KR101751684B1

KR101751684B1 - 아미노 말단을 동의코돈으로 치환한 CadA 유전자를 이용한 이타콘산의 생산방법

Info

Publication number: KR101751684B1
Application number: KR1020150165746A
Authority: KR
Inventors: 최종현; 송재준; 정대은; 전호근
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2017-06-28
Also published as: KR20170060952A

Abstract

본 발명은 동의코돈으로 치환된 CadA(cis-aconitate decarboxylase) 유전자를 이용하는 이타콘산의 생산방법에 관한 것이다. 상세하게는 동의 코돈 치환과 엠체리(mCherry) 접힘 리포터를 이용하여 CadA의 가용성 발현이 증대된 변이체를 선별하고, 선별된 상기 변이체를 갖는 대장균 숙주를 이용하여 0.5% 포도당이 첨가된 LB 배지에서 배양함으로써, 동일 조건으로 생산한 야생형 CadA를 포함하는 숙주보다 3배 높은 양의 이타콘산을 생산하였으며, 이후, 1%(v/v) 글리세롤(glycerol) 및 0.85g/ℓ의 구연산염(citrate)이 첨가된 변형된 M9 배지에서 0.2mM IPTG로 유도한 후 72시간 동안 배양하여 985.6±33.4㎎/ℓ의 이타콘산을 생산하였다. 또한, 동일한 배지를 이용한 유가 배양식 발효(fed batch fermentation)법으로 질소제한(nitrogen limitation)을 유도함으로써 이타콘산의 생산량을 약 7배(7.23g/ℓ)까지 증가시킬수 있다는 것을 확인하였다.

Description

아미노 말단을 동의코돈으로 치환한 CadA 유전자를 이용한 이타콘산의 생산방법{Method for producing itaconic acid using CadA gene substituted with synonymous codon of N-terminal region}

본 발명은 아미노 말단을 동의코돈으로 치환한 CadA 유전자를 이용한 이타콘산의 생산방법에 관한 것이다.

이타콘산은 2-메틸리덴부탄디오익산(2-methylidenebutanedioic acid)이라 불리기도하며, 불포화 디카르복실산과 공액 이중결합을 가지고 있어 화학적으로 활용하기 쉬운 특성이 있다. 이러한 특징으로 이타콘산은 섬유(fiber), 수지(resin), 플라스틱 고무(plastic rubber), 페인트(paint), 계면활성제(surfactant), 이온교환수지(ion-exchange resins) 및 윤활유(lubricant) 등의 다양한 제품의 원료로 활용되고 있다. 뿐만 아니라, 이타콘산은 석유화학 유래의 원료인 아크릴산(acrylic acid), 아세톤 시아노히드린(acetone cyanohydrin), 무수말레산(maleic anhydride) 및 트리폴리인산 나트륨(sodium tripolyphosphate)를 대체할 수 있어 그 활용성이 매우 높은 물질이다. 그러나 원료로 활용되기에는 생산단가가 높아 활용 범위가 제한되고 있다. 현재까지 이타콘산의 생산단가를 낮추기 위한 여러 연구가 진행되었으나, 이타콘산의 산업적 발효 공정 및 생산성(86.2g/ℓ)은 수십 년 동안 크게 개량되지 못하고 있다. 이는 이타콘산 생산 숙주인 필라멘트성 곰팡이인 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus)의 생리학적 특성에 기인한다.

최근 아스퍼질러스 테리우스(A. terreus)와 달리 효모와 대장균과 같이 발효 조건 및 개량이 용이한 숙주를 이타콘산 생산 미생물로 전환하려는 시도가 이뤄지고 있다. 자연적으로 이타콘산을 생산하지 못하는 대장균을 이타콘산 생산 숙주로 전환하기 위해서는, TCA 회로에 나타나는 이소구연산염(isocitrate)을 이타콘산으로 전환하는 시스-아코니테이트 디카르복실라아제(cis-aconitate decarboxylase: CadA)의 도입이 필요하다. 이타콘산의 생산은 CadA의 기능성 발현과 밀접하게 연관되어 있어, CadA의 과발현이 이타콘산 생산에 유리하다. 그러나 아스퍼질러스 테리우스(A. terreus)로부터 유래한 CadA가 이종 숙주에서 대부분 불용성 응집체로 발현되는 점은 이타콘산 생산 재조합 숙주의 개발에 큰 걸림돌이 되고 있다.

낮은 온도에서의 배양을 통해 CadA의 기능성 발현 증대 및 숙주의 대사 조절을 통해 대장균에서 이타콘산 생산량을 690㎎/ℓ까지 증대한 보고가 있으나, 첨가한 탄소원(9g/ℓ의 포도당) 대비 7.6%의 매우 낮은 전환률을 보인다. 따라서 이타콘산 생산에서 주요한 효소인 CadA의 기능성 발현 또는 활성의 증대가 이타콘산 생산 균주 개발에 중요한 일들 중 하나이나, 개량된 CadA를 빠르게 선별할 수 있는 적절한 방법이 없다.

현재 이타콘산의 생산 관련하여 알려진 기술의 일례로는 한국등록특허 제1428508호에 아스퍼질러스 테리우스 및 이를 이용한 이타콘산의 제조방법이 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2012-0116377호에 이타콘산 고생산성 변이 균주, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 이타콘산의 생산 방법이 개시되어 있으나, 아직까지 본 발명의 동의코돈으로 치환된 CadA(cis-aconitate decarboxylase) 유전자 도입을 통한 이타콘산의 대량생산 방법에 관하여 언급된 바는 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 동의코돈으로 치환된 CadA 유전자를 이용하는 이타콘산의 생산방법에 관한 것으로, CadA 유전자 동의코돈 라이브러리로부터 가용성이 우수한 유전자를 선별하고, 이를 이종숙주인 대장균에 도입하여, 탄소원으로 글리세롤을 사용하고, 구연산염을 추가한 R/2 및 M9 배지에서 배양하며, pH 조절을 위하여 암모니아 용액을 이용하고, 세포 성장이 목표치에 도달하면, IPTG를 처리하여 단백질 합성을 유도하였으며, 암모니아 용액 대신에 수산화나트륨 용액으로 치환함으로써 질소제한하였고, 이로부터 이타콘산의 생산량을 증진시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(1) 개시코돈을 제외한 5' 말단 코딩 영역 내의 코돈에 대하여, 워블 염기(wobble base)가 축퇴된 프라이머를 이용하여 무작위로 치환된 동의코돈을 포함하는 CadA 유전자 라이브러리로부터 가용성 및 발현량이 증진된 CadA 유전자를 선별하는 단계;

(2) 상기 선별된 CadA 유전자를 재조합 벡터에 삽입하여 대장균 세포를 형질전환시키는 단계; 및

(3) 상기 CadA 유전자가 도입된 대장균 세포를 배양하는 단계를 포함하는 동의코돈으로 치환된 CadA 유전자를 이용한 이타콘산의 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 CadA 유전자를 유효성분으로 함유하는 대장균에서 이타콘산을 생산하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 아미노 말단의 코돈을 동의코돈으로 치환한 CadA(cis-aconitate decarboxylase) 유전자를 이용하는 이타콘산의 생산방법에 관한 것으로, 기능성 발현을 증대시킬 수 있는 동의코돈으로 치환된 CadA 단일 유전자를 이용한 기능성 발현 증대와 배양 조건의 조절을 통하여 기존에 알려진 이종숙주를 활용한 것보다 높은 수율의 이타콘산을 생산하는 방법이다.

본 발명의 이타콘산의 대량 생산방법은 기존 대사공학적 연구 결과들과 결합하여 생산 수율을 더 높일 수 있음을 보여줄 뿐만 아니라, 포도당 대신에 낮은 단가의 crude 글리세롤을 이용함으로써, 비용을 절감할 수 있는 생산방법이다.

도 1은 엠체리-융합된 야생형 CadA 및 이들의 변이체(scvCadAs, No 1~No 8) 유전자를 도입한 대장균을 0.5%의 포도당을 포함하는 LB 배지를 이용하여 250㎖의 Baffled 플라스크에서 30℃, 200rpm의 조건으로 배양하여 생산한 이타콘산의 생산량 및 형광강도를 나타낸 도면이다.
도 2는 CadA의 동의코돈 변이체 라이브러리로부터 엠체리(mCherry)의 붉은 형광(Red fluorescence)이 높게 나타난 8개의 변이체의 무작위 치환된 위치인 N 말단에서 10번째 아미노산을 코딩하는 부분의 유전자 서열을 무작위로 치환된 서열과 그에 상응하는 야생형 CadA 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 야생형 CadA 및 선별된 변이체 scvCadAs(No 2 및 No 8)의 발현량을 확인한 SDS-PAGE 사진이다. (A)는 4시간 동안 IPTG(isopropyl 1-thio-β-D-galactoside) 유도하여 인큐베이션한 것이고, (B)는 24시간 동안 IPTG 유도하여 인큐베이션한 것이다. 붉은 화살표는 T5 프로모터 조절하에 발현한 CadA 및 scvCadA를 표시한 것이고, T는 총 단백질이고, S는 가용성 분획을 나타낸다.
도 4는 탄소원으로 0.5%의 포도당을 이용하는 LB, R/2 및 M9 최소배지에서, scvCadA 변이체(scvCadA_No 8) 유전자가 도입된 대장균을 250㎖의 Baffled 플라스크에서 30℃, 200rpm의 조건으로 배양하여 획득한 이타콘산의 생산량을 나타낸 것이다.
도 5는 탄소원으로 글리세롤을 이용하는 LB, R/2 및 M9 최소배지에서, scvCadA 변이체(scvCadA_No 8) 유전자가 도입된 대장균을 250㎖의 Baffled 플라스크에서 30℃, 200rpm의 조건으로 배양하여 배양시간에 따른 이타콘산 및 아세트산의 생산량을 나타낸 것이다. -■-: 이타콘산, -△-: 글리세롤, -●-: 아세트산을 의미한다.
도 6은 1%의 글리세롤이 포함된 50㎖의 최소배지가 담긴 250㎖의 Baffled 플라스크에 scvCadA 변이체(scvCadA_No 8) 유전자가 도입된 대장균을 접종하여 30℃, 200rpm의 조건으로 배양한 대장균으로부터 생산한 이타콘산, pH, 및 OD₆₀₀ 를 나타낸 그래프이다. (A)는 R/2 배지에서, 구연산을 포함하지 않은 조건이고, (B)는 R/2 배지에서, 구연산을 포함하는 조건으로 배양한 것이며, (C)는 M9 최소배지에서, 구연산을 포함하지 않은 조건이고, (D)는 M9 최소배지에서, 구연산을 포함하는 조건으로 배양한 것이다. -○-: OD₆₀₀, -●-: pH, -■-: 이타콘산의 생산량을 의미한다.
도 7은 0.85g/ℓ의 구연산 및 0.4%의 글리세롤을 포함하는 M9 배지에서 scvCadA 변이체(scvCadA_No 8) 유전자가 도입된 대장균을 유가배양식 발효법으로 생산한 이타콘산의 생산량을 나타낸 것이다. (A)는 70%의 글리세롤 및 50%의 암모니아 용액을 각각 탄소원 및 질소원 공급 용액으로 이용한 표준 발효이고, (B)는 ITPG로 6시간 동안 유도한 후, 암모니아 용액을 5N의 수산화나트름 용액으로 치환한 2단계 발효이다. 화살표는 IPTG 유도(induction)시간을 나타내고, -○-: 이타콘산의 생산량, -■-:OD₆₀₀을 의미한다.

본 발명은

(3) 상기 CadA 유전자가 도입된 대장균 세포를 배양하는 단계를 포함하는 동의코돈으로 치환된 CadA 유전자를 이용한 이타콘산의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 이타콘산의 생산방법에서, 상기 CadA 유전자는 야생형 CadA 유전자 서열에서 5′말단 코딩 영역의 코돈을 동의코돈으로 무작위 치환하여 기능성 발현이 증진된 단백질을 코딩하는 유전자를 선별하는 방법으로부터 획득한 것이며, 도 2에 개시한 바와 같이, 개시코돈을 제외한 5′말단 코딩 영역 내의 코돈에 대하여 워블 염기(wobble base)가 축퇴된 프라이머를 이용하여 무작위로 치환된 동의코돈을 포함하는 유전자 라이브러리를 생산하여, 상기 유전자 라이브러리를 재조합벡터에 삽입하여 숙주세포를 형질전환시키고, 형질전환된 숙주세포를 배양하여 가용성이 증진된 것을 선별한 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 이타콘산의 생산방법에서, 상기 선별된 가용성 및 발현량이 증진된 CadA 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 이타콘산의 생산방법에서, 상기 CadA 유전자의 3' 말단의 코딩 영역에 리포터를 융합하여 형광분석 등으로 쉽게 분석할 수 있도록 리포터를 융합할 수 있으며, 바람직하게는 RFP(Red fluorescent protein 또는 mCherry라고 함), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(Yellow fluorescent protein) 또는 GFP(Green fluorescent protein) 폴딩 리포터가 융합할 수 있으며, 가장 바람직하게는 엠체리(mCherry) 폴딩 리포터를 융합한 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 이타콘산의 생산방법에서, 상기 단계(3)의 배양은

(a) 상기 CadA 유전자가 도입된 대장균 세포를 R/2 또는 M9 최소배지에서 pH를 유지하기 위하여, 주기적으로 암모니아 용액을 공급하고, 글리세롤을 주기적으로 공급하는 1차 유가 배양을 수행하는 단계; 및

(b) 상기 1차 유가 배양 이후에, IPTG를 첨가하여 단백질 합성을 유도하고, 상기 pH 조절을 위한 암모니아 용액 대신에 수산화나트륨 용액을 공급하여 질소제한(nitrogen limitation)을 유도하는 2차 유가 배양을 수행하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 이타콘산의 생산방법에서, 상기 R/2 또는 M9 최소배지는 탄소원으로 60~80%(v/v)의 글리세롤을 이용하며, 0.8~0.9중량% 구연산염(Citrate)을 포함하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 70%(v/v)의 글리세롤과 0.85%(w/w)의 구연산을 이용하는 것이지만 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 이타콘산의 생산방법은 상기 글리세롤을 주기적으로 공급하는 유가 배양인 것이 특징이며, 공급은 pH가 감소할 때 공급하는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 경우에 따라 일정시간 간격으로 공급할 수도 있다.

본 발명에서의 유가 배양은 탄소원인 글리세롤과 질소원인 암모니아를 주기적으로 공급하여 대장균 세포를 배양하는 것이다. 본 발명의 유가 배양은 2단계로 이루어지며, 1차 배양은 세포의 성장 단계로, 대장균 세포의 성장이 기준치 이상으로 성장하면 IPTG 유도하여 CadA 단백질을 발현시킨 후, 질소제한을 통해 세포의 성장을 억제하여 이타콘산을 생산하도록 하는 것이 특징이다.

상기 M9 최소배지는 0.015g/ℓ의 CaCl₂, 6g/ℓ의 Na₂HPO₄, 3g/ℓ의 KH₂PO₄, 0.5g/ℓ의 NaCl, 1g/ℓ의 NH₄Cl, 0.5g/ℓ의 MgSO₄, 1%(v/v)의 글리세롤을 포함하는 배지이며, R/2 최소배지는 2g의 (NH₄)₂HPO₄, 6.75g의 KH₂PO₄, 0.85g의 시트르산(citric acid), 0.7g의 MgSO₄7H₂O, 미량금속 용액(trace metal solution; 5M의 HCl 리터 당 10g의 FeSO₄7H₂O, 2.25g의 ZnSO₄7H₂O, 1g의 CuSO₄5H₂O, 0.35g의 MnSO₄H₂O, 0.23g의 Na₂B₄O₇10H₂O, 2g의 CaCl₂2H₂O, 0.106g의 (NH₄)₆MO₇O₂₄4H₂O를 포함하는 용액), 1%(v/v)의 글리세롤을 포함하는 배지이다.

상기 단계(a) 및 (b)에서 1차 및 2차 유가 배양은 25~40℃, 200~1000 rpm의 조건으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

따라서, 본 발명의 이타콘산의 생산방법은 바람직하게는

(1) 시스 아코니트산 탈카르복실화 효소(CadA)를 코딩하는 동의코돈 유전자 및 상기 유전자의 3' 말단에 엠체리(mcherry) 폴딩 리포터를 융합한 유전자 라이브러리를 구축하는 단계;

(2) 상기 유전자 라이브러리를 대장균에 형질전환하고, 가용성 및 발현량이 증진된 CadA 유전자를 선별하는 단계;

(3) 상기 선별된 CadA 유전자가 도입된 대장균을 R/2 또는 M9 최소배지에서 주기적으로 암모니아 용액을 공급하여 pH를 유지하고, 글리세롤을 주기적으로 공급하는 1차 유가 배양 단계; 및

(4) 상기 1차 유가 배양 이후에, IPTG를 첨가하여 단백질 합성을 유도(induction)하고, pH 조절을 위해 암모니아 용액 대신에 수산화나트륨 용액을 공급하여 질소제한(nitrogen limitation)하는 2차 유가 배양 단계를 포함할 수 있으며,

더욱 바람직하게는

(2) 상기 유전자 라이브

러리를 대장균에 형질전환하고, 가용성 및 발현량이 증진된 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 CadA 유전자를 선별하는 단계;

(3) 상기 선별된 CadA 유전자가 도입된 대장균을 R/2 또는 M9 최소배지에서 주기적으로 암모니아 용액을 공급하여 pH를 유지하고, 70%(v/v)의 글리세롤을 주기적으로 공급하는 1차 유가 배양 단계; 및

(4) 상기 1차 유가 배양 이후에, 0.2mM의 IPTG를 첨가하여 단백질 합성을 유도(induction)하고, pH 조절을 위해 암모니아 용액 대신에 5N 수산화나트륨 용액을 공급하여 질소제한(nitrogen limitation)하는 2차 유가 배양 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 CadA 유전자를 유효성분으로 함유하는 대장균에서 이타콘산을 생산하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 선별된 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 CadA 유전자는 가용성 및 발현량이 야생형 CadA 유전자에 비해 증가됨으로 인해 대장균에서 이타콘산을 현저하게 많이 생산할 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

[재료 및 방법]

1. 균주 및 프라이머 제작

이타콘산 생산 숙주로서 변이체 라이브러리 확립을 위하여 대장균 XL1-Blue(ΔmcrA)183　ΔmcrCB - hsdSMR - mrr)173 endA1 supE44 thi -1 recA1　gyrA96 relA1 lac　 [F' 　proAB lacI^q ZΔ15Tn10( Tet ^r )])을 이용하였다.

하기 표 1에 본 발명에서 사용한 프라이머 및 동의코돈 라이브러리를 구축하기 위한 플라스미드를 개시하였다. 플라스미드 pSCT5는 본 발명자에 의해 동의코돈 라이브러리를 구축하기 위하여 기 설계된 것이다.

본 발명에 사용된 플라스미드 및 프라이머

플라스미드 및 프라이머	서열(5' -> 3')	소스/제한효소자리
플라스미드
pQE30	AmpR, Col E1 ori	Qiagen
pSCT5	AmpR; Col E1 ori, PT5-lac::mCherry	Cheong et al., 2015
pSCT5-CadA	AmpR; Col E1 ori, PT5-lac::CadA
pSCT5-scvCadA	AmpR; Col E1 ori, PT5-lac::scvCadA
프라이머
CadA F (서열번호 1)	CGGACTAGTATGACGAAGCAATCTGCTGACAGC	SpeI
CadA R (서열번호 2)	CGGGGTACCGACCAGAGGAGATTTGACTGGGCAATTCA	KpnI
scvCadA F (서열번호 3)	CGGACTAGTATGACNAARCARTCNGCNGAYAGYAAYGCNAAR AGCGGTGTGACGGCCGAA	SpeI
CadA stop R (서열번호 4)	CCCAAGCTT TCAGACCAGAGGAGATTTGACTGGGCAATTC	HindIII
pSCT5 F (서열번호 5)	GTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC

2. 유전적 방법

시스-아코니테이트 디카르복실라아제(CadA)를 코딩하는 유전자는 IDT에 의해 합성되었다.

CadA 유전자의 기능적 발현량을 증진시키기 위하여 종래의 방법으로 동의코돈 라이브러리를 설계하였다. 간단하게는 Phusion DNA 폴리머라아제를 사용하고, scvCadA F(서열번호 1) 및 CadA R(서열번호 2) 프라이머를 이용하여 동의코돈 치환체들을 증폭하여 획득하였다. 이후, pSCT 5에 클로닝하고, 제한효소 SpeI 및 KpnI을 이용하는 알려진 방법으로 절단하였다.

동의코돈 변이체(Synonymous codon variant CadAs; ScvCadAs)는 엠체리의 붉은 형광강도에 기초하여 선별하였다. 선별된 동의코돈 변이체(ScvCadAs) 유전자들은 pSCT5 F(서열번호 5) 및 CadA stop R(서열번호 4) 프라이머를 이용하여 증폭하였고, SpeI 및 HindIII으로 절단하였다. 이후 다시 동일 제한 효소로 절단한 pSCT5에 클로닝하여, 엠체리를 제거하였다. 엠체리가 제거된 동의코돈 변이체가 클로닝된 것을 pSCT5::scvCadA8으로 나타내었다. 이후 다시 동일 제한 효소로 절단한 pSCT5에 클로닝하여, 엠체리를 제거하였다. 엠체리가 제거된 동의코돈 변이체가 클로닝된 것을 pSCT5::scvCadA8으로 나타내었다.

3. 배지 및 배양 조건

이타콘산의 생산을 극대화시키기 위하여, Luria-Bertani(LB), 0.015g/ℓ의 CaCl₂, 6g/ℓ의 Na₂HPO₄, 3g/ℓ의 KH₂PO₄, 0.5g/ℓ의 NaCl, 1g/ℓ의 NH₄Cl, 0.5g/ℓ의 MgSO₄을 포함하는M9 최소배지 또는 2g의 (NH₄)₂HPO₄, 6.75g의 KH₂PO₄, 0.85g의 시트르산(citric acid), 0.7g의 MgSO₄7H₂O, 미량금속 용액(trace metal solution; 5M의 HCl 리터 당 10g의 FeSO₄7H₂O, 2.25g의 ZnSO₄7H₂O, 1g의 CuSO₄5H₂O, 0.35g의 MnSO₄H₂O, 0.23g의 Na₂B₄O₇10H₂O, 2g의 CaCl₂2H₂O, 0.106g의 (NH₄)₆MO₇O₂₄4H₂O를 포함하는 용액)을 포함하는 R/2 최소 배지에 다양한 농도의 포도당 또는 글리세롤을 첨가하여 배양조건을 확립하였다.

100㎍/㎖의 앰피실린은 플라스미드 유지를 위해 공급하였고, 0.2mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)은 scvCadA8 유전자의 발현을 유도하기 위하여 첨가되었다.

플라스크 배양은 14㎖의 튜브에서 밤샘 배양하여 준비하였고, 이를 0.4%의 글리세롤 및 0.85g/ℓ의 구연산염을 함유하는 변형된 200㎖의 M9 배지를 포함하는 1ℓ의 baffled 삼각 플라스크에 접종하여 30℃의 온도 조건하에서 200rpm으로 OD₆₀₀ 값이 0.5~0.6 될 때까지 배양하였다. 이후에 0.2mM의 IPTG를 첨가하여 72시간 동안 인큐베이션 하였다. 모든 발효실험은 세 번 반복하여 실시하였다.

4. 유가 배양식 발효( Fed - Batch fermentation )

유가 배양식 발효(Fed-batch fermentation)는 1%(v/v)의 글리세롤, 0.85g/ℓ의 구연산 및 34㎍/ℓ의 클로람페니콜(chloramphenicol)을 함유하는 M9 배지를 이용하여 5ℓ의 발효조에서 수행하였다. 발효 전에, 단일 콜로니를 형성한 대장균(XL1-Blue harboring pSCT5::scvCadA8)을 14㎖의 튜브에서 밤샘 배양하여 준비하였고, 이를 100㎖의 변형된 M9 배지를 포함하는 250㎖의 baffled 플라스크에 접종하여 30℃의 온도 조건하에서 200rpm으로 OD₆₀₀ 값이 2.5가 될 때까지 배양하였다. baffled 플라스크에서 실시한 모든 배양물은 2ℓ의 변형된 M9 배지가 들어있는 5ℓ의 발효조로 옮겨졌다. 호기성 조건을 공급하기 위하여, 무균 공기를 2ℓ/min으로 공급하였고, 용존산소가 포화공기 30% 이상을 유지하기 위하여, 200~1000rpm으로 교반하였으며, 30℃의 온도 조건으로 발효하였다. 50% 암모니아는 pH6.1으로 유지하도록 자동적으로 조절하여 첨가되었고, pH가 6.13 이상으로 증가할 때 70% 글리세롤이 자동적으로 조절하여 첨가되도록 하였으며, 0.2mM의 IPTG는 OD₆₀₀값이 10일 때 첨가하였다. 질소제한을 위하여, 0.2mM의 IPTG로 유도하여 6시간 동안 인큐베이션하고, 50%의 암모니아 용액을 5N 수산화나트륨 용액으로 치환하여 제공하였다.

5. 분석 방법

세포 성장을 모니터링하기 위하여 UV-VIS 분광기를 이용하여 OD₆₀₀에서 흡광도를 측정하였다. 14,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 배양액으로부터 세포를 제거한 후, 미분 굴절률(differential refractive index) 검출기 및 210nm에서 측정할 수 있는 UV 검출기가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 발효액에 포함된 아세트산 및 구연산염, 글리세롤 및 포도당의 농도를 측정하였다.

시료들은 Aminex HPX-87H 칼럼(300×4.6mm Biorad)으로 40℃에서 0.6㎖/min 유속으로, 5mM의 H₂SO₄ 이동상을 이용하여 분리하였다.

실시예 1. 동의코돈의 선별

CadA의 발현 증대가 이타콘산(itaconic acid) 생산량 증대와 밀접한 관계가 있다는 결과들이 보고된 바 있으나, 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus)로부터 유래한 CadA가 이종숙주에서 대부분 불용성 응집체로 발현되는 점과 발현 증가 여부를 빠르게 확인할 방법이 없다는 점이 이타콘산을 생산하는 숙주 개발에서 해결해야 할 과제이다.

이러한 상황에서 본 실시예 1에서는 5' 코딩영역의 코돈을 동의코돈으로 무작위 치환을 통해 불용성 응집체로 발현되는 슈도모나스 푸티나(Pseudomonas putida) 유래의 포름알데히드 탈수소 효소(formaldehyde dehydrogenase)의 가용성 발현율을 증대시킨 방법을 CadA의 가용성 발현 증대를 위해 적용하였다.

CadA의 동의코돈 변이체 라이브러리로부터 엠체리(mCherry)의 붉은 형광(Red fluorescence)이 높게 나타난 8개의 변이체를 선별하였다(도 2). 야생형 CadA, 엠체리(mCherry)가 융합된 CadA 및 선별한 후보를 LB 배지에서 24시간 동안 배양 후, 배양액에 축적된 이타콘산(itaconic acid)의 양 및 대장균이 갖는 붉은 형광(Red fluorescence)의 세기를 비교하였다.

CadA 야생형 및 이로부터 선별한 8개의 변이체들에 따른 이타콘산의 생산량 및 붉은 형광강도를 도 1에 개시하였는데, 선별한 8개의 변이체의 이타콘산(itaconic acid) 생산량은 야생형 CadA(30.97±1.25mg/ℓ)에 비해 높다는 것을 확인할 수 있었다.

특히 2, 6 과 8번의 이타콘산(itaconic acid) 생산량은 126.13±13.51㎎/ℓ, 106.38±5.13㎎/ℓ 및 104.46±4.65㎎/ℓ로 대조군과 비교해 약 3~4배 높은 것으로 확인되었다. 이와 같은 이타콘산(itaconic acid) 생산량의 증대가 CadA의 가용성 발현이 증대한 결과임을 SDS-PAGE를 통하여 확인하였으며, C-말단에 융합된 엠체리(mCherry)를 제거한 후, 전체 발현량과 가용성 발현이 더욱 많이 증가된 것을 확인할 수 있었다 (도 3).

최종적으로 가용성 발현이 증대된 동의코돈 변이체 중에서 이타콘산(itaconic acid)의 생산량의 편차가 가장 적은 변이체 8번(scvCadA No 8; 서열번호 6)을 갖는 숙주를 이용하여 이후의 실험을 진행하였다.

실시예 2. M9 및 R/2 최소배지에서 포도당의 공급에 따른 이타콘산의 생산량

pSCT5-scvCadA No 8의 유전자가 도입된 대장균 XL1-Blue를 0.5% 포도당이 포함된 LB, M9 및 R/2 최소배지에서 배양하며, 72시간 동안 이타콘산(itaconic acid) 생산량을 측정하였다.

M9 최소배지에서 가장 많은 양의 이타콘산(itaconic acid)이 생산되는 것이 확인되었다(도 4). 이와 같은 결과는 CadA의 단독 발현으로 얻은 이타콘산(itaconic acid) 생산량 중 가장 높은 것이다. 하지만, 대사 조절이 적용된 대장균을 활용한 기술보다 낮은 수준이므로, 이타콘산(itaconic acid)의 생산량 증대를 위해 포도당의 농도를 0.5 내지 4.0%까지 높여 배양하였다.

72시간 배양 후, 1.0% 포도당을 첨가한 경우에서만 0.5% 포도당을 첨가하였을 때보다, 이타콘산(itaconic acid)의 생산량이 소폭 증가하는 것이 관찰되었으나(표 2), 포도당의 첨가 농도가 증가함에 따라 이타콘산 수율은 급격하게 감소하는 것으로 나타났다. 이는 증가한 아세트산의 축적 및 pH 감소와 관련되어 있을 것으로 추측된다(표 2).

M9 최소배지에서 포도당(glucose)의 공급에 따른 이타콘산(IA) 및 아세트산의 생산량

포도당 농도 (g/ℓ)	이타콘산 (mg/ℓ)	수율 (g IA/g carbon source)	아세트산 (g/ℓ)
5	522.6±22.0	0.108	1.735±0.086
10	533.9±0.9	0.125	2.897±0.046
20	474.4±2.5	0.113	2.846±0.021
30	427.8±1.0	0.056	2.865±0.040
40	385.7±3.4	0.036	2.976±0.050

실시예 3. M9 및 R/2 최소배지에서 글리세롤( glycerol )의 공급에 따른 이타 콘산의 생산량

글리세롤을 이용하는 경우, 부산물인 아세트산의 감소와 이타콘산의 전구체인 이소구연산염(iso citrate)이 증가하는 효과를 얻을 수 있어 이타콘산 생산량이 증대시킬 수 있을 것이라 예상하였다. 이를 바탕으로 포도당 대신에 글리세롤을 탄소원으로 이용하며, 상기 실시예 2와 동일한 조건에서 배양하여 생산된 이타콘산(itaconic acid)의 생산량을 확인하였다.

포도당을 탄소원으로 이용했을 때와 달리 LB 배지를 제외한 M9 및 R/2 최소배지에서 아세트산 축적량이 1g/ℓ 내외로 감소하였으며, R/2 최소배지에서 포도당을 이용하였을 때보다 약 1.5배가 높은 860.5±24.6㎎/ℓ의 이타콘산(itaconic acid)이 생산되었다(도 5).

하지만, 상기 결과를 바탕으로 1~5%(v/v)의 글리세롤이 첨가된 R/2 배지에서 생산한 이타콘산(itaconic acid)의 생산 수율을 측정한 결과, 포도당의 첨가량을 증가시켰을 때와 같이 이타콘산(itaconic acid) 생산 수율이 감소하며 아세트산 축적이 증가하는 것을 확인하였다(표 3).

R/2 최소배지에서 글리세롤(glycerol)의 공급에 따른 이타콘산(IA) 및 아세트산의 생산량

글리세롤 농도 (g/ℓ)	이타콘산(mg/ℓ)	수율(g IA/g 탄소원)	아세트산(g/ℓ)
10	860.5±24.6	0.096	0.588±0.180
20	634.7±17.5	0.082	2.137±0.119
30	512.9±13.1	0.067	2.484±0.281
40	237.5±5.58	0.076	3.006±0.025
50	192.9±2.38	0.080	3.097±0.093

M9 최소배지를 활용했을 때와 큰 차이가 없었으나, R/2 배지에서 이타콘산(itaconic acid)의 생산량이 가장 높았으며, 대장균의 성장이 2배 이상 차이가 나는 것을 확인하였다(도 5). 이러한 차이는 R/2 배지와 M9 최소배지의 미량 금속(trace metal) 및 구연산염(citrate)에 의해 유도될 것이라 예상하였다. 특히 구연산염(citrate)의 경우 미생물 성장을 촉진한다는 보고가 있어, 두 개의 인자들 중 구연산염(citrate)에 따른 효과를 확인하기 위하여, R/2 및 M9 최소배지에 구연산염(citrate)의 유무에 따른 이타콘산 생산량을 확인하였다.

결과적으로 구연산염(citrate)이 첨가되지 않은 R/2 배지에서는 대장균 세포의 성장 및 이타콘산 생산량이 급격하게 감소하는 것이 확인되었으며(표 4 및 도 6), 구연산염(citrate)이 첨가된 M9 최소배지에서는 대장균 세포의 성장 및 이타콘산의 생산이 많이 증가하는 것을 확인하였다.

R/2 및 M9 최소배지에서 이타콘산의 생산량에 미치는 구연산염의 효과

배지	구연산염(g/ℓ)	이타콘산 (mg/ℓ)	글리세롤 소모 (g/ℓ)	수율(g IA/g 글리세롤)	잔여 구연산 (g/ℓ)
R/2	-	232.8±3.7	2.71±0.28	0.086
R/2	0.85	930.0±38.0	8.95±0.08	0.104	1.11±0.02
M9	-	615.7±19.4	2.32±0.16	0.265
M9	0.85	985.6±33.4	3.05±0.13	0.323	1.15±0.03

실시예 4. M9 배지에서 글리세롤 및 구연산염을 공급한 이타콘산의 생산량

일정한 pH를 유지하는 조건에서 더 높은 이타콘산 생산 효율을 얻을 수 있다는 기존 결과들을 바탕으로, 50% 수산화암모늄(ammonium hydroxide)으로 pH를 6.2로 유지하며 유가배양(Fed-batch culture)을 수행하였다.

그 결과, 도 7A에 개시한 바와 같이, 83시간 동안 1.46g/ℓ의 이타콘산을 생산하였다. 플라스크 배양(flask culture)를 이용해 이타콘산을 생산한 것에 비해 약 1.5배 증가한 정도이지만, 글리세롤이 약 148.3g이 소모되어 탄소원의 소모량 대비 수율은 0.1%로 플라스크 배양(flask culture)의 32%에 비해 현저하게 낮았다. 이와 같은 결과는 대부분의 영양분이 이타콘산의 생산이 아니라, 세포의 성장에 활용되었을 것으로 판단하였다.

5ℓ발효조에서의 배양은 플라스크 배양(flask culture)과는 달리 바이오매스가 급격하게 증가하며, 이는 pH 조절을 위해 공급된 암모니아 용액의 질소가 원인 인 것으로 예측되었다. 이를 확인하기 위해, OD₆₀₀ 값이 약 10인 근처에서 4시간 동안 0.2mM IPTG 유도 후, 수산화암모늄(암모니아 용액)을 5N NaOH로 교체하여 pH를 보정하였다. 그 결과, 도 7B에 개시한 바와 같이, 질소제한 약 20시간 후, OD₆₀₀의 값이 약 30인 부근에서 세포의 성장이 정지한 것을 확인할 수 있었으며, IPTG 유도 후, 90시간의 배양에서 7.23 g/ℓ의 이타콘산을 생산하였다 (도 7B).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for producing itaconic acid using CadA gene substituted with synonymous codon of N-terminal region <130> PN15326 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cggactagta tgacgaagca atctgctgac agc 33 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cggggtaccg accagaggag atttgactgg gcaattca 38 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cggactagta tgacnaarca rtcngcngay agyaaygcna aragcggtgt gacggccgaa 60 60 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cccaagcttt cagaccagag gagatttgac tgggcaattc 40 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtatcacgag gccctttcgt cttcac 26 <210> 6 <211> 1473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CadA <400> 6 atgactaagc agtcggcgga cagtaatgcg aagagcggtg tgacggccga aatttgccat 60 tgggcgtcga acttagccac agacgatatc ccgagcgatg tgctggaacg cgccaaatat 120 ctgattctcg atggcatcgc atgcgcctgg gtgggcgccc gcgtgccatg gagtgaaaaa 180 tacgtacagg ccacgatgag ctttgaacca ccgggtgcgt gtcgcgtgat tggttacggt 240 caaaaactgg gtccagttgc cgcagctatg acaaattcag cgttcattca agccactgaa 300 ctggatgatt accactctga ggcaccgctg catagtgcgt ccattgtgtt acctgctgta 360 tttgcagcga gtgaagtact ggctgagcag ggtaagacaa ttagcgggat tgacgtcatt 420 ctggcggcca ttgtcgggtt cgaaagtggc ccgcgcattg gcaaggctat ttatggtagc 480 gacctgctga acaacggttg gcattgtggt gctgtttatg gtgcaccagc cggtgcactg 540 gccacgggta aactcctggg cttaacgccg gattcaatgg aagacgcgct tggcattgcg 600 tgtactcagg cttgcggtct gatgtccgcg cagtatggtg gaatggttaa acgtgttcag 660 catgggtttg ccgcacgcaa cgggttgtta ggtgggctgc ttgcgtatgg tggctatgag 720 gccatgaaag gcgttttgga acgttcttac ggcgggtttt tgaagatgtt taccaaaggt 780 aatggtcgtg aaccgcccta taaggaggag gaagtcgtgg cggggctggg ctctttttgg 840 cacaccttta ccatccgtat caaactgtat gcttgctgcg gcctggtgca tggtccggtt 900 gaagcaatcg aaaaactgca acgccgttat cccgaacttt tgaaccgtgc aaatctttcc 960 aatattcgtc acgtttatgt tcaactgtcg accgcctcca atagccattg cggttggatt 1020 cccgaagaac gtcccatttc ttctattgct ggtcaaatga gcgtggcgta tattttagcc 1080 gtgcaactcg tcgaccaaca gtgcttgctg gcccaattca gcgagtttga cgataatctg 1140 gaacgtcctg aagtttggga tttggcacgc aaagtgactc cttcgcattc agaggagttt 1200 gaccaagatg gtaattgctt gtctgcaggc cgtgtccgca tcgagtttaa tgacggtagc 1260 agcgtgaccg agaccgtaga gaaaccgctg ggtgtgaagg aacctatgcc aaacgaacgt 1320 atccttcaca aatatcgtac tctggccgga agtgttacag atgaatcccg tgttaaagaa 1380 atcgaggatc ttgtattatc tttagatcgt ctgaccgata tcacgccgct tttggagctg 1440 ctgaattgcc cagtcaaatc tcctctggtc tga 1473

Claims

(1) 개시코돈을 제외한 5' 말단 코딩 영역 내의 코돈에 대하여, 워블 염기(wobble base)가 축퇴된 프라이머를 이용하여 무작위로 치환된 동의코돈을 포함하는 CadA 유전자 라이브러리로부터 가용성 및 발현량이 증진된 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 CadA 유전자를 선별하는 단계;
(2) 상기 선별된 CadA 유전자를 재조합 벡터에 삽입하여 대장균 세포를 형질전환시키는 단계; 및
(3) 상기 CadA 유전자가 도입된 대장균 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 동의코돈으로 치환된 CadA 유전자를 이용한 이타콘산의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 CadA 유전자의 3' 말단의 코딩 영역에 RFP(Red fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(Yellow fluorescent protein) 및 GFP(Green fluorescent protein) 중에서 선택된 어느 하나의 폴딩 리포터를 코딩하는 유전자를 융합하는 것을 특징으로 하는 이타콘산의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(3)의 배양은
(a) 상기 CadA 유전자가 도입된 대장균 세포를 R/2 또는 M9 최소배지에서 pH를 유지하기 위하여, 주기적으로 암모니아 용액을 공급하고, 글리세롤을 주기적으로 공급하는 1차 유가 배양을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 1차 유가 배양 이후에, IPTG를 첨가하여 단백질 합성을 유도하고, 상기 pH 조절을 위한 암모니아 용액 대신에 수산화나트륨 용액을 공급하여 질소제한(nitrogen limitation)을 유도하는 2차 유가 배양을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이타콘산의 생산방법.
제3항에 있어서, 상기 단계(a) 및 (b)에서 1차 및 2차 유가 배양은 25~40℃, 200~1000rpm의 조건으로 수행하는 것을 특징으로 하는 이타콘산의 생산방법.
제3항에 있어서, 상기 단계(b)에서 질소제한은 세포의 성장을 정지시키는 것을 특징으로 하는 이타콘산의 생산방법.
삭제
(1) 시스-아코니테이트 디카르복실라아제(CadA)를 코딩하는 동의코돈 유전자 및 상기 유전자의 3' 말단에 엠체리(mcherry) 폴딩 리포터를 융합한 유전자 라이브러리를 구축하는 단계;
(2) 상기 유전자 라이브러리를 대장균에 형질전환하고, 가용성 및 발현량이 증진된 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 CadA 유전자를 선별하는 단계;
(3) 상기 선별된 CadA 유전자가 도입된 대장균을 R/2 또는 M9 최소배지에서 주기적으로 암모니아 용액을 공급하여 pH를 유지하고, 글리세롤을 주기적으로 공급하는 1차 유가 배양 단계; 및
(4) 상기 1차 유가 배양 이후에, IPTG를 첨가하여 단백질 합성을 유도(induction)하고, pH 조절을 위해 암모니아 용액 대신에 수산화나트륨 용액을 공급하여 질소제한(nitrogen limitation)하는 2차 유가 배양 단계를 포함하는 이타콘산의 생산방법.
삭제
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 CadA 유전자를 유효성분으로 함유하는 대장균에서 이타콘산을 생산하기 위한 조성물.