KR100472082B1

KR100472082B1 - 재조합 단백질의 생산성 증가를 위한 재조합 효모의 배양방법

Info

Publication number: KR100472082B1
Application number: KR10-2002-0020257A
Authority: KR
Inventors: 정준기; 최의성; 오태광; 장형욱; 조영일; 함승주; 안익성; 안정오
Original assignee: 주식회사 에이스바이오텍
Priority date: 2002-04-13
Filing date: 2002-04-13
Publication date: 2005-02-21
Also published as: KR20030081837A

Abstract

본 발명은 GAPDH 프로모터 조절하에서 재조합 단백질을 생산하는 재조합 효모의 배양에 있어서, 종균 접종 후 약 20 내지 28시간 후에 추가 배지를 일정한 속도로 공급하여 일정한 농도가 되도록 균체를 배양한 다음 상기에서 배양한 균체의 비증식 속도가 일정한 범위로 유지되도록 선형공급방식으로 배지를 추가로 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 효모의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 효모의 배양방법은 GAPDH 프로모터 조절에 의해 생성되는 재조합 단백질을 대량생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

재조합 단백질의 생산성 증가를 위한 재조합 효모의 배양방법{Method Of Recombinant Yeast Culture For Enhancing Productivity Of Recombinant Protein}

본 발명은 재조합 단백질의 생산성 증가를 위한 재조합 효모의 배양방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 GAPDH 프로모터 조절하에서 재조합 단백질을 생산하는 재조합 효모의 배양에 있어서, 종균 접종 후 약 20 내지 28시간 후에 추가 배지를 일정한 속도로 공급하여 일정한 농도가 되도록 균체를 배양한 다음 상기에서 배양한 균체의 비증식 속도가 일정한 범위로 유지되도록 선형공급방식으로 배지를 추가로 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 효모의 배양방법에 관한 것이다.

GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)프로모터는 유전자 발현 프로모터 중에서 매우 강력한 구성적 프로모터(constitutive promoter)로 알려져 있다. 효모와 같은 진핵세포에서 유전자의 발현은 전사효율성과 분비경로에 크게 영향을 받기 때문에 높은 전사효율성을 위한 강력한 프로모터가 요구된다(Broker, M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 756-764 (1991)). 따라서, GAPDH 프로모터는 사카로마이세스 세레비지에(Sacharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)등의 효모에서 외래 유전자의 발현을 위한 프로모터로 사용되어 왔다(Kniskern et al., Gene, 46, 135 (1986); Travis et al., J. Biol. Chem., 260, 4384 (1985); Hallewell et al., Bio/Technol., 5, 363 (1987); Rosenberg et al., Methods in Enzymol., 185, 341 (1990); Waterham et al., Gene, 186, 37 (1997)).

한편, GAPDH 프로모터는 배지 중에 포도당이 존재하면 발현이 억제되고 포도당이 고갈되면 발현이 유도되는 특성이 있다. 이러한 GAPDH 프로모터의 특성을 이용하여 GAPDH 프로모터를 갖는 재조합 효모 발효에 있어서, 포도당 농도를 조절함으로써 특정 산물을 고수율로 생산할 수 있는 방법이 연구되어 왔다. 가장 보편적인 방법으로는 포도당 제한 유가배양이 사용되어 왔으나(Fieschko J. C. et al., Biotechnol. Bioeng. 29, 1113-1121 (1987); Turner, B. G. et al., Biotechnol. Bioeng. 37, 869-875 (1991)), 이때 산물의 독성에 의한 균체 증식 수율의 감소와 플라스미드의 불안정성이 문제가 되었다. 이를 해결하고자 초분비 변이주(super secreting strain)인 pmrⅠ 균주를 사용하거나(Turner, B. G. et al., Biotechnol. Bioeng. 37, 869-875 (1991)) 다른 단백질과의 융합 또는 산물 독성에 대한 내성 변이주를 선별하는 방법 등이 연구되었다(Romanos M. A. et al., Yeast, 8, 423- 488 (1992)).

대한민국특허 제16869호에는 특정 단백질의 발현율을 향상시킬 수 있는 재조합 효모의 발효법이 개시된 바 있으며 대한민국특허 제128248호에는 재조합 효모의 개선된 유가식 발효방법이 개시된 바 있다. 대한민국 특허 제140307호에는 효모로부터 분비형 재조합 단백질의 생산을 위한 효율적 발효방법이 개시된 바 있다.

상기 대한민국특허 제16869호에서는 포도당 억제 프로모터인 ADH2/GAPDH 프로모터를 갖는 재조합 효모에서 특정 단백질의 발현율을 향상시키기 위해 발효 배지내 에탄올의 농도가 일정한 범위로 유지되도록 새로운 배지를 단계적으로 추가하는 방식을 사용한 것이다. 이는 재조합 효모가 재조합 단백질을 생성하기 위한 최적의 비증식속도가 발효기간 동안 계속적으로 유지되지 않는 단점이 있다. 또한, 상기 대한민국특허 제140307호에서는 발효 배지 내 에탄올의 농도가 0이 되는 시점에서 ADH2/GAPDH 프로모터를 갖는 재조합 효모의 비증식속도가 일정한 범위로 유지되도록 새로운 배지를 대수적 공급방식으로 추가하는 것을 특징으로 한다. 이는 발효 배지 내 초기 포도당과 부산물인 에탄올이 0이 되는 시점까지 상당한 시간이 소요되며, 또한 그 시점에서는 이미 탄소원이 고갈되어 균체의 영양소 결핍 현상으로 단백질 효소가 과다 생산되거나 또는 생산성이 떨어지는 균체가 유도될 수 있는 단점이 있다.

본 발명자들은 재조합 단백질의 생산성을 효율적으로 증가시킬 수 있는 재조합 효모의 배양방법을 연구하던 중 GAPDH 프로모터의 조절하에서 재조합 단백질을 생산하는 재조합 효모의 배양에 있어서 종균 접종 후 약 20 내지 28시간 후에 추가 배지를 일정한 속도로 공급하여 일정한 농도가 되도록 균체를 배양한 다음 균체의 비증식 속도가 일정한 범위로 유지되도록 선형공급방식으로 배지를 추가로 공급하는 경우에 재조합 단백질의 생산성을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 GAPDH 프로모터의 조절하에서 재조합 단백질을 생산하는 재조합 효모의 배양에 있어서,

ⅰ) 종균 접종 후 약 20 내지 28시간 후에 추가 배지를 일정한 속도로 공급하여 일정한 농도가 되도록 균체를 배양하는 단계; 및

ⅱ) 상기 ⅰ)단계에서 배양한 균체의 비증식 속도가 0.05 내지 0.08h ^-1범위에서 유지되도록 선형공급방식으로 배지를 추가로 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 효모의 배양방법을 제공한다.

본 발명은 GAPDH 프로모터의 조절하에 재조합 단백질을 생산하는 재조합 효모의 배양에 있어서,

ⅱ) 상기 ⅰ)단계에서 배양한 균체의 비증식 속도가 0.05 내지 0.08h ^-1범위에서 유지되도록 선형공급방식으로 배지를 추가로 공급하는 단계를 포함하는 것을 특 징으로 하는 재조합 효모의 배양방법을 제공한다.

본 발명에서 재조합 효모는 이종 유전자를 포함하며, 상기 이종 유전자의 발현을 조절하는 프로모터로서 GAPDH 프로모터를 갖는 효모를 의미한다. 바람직하게는, 이종 유전자 및 이의 발현을 조절하는 GAPDH 프로모터를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 효모를 의미한다. 형질전환을 위한 효모로는 예를 들면, 사카로마이세스 속( Saccharomyces sp.), 캔디다 속( Candida sp.), 피키아 속( Pichia sp.), 한세눌라 속( Hansenula sp.), 크루베로마이세스 속( Klyveromyces sp.), 시조사카로마이세스 속( Schizosacchromyces sp.), 스와니노마이세스 속( Schwanniomyces sp.) 미생물을 사용할 수 있다.

본 발명에서 재조합 단백질은 상기 재조합 효모에 형질전환된 이종 유전자가 GAPDH 프로모터의 조절에 의해 발현됨으로써 생성된 산물을 말한다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 사람 과립구 콜로니 자극 인자, 사람 리포코르틴, B형 간염 바이러스의 표면 항원, 의약용 단백질 히루딘, 공업용 효소인 셀루레이즈, 자일레이즈, 인버테이즈, 글루코즈 옥시테이즈, 글루코아밀레이즈, 리파아제 등을 포함한다.

ⅰ) 단계에서 종균 접종은 보존된 상태의 재조합 효모를 접종용 배지에서 배양하여 활성화시킨 다음 균체 증식을 위한 성장용 배지에 일정량을 첨가한다.

접종용 배지는 특별히 한정되지는 않으며 재조합 효모가 활성화되기에 적합 한 배지를 사용하며 탄소원 및 질소원을 포함한다. 예를 들면, 포도당 1 내지 3%(w/v), 효모 엑기스 0.5 내지 1.5%(w/v) 및 펩톤 1 내지 3%(w/v)를 포함하는 배지를 사용한다.

성장용 배지는 특별히 한정되지는 않으며 균체의 증식에 필요한 탄소원, 질소원 및 미네랄, 비타민, 금속이온과 같은 기타 필수성분을 충분히 포함한다. 예를 들면, 포도당 1 내지 3%(w/v), 효모엑기스 0.1 내지 0.2%(w/v) 및 미량의 황산마그네슘, 카사미노산(casamino acid), 인산수소칼륨, 황산망간, 황산철, 황산아연을 포함할 수 있다.

종균 접종이 완료되면, 이를 약 20 내지 28시간, 바람직하게는 약 24시간 동안 배양한 다음 추가의 배지를 일정한 속도로 공급한다.

추가의 배지로는 포도당 30 내지 50%(w/v), 효모 엑기스 1 내지 3%(w/v), 카사미노산 1 내지 3%(w/v), 인산수소칼륨 1 내지 2%(w/v)로 구성된 생산용 배지를 사용한다.

추가 배지의 공급속도는 약 0.8g/L/hr 내지 1.3g/L/hr, 바람직하게는 약 1g/L/hr가 되도록 하며 균체 농도가 약 10g/L 내지 약 15g/L, 바람직하게는 약 12g/L가 될 때까지 공급한다.

ⅱ) 단계에서는 상기 ⅰ)단계에서 배양한 균체의 비증식 속도가 0.05 내지 0.08h ^-1범위에서 유지되도록 선형공급방식을 사용하여 배지를 추가로 공급하는 단계이다. 이때 선형공급(linear feeding) 방식은 하기 수학식 1을 사용하여 배지의 공급속도를 1g/l/hr에서 6g/l/hr(배지공급종료시 공급속도)까지 선형적으로 증가하도록 조절하는 방식을 말한다. 즉, 추가 배지 공급을 시작할때 공급속도가 1g/l/hr가 되도록 수학식 1에 따라 F값을 결정하여 결정된 값에 따라 배지를 추가로 공급하고 일정한 균체의 증식속도(0.05 내지 0.08h ^-1)를 유지하기 위해 배양액 중의 세포농도, 배양액 부피변화, 기질농도 및 기질에 대한 균체수율을 고려하여 dF값을 결정함으로써 배지의 공급속도가 1g/L/hr에서 6g/L/hr(배지공급종료시 공급속도)까지 선형적으로 증가되도록 한다. 종래의 배지의 추가 공급 방식은 수학식 2를 사용하여 균체의 증식 속도가 지수함수를 유지하도록 배지의 첨가속도를 조절하는 대수적 공급하는 방식이었다. 본 발명자들은 종래의 대수적 공급방식이 아닌 본 발명에 따른 선형공급방식으로 배지를 공급하였을 때, 재조합 단백질의 생산성이 약 2배이상 증가됨을 확인하였다.

상기식에서,

F:배지공급속도(ml/hr)

M:비례인자(ml/hr ²)

B: 임의의 공급속도에 대한 공급 보정값(ml/hr)

ΔV: 추가배지 총부피(ml)

t ₁: 배지추가의 종료시간(hr)

t:발효시간(hr), t ₀:최초 선형 발효배지 공급 시간(hr)

dF: 배지공급속도의 변화(ml/hr)

μ*: 결정된 세포의 비증식속도(0.05 내지 0.08h ^-1범위)

X: 세포농도(g/L)

V: 배양액 부피(ml)

S ₀: 초기 배지 농도(g/L)

Y _x/s: 기질에 대한 균체 수율

상기 식에서,

dV: 발효액의 부피 변화(L)

F: 배지 첨가 속도(l/hr)

dt: 첨가속도 조절간격(hr)

X: 세포농도(g/L), X ₀: 초기 세포농도(g/L)

V: 발효액의 부피(L), V ₀: 초기 발효액 부피(L)

μ: 비증식 속도(hr ^-1)

Δt; 미세시간변화(hr)

S _F: 첨가되는 배지 농도(g/L), S ₀: 초기 배지 농도(g/L)

Y _x/s: 기질에 대한 균체 수율

특정 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 효모의 배양방법에 따라 GAPDH 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 리파제 유전자를 포함하는 재조합 효모를 배양함으로써 리파제의 생산성을 증가시킬 수 있는 방법을 제공한다.

리파제(Lipase)는 과량의 수분하에서 트리글리세리드를 가수분해하는 효소이다. 본질적으로 반응은 가역적이며 특수한 조건 아래에서 글리세리드의 합성, 에스테르 교환반응 등을 촉매하기도 한다. 자연계에 리파제는 동물, 식물 및 미생물 에 널리 분포되어 있다. 최근까지 리파제는 소화효소에 사용할 목적으로 소, 돼지의 췌장에서 추출하거나, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 리조퍼스 딜레마(Rhizopus delemar) 등의 미생물 배양을 통해 획득하였다. 그러나, 췌장에서 추출하는 방법으로는 리파제를 대량 생산 할 수 없기 때문에 산업적인 측면에서는 미생물 배양법을 사용하고 있다.

본 발명의 재조합 효모는 리파제 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환함으로써 제조할 수 있다. 상기 발현벡터는 리파제 유전자가 GAPDH 프로모터와 아밀라아제 분비시그날에 의해 조절되도록 작제할 수 있다. 리파제 유전자는 식물, 동물 또는 미생물로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 미생물 유래, 더욱 바람직하게는 바실러스 스테로써모필러스( Bacillus stearothermophilus L1)로부터 유래된 것으로 내열성 및 내알칼리성을 지닌 리파제를 암호화한다. 본 발명에서 예시된 발현벡터는 pYEGAP-lip이며, 재조합 효모는 상기 발현벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae 2805/ pYEGAP-lip)이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

재조합 효모의 제조

실시예 1

리파제 유전자의 발현 벡터 작제

리파제를 분비하는 재조합 효모를 제조하기 위해 문헌에 기술된 방법에 따라 리파제 유전자를 포함하는 발현 벡터를 작제하였다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor New York (1989)). 이때, 리파제가 효율적으로 분비되도록 하기 위해 아스퍼질러스 오리제( Aspergillus orzaye )의 아밀라아제 시그날펩타이드(α-amylase signalpeptide)를 단백질 발현용 플라스미드 벡터 pYEGAP(Pharmacia)의 적절한 제한효소 사이트에 삽입시켰다. 상기 아밀라아제 시그날펩타이드 유전자와 제한효소 사이트는 다음과 같다.

5'-AA TTC ATG ATG GTC GCG TGG TGG TCT CTA TTT CTG TAC GGC CTT CAG GTC GCG GCA CCT GCT TTG GCT CAT ATG AAA GGT AAG CTT G -3'(서열번호 1)

Nde I Hind III Sal I

다음으로, 리파제 유전자의 해당영역(ORF, open reading frame)에 해당하는 DNA를 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭하여 이를 제한효소로 분리 정제한 다음 상기 플라스미드 벡터 pYEGAP에 결합시켰다. 즉, 바실러스 스테로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus L1)으로 부터 유래된 리파제 N-말단 유전자(서열번 호 2)를 주형으로 하고 제한효소 Nde I 절단부위와 전사개시 코돈 ATG를 포함하는 프라이머(서열번호 3)와 C-말단을 포함하는 프라이머(서열번호 4)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 1.2kb의 유전자를 증폭하였다.

5'-GAA CAT ATG ATG AAA GGC TGC CGG GTG ATG GTT-3'(서열번호 3)

Nde I

5'-GCA AAG CTT TTA AGG CCG CAA ACT CGC CAG-3'(서열번호 4)

Hind III

상기에서 증폭된 리파제 유전자를 제한효소 Nde I , Hind III 로 처리하여 분리 및 정제한 다음 동일한 효소로 처리한 플라스미드 벡터 pYEGAP에 결합시켰다. 상기에서 작제된 리파제를 발현하는 플라스미드를 pYEGAP-lip으로 명명하였다.

실시예 2

효모의 형질전환

상기 실시예 1에서 작제한 발현 벡터 pYEGAP-lip를 숙주효모인 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae 2805)에 형질전환시켜 재조합 효모(S. cerevisiae 2805/ pYEGAP-lip)를 제조하였다. 효모균주의 형질전환은 당업계에 공지된 방법을 사용하였다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor New York (1989)).

상기 재조합 효모의 리파제 활성을 평판 분석법(plate assay method)으로 측정한 다음 가장 높은 활성을 보인 균주를 생산용 균주로 선발하였다. 즉, 재조합 효모를 1% 트리카프리린(tricaprylin)이 함유된 YPD 평판 배지에 접종하여 72시간 배양한 다음 세포 주위의 투명환의 크기를 측정하여 크기가 가장 큰 균주를 생산용 균주로 선발하였다.

최적 배양조건의 확립

다음의 실시예에서 각종 측정방법은 다음과 같이 수행하였다.

(1) 세포건조량(Dry Cell Weight) 측정

배양액을 원심분리하여 세포를 회수한 다음 등장액으로 세척하고 이를 80℃로 건조하여 항량에 도달하였을 때의 무게를 측정하였다.

(2) 리파제의 정량

리파제의 역가는 pH-stat방법(Carrie, A. et al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition , 39, 165-187 (1999))을 사용하여 측정하였다.

(3) 포도당의 정량

포도당의 정량은 포도당 분석기(glucose analyzer, YSI Incorp., YSI 2700)를 사용하여 분석하였다.

(4) 에탄올의 정량

에탄올의 정량은 HPLC(Gilson Corp., Gilson 305)를 이용하여 분석하였다. 이때, 고정상으로는 양이온교환수지 컬럼(300mm×7.8mm, Biorad Lab., Amine HPX-87H)을 사용하였으며, 이동상으로는 0.008M 황산용액을 사용하여 유속 0.4ml/min로 분석하였다.

실시예 3

재조합 효모의 유가식 발효공정에서 생산용 배지의 공급시기 결정

재조합 리파제를 생산하기 위한 재조합 효모의 유가식 발효공정에서, 생산용 배지의 공급시기를 결정하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 상기 실시예 1의 재조합 효모를 접종용 배지[포도당 2%(w/v), 효모 엑기스 1%(w/v), 펩톤 2%(w/v)]에 접종하여 30℃에서 150rpm으로 교반하면서 24시간 배양하였다. 상기 배양액을 2L 성장배지[포도당 2%(w/v), 효모엑기스 0.15%(w/v), 황산마그네슘 0.025%(w/v), 카사미노산(casamino acid) 0.15%(w/v), 인산수소칼륨 0.075%(w/v), 황산망간 0.002%(w/v), 황산철 0.002%(w/v), 황산아연 0.001%(w/v), pH 5.5]에 10% 농도가 되도록 접종하고 30℃, pH 5.5, 통기량 1vvm 및 DOT(용존산소량포화량) 30%이상으로 유지하면서 배양하였다. 종균 접종 후 각각 12시간, 24시간 및 32시간 후에 생산용 배지[포도당 40%(w/v), 효모 엑기스 2.5%(w/v), 카사미노산 2%(w/v), 인산수소칼륨 1.5%(w/v)]를 1g/L/hr의 속도로 균체 농도가 12g/L가 될 때까지 일정하게 공급하였다. 발효가 종료되면 단위균체당 리파제 활성을 측정하였다.

실험 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 재조합 효모 종균을 접종한 후 24시간부터 생산용 배지를 공급한 경우에 단위 균체당 리파제 활성이 가장 높게 나타났다.

생산용 배지의 공급시기에 따른 단위균체당 리파제 활성

생산용 배지의 공급시기	발효시간(hr)	단위균체당 리파제 활성(U/g·cell)
종균접종 후 12시간 후	40	0.83
종균접종 후 24시간 후	35	1.08
종균접종 후 32시간 후	37	0.79

이러한 결과는 종균접종 후 12시간 후에 생산용 배지를 공급한 경우에는 성장배지 중의 포도당으로부터 생성된 에탄올이 균체에 의해 소비되지 않고 잔존해 있기 때문에 리파제 활성이 낮은 것으로 추정된다. 또한, 종균접종 후 32시간 후에 생산 배지를 공급한 경우에는 성장배지 중의 포도당 및 에탄올이 모두 고갈된 상태에 이르러 단백질 분해효소가 분비되었거나 또는 균체가 탄소원의 결핍으로 인해 성장이 저해되어 리파제 활성이 낮았던 것으로 추정된다. 따라서, 생산배지를 공급하는 적절한 시기로 약 24시간 후에 공급하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 4

재조합 효모의 유가식 발효공정에서 생산용 배지의 공급속도 결정

재조합 리파제의 생산을 위한 재조합 효모의 유가식 발효공정에서, 생산용 배지의 공급속도를 결정하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 종균을 배양한 다음 성장배지에 접종하고 종균 접종 후 24시간 후에 생산용 배지를 각각 0.5g/L/hr, 1g/L/hr, 2g/L/hr의 속도로 균체 농도가 12g/L가 될 때까지 일정하게 공급하였다. 각각의 발효공정이 종료되면, 단위균체당 리파제 활성을 측정하였다.

실험 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 생산용 배지를 1g/L/hr의 속도로 공급한 경우 단위균체당 리파제 활성이 가장 높게 나타났다.

생산용 배지의 공급속도에 따른 단위균체당 리파제의 활성

생산용 배지의 공급속도	발효시간(hr)	단위균체당 리파제 활성(U/g·cell)
0.5g/L/hr	40	0.83
1g/L/hr	35	1.08
2g/L/hr	37	0.79

이러한 결과는 생산용 배지를 0.5g/L/hr로 공급하는 경우에 균체 성장 및 리 파제 생산에 있어서, 공급량이 부족하기 때문이며 2g/L/hr로 공급하는 경우에는 과도한 공급으로 인해 에탄올 생성이 유발되어 리파제 생산이 억제되는 것으로 추정된다. 따라서, 생산배지를 공급하는 적절한 속도로는 약 1g/L/hr가 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 5

재조합 효모의 유가식 발효공정에서 균체 증식속도의 결정

재조합 리파제의 생산을 위한 재조합 효모의 유가식 발효공정에서, 컴퓨터 알고리즘에 의해 제어되는 균체 증식속도에 따른 리파제 활성을 조사하였다. 즉, 균체의 성장이 적정수준까지 이르도록 배양한 다음, 초기 탄소원(포도당과 부산물인 에탄올)이 고갈되는 시점에 균체의 비증식 속도(specific growth rate; μ)가 일정하게 유지되도록 대수적 공급방식(exponential feeding)으로 배지를 공급하였다.

상기 실시예 3과 동일한 방법으로 재조합 효모를 접종용 배지에서 24시간 성장시킨 다음 2L의 성장배지에 10% 농도가 되도록 접종하였다. 이를 24시간 동안 배양한 다음 균체 농도가 12g/L가 될 때까지, 생산용 배지를 1g/L/hr의 속도로 공급하였다. 그 다음으로 비증식 속도가 각각 0.03, 0.05, 0.07 및 0.1이 유지되도록 유가식 배양을 실시하였다. 생산용 배지의 공급속도는 수학식 2를 이용하여 결정하였다. 상기 생산용 배지의 공급은 균체 농도가 60g/L가 될 때까지 공급하였 다. 이때, 발효조건은 실시예 3과 동일하게 수행하였다.

실험 결과, 대사 부산물인 에탄올은 거의 생성되지 않았으며 리파제의 생산성(specific productivity)은 표 3에 나타낸 바와 같이 균체의 비증식 속도가 0.07h ^-1일 때 가장 높게 나타났다. 따라서, 균체의 비증식 속도를 약 0.05 내지 0.08h ^-1범위로 유지하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.

균체의 비증식 속도에 따른 리파제의 생산성

균체의 비증식 속도(μ)	발효 시간(hr)	리파제 생산성(U/mg·cell/hr)
0.03	84.2	0.112
0.05	60.4	0.123
0.07	52.4	0.132
0.1	49.1	0.115

실시예 6

선형 공급방식을 이용한 재조합 효모의 유가식 발효

상기 실시예 5의 대수적 공급방식의 컴퓨터 제어 알고리즘 대신에 선형공급(linear feeding) 방식을 사용하여 유가식 발효를 수행하였다. 이때, 실시예 5와 동일한 방식으로 균체농도가 12g/L가 되도록 성장시킬 때까지는 생산배지를 1g/L/hr로 공급하였으며, 이후 균체의 증식속도가 약 0.05 내지 0.08h ^-1범위로 유지되도록 수학식 1을 사용하여 선형공급방식으로 배지를 추가로 공급하였다. 선형공급방식을 이용한 배지의 추가 공급은 배지의 공급속도 1g/L/hr에서부터 시작하여 균체의 증식속도를 일정하게 유지하기 위해 수학식 1로부터 계산된 배지공급속도 변화에 따라 공급속도를 1g/L/hr에서 6g/L/hr(배지공급종료시 공급속도)까지 선형적으로 증가하도록 조절하였다. 이때, 발효조건은 실시예 3과 동일하게 하였다. 배양이 종료된 후 리파제 활성을 대수적 공급방식의 알고리즘을 사용한 경우와 비교하였다.

실험 결과, 표 4 및 도 1에 나타낸 바와 같이 대수적 공급방식 대신 선형 공급방식을 사용한 경우 리파제의 활성이 2.4배까지 증가하였으며 생산성 또한 증가되었다.

배지공급방식에 따른 리파제 활성 및 생산성

배지 공급방식	발효시간(hr)	리파제 활성(U/mL)	리파제 생산성(U/mg·cell/hr)
대수적 공급방식	61	80	0.099
선형공급방식	70	195	0.244

본 발명에 따른 재조합 효모의 배양방법은 GAPDH 프로모터 조절에 의해 생성되는 재조합 단백질을 대량생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 배양방법에 의해 배양한 재조합 효모에서 리파제 생산정도를 나타낸 그래프이다(◆: 포도당, ◇: 에탄올, ●: 건조세포중량, ■: 리파제 활성, …: 공급속도).

<110> Acebiotech Inc. <120> Method Of Recombinant Yeast Culture For Enhancing Productivity Of Recombinant Protein <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aattcatgat ggtcgcgtgg tggtctctat ttctgtacgg ccttcaggtc gcggcacctg 60 ctttggctca tatgaaaggt aagcttg 87 <210> 2 <211> 1167 <212> DNA <213> Bacillus stearothermophilus <220> <221> gene <222> (1)..(1167) <223> encoding lipase <400> 2 gcatctccac gcgccaatga tgcacccatc gtgcttctcc atgggtttac cggatggggg 60 cgagaggaaa tgcttggatt caagtattgg ggcggcgtac gcggcgatat cgaacaatgg 120 ctgaacgaca acggatatcg aacgtatacg ctggcggtcg gaccgctctc gagcaactgg 180 gaccgggcgt gtgaagcgta cgcccagctt gtcggcggaa cggtcgatta tggcgcggcc 240 catgcggcga agcacggcca tgcgcggttt ggccgcacgt atccggggtt gctgccggaa 300 ttgaaaagag gaggccgcgt ccatatcatc gcccacagcc aaggagggca gacggcccgt 360 atgcttgtct cgctcctgga gaacggaagc caagaagagc gggagtacgc caaggagcac 420 aacgtgtcgt tgtcgccgtt gtttgaaggc ggacatcgtt ttgtgttgag cgtgacgacc 480 atcgccactc ctcatgacgg gacgacgctt gtcaacatgg ttgatttcac cgatcgcttt 540 tttgacttgc aaaaagcggt gctggaagcg gcggctgtcg ccagcaacgc gccgtacaca 600 agcgaaatat acgattttaa gctcgaccaa tgggggctgc gccgcgagcc aggcgaatcg 660 ttcgaccatt attttgaacg gctcaagcgc tcccctgtct ggacatcgac cgataccgcc 720 cgctacgatt tatccgttcc cggggctgag acgttgaatc gatgggtgaa agccagcccg 780 aatacgtatt atttgagctt ttctaccgaa cggacgtatc gaggagctct gacaggcaac 840 tattatcccg aacttggaat gaacgcattc agcgcgattg tctgcgcccc gtttctcggc 900 tcgtaccgca atgcggcgct tggcattgac agccattggc ttgggaacga cggcattgtc 960 aataccattt cgatgaacgg tccgaagcgt ggatcaaacg atcgaatcgt gccgtatgac 1020 gggacgttga aaaaaggagt ttggaatgat atggggacgt acaacgtcga ccatttggaa 1080 gtcatcggcg ttgacccgaa tccgtcattt aatattcgcg ccttttattt gcggcttgcc 1140 gagcaactgg cgagtttgcg gccttaa 1167 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaacatatga tgaaaggctg ccgggtgatg gtt 33 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcaaagcttt taaggccgca aactcgccag 30

Claims

GAPDH 프로모터의 조절하에서 재조합 단백질을 생산하는 재조합 효모의 배양에 있어서,

ⅰ) 종균 접종 후 20 내지 28시간 후에 추가 배지를 0.8 내지 1.3g/L/hr의 속도로 공급하여 10 내지 15g/L의 농도가 되도록 균체를 배양하는 단계; 및

ⅱ) 단계 ⅰ)에서 배양한 균체의 비증식 속도가 0.05 내지 0.08h ^-1 범위에서 유지되도록 하기 수학식에 의해 계산되는 선형공급방식으로 배지를 추가로 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 효모의 배양방법.

<수학식>

상기 식에서

F: 배지공급속도(㎖/hr)

M: 비례인자(㎖/hr ²)

B: 임의의 공급속도에 대한 공급 보정값(㎖/hr)

ΔV: 추가배지 총부피(㎖)

t ₁: 배지추가의 종료시간(hr)

t: 발효시간(hr)

t ₀: 최초 선형 발효배지 공급 시간(hr)

dF: 배지공급속도의 변화(㎖/hr)

μ ^*: 결정된 세포의 비증식속도 (0.05 내지 0.08h ^-1 범위)

X: 세포농도(g/L)

V: 배양액 부피(㎖)

S ₀: 초기 배지 농도(g/L)

Y _x/s: 기질에 대한 균체 수율
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 단계 ⅱ)에서 배지의 추가 공급은 균체 농도가 60g/L로 될 때까지 수행함을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 재조합 효모가 리파제 발현 벡터를 포함하는 것을 특징으로 방법.
제6항에 있어서, 리파제 발현 벡터가 리파제 유전자, GADPH 프로모터 및 아밀라아제 분비 시그날을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.