KR101087760B1 - 신규한 재조합 효모 균주 및 이를 이용한 에탄올 및 목적단백질의 동시 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 재조합 효모 균주 및 이를 이용한 에탄올 및 목적단백질의 동시 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 게놈 상의 GAL80 유전자가 결손되고, GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터를 가지며, 혐기적 조건에서 에탄올 및 목적 단백질의 동시 생산능을 갖는 재조합 효모 균주를 제조하고, 이를 이용하여 혐기적 조건에서 에탄올 및 목적단백질을 동시에 생산하는 방법에 관한 것이다.
재조합 효모, 사카로마이세스 세레비지애, 에탄올, 목적단백질
Description
본 발명은 신규한 재조합 효모 균주 및 이를 이용한 에탄올 및 목적단백질의 동시 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 게놈 상의 GAL80 유전자가 결손되고, GAL10 프로모터 및 ADH1 프로모터를 가지며, 혐기적 조건에서 에탄올 및 목적 단백질의 동시 생산능을 갖는 재조합 효모 균주를 제조하고, 이를 이용하여 혐기적 조건에서 에탄올 및 목적단백질을 동시에 생산하는 방법에 관한 것이다.
효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 안전성이 입증된 GRAS (Generally Regarded as Safe) 생물체이며, 연구의 역사도 매우 오래되어 전통적 유전학 기법이 매우 잘 발달됨으로써 유전적 조작이 용이하다. 또한 최근에는 지놈 염기서열 분석도 완료되어 마이크로 어레이 분석 등의 최신기법을 사용하여 연구가 가능하므로 재조합 단백질 발현에 가장 많이 사용되는 시스템 중 하나이다.
또한, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 전통적으로 에탄올 발효에 가장 많이 이용되고 있는 균주이다. 에탄올 발효 시 당화와 발효를 동시에 진행하는 방법인 SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) 공정이나 당화에 필요한 효소 생산을 겸하는 일관 공정인 CBP (Consolidated Bioprocessing) 공정이 에탄올 발효 생산성 극대화를 위한 이상적 공정이므로 이의 구현을 위하여 아밀라제 (Den Haan R. 등, Metab. Eng. 9, 87-94, 2007), 셀루라제 (Eksteen JM 등, Biotechnol. Bioeng. 84, 639-646, 2003) 등의 효소를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주에 발현시키는 연구가 이루어져 왔다 (van Zyl WH 등, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 108, 205-235, 2007).
대량으로 사용되는 공업용 효소 등의 단백질을 에탄올 발효와 동시에 생산할 수 있고 이러한 단백질의 생산이 에탄올 발효에 영향을 미치지 않으면서 에탄올 및 단백질의 동시생산이 가능하다면, 생산비용을 획기적으로 낮출 수 있는 방법을 제공할 수 있을 것이다.
사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모균주에서 에탄올과 같은 대사산물(metabolite)과 재조합 단백질을 동시에 생산하기 위해서는, 혐기적 조건에서 고효율로 발현되는 프로모터가 필요하다. 최근 혐기상태에서 잘 발현되는 프로모터에 관한 연구가 알려진 바 있으나 (Wiebe MG, FEMS Yeast Res. 8, 140-154, 2008, Linde JJM 등, J. Bacteriol. 181, 7409-7413, 1999) 재조합 단백질 생산을 위해서는 주로 호기상태의 발효에 관하여 연구되어 왔고 구성적 발현 (constitutive expression)을 위해서 GAPDH 프로모터 등, 유도적 발현(inducible expression)을 위해서 GAL1, GAL10 프로모터 등이 많이 사용되어 왔다. 특히 GAL 프로모터는 갈락토오스를 유도인자(inducer)로 하여 유도발현 하였을 때 발현 되지 않은 경우와 비교하여 약 1대 1000의 tight regulation이 가능하며 가장 강력한 조절가능 프로모터 중의 하나이다. GAL10 프로모터의 조절 기작에 대한 많은 연구가 이루어져 왔으며 특히 글루코스에 의한 조절을 피할 수 있는 효모 숙주의 결핍주를 개발함으로써 프로모터 활용도를 높이고자 하는 연구 성과가 발표된 바 있다 (Ostergaard S 등, Nat. Biotechnol. 18, 1283-1286, 2000, Ostergaard S 등, FEMS Yeast Res. 1, 47-55, 2001, Stagoj MN 등, FEMS Microbiol. Lett.244, 105-110, 2005). 그러나 GAL10 프로모터의 혐기상태에서의 발현에 관한 자세한 연구는 발표된 바 없으며 본 발명자들이 GAL10 프로모터를 에탄올 발효에 적합한 혐기적 발효상태에서 활성을 분석하면 상당히 낮은 값을 보였다.
이에, 본 발명자들은 이러한 문제를 해결하기 위하여 GAL10 프로모터를 사용하여 혐기적인 조건에서도 우수한 발현율을 얻을 수 있는 방법을 연구하던 중 효모에서 갈락토오스(galactose) 대사에 관련되는 유전자인 gal80 유전자의 결손주를 사용하면 혐기적인 조건에서 에탄올 및 재조합 단백질의 과생산이 가능함을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명자들은 혐기적 에탄올 발효 시 재조합단백 질의 동시 생산이 에탄올 발효에 커다란 영향을 미치지 않음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 게놈 상의 GAL80 유전자가 결손되고, GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터, 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 도입된, 혐기적 조건에서 에탄올 및 목적 단백질의 동시 생산능을 갖는 신규한 재조합 효모 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 효모 균주 게놈 상의 GAL80 유전자를 결손시켜 GAL80 유전자 결손 효모 균주를 제조하는 단계; (b) 상기 GAL80 유전자 결손 효모 균주에 GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터, 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입시켜 재조합 효모 균주를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 재조합 효모 균주를 혐기적 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 및 목적 단백질을 동시에 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 게놈 상의 GAL80 유전자가 결손되고, GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터, 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 도입된, 혐기적 조건에서 에탄올 및 목적 단백질의 동시 생산능을 갖는 신규한 재조합 효모 균주에 관한 것이다.
본 발명에서 "효모"라 함은 단세포 진핵생물의 일종으로서, 원핵생물인 대장균과 함께 재조합 단백질의 생산에 주로 사용되는 생물을 말한다. 본 발명 의 효모 균주는 갈락토오스 대사에 관여하는 유전자의 일종인 GAL80 유전자를 결손시켜 이용하거나, 이미 GAL80 유전자가 결손된 변이주를 이용하는 것이 바람직한데, 이때, 효모 균주로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 및 스키조사카라마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애를 이용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 Y2805 균주의 GAL80 유전자를 결손시켜 이용하거나 GAL80 유전자가 결손된 변이균주 사카로마이세스 세레비지애 Y2805(gal80-)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 효모 균주는 염색체상에서 GAL80 유전자를 결손시키는 방법으로는 당업계에 알려진 통상적인 유전자 결손방법, 예를 들면, 화학물질이나 자외선과 같은 빛을 이용하거나, 상동재조합 기술을 통한 유전자 재조합 기술을 이용하여 GAL80 유전자 부위가 변이되어 결실된 돌연변이체를 얻을 수 있고, 바람직하게는 유전자 팝-아웃 기술을 이용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서는 본 발명자가 기출원한 특허(한국특허출원 2007-0080946)에 개시된 효모 균주인 GAL80 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애 Y2805(gal80-)를 이용하였다.
본 발명의 효모 균주는 GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터, 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 도입되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자 외에 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트, 분비시그널 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
본 발명의 벡터는 효모 균주 세포 내에서 복제가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있 고, 바람직하게는 자기복제를 위한 2 micron 서열을 가지는 효모용 발현 벡터이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터는 프로모터로서 효모 균주 내에서 강력한 프로모터 활성을 나타내는 것으로 알려진 GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터를 포함하며, 이러한 본 발명의 프로모터는 벡터 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결되어, 상기 벡터가 효모 균주 숙주세포 내로 도입된 후, 프로모터 활성을 통해 목적단백질 발현이 유도되게 된다.
또한, 본 발명의 벡터는 발현시키고자 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자를포함하는데, 이는 전체 유전자, 또는 그의 일정한 영역을 코딩하는 서열일 수 있다. 본 발명의 벡터를 사용하여 발현시킬 수 있는 목적 유전자는 효모 균주에서 안정적으로 발현될 수 있는 유전자라면 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 의학, 산업적으로 유용한 목적 단백질이 이용될 수 있으며, 예를 들면, 효소, 호르몬, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 항원, 항체 등이 가능하고, 가장 바람직하게는 산업적으로 유용한 지질분해효소의 하나인 리파제 CalB 단백질 또는 사카로마이세스 세레비지애 균주에 코돈 최적화된 리파제 CAlB14opt을 코딩하는 유전자이다.
"리파제 CalB"는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래의 리파제 B 단백질로서, 의약품 및 정밀 화학제품의 합성에 가장 많이 사용되는 효소이지만, 20 ℃ 이하의 저온조건에서만 단백질의 접힘(folding)이나 퇴화(degradation) 현상이 없이 정상적인 단백질이 생성되고, 효모의 생육 적정온도인 30℃에서 배양하게 되면 단백질의 접힘(folding)이나 퇴화(degradation) 현상 등으로 인해 전체적인 생산성이 감소되는 특성을 가지고 있어 대량 생산에 어려움이 있는 단백질로 알려져 있다. 본 발명자는 이러한 문제를 해결하기 위해 통상의 발효배양 온도인 30℃에서도 안정적인 발현이 가능한 코돈 최적화된 리파제 CalB14opt을 제작한바(한국특허출원 2007-0092823), 본 발명의 구체적 실시예에서는 상기 리파제 CalB14opt를 목적 유전자로 이용하였다.
또한, 본 발명의 벡터는 상기 프로모터 및 목적단백질을 코딩하는 유전자 외에 생성된 단백질을 세포 외로 분비시키기 위한 분비시그널 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 여기서 "분비 시그널"은 리포좀에서 합성된 단백질이 소포체, 골지체 나아가 세포 밖으로 분비되도록 하는 작용을 하는 체계를 말하며, 각 생물종들 및 발현하는 단백질에 따라 그 종류 또한 다양하다. 본 발명에서 이용할 수 있는 분비시그널 유전자로는 MFα, PHO5, SUC2, AMY, SED 및 킬러톡신(Killer Toxin, KT) 등이 가능하며, 바람직하게는 MFα 유전자이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 벡터는 선별 마커(selection market)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 목적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 효모 균주는 상기한 벡터를 프로모터가 작용할 수 있는 양태로 효모 균주세포 내로 도입시키는 것에 의해 구축될 수 있다. 유전자 작제물 형태인 벡터를 세포 내로 도입시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 형질전환 방법이다. 여기서 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
한편, 게놈 상의 GAL80 유전자가 결손되고, 상기한 벡터가 도입된 본 발명의 재조합 효모 균주는 혐기적 조건에서 에탄올 및 목적 단백질의 동시 생산능을 가짐을 특징으로 한다.
효모 균주는 산소가 없는 혐기적 조건에서는 에탄올 발효를 하게 된다. 그러나 통상적인 효모 균주를 이용한 단백질 발현 시스템 내에서는 프로모터들이 호기 조건에서 강력한 활성을 나타내고, 혐기적 조건에서는 그 활성이 80~90% 가까이 소실되어 정상적인 단백질 발현이 불가능한 한계가 있어 왔다. 그러나, 본 발명의 재조합 효모 균주는 혐기적 조건에서도 강력한 프로모터 활성을 나타내므로, 에탄올 발효 및 목적 단백질의 발현이 동시적으로 일어나는 특징을 가진다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 효모 균주 게놈 상의 GAL80 유전자를 결손시켜 GAL80 유전자 결손 효모 균주를 제조하는 단계; (b) 상기 GAL80 유전자 결손 효모 균주에 GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터, 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입시켜 재조합 효모 균주를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 재조합 효모 균주를 혐기적 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 및 목적 단백질을 동시에 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 재조합 효모 균주의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 산소가 유입되지 않은 혐기 상태에서 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 적절한 배양 방법으로는 유가식 배양(fed-batch culture), 회분식 배양(batch culture) 및 연속식 배양(cintinuous culture) 등이 가능하며, 바람직하게는 유가식 배양이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한 다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.
배양물의 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절히 사용하여 조절할 수 있다. 발포는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 조절할 수 있다. 배양 온도 는 통상적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다, 가장 바람직하게는 30℃이다. 배양은 원하는 목적 단백질 및 에탄올의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있으며, 단백질은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 재조합 효모 균주를 배양시켜 에탄올을 발효시키고, 목적 단백질을 발현시켜 생산한 후, 에탄올 및 목적 단백질의 회수는 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지로부터 분리해낼 수 있다. 단백질 회수는 단백질의 물리, 화학적 특성에 따라 적합한 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등의 방법이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 생산 방법을 통해, 리파제 CaB 유전자를 벡터에 포함시켜 제조한 효모 균주를 배양시켜 수득한 리파제 CalB 단백질은 바이오촉매로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 재조합 효모 균주는 혐기적 조건에서 에탄올 및 목적 단백질의 동시 생산이 가능한 장점을 가진다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. GAL10 프로모터를 이용하여, 사카로마이세스 세레비지애(
Saccharomyces cerevisiae
) 균주에서 CalB14 발현
GAL10 프로모터는 가장 강력한 조절가능 프로모터 중의 하나로서 사카로마이세스 세레비지애에서 유전자 발현에 가장 많이 사용되며 상업적인 키트로 판매가 되고 있기도 하다. 그러나, GAL10 프로모터를 사용하여 재조합단백질을 생산하는 경우 대부분 호기조건의 발효 방법을 선택하게 된다.
본 발명자들은 GAL10 프로모터를 사용하여 혐기조건의 에탄올 발효와 동시에 공업용 효소로 많이 사용되는 지질분해효소인 돌연변이된 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래의 lipase (CalB14) (효모 표면 발현 벡터를 이용하여 변이 리파제를 스크리닝하는 방법 및 신규 변이 리파제, 한국등록특허 제475133호)의 재조합 생산 방법을 조사하던 중 GAL10 프로모터는 효모에서의 에탄올의 과생산을 위한 혐기적 발효상태에서 상당히 낮은 프로모터 활성을 보임을 발견하였다.
CalB14의 코돈(codon)이 사카로마이세스 세레비지애에 최적화(optimization)된 유전자인 CalB14opt (효모에서 재조합단백질을 고효율로 분비발현 시키는 방법, 한국특허출원 제2007-0092823호)를 발현시키기 위해 사카로마이세스 세레비지애 유 래의 GAL10 프로모터를 사용하였고, 발현된 단백질의 분비를 위하여 효모에서 가장 많이 사용되는 분비 유도 서열 mating factor-α(MFα) 신호 서열(signal sequence)을 사용하였다. 여기서, MFα역시 S. cerevisiae에 코돈이 최적화된 유전자인 MFαopt를 사용하였다 (효모에서 재조합단백질을 고효율로 분비발현 시키는 방법, 한국특허출원 2007-0092823, 2007. 9. 12.).
사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) 유래의 GAL10 프로모터를 SacI과 EcoRI 제한효소로 절단하여 MFαopt와 CalB14opt 를 함께 사카로마이세스 세레비지애 발현벡터에 클로닝하였고, pGAL-MFa opt-CalB14 opt로 명명하였다(도 1 참조). 상기 재조합 발현벡터를 S. cerevisiae Y2805 균주에 리튬/아세테이트(lithium/acetate) 방법을 이용하여 형질전환 하였고, UD(Ura-, glucose) plate에서 얻은 형질전환체(transformant)를 YPD(2% glucose)-tributyrin plate 및 YPDG(1% glucose, 1% galactose)-tributyrin plate에 picking하여 30℃에서 24시간 배양시킨 후, 리파제 활성을 나타내는 halo를 보이는 콜로니를 각각 선별하였다.
CalB14 단백질을 혐기적 조건으로 발현하기 위하여, 통기가 안되도록 배지를 함유한 시험관을 파라필름(parafilm)으로 sealing하였고 rotary shaker에서 30℃에서 72시간 정치 배양시켜 CalB14 단백질의 발현을 유도하였다. 호기적인 경우는 통기를 위하여 parafilm으로 sealing하지 않고, rotary shaker에서 200rpm으로 30℃ 에서 72시간 배양하였다. 각각의 배양액으로부터 얻은 상등액을 ρNPP (ρ-nitrophenyl palmitate)를 기질로 하여 5분간 반응시킨 후 리파제 활성(lipase activity)을 측정하였다.
리파제 CalB14를 GAL10 프로모터를 이용하여 S. cerevisiae 야생형균주 (Y2805) 에서 발현 시켰을 때 GAL10 프로모터의 유도물질(inducer)인 갈락토오스(galactose)를 탄소원으로 하여 100g/L의 농도로 발현을 유도하였을 때 호기상태에서는 약 1,393 U/L의 값을 보인 반면, 혐기상태에서는 세포성장이 매우 저조하였고 약 166 U/L의 낮은 값을 보였다. 세포성장의 문제를 해결하기 위하여 글루코오스 100 g/L + 갈락토오스 10 g/L의 조건으로 발현을 유도하였을 경우에도 세포성장은 정상적이었으나, 리파제 활성은 약 318 U/L의 비교적 낮은 값을 보였다.
한편 호기조건에서 갈락토오스(galactose) 대신 글루코오스(glucose)만 사용하여도 발현이 잘 되는 갈락토오스 대사 관련 유전자 결손주 gal80 균주(Y2805 (gal80-); 기탁번호 KCTC 11162BP)를 (이스트 GAL80 결핍주를 이용한 재조합단백질의 생산 방법, 한국특허출원 제2007-0080946호) 사용하여 혐기조건에서의 거동을 살펴보았다. pGAL-MFa opt-CalB14 opt를 함유한 Y2805 (gal80-)를 갈락토오스를 탄소원으로 사용하지 않고 탄소원으로 글루코오스만 사용하여 혐기적인 조건에서 배양하였을 경우, 리파제 활성이 Y 2805 균주의 혐기적인 조건에서의 리파제 생산량뿐만 아니라 호기조건에서의 생산량 보다 높은 1,958 U/L의 높은 값을 보였다. 세 포중량 당 생산성의 경우는, gal80이 결손되지 않은 Y 2805 균주의 혐기적인 조건에서의 리파제 생산량보다 약 4배의 증가된 값을 보였다. 이는 혐기조건에서 gal80 결핍주가 재조합 단백질 생산성이 gal80이 결핍되지 않은 균주보다 우수한 특성을 나타냄을 알 수가 있었다. 따라서, 이후 실험은 gal80 결핍주를 이용하여, 혐기적인 조건에서의 단백질 생산 및 에탄올의 동시생산에 관한 연구를 수행하였다.
효모 균주의 발현조건 및 CalB14 생산성에 대한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 배양상태 | 발현균주1 | 배양배지2 | OD(A600) | Activity(U/L) | Activity/OD(U/OD) |
| 호기 | Y 2805 | YPGal 10% | 19.1 | 1,393 | 72.9 |
| 혐기 | Y 2805 | YPGal 10% | 3.8 | 166 | 43.8 |
| Y 2805 | YPGlu 10%+Gal 1% | 14.8 | 318 | 21.5 | |
| Y 2805 (gal80-) | YPGlu 10% | 11.5 | 1,958 | 173.3 |
1모든 발현균주는 pGAL-MFa opt-CalB14 opt에의해서 형질전환된 균주
2YPGal 10%(yeast extract 10 g/L, Bacto-pepton 20 g/L, galactose 100 g/L)
YPGlu 10%+Gal 1%(yeast extract 10 g/L, Bacto-pepton 20 g/L, glucose 100 g/L, galactose 10 g/L)
YPGlu 10%(yeast extract 10 g/L, Bacto-pepton 20 g/L, glucose 100 g/L)
실시예 2. GAL10 프로모터를 이용한, 혐기적인 조건하에서 S. cerevisiae에서 에탄올과 CalB14 동시생산
혐기적인 조건하에서, 에탄올과 단백질의 동시생산의 보다 정확한 실험을 위하여, 5L 발효조에서 실험을 수행하였다. pGAL-MFa opt-CalB14 opt의 재조합 발현벡터에 형질전환된 S. cerevisiae Y2805 gal80 변이주를 200ml YPD를 함유한 1,000ml baffled flask에 접종한 후, 30℃에서 24시간 배양시킨 것을 glucose 100 g/L, yeast extract 10 g/L, Bacto peptone 20 g/L의 2,500mL을 함유한 5L 발효조에 접종하고, 혐기적인 조건을 위하여, 공기를 넣지 않고, 임펠라 속도를 50 rpm으로 고정시켰다. 배양은 30℃, pH 6.0의 조건에서 수행되었으며, 배양 도중에 초기 글루코오스가 거의 소모될 무렵에 글루코오스 200g이 300ml에 녹아있는 용액을 배양기에 첨가하였다. 포도당과 에탄올은 HPX 87H 컬럼(Bio-Rad, USA)를 이용한 HPLC(Gilson, France)를 통하여 분석하였으며, CalB14의 발현량은 각각의 배양액으로부터 얻은 상등액을 ρNPP (ρ-nitrophenyl palmitate)를 기질로 하여 5분간 반응시킨 후 리파제 활성을 측정하였다.
도 2에서 보이는 것처럼, 접종 후 15시간까지 균체가 25.4OD까지 지수성장을 유지하다가 배양말기까지 균체의 성장이 거의 이루어지지 않았다. 또한 에탄올은 배양기간 동안 계속 생산되어 94.8 g/L까지 생산되었으며, CalB의 발현량도 배양기간 동안 거의 계속적으로 증가하여, 배양말기에는 1,782 U/L의 최대 발현량을 보였다. 에탄올의 포도당 대비 수율은 이론적인 수율과 비슷한 51.8%정도였다.
대조군으로, CalB를 코딩하는 유전자가 포함되지 않은 Y2805를 상기의 배양조건에서 발효를 수행하였다(도 3 참조). Y2805와 pGAL-MFa opt-CalB14 opt의 재조합 발현벡터에 형질전환된 Y2805 gal80 변이주의 에탄올 생산을 비교했을 때, 에탄올수율은 50% 부근으로 비슷하였으며, 또한, CalB의 발현이 증대되는 25-30시간에서 비에탄올생산속도(gethanol/cellOD600/h)도 0.11부근으로 비슷하였다. 이는 pGAL-MFa opt-CalB14 opt의 재조합 발현벡터에 형질전환된 Y2805 gal80 변이주에서 CalB의 발현이 에탄올의 생산에 큰 영향을 끼치지 않으면서, 혐기적인 조건에서 효과적으로 에탄올과 CalB14를 동시 생산함을 확인할 수가 있었다.
실시예 3. 다양한 프로모터를 이용한, 혐기적인 조건하에서 S. cerevisiae에서 에탄올과 CalB14 동시생산
혐기적 조건에서 프로모터활성이 높다고 알려져 있는(Wiebe et al., FEMS Yeast Res 8, 2008, p140-154) PDC1, PGK 및 ADH1 프로모터들을 사용하여, 혐기적인 조건하에서의 에탄올과 재조합단백질의 동시생산에 관하여 비교분석하였다.
실시예1에서 제조된 pGAL-MFa opt-CalB14 opt의 재조합 발현벡터에서 GAL10를 PDC1, PGK 와 ADH1으로 각각 대체하였다. 즉, S. cerevisiae 유래의 ADH1와 PGK와 PDC1 프로모터를 코딩하는 유전자들을 표 2에 나타나 있는 ScADH1-F와 ScADH1-R, ScPGK1-F와 ScPGK1-R, ScPD1-F와 ScPDC1 프라이머의 조합으로 S. cerevisiae Y2805 균주의 genomic DNA를 template로 하여 각각 PCR을 통하여 증폭하였다. 각각의 PCR product를 pGEM-T easy vector에 sub-cloning 하여 염기서열을 확인한 후, SacI(PDC1 프로모터인 경우 BamHI)과 EcoRI 제한효소 절단하여 각각의 프로모터를 함유한 유전자부분을, 같은 제한효소로 절단된 pGAL-MFa opt-CalB14 opt에 삽입시켰다. 이렇게 제조된 발현벡터들을 각각 pADH1-MFa opt-CalB14 opt, pPGK-MFa opt-CalB14 opt와 pPDC1-MFa opt-CalB14 opt으로 명명하였다 (도 4 참조).
ADH1, PGK 및 PDC1 프로모터를 증폭하기 위해 사용한 프라이머 서열을 하기 표 2에 나타내었다.
| 프라이머명 | 서열 |
| ScADH1-F | 5'-GAGCTCTGTAGCCCTAGACTTGAT-3' (서열번호 1) |
| ScADH1-R | 5'-GAATTCTGTATATGAGATAGTTGA-3' (서열번호 2) |
| ScPGK1-F | 5'-GAGCTCGGGCCAGAAAAAGGAAGT-3' (서열번호 3) |
| ScPGK1-R | 5'-GAATTCTGTTTTATATTTGTTGTA-3' (서열번호 4) |
| ScPDC1-F | 5'-ATATATGGATCCGCGTTTATTTACCTATCTC-3' (서열번호 5) |
| ScPDC1-R | 5'-ATATATGAATTCTTTGATTGATTTGACTGTGTTA-3' (서열번호 6) |
*이택릭체는 첨가된 제한효소인식서열을 의미함.
제조된 재조합 발현벡터들을 Y2805(gal80-)에 lithium/acetate 방법을 이용하여 형질전환하였고, UD(Ura-, glucose) plate에서 얻은 형질전환체들을YPD-tributyrin plate에 picking하여 30℃에서 24시간 배양시킨 후, halo를 통하여 리파제 활성을 보이는 콜로니를 각각 선별하였다.
선별된 각각의 형질전환균주를 이용하여, 실시예 2와 같은 배양조건의 5L 발효조를 통하여 에탄올과 CalB14의 동시생산 경향을 알아보았다.
도 5, 6, 7에서 보이는 것처럼, 테스트된 모든 균주에서 에탄올이 고농도로 생산됨을 알 수가 있었다. 하지만, CalB14의 발현은 리파제의 활성으로 미루어보아, ADH1의 프로모터를 사용하였을 때, GAL10 프로모터를 사용하는 경우와 유사하였으며, PDC1와 PGK의 경우는 낮거나 거의 발현이 되지 않았다.
다양한 프로모터들을 이용한 Y 2805 (gal80-)의 혐기적인 조건하에서의 발효결과들을 하기 표 3에 나타내었다.
1Ethanol yield는 생산된 ethanol/소비된 glucose x 100으로 계산됨
2상대적인 CalB Activity는 GAL10프로모터를 사용했을 때 대비한 상대적인 값을 말한다.
표 3에 나타나 있듯이 테스트된 모든 균주는 혐기적인 조건하에서 에탄올 수율이 이론적인 수율과 거의 유사하게 생산되었다. 하지만, CalB14의 발현은 GAL10과 ADH1 프로모터를 사용했을 때가 가장 높게 나왔다.
이런 결과들을 통해서, 혐기적인 조건하에서 에탄올과 재조합 단백질이 Y2805의 gal80 결핍주를 사용하고, GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터를 사용하면 효과적인 동시 생산이 가능하다는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 신규한 재조합 효모 균주는 혐기적 조건에서 에탄올 및 목적 단백질의 동시 생산이 가능한 장점이 있고, 특히, 공업용 효소를 포함한 산업용 재조합 단백질의 대량 생산과 에탄올 발효가 동시에 가능하여 이들의 생산비용을 획기적으로 낮출 수 있으므로, 다양한 산업분야에 효율적으로 이용될 수 있다.
도 1은 GAL10 프로모터를 이용한 효모에서의 CalB14 발현을 위한 재조합 발현벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 혐기적인 조건의 5L 발효조에서 Y 2805 (gal80-)/pGAL-MFa opt-CalB14 opt를 이용한 에탄올과 CalB14의 동시생산 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 혐기적인 조건의 5L 발효조에서 Y 2805를 이용한 에탄올생산 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 ADH1(A), PGK(B) 및 PDC1(C) 프로모터를 이용한 CalB14의 발현벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 혐기적인 조건의 5L 발효조에서 Y 2805 (gal80-)/pPDC1-MFa opt-CalB14 opt를 이용한 에탄올과 CalB14의 동시생산 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 혐기적인 조건의 5L 발효조에서 Y 2805 (gal80-)/pPGK-MFa opt-CalB14 opt를 이용한 에탄올과 CalB14의 동시생산 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 혐기적인 조건의 5L 발효조에서 Y 2805 (gal80-)/pADH1-MFa opt-CalB14 opt를 이용한 에탄올과 CalB14의 동시생산 결과를 나타낸 그래프이다.
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ScPGK1 reverse primer
<400> 4
gaattctgtt ttatatttgt tgta 24
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ScPDC1 forward primer
<400> 5
atatatggat ccgcgtttat ttacctatct c 31
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ScPDC1 reverse primer
<400> 6
atatatgaat tctttgattg atttgactgt gtta 34
Claims (10)
- 게놈 상의 GAL80 유전자가 결손되고, GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터, 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 도입된, 혐기적 조건에서 에탄올 및 목적 단백질의 동시 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 효모 균주는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 재조합 효모 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 MFα, PHO5, SUC2, AMY, SED 및 킬러톡신으로 구성된 군으로부터 선택되는 분비시그널 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 효모 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 리파제 B(CalB) 또는 사카로마이세스 세레비지애 균주에 코돈 최적화된 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 변이 리파제 B14(CalB14)이고, 혐기적 조건에서 에탄올 및 리파제의 동시생산이 가능한 재조합 효모 균주.
- (a) 효모 균주 게놈 상의 GAL80 유전자를 결손시켜 GAL80 유전자 결손 효모 균주를 제조하는 단계;(b) 상기 GAL80 유전자 결손 효모 균주에 GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모 터, 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입시켜 재조합 효모 균주를 제조하는 단계; 및(c) 상기 재조합 효모 균주를 혐기적 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 및 목적 단백질을 동시에 생산하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 (a)에서 제조된 GAL80 유전자 결손 효모 균주가 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) Y2805(gal80-) 인 것을 특징으로 하는 에탄올 및 목적 단백질을 동시에 생산하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 재조합 효모 균주는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 단계 (b)의 벡터가 MFα, PHO5, SUC2, AMY, SED 및 킬러톡신으로 구성된 군으로부터 선택되는 분비시그널 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자가 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 리파제 B(CalB) 또는 사카로마이세스 세레비지애 균주에 코돈 최적화된 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 변이 리파제 B14(CalB14)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
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