 또한, 예를 들어 mRNA의 안정성을 향상시킴으로써 번역을 증대시킬 수도 있다.
유전자 카피수를 증가시키기 위해, 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자를 예를 들어 바람직하게는 이소시트레이트 데히드로게나제에 지정된 조절 유전자 서열, 특히 유전자 발현을 증대시키는 조절 유전자 서열을 함유하는 유전자 구조물 또는 벡터에 혼입시킬 수 있다. 이어서, 리보플라빈 생산 미생물을 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자를 함유하는 유전자 구조물로 형질전환시킨다.
본 발명에 따르면, 이소시트레이트 데히드로게나제의 과다발현은 또한 프로모터를 대체시킴으로써 달성할 수 있다. 이와 관련하여, 유전자 카피를 혼입시키거나 프로모터를 대체시킴으로써 더 높은 효소 활성을 달성할 수 있다. 그러나, 또한 프로모터를 대체시키는 동시에 유전자 카피를 혼입시킴으로써 목적하는 효소 활성의 변화를 달성할 수도 있다.
이소시트레이트 데히드로게나제 유전자의 변화는 NAD(P)H의 형성을 가속화시키는 동시에 리보플라빈의 형성을 이전에 달성할 수 없었던 정도로 크게 증가시킨다.
이소시트레이트 데히드로게나제 유전자는 바람직하게는 미생물, 특히 바람직하게는 진균으로부터 단리된다. 이와 관련하여, 아쉬비아 속의 진균이 바람직하다. 가장 바람직한 것은 아쉬비아 고씹피이 종이다.
그러나, 세포가 이소시트레이트 데히드로게나제를 형성하기 위한 서열을 포함하는, 식물 및 동물 세포인 다른 모든 생물체도 또한 유전자를 단리하기에 적합하다. 유전자는 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자에 결함이 있는 돌연변이체의 동종 또는 이종 상보성에 의해, 또는 이종 프라이머를 이용하는 이종 프로빙 또는 PCR에 의해 단리할 수 있다. 서브클로닝을 위해, 상보적인 플라스미드 내의 삽입체를 제한 효소를 이용하여 적합한 단계에 의해 계속하여 크기를 최소화할 수 있다. 추정의 유전자를 서열분석하고 확인한 후, PCR에 의해 완전 일치 서브클로닝을 한다. 생성된 단편을 삽입체로써 포함하는 플라스미드를 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자 결함 돌연변이체에 도입하여 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자의 기능에 대해 시험한다. 최종적으로, 기능성 구조체를 사용하여 리보플라빈생산체를 형질전환시킨다.
단리 및 서열분석한 후, 주어진 아미노산 서열 또는 그의 대립유전자 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자를 얻을 수 있다. 대립유전자 변이체는 특히 이소시트레이트 데히드로게나제 활성은 보존되면서 상응하는 서열로부터 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 치환에 의해 얻을 수 있는 유도체를 포함한다. 상응하는 서열은 도 2b의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 1262로 나타나 있다.
도 11에 나타낸 뉴클레오티드 -661 내지 -1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 또는 필수적으로 동일하게 작용하는 DNA 서열은 특히 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자의 상류에 위치한다. 따라서, 프로모터의 작용 또는 활성은 손상시키지 않으면서 1개 이상의 뉴클레오티드 치환 또는 삽입 및(또는) 결실에 의해 주어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터와 상이한 프로모터를 예를 들어 유전자 상류에 위치시킬 수 있다. 또한, 프로모터의 활성은 그의 서열을 변화시켜 증가시킬 수 있거나 활성 프로모터로 완전히 대체시킬 수 있다.
특히 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자의 활성을 증가시키는 조절 유전자 서열 또는 조절 유전자를 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자에 지정할 수 있다. 따라서, RNA 폴리머라제와 DNA 사이의 상호작용을 향상시킴으로써 이소시트레이트 데히드로게나제 발현을 증가시키는 소위 "인핸서"를 예를 들어 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자에 지정할 수 있다.
상류에 위치하는 프로모터 및(또는) 조절 유전자를 갖거나 갖지 않고 하나이상의 DNA 서열을 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자의 상류 및(또는) 하류에 배치시켜, 유전자를 유전자 구조에 포함시킬 수 있다. 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자를 클로닝하여 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자를 함유하고 리보플라빈 생산체를 형질전환시키기에 적합한 플라스미드 또는 벡터를 얻을 수 있다. 형질전환에 의해 얻을 수 있는 세포는 복제가능한 형태, 즉 게놈상의 임의의 위치에서 상동성 재조합에 의해 혼입된 유전자 카피를 갖는 염색체, 및(또는) 플라스미드 또는 벡터 상에 추가의 카피로 유전자를 포함한다.
본 발명에 따라 얻은 단세포 또는 다세포 생물체는 생물공학 방법에 사용할 수 있는 모든 세포일 수 있다. 상기 세포는 진균, 효모, 세균 및 식물 및 동물 세포를 예로 들 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 세포는 바람직하게는 형질전환된 진균 세포, 특히 바람직하게는 아쉬비아 속의 진균이다. 특히 바람직한 것은 아쉬비아 고씹피이 종이다.
본 발명은 하기 실시예로써 보다 상세하게 설명되지만, 이로써 본 발명을 실시예에 한정하고자 하는 것은 아니다.
도 1은 염색체AgIDP3 유전자를 결실 및 G418R유전자 삽입에 의해 불활성화된 유전자 카피로 치환시키기 위한 벡터 pIDPkan를 제작하는 개략도이다.
도 2는 서던 블롯팅을 이용하여AgIDP유전자좌에서 부분적인 결실과 동시에제네티신 내성 카세트의 삽입을 확인한다. SphI 절단된 게놈 DNA를 딕옥시게닌 표지된 프로브로 혼성화하였다.
도 3은 글로코스 완전 배지 상에서 배양시 아쉬비아 야생형, 변이체A.g. △IDP3b 및AgIDP과다발현체A.g.pAGIDP3a 및A.g.pAGIDP3b로부터의 NADP 특이적 ICDH의 효소 활성을 비교한다.
도 4는 대두유 완전 배지에서 배양시 아쉬비아 야생형 및 변이체A.g. △IDP3b의 성장 및 리보플라빈 형성을 비교한다.
도 5는 대두유 완전 배지에서 배양시 아쉬비아 야생형 및AgIDP3 과다발현체A.g.pAGIDP3a 및A.g.pAGIDP3b의 성장, 리보플라빈 형성 및 NADP 특이적 ICDH을 비교한다.
도 6은TEF프로모터 및TEF종결자의 조절하에AgIDP3 유전자를 과다발현하는 플라스미드를 나타낸다.
2번째 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 변화시켜 SphI 절단 부위를 도입하였다. 이때, 아미노산 글리신에서 루이신으로의 보존적 치환이 수반되었다.
도 7은 퍼옥시좀에서 문헌 [Henke et al (1998)]에 따른 짝수 (A) 및 홀수 (B, C) 탄소에서 이중 결합을 갖는 불포화 지방산의 대사 경로를 나타낸다.
도 8은 퍼콜 (Percoll) 밀도 구배로 아쉬비아 야생형으로부터 단리된 세포기관을 분리하여 마커 효소인 카탈라제 (퍼옥시좀) 및 푸마라제 (미토콘드리아), NAD-특이적 및 NADP-특이적 ICDH, 불포화 지방산을 대사하는데 필요한 2,4-디에노일-CoA 리덕타제 및 △3,△2-에노일-CoA 이소머라제의 활성 (U/㎖)을 나타낸다.
도 9는 상이한 지방산 (A: 18:1 시스9; B: 18.2 시스9,12; C: 18:3 시스9,12,l5) 상에서 아쉬비아 야생형, 변이체A.g. △IDP3a 및A.g. △IDP3b 및 과다발현체A.g.pAGIDP3a 및A.g.pAGIDP3b의 직경 성장을 비교한다.
도 10은 야생형 균사체 (A) 및 변이체A.g. △IDP3b 균사체 (B)의 세포 기관을 원심분리한 후의 퍼콜 밀도 구배에서 효소 카탈라제 및 ICDH의 분포를 나타낸다.
서열의 설명
퍼옥시좀의 NADP-특이적 이소시트레이트 데히드로게나제를 코딩하는 아쉬비아 고씹피이AgIDP3 유전자의 뉴클레오티드 서열, 및 그로부터 추정된 아미노산 서열.
이소시트레이트 데히드로게나제 (IDP3) 유전자를 PCR에 의해 클로닝한 후 서열분석하였다 (서열, 도 11 참조). 제네티신 내성 유전자를 이용하여 치환 돌연변이 유발법에 의해 유전자를 재조합 방법으로 부분적으로 결실시키고 (도 1) 서던 블롯팅에 의해 확인하였다 (도 2). 이러한 파괴, 즉 진균 게놈의 유전자를 파괴시켜 진균 내에서 유전자에 의해 코딩되는 이소시트레이트 데히드로게나제를 더이상형성할 수 없도록 하였다. 도 3은 야생형 ATCC 10895에 비해 파괴된 균주 Ag△IDP3b에서 효소 활성이 감소하였음을 나타낸다. 퍼옥시좀을 준비하여 상기 효소가 퍼옥시좀에 위치한다는 것을 증명하였다 (도 10). 야생형 퍼옥시좀에서는 효소 활성을 명백하게 측정할 수 있었지만, 파괴된 균주의 퍼옥시좀에서는 더이상 활성을 나타내지 않았다.
유전자 파괴는 모 균주에 비해 비타민 형성을 크게 감소시켰다 (도 4). 대조적으로, 플라스미드 (도 6) 상의 강한 TEF 프로모터 조절 하에 추가의 카피로 유전자를 아쉬비아 세포에 도입시키는 경우, 효소 활성 및 리보플라빈의 형성이 확연히 증가하였음을 측정할 수 있었다 (도 5).
도 7은 3가지 별개의 반응 경로중 두 경로에서 불포화 지방산의 대사에 환원제로서 NADPH가 필요하다는 것을 나타낸다. 이와 관련된 2,4-디에노일-CoA 리덕타제는 아쉬비아 세포의 퍼옥시좀에 위치함을 확인하였다 (도 8). IDP3 유전자의 파괴는 여기서 리놀레산 또는 리놀렌산 상에서 세포 성장을 감소시켜야 한다. 이것을 또한 측정할 수 있었다 (도 9). 이것으로 세포 대사에 있어 IDP3이 NADPH 형성에 중요하다는 것을 증명하였다.

Claims (21)

  1. 야생형 아쉬비아 고씹피이 (Ashbya gossypii) 종 ATCC 10895보다 높은 NAD(P)H 형성 효소 활성을 갖는, 리보플라빈의 생물공학적 생산을 위한 단세포 또는 다세포 생물체, 특히 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 상승된 단세포 또는 다세포 생물체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 진균인 단세포 또는 다세포 생물체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아쉬비아 속의 진균인 단세포 또는 다세포 생물체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아쉬비아 고씹피이 종의 진균인 단세포 또는 다세포 생물체.
  6. 도 11에 나타낸 아미노산 서열 및 그의 대립유전자 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자.
  7. 제6항에 있어서, 도 11에 나타낸 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 1262의 뉴클레오티드 서열 또는 필수적으로 작용하는 DNA 서열을 갖는 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 도 11에 도시된 뉴클레오티드 -661 내지 -1의 뉴클레오티드 서열 또는 필수적으로 작용하는 DNA 서열의 상류 프로모터를 갖는 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자.
  9. 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 조절 유전자 서열이 지정된 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자.
  10. 제6항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자를 포함하는 유전자 구조물.
  11. 제6항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자 또는 제10항에 따른 유전자 구조물을 함유하는 벡터.
  12. 제6항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자 또는 제10항에 따른 유전자 구조물을 복제가능한 형태로 포함하는 리보플라빈 생산을 위한 형질전환 생물체.
  13. 제12항에 있어서, 제11항에 따른 벡터를 포함하는 형질전환 생물체.
  14. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 생물체를 사용하여 리보플라빈을 생산하는 방법.
  15. 야생형의 아쉬비아 고씹피이 종 ATCC 10895보다 NAD(P)H 형성 효소의 활성이 증가되도록 변형된, 리보플라빈 생산 단세포 또는 다세포 생물체를 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 유전자 방법에 의해 생물체를 변형시키는 것인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 프로모터를 대체하고(하거나) 유전자 카피 수를 증가시켜 생물체를 변화시킴으로써 효소 활성을 증가시키는 것인 방법.
  18. 제15항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 내생 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자를 변형시켜 효소 활성을 증가시키는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제5항 및 제12항 및 제13항중 어느 한 항에 따른 생물체의 리보플라빈 생산을 위한 용도.
  20. 제6항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 이소시트레이트 데히드로게나제 유전자 및 제10항에 따른 유전자 구조물의 제1항 내지 제5항 또는 제12항 및 제13항의 생물체를 제조하기 위한 용도.
  21. 제11항에 따른 벡터의 제1항 내지 제5항 또는 제12항 및 제13항의 생물체를 제조하기 위한 용도.
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