CN1369013A - 用于生产核黄素的单细胞生物体或多细胞生物体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用生物技术方法生产核黄素的单细胞或多细胞生物体,尤其是微生物,这些微生物中与NAD(P)H形成相关的酶活力要高于棉桃阿舒氏囊霉种ATCC 10895的NAD(P)H形成酶活力。
Description
本发明涉及产生核黄素的单细胞生物体或多细胞生物体。
维生素B2,也叫做核黄素,对人和动物来说是必不可少的。维生素缺乏可造成口和咽黏膜发炎、嘴角撕裂、皮褶瘙痒和发炎以及其他的皮肤损伤、结膜、视力下降、角膜浑浊等疾病。在婴儿和儿童中会造成体重停止增加和体重下降。因此,维生素B2是具有其经济重要性,尤其是其用做治疗与维生素缺乏相关的维生素药剂和作为食品添加剂。此外,它也可用作食品染料,例如用在蛋黄酱、冰激凌、布丁中。
核黄素可通过化学法和微生物学方法来生产。在化学生产方法中,核黄素通常是以多步方法的纯终产物的形式得到的,然而这必须使用相对较为昂贵的出发物质,如D-核糖。
利用微生物体来生产核黄素为利用化学法生产这种物质提供了一种替代方法。利用微生物法生产核黄素尤其是可用于没有对核黄素做高纯度要求的情况。这些情况有例如核黄素用做动物饲料产品添加剂。在这些情况下,微生物法生产核黄素具有可通过一步法来获得的优点。这种方法也可能利用可再生原材料,如植物油原料来进行微生物合成。
已经有关于利用真菌如棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)或Eremothecium ashbyi发酵来生产核黄素的公开内容(The MerckIndex,Windholz et al.,eds.Merck&Co.,page 1183,1983,A.Bacher,F.Lingens,Augen.Chem.1969,p.393);然而,酵母如假丝酵母或酿酒酵母、以及细菌如梭状芽孢杆菌、芽孢杆菌和棒状杆菌也适于核黄素的生产。
此外,已经有对通过酵母著名念珠菌(Candida famata)来生产核黄素的方法的描述,如专利US05231007。
已经有对核黄素超量生产菌株的描述,如在专利EP405307,其中的菌株是通过转化枯草芽孢杆菌的核黄素生物合成基因来获得的。然而,这些原核基因是不适于通过真核生物如酿酒酵母或棉桃阿舒氏囊霉经由重组方法来生产核黄素的。鉴于这个原因,按照专利WO93/03183的方法,从一种真核生物即酿酒酵母中将特异的核黄素生物合成基因分离出来,目的是利用它们在真核的核黄素产生生物体中寻找一种重组方法来生产核黄素。然而,如果不能为核黄素生物合成中特异的酶提供充足的底物,在核黄素生产中,这样的重组生产方法是不成功的,或者是仅仅取得有限的成功。
1967年,Hanson发现(Hansom AM,1967,in MicrobialTechnology,Peppler,HJ,pp.222-250 New York)在利用棉桃阿舒氏囊霉生产核黄素时添加甘氨酸可增加核黄素的形成。然而,这样的方法是不利的,因为甘氨酸是一种很昂贵的原料。鉴于这种原因,我们努力通过制备突变体来优化核黄素的生产。
专利DE19545468.5A1中公开了另外一种通过微生物法生产核黄素的方法,在这种方法中,核黄素生产微生物中的异柠檬酸裂解酶基因的表达和异柠檬酸裂解酶活力都得到了提高。此外,专利DE19840709 A1公开了通过生物技术方法利用单细胞生物或多细胞生物,尤其是微生物来生产核黄素的方法。这些生物体的区别就在于其体内的甘氨酸代谢水平至少与野生种棉桃阿舒氏囊霉ATCC10892相同,而前者是经过改造使其具有不需要任何的外部甘氨酸供应就能合成核黄素的能力。
然而,即使与这些方法相比,仍然需要进一步的优化核黄素生产。
按照本发明的目标,我们需要得到单细胞或多细胞生物,优选微生物,来进行核黄素的生物技术法生产,而这些生物可使得进一步优化核黄素的形成成为可能。尤其是,有必要找到一株生物体,利用它就可获得比本领域中现今的核黄素生产更加经济的生产方法。最重要的,这些微生物应该有可能使得核黄素的产量要比利用现有微生物获得的产量高。
我们已经发现,通过一种单细胞或多细胞生物我们就可实现这种目标,这些生物中与NAD(P)H形成相关的酶的活力较野生种棉桃阿舒氏囊霉ATCC10895中这种酶的活力要高。
通过提高NAD(P)H形成酶(NAD(P)H-bildenden)的活力或降低NAD(P)H降解酶(NAD(P)H verbrauchenden Enzyms)的活力,或者改变其特性就能够实现加速细胞内NAD(P)H供应这个目标。这可通过对生物体进行已知的菌株改进来实现。也就是说,在最简单的情况下,按照微生物学中传统的筛选方法就可筛选到相应的菌株。也可通过突变来进行随后的筛选。就此而论,可以通过化学诱变或物理诱变来完成突变。另一种方法是通过重组来筛选和诱变。最后,本发明中的生物可以通过基因操作的方法来制备。
按照本发明,修饰后的生物体细胞内产生的NAD(P)H要多于维持其代谢所需的NAD(P)H量。按照本发明,通过制备一种体内具有提高的异柠檬酸脱氢酶活力的生物体就可优选的实现体内NAD(P)H产量增加的目的。例如,这可通过修饰催化中心来促进底物周转率或破坏酶抑制剂的作用来实现。也可通过增加酶的合成,如通过基因扩增或抑制酶生物转化的因子消除来提高异柠檬酸脱氢酶的活力。
按照本发明,可优选通过对异柠檬酸脱氢酶基因进行突变来优选的提高异柠檬酸脱氢酶的活力。这样的突变可利用传统方法通过随机的方式,如通过紫外线辐射或突变诱导化学物质,或明确的使用重组DNA方法如缺失、插入和/或核酸互换来完成。
可以利用引入异柠檬酸脱氢酶基因拷贝和/或增强对异柠檬酸脱氢酶表达产生正面影响的调节因子来实现异柠檬酸脱氢酶基因的表达。因此,要优选在转录水平上的增强调节元件,尤其是提高转录信号。然而,此外也可增强翻译如提高mRNA的稳定性。
为了增加基因拷贝数目,可将异柠檬酸脱氢酶基因,例如引入优选含有调节基因序列,尤其是含有可增强异柠檬酸脱氢酶基因表达的调节基因序列的基因结构或载体中,而这些调节基因序列是与异柠檬酸脱氢酶基因相对应的。然后将利用含有异柠檬酸脱氢酶基因的基因结构对核黄素生产微生物进行转化。
按照本发明,也可通过替换启动子来获得对异柠檬酸脱氢酶的过度表达。在这一点上,通过引入基因拷贝或通过替代启动子就可获得更高的酶活力。然而,也可通过同时替换启动子和引入基因拷贝来获得酶活力上所需的改变。
在异柠檬酸脱氢酶上的改变促进了NAD(P)H的形成,并且同时在核黄素的形成上取得了前所未有的惊人提高。
优选的从微生物,尤其是优选的从真菌中分离异柠檬酸脱氢酶基因。在这一点上,更加优选的是Ashbya属的真菌。棉桃阿舒氏囊霉是最优选的。
然而,所有其细胞中,还包括植物和动物细胞,含有形成异柠檬酸脱氢酶基因序列的其他生物体也适于进行基因分离。可通过对存在异柠檬酸脱氢酶基因缺陷的突变体进行同源或异源互补的方式,或通过利用异源引物进行的异源探针或PCR扩增方式就可分离到这些基因。对于亚克隆方法来讲,通过利用合适的限制性酶的合适步骤就可随后降低插入的互补性质粒的大小。对假定的基因进行鉴定和排序,然后就通过PCR进行非常合适的亚克隆。将携带有结果片段的质粒作为插入物引入异柠檬酸脱氢酶基因缺陷型突变株中,而在此之前已经对这些突变株进行了异柠檬酸脱氢酶功能检测。最后,将功能性构件用于转化核黄素生产生物体。
在分离和排序之后就可获得含有编码给定氨基酸或其等位变体的核苷酸序列的异柠檬酸脱氢酶基因。等位变体包括,尤其是可对相应的序列进行缺失、插入或替代操作得到的保留异柠檬酸脱氢酶活力的衍生物。在图2b中给出了1-1262的核苷酸序列。
图11展示的含有-1到-661位的核苷酸序列的启动子,或基本上以相同方式作用的,特别的位于异柠檬酸脱氢酶基因的上游的DNA序列。因此,可将与含有给定核苷酸序列的启动子不同的启动子,例如置于基因的上游,而这些不同的启动子是通过对一或多个核苷酸互换或通过插入和/或缺失的方式得到的,但启动子功能或活力未遭破坏。此外,可通过对其序列进行修饰或用活性启动子完全替代的方式来提高启动子的活性。
此外,可将调节基因序列或调节基因,特别是可提高异柠檬酸脱氢酶基因活性的调节基因或调节基因序列连接到(zuordnen)异柠檬酸脱氢酶基因。因此,可将那些通过提高DNA多聚酶和DNA间的相互作用的增强子,例如,连接到(zuordnen)异柠檬酸脱氢酶基因,从而提高异柠檬酸脱氢酶的表达。
在上游序列含有或不含启动子的情况下,和/或上游序列含有或不含调节基因的情况下,可将一或多个DNA序列置于异柠檬酸脱氢酶基因的上游或下游,这样异柠檬酸脱氢酶基因就被包含在一个基因结构中了。通过克隆异柠檬酸脱氢酶基因我们就可获得含有异柠檬酸脱氢酶基因并且适于转化核黄素生产生物体的质粒或载体。通过转化就可获得含有可复制形式的基因,也即在染色体上具有额外拷贝的基因的细胞,通过在基因组和/或质粒或载体的任意位点进行同源重组这些基因拷贝就整合到细胞中。
本发明获得的单细胞或多细胞生物体可以是能用于生物技术方法的任何细胞。这些细胞包括,例如真菌、酵母、细菌和植物动物细胞。按照本发明,优选的是转化过的真菌细胞,特别优选的是Ashbya属的真菌。在这一点上,尤其优选的是棉桃阿舒氏囊霉。
下面通过示例来详细的阐述本发明,但是这些示例并没有限制本发明的主题:
通过PCR对异柠檬酸脱氢酶基因(IDP3)进行克隆,然后进行排序(序列见图11)。通过Southern印记(图2)来确定已经利用遗传霉素抗性基因进行替代诱变而造成重组影响的部分缺失的基因(图1)。对真菌基因组中的基因的断裂,也即破坏导致真菌再也不能形成这种基因编码的异柠檬酸脱氢酶。图3表明相对于野生型ATCC10895菌株,断裂菌株AgΔDP3b中酶活力的降低。可通过过氧化物酶体标本来证明这种酶就是定位在这些细胞器中(图10)。虽然野生型过氧化物酶体中这种酶的活力可清楚的进行测定,但是断裂菌株中的过氧化物酶体中已经没有任何酶活力了。
与母本菌株相比,断裂基因造成维生素形成的明显下降(图4)。相反的,以额外的拷贝并在质粒(图6)中强TEF启动子控制下,将基因引入Ashbya属细胞中,我们就能检测到酶活力和核黄素形成的明显升高(图5)。
图7表明,在三条替代反应途径中的两条中,NADPH是用做不饱和脂肪酸代谢的还原剂。发现与此相关的2,4二烯酰基辅酶A定位于Ashbya属细胞的过氧化物酶体中(图8)。现在IDP3基因破裂应该导致细胞在亚油酸和亚麻酸上的生长降低。也可对此进行检测(图9)。这证明细胞代谢中IDP3的重要性在于它可形成NADPH。
图表描述
图1:pIDPkan载体构建方案,这个载体是用来替代含有一个基因拷贝的染色体AgIDP3基因的,这个基因拷贝已经通过缺失和插入G418R基因使其失活了。
图2:利用Southern印记分析来检查在AgIDP位点的部分缺失和同时插入Geneticin抗性弹夹。将经Sphl切割的基因组DNA与digoxygenin标记探针进行杂交。
图3:对比源自在葡萄糖完全培养基上生长的Ashbya野生型、A.g.ΔIDP3b突变株、以及AgIDP3过度表达体A.g.pAGIDP3a和A.g.pAGIDP 3b的NADP特异性ICDH的酶活力。
图4:对比在大豆油完全培养基上生长的Ashbya野生型和A.g.ΔIDP3b突变株的生长和核黄素的形成。
图5:对比在大豆油完全培养基上生长的Ashbya野生型和AgIDP3过度表达体A.g.pAGIDP3a和A.g.pAGIDP 3b的生长、核黄素形成和NADP特异性ICDH。
图6:在TEF启动子和TEF终止子控制下用于过度表达AgIDP3基因的质粒。为了引入Sphl切割位点就有必要改变编码第二个氨基酸的核苷酸顺序。这涉及亮氨酸对甘氨酸的保守取代。
图7:过氧化物酶体中含有双键的偶数(A)和奇数(B,C)碳原子的不饱和脂肪酸的分解代谢途径,参照Henke等(1998)的文献。
图8:利用Percoll密度梯度来从Ashbya野生型中分离细胞器。
标记酶过氧化氢酶(过氧化物酶体中)和延胡索酸酶(线粒体)的、NAD特异性的和NADP特异性的ICDH的和2,4-二烯酰基辅酶A还原酶和Δ2,Δ3-烯酰基辅酶A异构酶的活力(U/ml),这些都是不饱和脂肪酸分解代谢所要求的。
图9:对比在不同脂肪酸上的Ashbya野生型和A.g.ΔIDP3a和A.g.ΔIDP3b突变株,以及过度表达体A.g.pAGIDP3a和A.g.pAGIDP 3b的辐射形生长(A:18:1顺9;B:18:2顺9;C:18:3,顺9,12,15)。
图10:在对野生型菌丝体(A)和A.g.ΔIDP3b突变株的菌丝体(B)离心之后过氧化氢酶和ICDH在Percoll密度梯度中的分配。
序列描述
源自编码过氧化物酶体的NADP特异性异柠檬酸脱氢酶的A.Gossypii AgIDP3基因氨基酸序列和核苷酸序列。
序列表<110>BASF AG,Forschungszentrum[研究中心]Jülich<120>用于生产核黄素的单细胞和多细胞生物体<130>FZJ-9909-PCT<140>PCT/EP00/07370<141>2000-07-31<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2321<212>DNA<213>真菌棉桃阿舒氏囊霉(Pilz der Spezies Ashyba Gossypii)<220><221>CDS<222>(718)..(1266)<400>1ctgcagcaaa tcgaggtgat cgccaacgag gtggacgtgc ggcaggacgg gacctggtgc 60atccggtacc gcgacgagtc cgagcacggg cacgacaagt cgcggtcgat cgcggcgtgc 120aagcagcgct ggcaacacct cgagcccgcg ccggtgtatt tctactgcgg cgatgggatc 180agcgacctga gcgctgcgaa ggaatgcgac ctgctgtttg cgaagagtgg caaggacctg 240atctccttct gcaagaagca ggacgttccg ttccgcgagt tcaacacttt tgacgatgtg 300ctgagcgcgg tcaagcgcgt ggtggcgggc gaggcctctg tcacggaact ccaggggggc 360tccgctgcgt aagcactgtc tgcatcagtg accttggcgg tagctgcgat ttgtaactac 420ctacgtaatt agtcctgctc gcgctgcggt ccagtgctag gcacgcccca catgaaaggc 480agccgtaagc aattagtaac ggcctagtac ggctccgatg tatgtgctag cacatgacag 540cccaacgggt tgagaagtcc ggctcgaatc atttccgcgc cgagtgggtc gtgggtggag 600ccgcccgacc ccttgtcagc gcgggcagtt ggatataagg cagtggttgt agcaaaagtg 660agntgcgtgc atttcacgaa gccgagcgca acaacgcaca gacatcagta agcagct 717atg ggc aag gtg aag gta caa caa ccc atc gtc gag atg gac ggc gac 765Met Gly Lys Val Lys Val Gln Gln Pro Ile Val Glu Met Asp Gly Asp1 5 10 15gaa cag acg cgg atc atc tgg cac ttg atc aag gat cag ctc atc ttc 813Glu Gln Thr Arg Ile Ile Trp His Leu Ile Lys Asp Gln Leu Ile Phe
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180
Claims (21)
1.可用于通过生物技术法来生产核黄素的单细胞或多细胞生物体,特别是微生物,它们表现的NAD(P)H形成酶的活力要高于野生型棉桃阿舒氏囊霉ATCC 10895的NAD(P)H形成酶的活力。
2.权利要求1中的单细胞或多细胞生物体,它表现了提高了的异柠檬酸脱氢酶活力。
3.权利要求1或2中的单细胞或多细胞生物体,它是真菌。
4.权利要求1-3中的单细胞或多细胞生物体,其中的真菌是Ashbya属真菌。
5.权利要求1-4中的单细胞或多细胞生物体,其中的真菌是棉桃阿舒氏囊霉。
6.含有编码图11中的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)和其等位变体的多核苷酸序列的异柠檬酸脱氢酶基因。
7.权利要求6中的异柠檬酸脱氢酶基因,其含有图11中1-1262位核苷酸(SEQ ID NO.1)的核苷酸序列,或其功能基本相同的DNA序列。
8.权利要求6或7中的异柠檬酸脱氢酶基因,其含有包括图11中-661到-1位核苷酸的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)的上游启动子,或其功能基本相同的DNA序列。
9.含有权利要求6-8中的异柠檬酸脱氢酶基因和通过基因操作连接到这些基因上去的调节序列的基因结构。
10.含有权利要求6-9中异柠檬酸脱氢酶基因的基因结构。
11.含有权利要求6-9中的异柠檬酸脱氢酶基因或权利要求10中的基因结构的载体。
12.用于核黄素生产的转化生物体,其含有权利要求6-9中可复制形式的异柠檬酸脱氢酶基因,或权利要求10的基因结构。
13.权利要求12的转化生物体,其含有权利要求11中的载体。
14.生产核黄素的方法,其包括应用权利要求1-5中的微生物。
15.制备核黄素生产的单细胞或多细胞生物体的方法,其包括利用重组方法来提高相对于野生型棉桃阿舒氏囊霉ATCC 10895的NAD(P)H形成酶活力。
16.权利要求15中的方法,其中生物体的改变借助于基因技术方法完成。
17.权利要求15或16中的方法,其中酶活力的提高是通过替换启动子和/或增加基因拷贝数目来实现的。
18.权利要求15至17之任一中的方法,其中酶活力提高是内源性异柠檬酸脱氢酶基因变化的结果。
19.权利要求1-5和12-13中的微生物用于生产核黄素的应用。
20.权利要求6-9中的异柠檬酸脱氢酶基因和权利要求10中的基因结构用于制备权利要求1-5和12-13中的微生物的用途。
21.权利要求11中的载体用于制备权利要求1-5和12-13中的微生物的用途。
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